CN111593041B - 明胶作为重组家蚕乙酰胆碱酯酶保护剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了明胶作为重组家蚕乙酰胆碱酯酶保护剂的应用，本发明利用明胶作为重组家蚕乙酰胆碱酯酶的保护剂，其能够很好的保持重组家蚕乙酰胆碱酯酶的酶活，利用其制备了纯高稳定性的重组家蚕乙酰胆碱酯酶液体制剂和冻干粉制剂，其储存稳定性显著优于无保护剂的酶制剂。该两种含有保护剂的酶制剂对于重组家蚕乙酰胆碱酯酶在酶法检测农药残留的实际应用具有重大意义和推广价值。

Description

明胶作为重组家蚕乙酰胆碱酯酶保护剂的应用
技术领域
本发明涉及酶法检测农药残留领域，更具体的，涉及明胶作为重组家蚕乙酰胆碱酯酶保护剂的应用。
背景技术
乙酰胆碱酯酶是酶法检测农药残留的核心试剂，是一种丝氨酸水解酶，因其能够被有机磷类和氨基甲酸酯类农药抑制而被应用于对食品、农产品的农药残留检测中。被抑制后的酶会失去对底物水解的能力，导致显色剂颜色变化减弱，因此可以计算出待测样品中的农药残留量。酶法检测具有广谱和速效的特点，广泛应用于农产品农药残留的现场初筛。乙酰胆碱酯酶广泛存在于电鳐、电鳗、人、家蝇、果蝇、家蚕等动物、昆虫的血液或组织中。其中家蚕由于长期人工圈养而对农药具有高敏感性，其乙酰胆碱酯酶的研究也受到关注。获取乙酰胆碱酯酶的途径主要包括直接提取和基因工程重组表达，目前应用较多的为直接提取，其弊端在于提取率低、纯化程度差、酶灵敏度各异，在农药残留检测的实际应用中往往容易造成灵敏度低、假阳性等各种问题。相较之下，利用不同的表达***进行乙酰胆碱酯酶的重组表达有助于获取大量、廉价的酶源，同时可以通过加入标签蛋白进行亲和纯化，获得的纯化酶纯度高、活性好，利于进一步的研究和应用。
酶的稳定性包括热稳定性和储存稳定性是影响其实际应用的重要因素之一，提高酶的稳定性方法多种多样，包括分子进化、添加保护剂或分子伴侣、化学修饰以及固定化处理等。添加保护剂是最为便捷、廉价和实用的方法，常用的保护剂包括醇类、糖类、盐类、聚合物、有机溶剂等。通过筛选针对目标酶的保护剂类型，可以开发单一型或复合型保护剂，有效提高酶的稳定性。酶制剂的类型通常有液体制剂和冻干粉制剂。酶的液体制剂制备、储存和使用方便，避免了冻干和复溶时对酶造成的损害和损失，但液体酶制剂容易出现结构损坏、聚集、降解等不良情况。配合保护剂将酶制备成冻干粉制剂，能够使酶的结构保持稳定，提高酶在不同温度下的储存稳定性。
在重组家蚕乙酰胆碱酯酶用于农药残留检测的研究中，该酶的活性和灵敏度较好，但其稳定性差造成了应用和储藏的不便，限制了其实际应用。目前尚未有一种针对重组家蚕乙酰胆碱酯酶的保护剂，制约了其的应用。因此，针对该酶进行保护剂的筛选研究具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供明胶作为重组家蚕乙酰胆碱酯酶保护剂的应用。
本发明的第一个目的在于提供明胶作为重组家蚕乙酰胆碱酯酶保护剂的应用。
本发明的第二个目的在于提供明胶在制备高稳定性乙酰胆碱酯酶液体制剂中的应用。
本发明的第三个目的在于提供明胶在制备高稳定性乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种高稳定性重组家蚕乙酰胆碱酯酶液体制剂。
本发明的第五个目的在于提供一种高稳定性重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
明胶作为重组家蚕乙酰胆碱酯酶保护剂的应用。
优选地，明胶的工作浓度为1～10g/L。
优选地，明胶的工作浓度为5g/L。
优选地，所述重组家蚕乙酰胆碱酯酶为由以下方法制备得到：毕赤酵母分泌表达的重组家蚕乙酰胆碱酯酶上清液作为粗酶液，经Ni亲和层析进行纯化，并置换至50 mM磷酸盐缓冲液中。
更优选地，所述重组家蚕乙酰胆碱酯酶保护剂保护酶活。
本发明还要求保护以下内容：
明胶在制备高稳定性乙酰胆碱酯酶液体制剂中的应用。
明胶在制备高稳定性乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂中的应用。
优选地，明胶作为冻干剂在制备高稳定性乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂中的应用。
进一步，本发明还要求保护以下内容：
一种高稳定性重组家蚕乙酰胆碱酯酶液体制剂，其特征在于，含有明胶。
一种高稳定性重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂，其特征在于，含有明胶。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用明胶作为重组家蚕乙酰胆碱酯酶的保护剂，其能够很好的保持重组家蚕乙酰胆碱酯酶的酶活，利用其制备了纯高稳定性的重组家蚕乙酰胆碱酯酶液体制剂和冻干粉制剂，其储存稳定性显著优于无保护剂的酶制剂。该两种含有保护剂的酶制剂对于重组家蚕乙酰胆碱酯酶在酶法检测农药残留的实际应用具有重大意义和推广价值。
附图说明
图1为重组家蚕乙酰胆碱酯酶的镍亲和纯化SDS-PAGE电泳图。
图2为6种保护剂在4℃条件下对纯化酶的保护作用和明胶浓度筛选结果。
图3为5g/L明胶对液体酶制剂在-80、-20和4℃下储存稳定性的影响。
图4为5g/L明胶对酶的冻干前后活性影响。
图5为5g/L明胶对冻干粉酶制剂在-80、-20、4和25℃下储存稳定性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1重组家蚕乙酰胆碱酯酶的镍亲和纯化
一、实验方法
1、取毕赤酵母分泌表达的重组家蚕乙酰胆碱酯酶上清液作为粗酶液，每1L加入1mL镍填料预混。收集填料，用10倍体积的50mM磷酸盐缓冲液进行冲洗。以200mM 咪唑进行洗脱，每1mL进行收集。用nanodrop测定各管的蛋白质浓度，将有浓度的洗脱液收集混合，用50kDa截留量的超滤管，加入样品和50mM磷酸盐缓冲液进行离心脱盐，直至nanodrop测定浓度时A260/A280为0.5-0.7时，说明缓冲液中的咪唑完全被置换。
2、取约2μg样品进行SDS-PAGE电泳检测鉴定，并测定酶活性。活性测定步骤为：在酶标板中加入240μL 50mM磷酸盐缓冲液，90μL稀释的纯化重组家蚕乙酰胆碱酯酶(约10μg/mL)，30μL显色剂DTNB。体系在37℃孵育10min后，加入30μL 底物ATChI，测定0、10min时405nm处的吸光值，根据公式(1)计算酶活性。
Figure RE-GDA0002595233360000031
公式中：ΔA405nm为405nm处反应前后吸光度的变化值，a为酶的稀释倍数，消光系数ε＝1.36×104L/(mol·cm)，T为反应的时间，d为光程(cm)，V为反应体系总体积，Ve为反应体系中酶液的体积，a为酶的稀释倍数。
二、实验结果
SDS-PAGE电泳检测鉴定结果如图1所示，在70kDa大小附近显示一个较粗的目的条带，说明所制备的酶纯度较高。经过计算酶活约为20000U/mg。
实施例2重组家蚕乙酰胆碱酯酶保护剂
一、重组家蚕乙酰胆碱酯酶保护剂的选择
1、实验方法
选取6种试剂：甘油、山梨醇、蔗糖、NaCl、明胶、DMSO，以1g/L的终浓度添加至稀释的实施例1制备的纯化酶液中(约25U/mL)，置于4℃条件下储存30d，每3d测定一次酶活性。
以0d的酶活性为100％，计算各温度条件储存的剩余酶活性随时间的变化。
2、实验结果
结果如图2A，结果显示明胶作为保护剂时，能够部分维持活性，15d后剩余酶活性维持在60％左右，其余5种保护剂的结果与无保护剂时相似，15d后剩余酶活性在 28.5％以下。说明在6种试剂中，明胶能够作为酶的保护剂。
二、重组家蚕乙酰胆碱酯酶保护剂浓度的选择
1、实验方法
分别以1、5、10g/L的终浓度添加明胶至稀释的实施例1制备的纯化酶液中(约100U/mL)，置于4℃条件下储存30d，每3d测定一次酶活性。
以0d的酶活性为100％，计算各温度条件储存的剩余酶活性随时间的变化。
2、实验结果
结果如图2B，结果显示添加5或10g/L明胶时，均能够有效保护纯化的重组家蚕乙酰胆碱酯酶，4℃储存30d后剩余酶活性分别为96.4％和100％。因此，选取5g/L 明胶作为纯化的乙酰胆碱酯酶保护剂。
实施例3高稳定性重组家蚕乙酰胆碱酯酶液体制剂和冻干粉制剂的制备
一、高稳定性的重组家蚕乙酰胆碱酯酶液体制剂的制备
调整实施例1制备的纯化的重组家蚕乙酰胆碱酯酶至5μg/mL，其酶活性约为100U/mL。配置明胶溶液50g/L，计算并添加至液体酶中使其终浓度为5g/L。
二、高稳定性的重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂的制备
调整实施例1制备的纯化的重组家蚕乙酰胆碱酯酶至5μg/mL，其酶活性约为100U/mL。配置明胶溶液50g/L，计算并添加至液体酶中使其终浓度为5g/L。将含有明胶的酶液-80℃预冻12h后，置于冷冻干燥机中以预设条件进行冻干粉制备。约24h 后得到白色的重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂。
三、重组家蚕乙酰胆碱酯酶液体制剂和冻干粉制剂酶活性测定
1、酶活性测定所需组分的配制
(1)50mM磷酸盐缓冲液：分别称取7.2495g Na2HPO4·12H2O与0.741g NaH2PO4·2H2O，溶于500mL蒸馏水中。室温保存。
(2)10mM显色剂DTNB：称取3mg二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)溶于1mL 50mM磷酸盐缓冲液中，震荡摇匀后置于4℃冰箱保存备用。
(3)10mM底物ATChI：称取3mg碘代硫代乙酰胆碱，溶解于1mL 50mM磷酸盐缓冲液中，震荡摇匀后使用，现配现用。
2、酶制剂的活性测定方法
(1)在酶标板中加入每孔150μL的50mM磷酸盐缓冲液，90μL液体酶制剂或溶解的酶冻干粉，30μL 10mM的显色剂DTNB。混合体系在37℃下孵育10min。
(2)加入每孔30μL 10mM的底物ATChI，测定0min和10min时405nm处的吸光值。
(3)计算△A405 nm(10min-0min)，以下列公式计算酶活性：
Figure RE-GDA0002595233360000051
公式中：ΔA405nm为405nm处反应前后吸光度的变化值，a为酶的稀释倍数，消光系数ε＝1.36×104L/(mol·cm)，T为反应的时间，d为光程(cm)，V为反应体系总体积，Ve为反应体系中酶液的体积，a为酶的稀释倍数。
实施例4重组家蚕乙酰胆碱酯酶液体制剂和冻干粉制剂稳定性分析
一、温度对重组家蚕乙酰胆碱酯酶液体制剂酶活的稳定性的影响
1、实验方法
将实施例3制备的重组家蚕乙酰胆碱酯酶液体制剂和不含保护剂的液体酶制剂(以添加同样体积的50mM磷酸盐缓冲液代替明胶按照实施例3的方法制备得到)分别分装置于-80℃、-20℃和4℃条件下储存30d，进行酶活性测定，测定步骤同实施例 3。分别以0d时的酶活性为100％，计算各温度条件储存的剩余酶活性随时间的变化。
2、实验结果
结果结果如图3，三个温度储存条件下，未加明胶作为保护剂的液体酶活性逐渐下降，第30d时-80℃、-20℃和4℃条件下储存的剩余酶活性分别为3.2％、0.3％和 12.4％。加入5g/L明胶作为保护剂所制备的酶液体制剂活性保持较好，第30d时在上述三个温度条件下储存的剩余酶活性均在92％以上。结果证明所述的含有5g/L明胶作为保护剂的重组家蚕乙酰胆碱酯酶液体制剂具有较高的储存稳定性。
二、重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂稳定性分析
1、实验方法
将实施例3制备的重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂用50mM磷酸盐缓冲液复溶至冻干前相同体积，取冻干前后样品进行酶活性测定，测定步骤同实施例3。不含保护剂的冻干粉制剂(以添加同样体积的50mM磷酸盐缓冲液代替明胶按照实施例3的方法制备得到)作为对照。
2、实验结果
酶活性测定结果如图4。对照冻干后活性保留46.4％，而实施例3制备的重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂冻干后活性保留96.4％。说明实施例3制备的重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂在冻干过程中具有较高的稳定性。
三、温度对重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂的稳定性的影响
1、实验方法
将实施例3制备的重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂置于-80℃、-20℃、4℃和 25℃条件下储存30d，每3d测定一次酶活性，每次以冻干前相同体积进行复溶，进行酶活性测定，测定步骤同实施例3。以0d时的酶活性为100％，计算各温度条件储存的剩余酶活性随时间的变化。不含保护剂的冻干粉制剂(以添加同样体积的50mM 磷酸盐缓冲液代替明胶按照实施例3的方法制备得到)作为对照。
2、实验结果
结果如图5，对照在各温度活性随着时间逐步下降，第30d时剩余酶活在36.4％-66.2％之间。而实施例3制备的重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂在各温度下活性稳定，30d内一直保持在100％左右。所述的含有5g/L明胶作为保护剂的重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂具有较高的储存稳定性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (3)

1.明胶在制备高稳定性重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂中的应用，所述明胶的含量为5g/L，所述重组家蚕乙酰胆碱酯酶的储存温度为-80～-20℃。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，明胶作为冻干剂在制备高稳定性重组家蚕乙酰酶冻干粉制剂中的应用。
3.一种高稳定性重组家蚕乙酰胆碱酯酶冻干粉制剂，其特征在于，含有5g/L明胶，所述重组家蚕乙酰胆碱酯酶的储存温度为-80～-20℃。
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