CN111592592A - 人胎盘不同类型胶原蛋白选择性提取制备方法和使用 - Google Patents
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Abstract
本发明所涉及的是一种人胎盘不同类型胶原蛋白的选择性提取制备方法和使用方法，使用方法是修复、增强和代替哺乳动物组织。属于医用生物材料制备和应用领域。已有的人胎盘胶原蛋白的制备方法都涉及到先利用胃蛋白酶在酸性低盐条件下消化提取，提取物中含有人胎盘中所有的各型胶原，然后利用各种方法分离不同类型的胶原。目前尚无文献资料以人胎盘为原料利用选择性酶消化直接提取胎盘各类型人胶原生产方法的报道。建立无需冗长生产过程的选择性酶消化直接分类提取人胎盘各类胶原生产方法，对于重复可控生产人胎盘胶原医用生物材料具有重要意义。
Description
1.技术领域
本发明所涉及的是一种人胎盘不同类型胶原的选择性提取制备方法和使用方法，使用方法是修复、增强和代替哺乳动物组织。属于医用生物材料制备和应用领域。
2.背景技术
胶原是人体及动物体内含量最多的蛋白质，也是器官中***的主要成分。胶原蛋白约占人体全身蛋白总量的33％。胶原蛋白不仅是一种分布广泛的结构蛋白，而且具有多种生理功能。胶原蛋白除作为组织的支持物，赋予组织张力外，对细胞的分化、运动、化学趋向性和***的修复均起着重要的作用。多年的医学和生物学研究发现胶原蛋白是一种理想的生物材料。胶原作为一种天然蛋白质材料，已广泛应用于生物医学领域。如注射胶原蛋白用于软组织添补，止血，创伤敷料，骨科修复和血管移植涂层。近年来，基于胶原蛋白的组织工程产品已经被开发并商业化，但医疗器械行业的担忧是市场上现有的胶原生物材料都是动物组织来源的胶原蛋白，它们普遍存在异种组织排斥反应、免疫反应和抗体形成等安全隐忧，其临床应用被动物源性受到限制。为克服动物源胶原的安全性方面的隐患，已有利用基因工程的方法制备重组人胶原方面的报道。但这些重组人胶原和重组类人胶原在氨基酸序列及翻译后修饰方面和天然人胶原有显著的差别。临床安全性还有待进一步证实。
人胎盘胶原含量丰富，同时含有多种类型的胶原，如成纤维类I、III型胶原和基底膜 IV型胶原。人胎盘来源的天然人胶原的使用可以克服动物源胶原、重组人胶原和重组类人胶原的以上所述的各种风险，具有更高的安全性。
已有的人胎盘胶原的制备方法都涉及到先利用胃蛋白酶在酸性低盐条件下消化提取，提取物中含有人胎盘中所有的各型胶原，然后利用各种方法分离不同类型的胶原。刘秉慈以人胎盘为原料，经胃蛋白酶在0.5MHAC中消化提取，盐析后获取沉淀A，进一步酸性盐提取获得沉淀B，将两种沉淀以不同比例混合并加入生长激素和利多卡因后用于填充小型凹陷性皮肤缺损(中国发明专利，公告号：CN1081379)。林海以人胎盘为原料，经胃蛋白酶在0.2-0.8M HAC中消化提取，然后分级盐析，分离各类型的胶原(中国发明专利，公告号：CN103525890B)。Carl Randall Harrell以人胎盘为原料，经胃蛋白酶在0.5M HAC 中消化提取，然后分级盐析，选择性分离各类型的胶原(US Pub.No.：US 2012/0189586 A1)。Jean-Louis Tayot以人胎盘为原料，清洗后经胃蛋白酶在0.05M柠檬酸溶液中消化溶解胎盘各类型胶原，然后利用浓碱溶液中和消化组织分离IV型胶原，之后继续用胃蛋白酶消化和和分级盐析，分离I型和III型胶原(USPat.No.：5436135)。到现在为止，尚无文献资料以人胎盘为原料利用选择性酶消化直接提取胎盘各类型胶原生产方法的报道。建立无需冗长生产过程的选择性酶消化直接分类提取人胎盘各类胶原的生产方法，对于重复可控生产人胎盘胶原医用生物材料具有重要意义。
本发明描述了人胎盘不同类型胶原的选择性提取制备方法和使用方法，使用方法包括修复、增强和代***组织。
3.发明内容
3.1.定义
当在本文中使用时，以下术语具有下列含义：
″胶原″指本领域技术人员已知的任何胶原。
人胎盘“纤维胶原”，主要由I型胶原和III型胶原组成，包括I型胶原分子和它的多聚体，III型胶原分子和它的多聚体以及I型胶原分子和III型胶原分子的共聚体。I 型胶原是异三聚分子，含有两条α1(I)链和一条α2(I)链，“III型胶原”是纤维胶原。III型胶原是同三聚胶原，含有三条相同的α1(III)链。
“基底膜IV型胶原”是以片层而不是纤维的形式存在于基底膜中，IV型胶原最常见含有两条α1(IV)链和一条α2(IV)链，组成IV型胶原的具体链是组织特异性的。
“生物相容性”指在活体组织中不产生毒性、损伤或免疫反应或排斥从而具有生物可相容的性质。当在身体中使用人造材料时，身体对未知材料的应答是主要关心的问题，因此材料的生物相容性是对这类材料而言重要的设计考量。
3.2.发明的实施方式
本发明涉及一种人胎盘不同类型胶原的选择性提取制备方法和使用方法，使用方法包括修复、增强和代替哺乳动物组织。
3.2.1.人胎盘胶原选择性制备方法
在实施方式中，本发明提供人胎盘不同类型胶原的选择性提取制备方法。以人胎盘组织为原料，依次进行组织预处理、选择性酶消化提取、盐沉淀的步骤，分别获得含有人I型和III型的纤维胶原和基底膜IV型胶原。
在本发明的方法中使用的胎盘在分娩出婴儿后尽快采集。在另一特定的实施方式中，所述胎盘在剖腹产分娩出正常健康婴儿后立即采集。在一些实施方式中，在任何进一步处理之前，所述胎盘从分娩开始保存48-120小时。可将胎盘从分娩或产房运送到另一个地点，例如实验室，以进一步处理。在其它实施方式中，所述胎盘被冷藏，直到进一步处理，即在约2°～8℃的温度下保存。在其它实施方式中，所述胎盘被冷冻储藏，直到进一步处理。即在约-20°～-80℃的温度下保存。本发明包含在生产之前使用本领域技术人员已知的标准技术对孕妇进行传染性疾病，包含但不限于HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV和已知会感染胎盘组织的其它病毒性病原体的筛选。
所述实施方式中人胎盘组织可以是完整的胎盘或可以选自胎盘的任意部分，如羊膜、绒毛膜及脐带。
通过所述实施方式预处理步骤可以根据本领域技术人员已知的方法对胎盘组织进行病毒灭活处理、清洗和破碎。
通过所述实施方式选择性酶消化提取，在一些实施方式中，是将预处理后的破碎人胎盘组织悬浮浸泡于选择性酶消化液I中，所述选择性消化液I为含有胃蛋白酶的有机弱酸盐溶液，pH值在1.5-3.0。胃蛋白酶浓度为0.1-5g/L，有机弱酸为醋酸(HAC)，其浓度为0.2-0.8mol/L，氯化钠浓度为0.7-1.0mol/L。所述消化液的量为人胎盘组织固体重量的5-10倍，在0°-10℃低温条件下连续搅拌消化10-48h 后，离心分离取上清液和沉淀。上清液用浓氢氧化钠中和备用(上清液I)，将沉淀搅拌悬浮于选择性酶消化液II中，所述选择性消化液II为含有胃蛋白酶的酸性盐溶液，pH值在1.5-3.0。胃蛋白酶浓度为0.1-5g/L，醋酸(HAC)浓度为 0.2-0.8mol/L。所述消化液的量为人胎盘组织固体重量的5-10倍，在0°-10℃低温条件下连续搅拌消化24-48h后，离心分离取上清液，上清液用浓氢氧化钠中和备用(上清液II)。在进一步选择性酶消化提取实施方式中，选择性酶消化液I 和II中，所用的有机弱酸可以为柠檬酸。
在另一些选择性酶消化提取实施方式中，是将预处理后的破碎人胎盘组织悬浮浸泡于选择性酶消化液I中，所述选择性消化液I为含有胃蛋白酶的有机酸性盐溶液， pH值在1.5-3.0。胃蛋白酶浓度为0.1-5g/L，有机弱酸通过用浓盐酸调节有机弱酸盐溶液pH值至形成。有机弱酸盐为醋酸钠，其浓度为0.2-0.8mol/L，氯化钠浓度为0.7-1.0mol/L。用浓盐酸调节pH值至1.5-3.0。所述消化液的量为人胎盘组织固体重量的5-10倍，在0°-10℃低温条件下连续搅拌消化10-48h后，离心分离取上清液和沉淀。上清液用浓氢氧化钠中和备用(上清液I)，将沉淀搅拌悬浮于选择性酶消化液II中，所述选择性消化液II为含有胃蛋白酶的酸性盐溶液，pH值在1.5-3.0。胃蛋白酶浓度为0.1-5g/L，醋酸(HAC)浓度为0.2-0.8mol/L。所述消化液的量为人胎盘组织固体重量的5-10倍，在0°-10℃低温条件下连续搅拌消化24-48h后，离心分离取上清液，上清液用浓氢氧化钠中和备用(上清液II)。在进一步选择性酶消化提取实施方式中，选择性酶消化液I和II中，所用的有机弱酸盐可以为柠檬酸钠和柠檬酸钾。
通过所述实施方式盐沉淀从选择性酶消化提取出上清液I分离纯化基底膜IV型胶原。盐沉淀可以根据本领域技术人员已知的方法实施
通过所述实施方式盐沉淀从选择性酶消化提取出上清液II分离纯化含有I型和III 型胶原的纤维胶原。盐沉淀可以根据本领域技术人员已知的方法实施。
通过所述实施方式盐沉淀从选择性酶消化提取出上清液II分别分离纯化I型和III 型胶原。盐沉淀可以根据本领域技术人员已知的方法实施。
3.2.2.人胎盘胶原应用
利用本发明生产的人胎盘胶原纤维和基底膜IV型胶原，可根据临床用途需要单独使用或联合使用。
利用本发明生产的人胎盘胶原蛋白可以单独或和聚合物结构一起冷冻干燥制成海绵状材料。该胶原蛋白也可以单独或和聚合物结构一起经过常规已报道的方法制成薄膜或网状结构。该胶原蛋白也可以单独或和聚合物结构一起通过常规已报道的方法制成注射胶。此外，利用本发明生产的人胎盘胶原蛋白可以纺成纤维。在另一个实施例中，该胶原蛋白也可以单独或和聚合物结构一起制成管状结构。管状结构可单独或与相应细胞结合作为血管、神经和腺体管道和泌尿***重建的构建材料。
该胶原蛋白也可以单独或和聚合物结构一起制成注射胶，可用于软组织缺陷修复和填充，如皮肤除皱注射胶。
利用本发明生产的人胎盘胶原蛋白可用于组织工程和内脏器官再生，如肾脏、肝脏、脾脏和膀胱。也可用于骨骼组织的修复和再生，如骨骼、软骨和肌腱。其它用途包括软组织加固和修复如硬脑膜移植、疝修补术、盆底修复，神经再生如管状结构外周神经再生，组织加固如细胞和生物活性物质的传递、慢性创面修复和骨修复。
在一个实施方式中，利用本发明生产的人胎盘胶原蛋白可以制作成多孔支架，在支架中播种自体或异体细胞和组织碎片，如脂肪组织衍生干细胞和骨髓干细胞。载有细胞的支架具有组织再生和修复的作用。
利用本发明生产的人胎盘胶原蛋白可以与化学合成结构相结合，制成复合加固结构。例如，它可用作植入哺乳动物体内的支架结构，如用于组织修复的支架。它可以进一步和生物活性物质结合如细胞、生物小分子、生物大分子和组织碎片。
在另一个实施方式中，生物活性化合物及制剂可以纳入利用本发明生产的人胎盘胶原蛋白制成的注射胶、膜、网状结构，海绵状材料和组织支架。生物活性化合物及制剂可以根据其应用效应选择，这些效应包括促进或加速愈合的化合物或制剂、预防感染的化合物或制剂(如抗菌剂和抗生素)、减少炎症的化合物或制剂(如消炎药)，防止或最大限度地减少粘附形成的化合物，调节免疫***(如免疫抑制剂)的化合物或制剂。
在另一个实施方式中，生物活性大分子和制剂可以纳入利用本发明生产的人胎盘胶原蛋白制成的注射胶、膜、网状结构，海绵状材料和组织支架。生物活性大分子化和制剂可以根据其应用效应选择，这些生物活性大分子和制剂包括异源或自体生长因子、蛋白质(包括基质蛋白)、肽、抗体、酶、血小板、血小板丰富的血浆、糖蛋白、激素、细胞因子、糖胺多糖、核酸、病毒、病毒颗粒及其组合。也包括以下一种或多种生物大分子及制剂：上皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子 (HGF)、血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(如bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素衍生生长因子(如IGF-1、IGF-II)和转化生长因子(如 TGF-β)、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关肽、骨形态形成蛋白(如BMP-2、BMP-4：BMP-6)。BMP-12)、生长分化因子(如GDF5、GDF6、GDF8)、替那西金-c、透明质酸、硫酸软骨素、纤维连接蛋白、装饰素、血栓素、凝血酶衍生肽、肝素、硫酸肝素、DNA片段和DNA质粒。
这些用途和应用是利用本发明生产的人胎盘胶原蛋白的几个用途例证，不应被解释为它的用途仅局限于此。
4.附图说明
附图1为本发明所述的实施举例5中制备的胶原纤维的透射电子显微镜分析结果
5.具体实施方式
实施例1：选择性人胎盘IV型胶原提取制备
将疫病检测合格的人胎盘，冷冻储存，使用前4C下解冻，用纯水和0.05M柠檬酸钠，pH7.2溶液清洗。然后切碎，在10g搅碎的胎盘组织中加入50ml 0.5M HAC、0.7MNaCl、 1mg/ml pepsin，搅拌条件下消化过夜。高速离心，收集上清液。用10MNaOH中和至pH7.2， 4℃下过夜。离心分别收集沉淀物和上清液，上清液超滤浓缩至蛋白含量为0.5mg/ml左右。然后用500ml 0.05MTris、1.8MNaCl、pH7.5透析过夜。离心收集沉淀物。将沉淀物溶于0.05MTris、0.2MNaCl、pH7.5的溶液中后用纯水透析。冷冻干燥后密封4℃下保存。
实施例2：选择性人胎盘纤维胶原提取制备
胎盘组织经过实施例1酶消化提取后，加入50ml 0.5MHAC、1mg/ml pepsin，搅拌条件下消化48小时。高速离心，收集上清液。用10MNaOH中和至pH7.2，4℃下过夜。离心去除沉淀物，然后用500ml 0.5MHAC、0.7MNaCl、pH3.0透析过夜两次。离心收集沉淀物。将沉淀物溶于10mMHCl的溶液中。用10mMHCL透析后，密封4℃下保存。
实施例3：选择性人胎盘I型和III型胶原分离提纯
将实施例2提取的纤维胶原溶液用0.05M Tris、1.8MNaCl、pH 7.4透析过夜。离心收集沉淀物。将沉淀物溶于10mMHCl的溶液中。用10mMHCL透析后，密封4℃下保存。将上清液用10mMHCL透析后，密封4℃下保存。
实施例4：人胎盘胶原脯氨酸和脯氨酸羟基化水平分析
将实例2所制备的胶原溶液根据常规方法高温强酸完全水解，水解后产物用AQC衍生试剂衍生。然后利用超快速液相色谱/Rapid Separation LC(Shimazu日本，LC-20AXR)和串联四极杆质谱LC-MS/MS(AB SCIEX美国，Qtrap5500)分离分析。结果发现脯氨酸羟基化水平【羟脯氨酸基含量/(脯氨酸含量+羟脯氨酸含量)】为53.3％+/-1.0％。
实施例5：人胎盘纤维胶原成纤维化
将真空干燥的人胎盘纤维胶原蛋白用10mM HCl调至0.1mg/ml，将0.5ml稀释后的胶原溶液用100ml 0.02M Na2PO4、pH 7.2溶液室温下透析过夜(透析膜100KD)。收集胶原纤维悬浮液于1.5ml微量离心管中，透射电子显微镜分析。
实施例6：人胎盘胶原成纤维透射电子显微镜分析
将实施例5制备的胶原纤维悬浮液滴在覆有滤纸的蜡块上，将涂有薄炭膜的载网(中镜科仪)碳膜面平放于胶原纤维悬浮液滴上，3min后取下碳膜，滴加1％磷钨酸在覆有滤纸的蜡块上对取下的涂有薄炭膜的载网同方法染色3min，水洗染色两次各2min。然后用透射电子显微镜在30,000放大倍数下观察。胶原纤维的透射电子显微镜图像如附图所示。
Claims (20)
1.一种选择性提取制备人胎盘不同类型胶原的方法。
2.权利要求1所说的人胎盘不同类型胶原，是指人胎盘I型纤维胶原、人胎盘III型纤维胶原和人胎盘基底膜IV型胶原，权利要求1所说的一种选择性提取制备方法，是先在酸性盐溶液条件下用胃蛋白酶选择性提取基底膜IV型胶原，然后使用已报道的提取方法。
3.权利要求2所说酸性盐溶液条件下的pH值在1.5-3.0之间。
4.权利要求3所说酸性盐溶液条件的pH，调节pH所用的是有机弱酸，包括醋酸和柠檬酸。
5.权利要求3所说酸性盐溶液条件的pH，调节pH所用的是盐酸和有机弱酸盐，包括醋酸钠和柠檬酸钠。
6.权利要求2所说酸性盐溶液条件下的盐是氯化钠。
7.权利要求6所说酸性盐溶液条件下的氯化钠浓度在0.7mol/L至1.0mol/L之间。
8.权利要求1所说的一种选择性提取制备人胎盘不同类型胶原的方法，是首先选择性提取IV型胶原后，再应用胃蛋白酶酸性低盐溶液条件下提取含有I和III型胶原的纤维胶原，然后使用已报道的提纯方法。
9.权利要求8所说酸性低盐溶液条件的pH值在1.5-3.0之间。
10.权利要求9所说酸性低盐溶液条件的pH，调节pH所用的是有机弱酸，包括醋酸和柠檬酸。
11.权利要求9所说酸性低盐溶液条件的pH，调节pH所用的是盐酸和有机弱酸盐，包括醋酸钠和柠檬酸钠。
12.权利要求8所说酸性低盐溶液的盐是醋酸钠和氯化钠。
13.权利要求12所说酸性低盐溶液条件下的醋酸钠和氯化钠的浓度在0.0mol/L-0.5mol/L之间。
14.权利要求8所说的选择性提取的纤维胶原是使用已报道的方法分离制备I型纤维胶原、III型纤维胶原。
15.权利要求8所说的人胎盘IV型胶原使用方法是修复、增强和代***组织。
16.权利要求8所说的人胎盘纤维胶原使用方法是修复、增强和代***组织。
17.权利要求14所说的人胎盘I型纤维胶原、III型纤维胶原使用方法是修复、增强和代***组织。
18.权利要求2所说的人胎盘IV类型胶原使用方法，是并包括作为修复、增强和代***组织的生物材料和高分子生物材料、活性蛋白质、小分子药物、基因表达结构或哺乳动物细胞联合使用。
19.权利要求8所说的人胎盘纤维胶原使用方法，是并包括作为修复、增强和代***组织的生物材料和高分子生物材料、活性蛋白质、小分子药物、基因表达结构或哺乳动物细胞联合使用。
20.权利要求14所说的人胎盘I型纤维胶原、III型纤维胶原使用方法，是并包括作为修复、增强和代***组织的生物材料和高分子生物材料、活性蛋白质、小分子药物、基因表达结构或哺乳动物细胞联合使用。
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