CN111566126A - Pac1抗体及其用途 - Google Patents

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M·L·迈克尔斯
C·莫尔
D·E·皮帕
K·W·沃尔克
Z·王
C·许
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Abstract

本发明涉及人垂体腺苷酸环化酶激活多肽I型受体(PAC1)的中和抗体，以及包含此类抗体的药物组合物。还描述了使用这些中和抗体治疗或预防头痛病况如偏头痛和丛集性头痛的方法。

Description

PAC1抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年1月12日提交的美国临时申请号62/617,157的权益，将其通过引用以其全部内容并入本文。
以电子形式递交的文本文件的说明书
本申请含有一份已经以ASCII格式电子递交的序列表并且将该序列表通过引用以其全文特此结合。于2018年12月20创建的序列表的计算机可读格式的拷贝，被命名为A-2189-WO-PCT_SeqList_ST25，大小为490千字节。
技术领域
本发明涉及生物制药领域。特别地，本发明涉及特异性地结合人垂体腺苷酸环化酶激活多肽I型受体(PAC1)并有效抑制其生物活性的抗体。本发明还涉及包含这些抗体的药物组合物，以及生产和使用这些抗体的方法。
背景技术
偏头痛是可涉及明显疼痛的发作性头痛，常伴有恶心、呕吐、以及对光(畏光)和声音(声音恐怖症)极度敏感，并且有时会有事先感觉告警症状或体征(先兆)。偏头痛是世界范围内非常普遍的疾病，其中约12％的欧洲人口，并且美国18％的女性，6％的男性患有偏头痛发作(Lipton等人,Neurology[神经病学],第68卷:343-349,2007；Lipton等人,Headache[头痛],第41卷:646-657,2001)。一项评估美国偏头痛患病率的研究报告称，近一半的偏头痛患者群体每月有三次或更多次偏头痛(Lipton等人,Neurology[神经病学],第68卷:343-349,2007)。此外，偏头痛与许多精神病和医学合并症(如抑郁症和血管疾病)有关(Buse等人,J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry[神经病学神经外科和精神病学杂志],第81卷:428-432,2010；Bigal等人,Neurology[神经病学],第72卷:1864-1871,2009)。目前大多数偏头痛治疗要么耐受不良要么无效(Loder等人,Headache[头痛],第52卷:930-945,2012；Lipton等人,2001)；因此偏头痛仍然存在未得到满足的医疗需求。
偏头痛发病机理的一个主要组成部分涉及三叉神经血管***的活化。从血管周围神经纤维释放的三叉神经和副交感神经递质(Sánchez-del-Rio和Reuter,Curr.Opin.Neurol.[神经病学新见],第17卷(3):289-93,2004)导致颅血管的血管舒张，并且已被认为与偏头痛的发作有关(Edvinsson,Cephalagia[头痛杂志],第33卷(13):1070-1072,2013；Goadsby等人,NewEnglJMed.[新英格兰医学杂志],第346卷(4):257-270,2002)。
因在垂体前叶细胞中刺激环AMP(环腺苷酸，cAMP)形成的能力而得名的垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)是首先分离自绵羊下丘脑提取物的38-氨基酸(PACAP38)或27-氨基酸(PACAP27)肽(Miyata等人,Biochem Biophys Res Commun.[生物化学与生物物理研究通讯],第164卷:567-574,1989；Miyata等人,Biochem Biophys Res Commun.[生物化学与生物物理研究通讯],第170卷:643-648,1990)。PACAP属于VIP/促胰液素/胰高血糖素超家族。PACAP27的序列对应于PACAP38的27N末端氨基酸并与血管活性肠多肽(VIP)共享68％的同一性(Pantaloni等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],第271卷:22146-22151,1996；Pisegna和Wank,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],第90卷:6345-49,1993；Campbell和Scanes,Growth Regul.[生长调节杂志],第2卷:175-191,1992)。人体中PACAP肽的主要形式是PACAP38，并且PACAP38的药理学尚未显示出与PACAP27的药理学不同。已经报道了三种PACAP受体：以高亲和力结合PACAP并对VIP(PAC1受体)具有低得多的亲和力的一种受体，以及同样好地识别PACAP和VIP的两种受体(VPAC1和VPAC2受体)(Vaudry等人,Pharmacol Rev.[药理学评论],第61卷:283-357,2009)。
使用PACAP作为激发剂(challenge agent)诱导偏头痛样头痛的人类实验性偏头痛模型支持用于拮抗PACAP/PAC1信号传导途径作为偏头痛预防的治疗方法。在偏头痛患者的自发性偏头痛发作期间，PACAP38在血浆中升高，并且用舒马曲坦(一种急性偏头痛疗法)可以使这些升高的PACAP38水平正常化(Tuka等人,Cephalalgia[头痛杂志],第33卷:1085-1095,2013；Zagami等人,Ann.Clin.Transl.Neurol.[临床和转化神经病学年鉴],第1卷:1036-1040,2014)。PACAP38的输注导致健康受试者的头痛和偏头痛患者的偏头痛样头痛(Schytz等人,Brain[脑],第132卷:16-25,2009；Amin等人,Brain[脑],第137卷:779-794,2014；Guo等人,Cephalalgia[头痛杂志],第37卷:125-135,2017)。然而，在相同的模型中，在偏头痛患者中VIP不引起偏头痛样头痛(Rahmann等人,Cephalalgia[头痛杂志],第28卷:226-236,2008)。VIP输注不诱导偏头痛样头痛表明，PACAP38肽的作用是通过PAC1受体而不是VPAC1或VPAC2受体介导的，因为VIP在后两种受体处具有高得多的亲和力。这一概念得到动物研究的进一步支持，其中PAC1受体拮抗剂在偏头痛的体内模型中抑制三叉神经颈复合体中的伤害感受性神经元活性(Akerman等人,Sci.Transl.Med.[科学转化医学期刊],第7卷:308ra157,2015；Hoffmann等人,Cephalalgia[头痛杂志],第37卷(1S):3,摘要OC-BA-004,2017)。总之，这些数据表明抑制PAC1受体的PACAP激活的药理学试剂具有治疗偏头痛的潜力。
发明内容
本发明部分地基于特异性地结合人PAC1并有效地抑制人PAC1的高亲和力抗体的设计和产生。与先前所描述的抗PAC1抗体相比，本发明的这些抗体对人PAC1具有增强的抑制效力，其中IC50值在皮摩尔范围内。分离的抗体及其抗原结合片段可用于抑制、干扰或调节人PAC1的生物活性，包括抑制或减少PACAP诱导的PAC1激活、抑制或减少血管舒张、以及改善或治疗偏头痛和其他血管性头痛的症状。
在一些实施例中，这些分离的抗体及其抗原结合片段在表位处特异性地结合人PAC1，该表位包括选自以下的一个或多个氨基酸：SEQ ID NO:1的Asp59、Asn60、Ile61、Arg116、Asn117、Thr119、Glu120、Asp121、Gly122、Trp123、Ser124、Glu125、Pro126、Phe127、Pro128、His129、Tyr130、Phe131、Asp132和Gly135。在某些实施例中，该表位至少包含人PAC1的氨基酸Asn60、Ile61、Glu120和Asp121。在这些和其他实施例中，本发明的这些抗体和抗原结合片段包含位于轻链和重链可变区内特定位置处、与这些表位残基相互作用的特定氨基酸。例如，在一个实施例中，这些抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，其中根据AHo编号在位置29处的氨基酸是与人PAC1的氨基酸Glu120或Asp121相互作用的碱性氨基酸(例如，精氨酸或赖氨酸)。在另一个实施例中，这些抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其中根据AHo编号在位置61处的氨基酸是与人PAC1的氨基酸Asn60或Ile61相互作用的疏水、碱性、或中性亲水氨基酸(例如，异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)。在又另一个实施例中，这些抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其中根据AHo编号在位置66处的氨基酸是与人PAC1的氨基酸Asn60或Ile61相互作用的碱性或中性亲水氨基酸(例如，谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)。
本发明的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段可以抑制配体诱导的PAC1受体的激活。例如，在一些实施例中，这些抗PAC1抗体和抗原结合片段抑制PACAP诱导的人PAC1的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于500pM。在其他实施例中，这些抗PAC1抗体和抗原结合片段抑制PACAP诱导的人PAC1的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于300pM。在某些实施例中，这些抗PAC1抗体和抗原结合片段抑制PACAP诱导的人PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50在约50pM和约500pM之间。
在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段与来自其他物种的PAC1受体交叉反应。在一个实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段特异性地结合并抑制PACAP诱导的食蟹猴PAC1受体的激活。在这样的实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段可以抑制PACAP诱导的食蟹猴PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50在约0.1nM和约1nM之间或在约50pM和约500pM之间。在另一个实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段特异性地结合并抑制PACAP诱导的大鼠PAC1受体的激活。这些抗PAC1抗体或抗原结合片段可以抑制PACAP诱导的大鼠PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于10nM，例如其中IC50在约0.1nM和约10nM之间或在约100pM和约2nM之间。
在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3，重链可变区包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3。这些轻链可变区和重链可变区或CDR可以来自任何本文所描述的抗PAC1抗体。例如，在一些实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：CDRL1，其包含选自SEQ ID NO:5-16的序列；CDRL2，其包含SEQ ID NO:26的序列；CDRL3，其包含选自SEQ IDNO:36-38的序列；CDRH1，其包含选自SEQ ID NO:88-96的序列；CDRH2，其包含选自SEQ IDNO:106-166的序列；和CDRH3，其包含选自SEQ ID NO:171-177的序列。在其他实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：CDRL1，其包含选自SEQ ID NO:17-25的序列；CDRL2，其包含选自SEQ ID NO:27-35的序列；CDRL3，其包含选自SEQ ID NO:39-51的序列；CDRH1，其包含选自SEQ ID NO:97-105的序列；CDRH2，其包含选自SEQ ID NO:167-170的序列；和CDRH3，其包含选自SEQ ID NO:178-190的序列。
在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:54-66和SEQ ID NO:68-87的序列具有至少90％同一性或至少95％同一性的序列。在这些和其他实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与选自SEQ ID NO:191-312的序列具有至少90％同一性或至少95％同一性的序列。在一个实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包含选自SEQ ID NO:54-66的序列，重链可变区包含选自SEQ ID NO:191-295的序列。在另一个实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包含选自SEQ ID NO:68-87的序列，重链可变区包含选自SEQ ID NO:296-312的序列。
在本文所述的任一实施例中(包括以上所描述的实施例)，本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，该单克隆抗体或其抗原结合片段是嵌合的抗体或其抗原结合片段。在其他实施例中，该单克隆抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。在又其他的实施例中，该单克隆抗体或其抗原结合片段是全人源抗体或其抗原结合片段。该单克隆抗体可以是任何同种型的，例如人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。在一个具体的实施例中，该单克隆抗体是人IgG1抗体。在另一个具体是实施例中，该单克隆抗体是人IgG2抗体。该单克隆抗体可以包括含有人κ恒定区的轻链。在一些实施例中，该人κ恒定区包含SEQ ID NO:318或SEQ ID NO:319的序列。因此，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段可以包含轻链，该轻链包含在表1A中列出的融合至人κ恒定区的任何轻链可变区序列，该人κ恒定区包含SEQ ID NO:318或SEQ ID NO:319的序列。在其他实施例中，该单克隆抗体可以包括含有人λ恒定区的轻链。在某些实施例中，该人λ恒定区包含SEQ ID NO:315的序列。因此，在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段可以包含轻链，该轻链包含在表1A中列出的融合至人λ恒定区的任何轻链可变区序列，该人λ恒定区包含SEQ ID NO:315的序列。
在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段可以包含影响抗体或抗原结合片段糖基化的一个或多个修饰。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段包含一个或多个突变以减少或消除糖基化。在这样的实施例中，该未糖基化的抗体可以包含在其重链中氨基酸位置N297(根据EU编号方案)处的突变，例如N297G突变。该未糖基化的抗体可以包含另外的突变从而使抗体结构稳定。这样的突变可以包括半胱氨酸取代对，例如A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C、以及V323C和I332C(根据EU编号方案的氨基酸位置)。在一个实施例中，该未糖基化的抗体在其重链上包含R292C和V302C突变(根据EU编号方案)。在某些实施例中，该未糖基化的抗PAC1抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含SEQID NO:324或SEQ ID NO:325的氨基酸序列。
本发明还包括分离的多核苷酸，和编码本文所述的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段的表达载体，以及包含编码多核苷酸和表达载体的宿主细胞(例如CHO细胞)。在某些实施例中，本发明包括用于产生本文所述的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段的方法。在一个实施例中，该方法包括在允许抗体或抗原结合片段表达的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码抗PAC1抗体或抗原结合片段的表达载体；以及从培养基或宿主细胞中回收该抗体或抗原结合片段。
本文所述的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段可以在用于治疗或预防与PAC1生物活性相关的病情(例如头痛、偏头痛、丛集性头痛和血管舒张症状)的药物组合物或药物的生产中使用。因此，本发明还提供了包含本文所述的抗PAC1抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。该药物组合物可用于本文所述的任何方法中。
在某些实施例中，本发明提供了用于在有需要的患者中治疗或预防头痛病况的方法，这些方法包括向该患者给予有效量的本文所述的抗PAC1抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，用本发明的方法待治疗或预防的头痛病况是偏头痛。该偏头痛可以是发作性偏头痛或慢性偏头痛。在其他实施例中，用本发明的方法待治疗或预防的头痛病况是丛集性头痛。在某些实施例中，这些方法提供了针对这些病情的预防性治疗。
在本发明的这些方法的一些实施例中，这些方法包括将第二头痛治疗剂与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予患者。第二头痛治疗剂可以是急性头痛治疗剂，例如血清素受体激动剂(例如，5HT1B、5HT1D和/或5HT1F血清素受体的激动剂)。在一些实施例中，该急性头痛治疗剂是曲坦(triptan)、麦角胺、非甾体抗炎药或阿片样物质。在其他实施例中，与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予的该第二头痛治疗剂是预防性头痛治疗剂(例如，抗癫痫药、β-受体阻滞剂、抗抑郁剂或肉毒杆菌素A(onabotulinum toxinA))。该第二头痛治疗剂可以在本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段之前、之后或同时给予患者。
在本发明的方法的某些实施例中，这些方法包括将CGRP途径拮抗剂与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予患者。该CGRP途径拮抗剂可以是人CGRP受体拮抗剂，例如特异性地结合人CGRP受体的抗体。在一个实施例中，与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予的CGRP途径拮抗剂是厄瑞奴单抗(erenumab)。在其他实施例中，该CGRP途径拮抗剂可以是CGRP配体的拮抗剂，例如特异性地结合人α-CGRP和/或β-CGRP的抗体。在一个这样的实施例中，与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予的CGRP途径拮抗剂是瑞玛奈珠单抗(fremanezumab)。在另一个这样的实施例中，与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予的CGRP途径拮抗剂是伽奈珠单抗(galcanezumab)。在又另一个这样的实施例中，与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予的CGRP途径拮抗剂是依普奈珠单抗(eptinezumab)。
本发明还包括在有需要的患者中抑制血管舒张的方法。在一个实施例中，该方法包括向患者给予有效量的本文所述的任何这些抗PAC1抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，对治疗有需要的患者患有头痛病况(例如，偏头痛或丛集性头痛)。在其他实施例中，该对治疗有需要的患者患有例如与更年期相关的那些血管舒张症状(例如，热潮红、面部潮红、出汗和盗汗)。
特别考虑了在本文披露的任何方法中或根据本文披露的任何方法用于药物制备的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段的用途。例如，本发明包括用于在有需要的患者中治疗或预防头痛病况的方法中使用的抗PAC1抗体或抗原结合片段。该头痛病况包括偏头痛(例如，发作性和慢性偏头痛)和丛集性头痛。在一些实施例中，本发明提供了用于在有需要的患者中抑制血管舒张的方法中使用的抗PAC1抗体或抗原结合片段。在这样的实施例中，该患者可以被诊断为具有或患有头痛病况。在其他实施例中，本发明提供了用于在患有头痛病况的患者中抑制人PAC1受体激活的方法中使用的抗PAC1抗体或抗原结合片段。该头痛病况可以是偏头痛(例如，发作性或慢性偏头痛)或丛集性头痛。
本发明还包括抗PAC1抗体或抗原结合片段在制备用于治疗或预防有需要的患者的头痛病况的药物中的用途。该头痛病况包括偏头痛(例如，发作性和慢性偏头痛)和丛集性头痛。在某些实施例中，本发明涵盖抗PAC1抗体或抗原结合片段在制备用于在有需要的患者中抑制血管舒张的药物中的用途。在这样的实施例中，该患者可以被诊断为具有或患有头痛病况。在其他实施例中，本发明包括抗PAC1抗体或抗原结合片段在制备用于在患有头痛病况的患者中抑制人PAC1受体激活的药物中的用途。该头痛病况可以是偏头痛(例如，发作性或慢性偏头痛)或丛集性头痛。
附图说明
图1A是人PAC1胞外结构域(ECD)和29G4v9抗体的Fab片段之间的复合物的晶体结构的前视图。VL＝轻链可变区；CL＝轻链恒定区；VH＝重链可变区；并且CH1＝重链CH1恒定区。
图1B是人PAC1 ECD和29G4v9抗体的Fab片段之间的复合物的晶体结构的侧视图。该图描绘了图1A所示结构向左侧旋转90°。在该图中，轻链可变区(VL)位于重链可变区(VH)的后面，并且轻链恒定区(CL)位于重链CH1恒定区的后面。
图2A是人PAC1 ECD与29G4v9 Fab的轻链CDR1(SEQ ID NO:3的氨基酸24至34)之间界面的展开图。区1包含人PAC1 ECD(SEQ ID NO:1)的Glu120和Asp121残基，而区域3包含人PAC1 ECD的Phe127残基。
图2B是人PAC1 ECD与29G4v9 Fab的轻链CDR3中的Arg93残基之间界面的展开图。
图3A是人PAC1 ECD与29G4v9 Fab的重链CDR1氨基酸Arg31和Phe32之间界面的展开图。这两个重链CDR1氨基酸位于人PAC1ECD的Phe131残基的任意侧。
图3B是包含氨基酸残基Asn60和Ile61的人PAC1 ECD的区(相对于SEQ ID NO:1)与29G4v9 Fab的重链CDR2氨基酸Tyr53、Asp54和Gly56之间界面的展开图。
图3C是人PAC1 ECD与29G4v9 Fab的重链CDR3氨基酸Val102、Leu103和Thr104之间界面的展开图。
图4是针对来自酵母展示抗体Fab突变体文库的改进的结合突变体的选择方法的示意图。
图5是针对来自酵母展示文库的高亲和力结合突变体的结合解离速率驱动选择过程的示意图。
图6显示了抗PAC1抗体对maxadilan诱导的大鼠皮肤血流增加的抑制作用。在用10ng maxadilan(皮内注射)激发之前二十四小时，将七种抗体(420653、420845、420943、421873、420889(PL-50347)、421091(PL-50350)和421051(PL-50351))中的一种按0.1mg/kg或0.3mg/kg的剂量经静脉内给予大鼠。用激光多普勒成像进行maxadilan激发30分钟后评估皮肤血流。用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，随后用邓尼特多重比较检验(Dunnett'sMCT)与媒介物组相比较，*p<0.05，**p<0.01。
图7A显示了抗PAC1抗体420653对maxadilan诱导的大鼠皮肤血流的剂量依赖性效应。在用10ng maxadilan(皮内注射)激发之前二十四小时，将抗体按从0.01mg/kg至3mg/kg范围的七种剂量之一经静脉内给予大鼠。用激光多普勒成像进行maxadilan激发30分钟后评估皮肤血流。用单因素方差分析，随后用邓尼特多重比较检验与媒介物组相比较，*p<0.05，****p<0.0001。
图7B显示了抗PAC1抗体420845对maxadilan诱导的大鼠皮肤血流的剂量依赖性效应。在用10ng maxadilan(皮内注射)激发之前二十四小时，将抗体按从0.01mg/kg至3mg/kg范围的五种剂量之一经静脉内给予大鼠。用激光多普勒成像进行maxadilan激发30分钟后评估皮肤血流。用单因素方差分析，随后用邓尼特多重比较检验与媒介物组相比较，****p<0.0001。
图7C显示在大鼠中抗PAC1抗体的420943对maxadilan诱导的皮肤血流增加的剂量依赖性效应。在用10ng maxadilan(皮内注射)激发之前二十四小时，将抗体按从0.1mg/kg至30mg/kg范围的六种剂量之一经静脉内给予大鼠。用激光多普勒成像进行maxadilan激发30分钟后评估皮肤血流。用单因素方差分析，随后用邓尼特多重比较检验与媒介物组相比较，****p<0.0001。
图7D显示在大鼠中抗PAC1抗体的421873对maxadilan诱导的皮肤血流增加的剂量依赖性效应。在用10ng maxadilan(皮内注射)激发之前二十四小时，将抗体按从0.3mg/kg至30mg/kg范围的五种剂量之一经静脉内给予大鼠。用激光多普勒成像进行maxadilan激发30分钟后评估皮肤血流。用单因素方差分析，随后用邓尼特多重比较检验与媒介物组相比较，*p<0.05，****p<0.0001。
图8A是在大鼠中单剂量静脉内给予1mg/kg后，抗PAC1抗体420653、420845、420943和421873的血清浓度-时间曲线。
图8B是在大鼠中单剂量静脉内给予5mg/kg后，抗PAC1抗体420653、420845、420943和421873的血清浓度-时间曲线。
图8C是在大鼠中单剂量静脉内给予25mg/kg后，抗PAC1抗体420653、420845、420943和421873的血清浓度-时间曲线。
图9是在食蟹猴中单剂量静脉内给予10mg/kg后，抗PAC1抗体420653、420845、420943、421873和29G4v22的血清浓度-时间曲线。
图10A和10B显示抗PAC1抗体420653和29G4v22对maxadilan诱导的食蟹猴中皮肤血流增加的抑制效果的时程。在第0天，按0.1mg/kg或3mg/kg的抗体420653或按10mg/kg的抗体29G4v22以单次静脉内推注注射给予24只食蟹猴。在给予抗体后第2、4、7、10、14、21、28和36天，测量给予maxadilan后的反应。在每种情况下，在1ng maxadilan皮内注射后，通过激光多普勒成像30分钟测量皮肤血流所有的数据被表示为平均值±平均值的标准差。图10A显示在抗体处理后指定的天数由皮内注射maxadilan诱导的皮肤血流中％自基线的变化。通过单因素方差分析，之后使用邓尼特多重比较检验，在相同的处理中与第0天相比，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。除第36天外，每组8只动物，其中用3mg/kg的抗体420653测试4只动物，如^符号所示。图10B显示抗体处理对maxadilan诱导的皮肤血流的增加的抑制效果(表示为％抑制)。通过双尾未配对t检验，在每个时间点进行3mg/kg的抗体420653与10mg/kg的抗体29G4v22之间的#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001比较。
具体实施方式
本发明涉及分离的抗体和其抗原结合片段，该抗体和其抗原结合片段特异性地结合垂体腺苷酸环化酶激活多肽I型受体(PAC1)，特别是人PAC1。与先前所描述的抗PAC1拮抗剂抗体相比，本发明的这些抗体对人PAC1具有增强的抑制效力。本发明的抗体还与大鼠PAC1受体和食蟹猴PAC1受体交叉反应，从而允许对这些物种中的抗体进行临床前体内评估。
人PAC1是由染色体7上的ADCYAP1R1基因编码的468氨基酸蛋白质(NCBI参考序列NP_001109.2)。人PAC1受体是与腺苷酸环化酶正偶联的G蛋白偶联受体。由其内源性配体(例如，PACAP38或PACAP27)引起的人PAC1受体的激活导致胞内环AMP(环腺苷酸，cAMP)的增加。人PAC1的氨基酸序列提供为如下SEQ ID NO:1。
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人PAC1蛋白质的氨基酸1至23(SEQ ID NO:1)构成信号肽，该信号肽通常从成熟蛋白质中去除。成熟人PAC1蛋白具有G蛋白偶联受体的基本结构，该受体由七个跨膜结构域，由一个N末端区和三个胞外环组成的一个胞外结构域，三个胞内环和C末端细胞质结构域构成。N末端胞外结构域大约在SEQ ID NO:1的氨基酸24-153处，并且七个跨膜结构域中的第一个在SEQ ID NO:1的氨基酸154处开始。C末端细胞质结构域大约位于SEQ ID NO:1的氨基酸397-468处。参见Blechman和Levkowitz,Front.Endocrinol.[内分泌学前沿],第4卷(55):1-19,2013针对氨基酸序列内结构域的位置。术语“人PAC1”、“人PAC1受体”、“hPAC1”和“hPAC1受体”可互换地使用，并且可以指SEQ ID NO:1的多肽、SEQ ID NO:1的多肽减去信号肽(氨基酸1至23)、人PAC1的等位基因变体、或人PAC1的剪接变体。
本发明提供了特异性地结合人PAC1的抗体。“抗体”是包含特异性结合抗原的抗原结合片段的蛋白质，以及允许抗原结合片段采用促进抗体与抗原结合的构象的支架或框架部分。如本文使用的，术语“抗体”通常是指包含两个轻链多肽(每个约25kDa)和两个重链多肽(每个约50-70kDa)的四聚免疫球蛋白蛋白质。术语“轻链”或“免疫球蛋白轻链”是指从氨基端至羧基端包含单个免疫球蛋白轻链可变区(VL)和单个免疫球蛋白轻链恒定结构区(CL)的多肽。该免疫球蛋白轻链恒定结构区(CL)可以是人kappa(κ)或人lambda(λ)恒定结构区。术语“重链”或“免疫球蛋白重链”是指从氨基端至羧基端包含以下的多肽：单个免疫球蛋白重链可变区(VH)、免疫球蛋白重链恒定结构区1(CH1)、免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白重链恒定结构区2(CH2)、免疫球蛋白重链恒定结构区3(CH3)、和任选地免疫球蛋白重链恒定结构区4(CH4)。重链被分类为mu(μ)、delta(Δ)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。这些IgG类和IgA类抗体分别被进一步分成亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2。IgG、IgA和IgD抗体中的这些重链具有三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)然而IgM和IgE抗体中的这些重链具有四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。这些免疫球蛋白重链恒定结构区可以来自任何免疫球蛋白同种型(包括亚型)。抗体链通过CL结构域和CH1结构域之间(即，轻链和重链之间)和两个抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。
本发明还包括本文所描述的这些抗PAC1抗体的抗原结合片段。本文中与“结合片段”或“片段”可互换使用的“抗原结合片段”是缺少至少一些全长重链和/或轻链中存在的氨基酸的抗体的一部分，但它仍然能够特异性结合抗原。抗原结合片段包含但不限于单链可变区片段(scFv)、纳米抗体(例如，骆驼科动物重链抗体的VH结构域；VHH片段，参见Cortez-Retamozo等人,Cancer Research[癌症研究],第64卷:2853-57,2004)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、Fd片段、和互补决定区(CDR)片段，并且可以来源于任何哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、兔、或骆驼科动物)来源。抗原结合片段可以竞争靶抗原与完整抗体的结合，并且片段可以通过修饰完整抗体(例如酶促或化学切割)或使用重组DNA技术或肽合成从头合成来产生。在一些实施例中，该抗原结合片段包含来自抗体的与抗原结合的至少一个CDR，例如来自抗体的与抗原结合的重链CDR3。在其他实施例中，抗原结合片段包含来自结合抗原的抗体重链的所有三个CDR，或来自结合抗原的抗体轻链的所有三个CDR。抗原结合片段包含来自结合抗原(三个来自重链，并且三个来自轻链)的抗体的所有六个CDR。
术语“分离的分子”(其中分子是例如多肽、多核苷酸、抗体或抗原结合片段)是由于其来源或衍生源的以下分子：(1)与其天然状态下伴随的自然相关组件无关，(2)基本上不含来自相同物种的其他分子，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成的或在与其天然来源的细胞不同的细胞***中表达的分子将与其天然相关的组分“分离”。使用本领域熟知的纯化技术通过分离还可以使分子基本上不含天然相关的组分。可以通过本领域熟知的许多方法测定分子纯度或均匀性。例如，可以使用本领域熟知的技术，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶染色使多肽可视化来测定多肽样品的纯度。出于某些目的，可以通过使用HPLC或本领域熟知的其他方法进行纯化来提供更高的分辨率。
在本发明的某些实施例中，这些抗体或其抗原结合片段特异性地结合人PAC1。当抗体或其抗原结合片段在相似的结合测定条件下，与其他无关蛋白的亲和力相比具有显著更高的结合亲和力并因此能够区分该抗原时，该抗体或其抗原结合片段“特异性地结合”靶抗原。特异性地结合抗原的抗体或抗原结合片段可以具有平衡解离常数(KD)≤1x10-6M。当KD≤1x10-8M时，抗体或结合片段以“高亲和力”与抗原特异性地结合。在一个实施例中，本发明的这些抗体或结合片段与人PAC1结合，其中KD≤5x10-9M。在另一个实施例中，本发明的这些抗体或结合片段与人PAC1结合，其中KD≤1x10-9M。在又另一个实施例中，本发明的这些抗体或结合片段与人PAC1结合，其中KD≤5x10-10M。在另一个实施例中，本发明的这些抗体或结合片段与人PAC1结合，其中KD≤1x10-10M。在某些实施例中，本发明的这些抗体或结合片段与人PAC1结合，其中KD≤5x10-11M。在其他实施例中，本发明的这些抗体或结合片段与人PAC1结合，其中KD≤1x10-11M。在一个具体的实施例中，本发明的这些抗体或结合片段与人PAC1结合，其中KD≤5x10-12M。在另一个具体是实施例中，本发明的这些抗体或结合片段与人PAC1结合，其中KD≤1x10-12M。
使用各种技术测定亲和力，这些技术的一个实例是亲和力ELISA测定。在各种实施例中，通过表面等离子体共振测定(例如，基于
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的测定)来确定亲和力。使用该方法学，可以测量结合速率常数(以M-1s-1表示ka)和解离速率常数(以s-1表示kd)。然后可以由动力学速率常数(kd/ka)的比率计算平衡解离常数(以M表示的KD)。在一些实施例中，通过动力学方法测定亲和力，例如在Rathanaswami等人.Analytical Biochemistry[分析生物化学],第373卷:52-60,2008中描述的动力学排除测定(KinExA)。使用KinExA测定，可以测量平衡解离常数(以M表示的KD)和结合速率常数(以M-1s-1表示的ka)。可以由这些值(KDxka)计算解离速率常数(以s-1表示kd)。在其他实施例中，通过生物层干涉法测定亲和力，例如在Kumaraswamy等人,Methods Mol.Biol.[分子生物学方法],第1278卷:165-82,2015中的描述，并用于
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***(颇尔福特生物有限公司(PallForteBio))。可以使用生物层干涉法按实时计算动力学(ka和kd)和亲和力(KD)常数。在一些实施例中，本文所述的这些抗体或结合片段展示出所希望的特征，例如由人PAC1的kd(解离速率常数)测量的结合亲合力为约10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10s-1或更低(值越低表明结合亲合力越高)，和/或如由人PAC1的KD(平衡解离常数)测量的结合亲和力为约10-8、10-9、10-10、10-11、10-12M或更低(值越低表明结合亲和力越高)。
优选地，本发明的这些抗体或结合片段未显著地与促胰液素/胰高血糖素受体家族的其他成员结合或与其交叉反应，这些成员是例如人VPAC1受体(NCBI参考序列NP_004615.2)和人VPAC2受体(NCBI参考序列NP_003373.2)。如本文所用，在相似的结合测定条件下，当抗体或结合片段对抗原具有与其对其他无关蛋白的亲和力相当的结合亲和力时，该抗体或结合片段与靶抗原“不显著结合”。不显著结合靶抗原的抗体或结合片段还可包括那些在亲和力测定中不产生与阴性对照相比统计学上不同信号的蛋白质，例如本文描述针对靶抗原的那些抗体或结合片段。举例来说，抗体在基于ELISA或基于
Figure BDA0002576823830000172
的测定中产生信号值，用于测定与人VPAC1的结合，该信号值与用阴性对照(例如，不含抗体的缓冲溶液)产生的信号值没有统计学差异被认为不与人VPAC1显著地结合。不与抗原显著结合的抗体或结合片段对抗原可以具有平衡解离常数(KD)高于1x10-6M、高于1x10-5M、高于1x10-4M、或高于1x10-3M。因此，在某些实施例中，相对于人VPAC1和人VPAC2，本发明的这些抗体和结合片段选择性地与人PAC1结合。换言之，本发明的这些抗体和结合片段不显著地与人VPAC1或人VPAC2结合。
本发明的这些抗体和抗原结合片段可以抑制、干扰或调节人PAC1受体的一种或多种生物活性。人PAC1受体的生物活性包括但不限于,诱导PACAP介导的受体信号转导途径、诱导血管舒张、和抑制血管收缩。在一些实施例中，本发明的这些抗体或结合片段抑制PACAP(例如，PACAP38或PACAP27)与人PAC1受体的结合。例如通过测量体外竞争性结合测定中的结合，当过量的抗体或结合片段减少与PACAP结合的人PAC1受体的量时，会发生“结合抑制”，反之亦然，例如，减少至少约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99％或更多。抑制常数(Ki)指示本发明的这些抗体或抗原结合片段在预防PACAP与人PAC1受体结合方面的效力，可以从这种竞争性结合测定中计算。举例来说，将放射性同位素(例如，125I)附接至受体配体(例如，PACAP38)，并且该测定法测量在增加浓度的抗PAC1抗体或其结合片段中放射性标记的配体与人PAC1受体的结合。使用等式Ki＝IC50/(1+([L]/Kd))可以计算Ki值，其中[L]是使用的放射性配体的浓度(例如，125I标记的PACAP38)，并且Kd是放射性配体的解离常数。参见，例如Keen M,MacDermot J(1993)Analysis of receptors by radioligand binding[由放射性配体结合分析受体].在：Wharton J,Polak JM(编辑)Receptor autoradiography,principles and practice[受体放射自显影的原理和实践].牛津大学出版社，牛津(Oxford University Press,Oxford)中。拮抗剂的Ki值越低，拮抗剂越有效。在一些实施例中，本发明的这些抗体或其抗原结合片段竞争结合具有放射性标记的PACAP配体的人PAC1受体，其中Ki≤1nM。在其他实施例中，本发明的这些抗体或其抗原结合片段竞争结合具有放射性标记的PACAP配体的人PAC1受体，其中Ki≤500pM。在又其他的实施例中，本发明的这些抗体或其抗原结合片段竞争结合具有放射性标记的PACAP配体的人PAC1受体，其中Ki≤200pM。在某些其他的实施例中，本发明的这些抗体或其抗原结合片段竞争结合具有放射性标记的PACAP配体的人PAC1受体，其中Ki≤100pM。
在某些实施例中，本发明的这些抗体和抗原结合片段抑制配体诱导的人PAC1受体的激活。该配体可以是受体的内源性配体，例如PACAP38或PACAP27，或该配体可以是受体的另一种已知的激动剂，例如maxadilan。Maxadilan是一种65个氨基酸的肽，最初从沙蝇中分离出来，与VPAC1或VPAC2相比，对PAC1具有极佳的选择性，并因此可用作PAC1选择性激动剂(Lerner等人,JBiol Chem.[生物化学杂志],第266卷(17):11234-11236,1991；Lerner等人,Peptides[肽],第28卷(9):1651-1654,2007)。用于评估PAC1受体激活的各种测定法是本领域已知的，包括测量配体诱导的钙动员和cAMP产生的基于细胞的测定法。示例性基于细胞的cAMP测定描述于实例3中。其它适合的PAC1受体激活测定描述于Dickson等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年报],第1070卷:239-42,2006；Bourgault等人,J.Med.Chem.[医药化学杂志],第52卷:3308-3316,2009；以及美国专利申请号2011/0229423中，其全部均通过引用以其全部内容并入本文。
这些抗体或抗原结合片段对PAC1受体激活的抑制性活性可以通过计算受体的任何功能测定中IC50来定量，例如以上描述的那些。“IC50”是实现50％生物学或生物化学功能抑制所需的剂量/浓度。对于放射性配体，IC50是竞争配体的浓度，该竞争配体取代放射性配体的50％的特异性结合。任何特定物质或拮抗剂的IC50可以通过构建剂量-反应曲线并检查不同浓度的药物或拮抗剂对特定功能测定中逆转激动剂活性的影响来确定。通过测定抑制激动剂的最大生物反应的一半所需的浓度，可以计算给定拮抗剂或药物的IC50值。因此，在任何功能测定(例如在实例中描述的cAMP测定)激活人PAC1受体中，本发明的任何抗PAC1抗体或其结合片段的IC50值可以通过测定抑制配体(例如，PACAP27、PACAP38或maxadilan)的最大生物反应的一半所需的抗体或结合片段的浓度来测定。抑制配体诱导的(例如，PACAP诱导的)PAC1受体的激活的抗PAC1抗体或其结合片段被理解为是PAC1受体的中和或拮抗剂抗体或结合片段。
在某些实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的(PACAP38诱导的或PACAP27诱导的)人PAC1受体的激活。例如，这些抗体或抗原结合片段可以抑制PACAP诱导的人PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的钙动员测定或cAMP测定测量的IC50小于约10nM、小于约8nM、小于约5nM、小于约3nM、小于约1nM、小于约800pM、小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、或小于约100pM。在一个具体的实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的人PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于约5nM。在另一个具体的实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的人PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于约1nM。在仍另一个具体的实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的人PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于约500pM。在另一个实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的人PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于约300pM。在一些实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的人PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50在约0.1nM和约1nM之间。在其他实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的人PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50在约50pM和约500pM之间。
在一些实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段结合并抑制来自其他物种的PAC1受体。例如，这些抗体或抗原结合片段结合并抑制食蟹猴PAC1受体(NCBI参考序列XP_015303041.1)。在这样的实施例中，这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的食蟹猴PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的钙动员测定或cAMP测定测量的IC50小于约10nM、小于约8nM、小于约5nM、小于约3nM、小于约1nM、小于约800pM、小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、或小于约100pM。在一个实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的食蟹猴PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于约1nM。在另一个实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的食蟹猴PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于约500pM。在又另一个实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的食蟹猴PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50在约0.1nM和约1nM之间。在仍另一个实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的食蟹猴PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50在约50pM和约500pM之间。
在某些实施例中，这些抗体或抗原结合片段结合并抑制大鼠PAC1受体(NCBI参考序列NP_598195.1)。在这些实施例中，这些抗体或抗原结合片段可以抑制PACAP诱导的大鼠PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的钙动员测定或cAMP测定测量的IC50小于约10nM、小于约8nM、小于约5nM、小于约3nM、小于约1nM、小于约800pM、小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、或小于约100pM。在一个实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的大鼠PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于约10nM。在另一个实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的大鼠PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于约5nM。在又另一个实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的大鼠PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于约500pM。在仍另一个实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的大鼠PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于约300pM。在一些实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的大鼠PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50在约0.1nM和约10nM之间。在仍另一个实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段抑制PACAP诱导的大鼠PAC1受体的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50在约100pM和约2nM之间。在一些实施例中，其中本发明的这些抗体或结合片段与来自其他物种的PAC1受体交叉反应，这些抗体或结合片段可以用当的效力抑制PACAP诱导的PAC1受体的激活。例如，本发明的抗体或结合片段可以抑制PACAP诱导的人PAC1受体的激活，其中IC50类似于抗体或结合片段抑制PACAP诱导的食蟹猴或大鼠PAC1受体的激活的IC50。与本发明的这些抗体或结合片段的其他种类的PAC1受体的交叉反应性可以是有利的，因为可以在另外的临床前动物模型中评估这些抗体或结合片段的治疗功效。
通常，本发明的这些抗体或抗原结合片段不显著地抑制配体诱导的人VPAC1受体或VPAC2受体的激活(例如，PACAP38、PACAP27或VIP诱导的)。如本文使用的，在抗体或抗原结合片段存在或缺失的情况下，如果配体诱导的受体激活或配体与受体的结合之间不存在统计学差异，抗体或抗原结合片段将“不显著地抑制”受体的激活或配体与其受体的结合。例如，如果在抗体或结合片段的存在下，由表达人VPAC1受体的细胞中PACAP或VIP诱导的cAMP的产生的量与在抗体或结合片段缺失的情况下产生的量显著不同，那么该抗体或结合片段将被认为不显著地抑制PACAP/VIP诱导的人VPAC1受体的激活。类似地，如果在过量的抗体或结合片段的存在下与人VPAC1受体结合的PACAP或VIP的量与在抗体或结合片段缺失的情况下与受体结合的PACAP或VIP的量显著不同，那么该抗体或结合片段将被认为不显著地抑制PACAP或VIP与人VPAC1受体的结合。在某些实施例中，本发明的这些抗体或结合片段抑制PACAP诱导的人PAC1受体的激活，但不显著地抑制PACAP诱导的人VPAC1受体或人VPAC2受体的激活。因此，相对于人VPAC1受体和人VPAC2受体，本发明的这些抗体和结合片段选择性地抑制人PAC1受体。
在一些实施例中，本发明的这些抗体和结合片段可与人PAC1的特定区或表位结合。如本文使用的，“表位”是指能够被抗体或其片段特异性结合的任何决定簇。表位是抗原的区域，该表位与靶向该抗原的抗体或结合片段结合或相互作用，并且当该抗原是蛋白质时，包括与抗体或结合片段直接接触或相互作用的特定氨基酸。表位可以由连续氨基酸形成，或者由蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸形成。“线性表位”是其中氨基酸一级序列包含识别表位的表位。在单一序列中线性表位典型地包括至少3个或4个氨基酸，并更通常至少5个、至少6个、或至少7个氨基酸，例如，约8个至约10个氨基酸。与线性表位相反，“构象表位”是一组不连续的氨基酸(例如，在多肽中，是在多肽的一级序列中不连续的氨基酸残基，但是在多肽的第三和第四结构的背景下，彼此足够接近以被抗体或其结合片段结合)。表位决定簇可以包括化学活性表面分子群，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶分子特异的抗体或结合片段将优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中靶分子上的表位。
在某些实施例中，本发明的这些抗体或抗原结合片段与在人PAC1(SEQ ID NO:4)的N末端胞外结构域(ECD)内的表位处的人PAC1结合。在相关的实施例中，这些抗体或抗原结合片段与SEQ ID NO:1的氨基酸24-153内的表位处的人PAC1结合。在其他相关的实施例中，这些抗体或抗原结合片段与SEQ ID NO:1的氨基酸50-140内的表位处的人PAC1结合。如实例1中所述，人PAC1N末端ECD和抗PAC1中和抗体的Fab区的复合物的晶体结构揭示了人PAC1ECD内的关键氨基酸，这些氨基酸包含与抗PAC1Fab的结合界面。这些核心界面氨基酸，所有这些氨基酸在Fab中在离非氢原子
Figure BDA0002576823830000241
或更小的距离处包含至少一个非氢原子，包括Asp59、Asn60、Ile61、Arg116、Asn117、Thr119、Asp121、Gly122、Trp123、Ser124、Glu125、Pro126、Phe127、Pro128、His129、Tyr130、Phe131、Asp132和Gly135(相对于SEQ ID NO:1的氨基酸位置号)。因此，在一些实施例中，本发明的这些抗体或结合片段在表位处与人PAC1结合，该表位包含选自以下的一个或多个氨基酸：SEQ ID NO:1的Asp59、Asn60、Ile61、Arg116、Asn117、Thr119、Glu120、Asp121、Gly122、Trp123、Ser124、Glu125、Pro126、Phe127、Pro128、His129、Tyr130、Phe131、Asp132、和Gly135。在其他实施例中，这些抗体或结合片段在表位处与人PAC1结合，该表位至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸Asn60、Ile61、Glu120、和Asp121。在又其他的实施例中，这些抗体或结合片段在表位处与人PAC1结合，该表位至少包含氨基酸SEQ ID NO:1的Asn60、Ile61、Glu120、Asp121、Phe127和Phe131。在某些其他的实施例中，这些抗体或结合片段在表位处与人PAC1结合，该表位包含选自以下的所有氨基酸：SEQ ID NO:1的Asp59、Asn60、Ile61、Arg116、Asn117、Thr119、Glu120、Asp121、Gly122、Trp123、Ser124、Glu125、Pro126、Phe127、Pro128、His129、Tyr130、Phe131、Asp132和Gly135。
实例1中描述的人PAC1 ECD-Fab复合物的晶体结构还揭示了Fab的重链和轻链的CDR中与人PAC1 ECD中的氨基酸相互作用的重要残基，从而鉴定了抗体的互补位中的关键氨基酸。“互补位”是识别并结合靶抗原的抗体区。互补位残基包括轻链可变区(SEQ ID NO:3)中的Gln27、Gly30、Arg31和Ser32以及重链可变区(SEQ ID NO:2)中的Arg31、Phe32、Tyr53、Asp54、Gly56。互补位中若干个这些残基的特定突变被设计为改善与人PAC1 ECD中核心界面残基(即表位中的残基)的相互作用，与亲本抗体相比导致结合亲和力和抑制效力增强(参见实例1-3)。SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:52的轻链可变区中的Gln27、Gly30、Arg31和Ser32分别对应于AHo编号中的氨基酸位置29、32、39和40，并且SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:191的重链可变区中的Arg31、Phe32、Tyr53、Asp54、Gly56分别对应于AHo编号中的氨基酸位置33、39、60、61和66。AHo编号方案是基于结构的编号方案，该方案在CDR区中引入空位使得与经比对的结构域的平均结构的偏差最小化(Honegger和Pluckthun,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]309(3):657-670；2001)。在AHo编号方案中，不同抗体中结构相当的位置将具有相同的残基号。
在一些实施例中，本发明提供了与人PAC1(SEQ ID NO:1)特异性地结合的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：(i)轻链可变区，其中根据AHo编号在位置29处的氨基酸是与人PAC1的氨基酸Glu120或Asp121相互作用的碱性氨基酸，和(ii)重链可变区，其中根据AHo编号在位置61处的氨基酸是与人PAC1的氨基酸Asn60或Ile61相互作用的疏水、碱性或中性亲水氨基酸。如本文使用的，当一个氨基酸中的一个或多个原子与其他氨基酸中的一个或多个原子通过例如，范德华力、疏水或静电力形成非共价键时，一个氨基酸被称为与另一个氨基酸相互作用。碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸，然而中性亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸。在某些实施例中，在轻链可变区中根据AHo编号在位置29处的氨基酸是赖氨酸或精氨酸。在一个具体的实施例中，在轻链可变区中根据AHo编号在位置29处的氨基酸是赖氨酸。在相关的实施例中，在重链可变区中根据AHo编号在位置61处的氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸。在一个实施例中，在重链可变区中根据AHo编号在位置61处的氨基酸是异亮氨酸。在另一个实施例中，在重链可变区中根据AHo编号在位置61处的氨基酸是谷氨酰胺或天冬酰胺。在又另一个实施例中，在重链可变区中根据AHo编号在位置61处的氨基酸是精氨酸。
在一些实施例中，在抗体或其抗原结合片段的重链可变区中根据AHo编号在位置66处的氨基酸是碱性或中性亲水氨基酸，该氨基酸与人PAC1(SEQ ID NO:1)的氨基酸Asn60或Ile61相互作用。在重链可变区中根据AHo编号在位置66处的氨基酸可以是谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸。在一个实施例中，在重链可变区中根据AHo编号在位置66处的氨基酸是精氨酸。在另一个实施例中，在重链可变区中根据AHo编号在位置66处的氨基酸是天冬酰胺。
发现以上描述的互补位-表位相互作用与抑制效力的改进相关，其中IC50值在皮摩尔范围内。参见实例3。因此，具有根据AHo编号在轻链可变区中位置29处和重链可变区中位置61和/或66处的以上指定的氨基酸并且与人PAC1受体中的特定残基(SEQ ID NO:1的Glu120、Asp121、Asn60、和/或Ile61)相互作用的抗体或其抗原结合片段将被期望具有改进的抑制效力，例如，抑制PACAP诱导的人PAC1的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于500pM。在一些实施例中，这样的抗体或抗原结合片段可以抑制PACAP诱导的人PAC1的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的IC50小于300pM。在这些和其他实施例中，这些抗体或其抗原结合片段可以具有：包含与SEQ ID NO:52的序列具有至少90％同一性的序列的轻链可变区以及包含与SEQ ID NO:191的序列具有至少90％同一性的序列的重链可变区。
本发明的这些抗体或抗原结合片段可以包含来自特异性地结合如本文所述的人PAC1的抗体的轻链和重链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)。术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区(还称为“最小识别单位”或“超变区”)。存在三个重链可变区CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变区CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。如本文使用的，术语“CDR区”是指在单个可变区(即，三个轻链CDR或三个重链CDR)中出现的三个CDR的组。两条链的每条链中的CDR典型地通过框架区(FR)对齐以形成与靶蛋白(例如，人PAC1)上的特定表位或结构域特异性结合的结构。从N-末端至C-末端，天然存在的轻链和重链可变区二者典型地与以下这些元件的顺序一致：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。已经设计了一种编号***，用于将数字分配给氨基酸，该氨基酸占据这些结构域的每一个中的位置。在免疫学目的蛋白的Kabat序列中(1987和1991,NIH,Bethesda,MD)或Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:878-883中定义该编号***。使用该***可以鉴定给定抗体的互补决定区(CDR)和框架区(FR)。免疫球蛋白链中氨基酸的其他编号***包括
Figure BDA0002576823830000272
(international ImMunoGeneTicsinformation system[国际免疫遗传学信息***]；Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学]29:185-203；2005)和AHo(Honegger和Pluckthun,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]309(3):657-670；2001)。
在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的至少一个轻链可变区以及来自本文所描述的这些抗PAC1抗体中任一者的包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的至少一个重链可变区。轻链和重链可变区以及示例性人抗PAC1抗体的相关的CDR分别列出在以下表1A和1B中。
表1A.示例性抗人PAC1抗体轻链可变区氨基酸序列
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Figure BDA0002576823830000341
Figure BDA0002576823830000351
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表1B.示例性抗人PAC1抗体重链可变区氨基酸序列
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Figure BDA0002576823830000491
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本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段可以包含分别显示在表1A和1B中的一个或多个轻链CDR(即，CDRL)和/或重链CDR(即，CDRH)。在一些实施例中，这些抗PAC1抗体或其结合片段衍生自抗体29G4v9、29G4v10或29G4v22(即，具有29G4v9、29G4v10或29G4v22抗体的一个或多个CDRL和/或CDRH中的一个或多个取代)。例如，在某些实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含一个或多个轻链CDR，该轻链CDR选自以下：(i)选自SEQ ID NO:5至16的CDRL1，(ii)SEQ ID NO:26的CDRL2，和(iii)选自SEQ ID NO:36至38的CDRL3，和(iv)包含一个或多个，例如一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)，不超过五个、四个、三个、两个、或一个氨基酸的缺失或***的(i)、(ii)和(iii)的CDRL。在这些和其他实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含一个或多个重链CDR，该重链CDR选自：(i)选自SEQ ID NO:88至96的CDRH1,(ii)选自SEQ ID NO:106至166的CDRH2，和(iii)选自SEQ ID NO:171至177的CDRH3，和(iv)包含一个或多个，例如一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)，不超过五个、四个、三个、两个、或一个氨基酸的缺失或***的(i)、(ii)和(iii)的CDRH。
在其他实施例中，抗PAC1抗体或其结合片段衍生自抗体19H8(即，具有在19H8抗体的一个或多个CDRL和/或CDRH中的一个或多个取代)。在这样的实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含一个或多个轻链CDR，该CDRH选自(i)选自SEQ ID NO:17至25的CDRL1，(ii)选自SEQ ID NO:27至35的CDRL2，和(iii)选自SEQ ID NO:39至51的CDRL3，和(iv)包含一个或多个，例如一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)，不超过五个、四个、三个、两个、或一个氨基酸的缺失或***的(i)、(ii)和(iii)的CDRL。在这些和其他实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含一个或多个重链CDR，该重链CDR选自：(i)选自SEQ ID NO:97至105的CDRH1,(ii)选自SEQ ID NO:167至170的CDRH2，和(iii)选自SEQ ID NO:178至190的CDRH3，和(iv)包含一个或多个，例如一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)，不超过五个、四个、三个、两个、或一个氨基酸的缺失或***的(i)、(ii)和(iii)的CDRH。
在某些实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段可以包含表1A和1B中列出的CDR的1、2、3、4、5、或6种变体形式，每种形式与表1A和1B中列出的CDR序列具有至少80％、85％、90％或95％的序列同一性。在一些实施例中，这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包括表1A和1B中列出的CDR的1、2、3、4、5、或6种，每种与在这些表中列出的CDR相差不超过1、2、3、4或5个氨基酸。在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含选自SEQ ID NO:5至16的序列的CDRL1或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:26的序列的CDRL2或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；包含选自SEQ ID NO:36至38的序列的CDRL3或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；包含选自SEQ ID NO:88至96的序列的CDRH1或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；包含选自SEQ ID NO:106至166的序列的CDRH2或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；以及包含选自SEQ ID NO:171至177的序列的CDRH3或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体。在其他实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：CDRL1，其包含选自SEQ ID NO:5至16的序列；CDRL2，其包含SEQ ID NO:26的序列；CDRL3，其包含选自SEQ ID NO:36至38的序列；CDRH1，其包含选自SEQ ID NO:88至96的序列；CDRH2，其包含选自SEQ ID NO:106至166的序列；和CDRH3，其包含选自SEQ ID NO:171至177的序列。
在其他实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含选自SEQID NO:17至25的序列的CDRL1或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；包含选自SEQ ID NO:27至35的序列的CDRL2或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；包含选自SEQ ID NO:39至51的序列的CDRL3或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；包含选自SEQ ID NO:97至105的序列的CDRH1或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；包含选自SEQ ID NO:167至170的序列的CDRH2或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体；以及包含选自SEQ ID NO:178至190的序列的CDRH3或其具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的变体。在其他实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：CDRL1，其包含选自SEQ ID NO:17至25的序列；CDRL2，其包含选自SEQ ID NO:27至35的序列；CDRL3，其包含选自SEQ ID NO:39至51的序列；CDRH1，其包含选自SEQ ID NO:97至105的序列；CDRH2，其包含选自SEQ ID NO:167至170的序列；和CDRH3，其包含选自SEQID NO:178至190的序列。
在具体是实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中：(a)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ IDNO:7、26和36的序列；(b)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:5、26和36的序列；(c)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:12、26和36的序列；或(d)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:13、26和36的序列。
在其他具体的实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中：(a)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQID NO:88、108和171的序列；(b)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、116和171的序列；(c)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、134和171的序列；(d)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:92、145和174的序列；(e)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQID NO:88、108和172的序列；(f)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、128和172的序列；(g)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、153和171的序列；(i)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、154和171的序列；或(j)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQID NO:88、155和171的序列。
在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中：
(a)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:7、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、108和171的序列；
(b)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:7、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、116和171的序列；
(c)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:5、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、134和171的序列；
(d)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:5、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:92、145和174的序列；
(e)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:7、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、108和172的序列；
(f)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:5、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、128和172的序列；
(g)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:7、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、134和171的序列；
(h)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:12、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、153和171的序列；
(i)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:12、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、154和171的序列；或
(j)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:13、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、155和171的序列。
在一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:7、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ IDNO:88、108和171的序列。在另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:7、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、116和171的序列。在又另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:5、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、134和171的序列。在仍另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:5、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:92、145和174的序列。在一个具体的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:7、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、108和172的序列。在另一个具体的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区和包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ IDNO:12、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、153和171的序列。
在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中：(a)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:25、31和42的序列；(b)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:20、30和44的序列；(c)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、33和42的序列；(d)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:23、31和50的序列；(e)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、31和44的序列；(f)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、27和39的序列；(g)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:18、31和46的序列；(h)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、28和40的序列；(i)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:18、30和43的序列；或(j)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:22、28和49的序列。
在某些其他的实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中：(a)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQID NO:98、168和190的序列；(b)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:100、168和182的序列；(c)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:99、168和187的序列；(d)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:97、167和178的序列；(e)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQID NO:98、168和189的序列；(f)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:98、168和179的序列；或(g)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:102、169和182的序列。
在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中：
(a)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:25、31和42的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:98、168和190的序列；
(b)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:20、30和44的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:100、168和182的序列；
(c)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、33和42的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:99、168和187的序列；
(d)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:23、31和50的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:97、167和178的序列；
(e)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、31和44的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:98、168和189的序列；
(f)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、27和39的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:100、168和182的序列；
(g)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:18、31和46的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:98、168和179的序列；
(h)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、28和40的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:98、168和179的序列；
(i)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:18、30和43的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:100、168和182的序列；或
(j)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:22、28和49的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:102、169和182的序列。
在一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:25、31和42的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ IDNO:98、168和190的序列。在另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:20、30和44的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:100、168和182的序列。在又另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、33和42的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:99、168和187的序列。在仍另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:23、31和50的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:97、167和178的序列。在一个具体的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、31和44的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:98、168和189的序列。在另一个具体的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区和包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、27和39的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:100、168和182的序列。
在某些实施例中，本发明的这些抗体和抗原结合片段包含来自特异性地结合人PAC1的抗体(例如本文所述的这些抗体)的免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)。在本文中“可变区”与“可变结构域”(轻链的可变区(VL)，重链的可变区(VH))可互换地使用，是指每个轻和重免疫球蛋白链中的区域，该轻和重免疫球蛋白链直接参与抗体与抗原的结合。如上所述，可变轻链和重链的区域具有相同的一般结构，并且每个区域包含四个框架区(FR)，这些框架区序列是广泛保守的，由三个CDR连接。框架区采用β-折叠构象，并且这些CDR可形成连接β-折叠结构的环。每条链中的这些CDR通过框架区保持其三维结构，并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。
因此，在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段可以包含如表1A所示的选自LV-01至LV-15的轻链可变区，和/或如表1B所示的选自HV-01至HV-105的重链可变区，以及这些轻链和重链可变区的结合片段、衍生物和变体。在其他实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段可以包含如表1A所示的选自LV-16至LV-36的轻链可变区，和/或如表1B所示的选自HV-106至HV-122的重链可变区，以及这些轻链和重链可变区的结合片段、衍生物和变体。
可以将表1A中列出的每一个轻链可变区与表1B中列出的任意重链可变区组合以形成本发明的抗PAC1抗体或其抗原结合片段。这样的组合的实例包括但不限于：(i)LV-03与HV-03至HV-26、HV-32至HV-47、和HV-57至HV-62中的任一者；(ii)LV-04与HV-11至HV-91中的任一者；(iii)LV-05与HV-01、HV-03、HV-07、HV-09和HV-10中的任一者；(iv)LV-06与HV-01、HV-03、HV-07、HV-09和HV-10中的任一者；(v)LV-07与HV-01、HV-03、HV-07、HV-09和HV-10中的任一者；(vi)LV-08与HV-01；(vii)LV-09与HV-01；(viii)LV-10与HV-01；(ix)LV-11与HV-92、HV-93、HV-95至HV-97、和HV-99至HV-101中的任一者；(x)LV-12与HV-94；(xi)LV-13与HV-98；(xii)LV-14与HV-102至HV-104中的任一者；(xiii)LV-15与HV-105；(xiv)LV-17与HV-107；(xv)LV-18与HV-108；(xvi)LV-19与HV-109；(xvii)LV-20与HV-110；(xviii)LV-21与HV-110；(xix)LV-22与HV-111；(xx)LV-23与HV-107；(xxi)LV-24与HV-112；(xxii)LV-25与HV-113；(xxiii)LV-26与HV-114；(xxiv)LV-27与HV-106或HV-110；(xxv)LV-28与HV-115或HV-118；(xxvi)LV-29与HV-116；(xxvii)LV-30与HV-117；(xxviii)LV-31与HV-119；(xxix)LV-32与HV-120；(xxx)LV-33与HV-121；(xxxi)LV-34与HV-122；(xxxii)LV-35与HV-110；以及(xxxiii)LV-36与HV-110。
在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-03的序列(SEQ ID NO:54)的轻链可变区和包含HV-04的序列(SEQ ID NO:194)的重链可变区。在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-03的序列(SEQ IDNO:54)的轻链可变区和包含HV-13的序列(SEQ ID NO:203)的重链可变区。在其他实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-04的序列(SEQ ID NO:55)的轻链可变区和包含HV-38的序列(SEQ ID NO:228)的重链可变区。在仍其他的实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-04的序列(SEQ ID NO:55)的轻链可变区和包含HV-84的序列(SEQ ID NO:274)的重链可变区。在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-03的序列(SEQ ID NO:54)的轻链可变区和包含HV-24的序列(SEQ ID NO:214)的重链可变区。在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-04的序列(SEQ ID NO:55)的轻链可变区和包含HV-50的序列(SEQID NO:240)的重链可变区。在一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-03的序列(SEQ ID NO:54)的轻链可变区和包含HV-38的序列(SEQ ID NO:228)的重链可变区。在另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-11的序列(SEQ ID NO:62)的轻链可变区和包含HV-92的序列(SEQ ID NO:282)的重链可变区。在又另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-11的序列(SEQ ID NO:62)的轻链可变区和包含HV-93的序列(SEQ ID NO:283)的重链可变区。在仍另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-12的序列(SEQID NO:63)的轻链可变区和包含HV-94的序列(SEQ ID NO:284)的重链可变区。
在某些其他的实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-34的序列(SEQ ID NO:85)的轻链可变区和包含HV-122的序列(SEQ ID NO:312)的重链可变区。在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-21的序列(SEQ ID NO:72)的轻链可变区和包含HV-110的序列(SEQ ID NO:300)的重链可变区。在其他实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-30的序列(SEQ IDNO:81)的轻链可变区和包含HV-117的序列(SEQ ID NO:307)的重链可变区。在仍其他的实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-27的序列(SEQ ID NO:78)的轻链可变区和包含HV-106的序列(SEQ ID NO:296)的重链可变区。在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-32的序列(SEQ ID NO:83)的轻链可变区和包含HV-120的序列(SEQ ID NO:310)的重链可变区。在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-36的序列(SEQ ID NO:87)的轻链可变区和包含HV-110的序列(SEQ ID NO:300)的重链可变区。在一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-23的序列(SEQ ID NO:74)的轻链可变区和包含HV-107的序列(SEQ ID NO:297)的重链可变区。在另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-17的序列(SEQ ID NO:68)的轻链可变区和包含HV-107的序列(SEQ IDNO:297)的重链可变区。在又另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-20的序列(SEQ ID NO:71)的轻链可变区和包含HV-110的序列(SEQ ID NO:300)的重链可变区。在仍另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段包含：包含LV-26的序列(SEQ ID NO:77)的轻链可变区和包含HV-114的序列(SEQ ID NO:304)的重链可变区。
在一些实施例中，这些抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与表1A中轻链可变区(即，VL选自LV-01至LV-36)的序列不同的连续氨基酸序列，仅有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基，其中每个这样的序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、***或取代，其中这些缺失、***和/或取代导致相对于前述可变结构域序列不超过15个氨基酸变化。在一些抗PAC1抗体和结合片段中的轻链可变区包含与SEQ ID NO:52至87的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列(即，在表1A中的轻链可变区)。
在一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区含有与选自SEQ ID NO:54-66的序列具有至少90％同一性的序列。在另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:54-66的序列具有至少95％同一性的序列。在又另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:54-66的序列。在一些实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:54的序列。在其他实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:55的序列。在又其他的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:62的序列。在仍其他的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:63的序列。
在另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:68-87的序列具有至少90％同一性的序列。在又另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与选自SEQ IDNO:68-87的序列具有至少95％同一性的序列。在仍另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:68-87的序列。在某些实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:68的序列。在一些实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:71的序列。在其他实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:72的序列。在又其他的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:74的序列。在仍其他的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:77的序列。在某些实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:78的序列。在其他实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:81的序列。在一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:83的序列。在另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:85的序列。在又另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:87的序列。
在这些和其他实施例中，这些抗PAC1抗体和其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与表1B中重链可变区(即，VH选自HV-01至HV-122)的序列不同的连续氨基酸序列，仅有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15氨基酸残基，其中每个这样的序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、***或取代，其中这些缺失、***和/或取代导致相对于前述可变结构域序列不超过15个氨基酸变化。在一些抗PAC1抗体和抗原结合片段中的重链可变区包含与SEQ ID NO:191至312的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列(即，表1B中的重链可变区)。
在一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与选自SEQ ID NO:191-295的序列具有至少90％同一性的序列。在另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与选自SEQ ID NO:191-295的序列具有至少95％同一性的序列。在又另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:191-295的序列。在一些实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:194的序列。在其他实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:203的序列。在又其他的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:214的序列。在仍其他的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:228的序列。在某些实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:240的序列。在其他实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:274的序列。在一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:282的序列。在另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:283的序列。在又另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:284的序列。
在另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与选自SEQ ID NO:296-312的序列具有至少90％同一性的序列。在又另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与选自SEQ IDNO:296-312的序列具有至少95％同一性的序列。在仍另一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:296-312的序列。在一些实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ IDNO:296的序列。在其他实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:297的序列。在又其他的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:300的序列。在仍其他的实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:304的序列。在某些实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQID NO:307的序列。在其他实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:310的序列。在一个实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:312的序列。
如本文使用的，术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列所确定的。如本文使用的，“百分比同一性”是指在比较的分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且基于所比较的最小分子的大小来计算。对于这些计算，比对中的空位(如果有的话)必须通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括Computational Molecular Biology [计算分子生物学]中描述的那些(Lesk,A.M.,编辑),1988,纽约：牛津出版社(New York:Oxford University Press)；BiocomputingInformatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组项目],(Smith,D.W.,编辑),1993,纽约:学术出版社(New York:Academic Press)；Computer Analysis ofSequence Data,PartI[序列数据的计算机分析，第I部分],(Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑),1994,New Jersey:Humana Press(新泽西州，胡玛纳出版社)；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学中的序列分析],纽约:学术出版社；Sequence Analysis Primer[序列分析引物],(Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑),1991,纽约：斯托克顿出版社(New York:M.Stockton Press)；和Carillo等人,1988,SIAM J.Applied Math.[工业与应用数学学会应用数学杂志]48:1073。例如，序列同一性可以通过标准方法来确定，这些标准方法通常用于比较两种多肽的氨基酸位置的相似性。使用例如BLAST或FASTA的计算机程序，比对两个多肽或两个多核苷酸序列用于最佳匹配它们各自的残基(沿着一个或两个序列的全长，或沿着一个或两个序列的预定部分)。这些程序提供默认开放罚分和默认空位罚分，并且例如PAM 250(Dayhoff 等人,在Atlas ofProtein Sequence and Structure[蛋白序列和结构图谱],第5卷,增刊第3期,1978)或BLOSUM62(Henikoff等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]89:10915-10919)的评分矩阵可以与计算机程序一起使用。例如，然后可以将百分比同一性计算为：相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配范围内较长序列的长度和引入较长序列的空位数之和，以便比对这两个序列。在计算百分比同一性时，以给出序列之间最大匹配的方式来比对比较的序列。
GCG程序包是一个可用于确定百分比同一性的计算机程序，该程序包包括GAP(Devereux等人,1984,Nucl.AcidRes.[核酸研究]12:387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI[遗传学计算机组，威斯康星大学，麦迪逊，威斯康星州])。计算机算法GAP用于比对要测定的百分比序列同一性的两个多肽或两个多核苷酸。比对序列以使它们各自的氨基酸或核苷酸达到最佳匹配(如通过算法来确定“匹配范围”)。空位开放罚分(被计算为3x平均对角线，其中该“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；该“对角线”是由特定的比较矩阵分配给每个完全氨基酸匹配的分数或数字)和空位延伸罚分(通常是空位开放罚分的1/10倍)以及比较矩阵(例如PAM250或BLOSUM62)与算法结合使用。在某些实施例中，通过该算法还使用了标准比较矩阵(参见，用于PAM250比较矩阵的Dayhoff等人,1978,Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白质序列和结构的图谱]5:345-352；用于BLOSUM 62比较矩阵的Henikoff等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]89:10915-10919)。
使用GAP程序用于确定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推荐的参数包括：
算法：Needleman等人.1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453；
比较矩阵：来自Henikoff等人,1992,同上的BLOSUM 62；
空位罚分：12(但末端空位不存在罚分)
空位长度罚分：4
阈值的相似性：0
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可以导致仅两个序列的短区域的匹配，并且即使在这两个全长序列之间没有显著关系，该小的比对区域也可以具有非常高的序列同一性。因此，如果需要，所选比对方法(GAP程序)可以被调整以产生跨越靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对。
本发明的这些抗PAC1抗体可以包含任何免疫球蛋白恒定区。本文中术语“恒定区”与“恒定结构域”可互换地使用，是指除了可变区之外抗体的所有结构域。恒定区不直接参与抗原的结合，但表现出各种效应子功能。如上所述，取决于抗体的重链恒定区的氨基酸序列，抗体被分成特定的同种型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和亚型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。该轻链恒定区可以是例如，κ或λ型轻链恒定区，例如人κ或λ型轻链恒定区，该轻链恒定区处于所有的五种抗体同种型。人免疫球蛋白轻链恒定区序列的实例示出在以下表中。
表2.示例性人免疫球蛋白轻链恒定区
Figure BDA0002576823830000871
本发明的这些抗PAC1抗体的重链恒定区可以是例如，α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如人α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区。在一些实施例中，这些抗PAC1抗体包含来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的重链恒定区。在一个实施例中，该抗PAC1抗体包含来自人IgG1免疫球蛋白的重链恒定区。在这样的实施例中，如本文更详细描述的，该人IgG1免疫球蛋白恒定区可以包含一个或多个突变以防止抗体的糖基化。在另一个实施例中，该抗PAC1抗体包含来自人IgG2免疫球蛋白的重链恒定区。在又另一个实施例中，该抗PAC1抗体包含来自人IgG4免疫球蛋白的重链恒定区。人IgG1、IgG2和IgG4重链恒定区序列的实例示出在以下表3中。
表3.示例性人免疫球蛋白重链恒定区
Figure BDA0002576823830000881
Figure BDA0002576823830000891
表1A中披露的每个轻链可变区和表1B中披露的每个重链可变区可以附接至以上轻链恒定区(表2)和重链恒定区(表3)以分别形成完全抗体轻链和重链。此外，可以组合如此产生的重链和轻链序列中的每一个以形成完整的抗体结构。应当理解，本文提供的重链和轻链可变区还可以附接到具有与上文列出的示例性序列不同的序列的其他恒定结构区。
本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段可以是本文披露的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段的任一者。例如，在某些实施例中，该抗PAC1抗体是选自表9、10、12、13、14、19和20中列出的抗体中的任一者的抗PAC1抗体。在一些实施例中，这些抗PAC1抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，该轻链可变区和/或重链可变区具有在表9、10、12、13、19或20中列出的一个或多个氨基酸取代。例如，在一个实施例中，该抗PAC1抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含在一个或多个氨基酸位置27、28、30、31、32和/或93处具有突变的SEQ IDNO:52的序列。在某些实施例中，该突变选自Q27K、Q27R、Q27H、S28A、G30M、G30W、R31Q、R31L、R31H、R31W、R31Y、S32A、S32N、S32L、R93F、R93M、R93Y或其组合。在这些和其他实施例中，该抗PAC1抗体包含重链可变区，该重链可变区包含在一个或多个氨基酸位置31、32、49、52、53、54、56、57、62、70、102、103和/或104处具有突变的SEQ ID NO:191的序列。在一些实施例中，该突变选自R31F、R31H、R31Y、R31M、R31K、F32Y、A49G、S52N、S52T、Y53F、Y53H、Y53S、D54I、D54L、D54N、D54R、D54Q、D54Y、D54F、D54M、D54S、D54T、G56Q、G56N、G56R、G56H、G56A、G56S、G56T、G56D、N57A、N57F、N57G、N57S、N57Q、N57L、N57T、E62R、I70V、I70L、I70M、V102P、V102L、V102I、V102F、V102M、L103M、T104S、或其组合。
在另一个实施例中，该抗PAC1抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含在一个或多个氨基酸位置28、30、31、34、49、50、51、52、53、91、92、93、94和/或96处具有突变的SEQ IDNO:67的序列。该突变可以选自S28Y、S28T、S28K、S28P、S28Q、S28R、S28M、S30A、S30V、R31Q、N34V、N34S、Y49F、A50V、A50G、A51G、A51S、S52Q、S52H、S52N、S52Y、S52R、S52L、S53I、S53Y、S53N、S53M、S53H、S53R、S91A、Y92I、S93G、S93Q、S93I、S93N、S93M、P94E、P94M、P94N、P94Q、P94A、P94T、P94I、F96Y、或其组合。在这些和其他实施例中，该抗PAC1抗体包含重链可变区，该重链可变区包含在一个或多个氨基酸位置31、32、33、57、58、60、103、105、106、107,和/或110处具有突变的SEQ ID NO:296的序列。在一些实施例中，该突变选自S31N、N32R、N32K、N32H、S33L、S33Q、S33Y、S33V、S33D、S57G、K58Q、S60K、T103M、T103Q、T103R、T103V、K105N、K105E、K105D、K105I、K105A、K105S、K105Q、Q106G、Q106E、L107D、L107N、L110M、L110F、或其组合。
在某些实施例中，本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段选自抗体420653、420845、420943、421873、420889、421091、421051、480711、480706、480713、448730、448195、448788、448901、448689、448202、452128、448924、3574和3575或其抗原结合片段，该抗PAC1抗体或抗原结合片段的可变区和CDR序列在表1A和1B中列出。在一些实施例中，该抗PAC1抗体是选自420653、420845、420943、421873、420889、421091、421051、480711、480706和480713抗体的抗体。在其他实施例中，该抗PAC1抗体是选自448730、448195、448788、448901、448689、448202、452128、448924、3574和3575抗体的抗体。三种示例性人抗PAC1抗体的全长轻链序列和全长重链序列分别列出在以下表4A和4B中。
表4A.示例性抗PAC1抗体轻链序列
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Figure BDA0002576823830000981
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表4B.示例性抗PAC1抗体重链序列
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Figure BDA0002576823830001021
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Figure BDA0002576823830001071
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在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体可以包含如表4A所示的选自LC-01至LC-05的轻链，和/或如表4B所示的选自HC-01至HC-11的重链，以及这些轻链和重链的结合片段、衍生物和变体。在其他实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体可以包含如表4A所示的选自LC-06至LC-15的抗PAC1抗体，和/或如表4B所示的选自HC-12至HC-18的重链，以及这些轻链和重链的结合片段、衍生物和变体。
可以将表4A中列出的每一个轻链与表4B中列出的任意重链组合以形成本发明的抗PAC1抗体或其抗原结合片段。例如，在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-03(SEQ ID NO:506)的序列的轻链和包含HC-03(SEQ ID NO:521)的序列的重链在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-03(SEQ ID NO:506)的序列的轻链和包含HC-04(SEQ ID NO:522)的序列的重链。在其他实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-01(SEQ ID NO:504)的序列的轻链和包含HC-05(SEQ ID NO:523)的序列的重链。在仍其他的实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-01(SEQ ID NO:504)的序列的轻链和包含HC-06(SEQ ID NO:524)的序列的重链。在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-03(SEQ ID NO:506)的序列的轻链和包含HC-07(SEQ ID NO:525)的序列的重链。在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-01(SEQ ID NO:504)的序列的轻链和包含HC-08(SEQ ID NO:526)的序列的重链。在一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-03(SEQ ID NO:506)的序列的轻链和包含HC-05(SEQ ID NO:523)的序列的重链。在另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-04(SEQ IDNO:507)的序列的轻链和包含HC-09(SEQ ID NO:527)的序列的重链。在又另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-04(SEQ ID NO:507)的序列的轻链和包含HC-10(SEQ ID NO:528)的序列的重链。在仍另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-05(SEQ ID NO:508)的序列的轻链和包含HC-11(SEQ ID NO:529)的序列的重链。
在某些其他的实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-07(SEQ ID NO:510)的序列的轻链和包含HC-13(SEQ ID NO:531)的序列的重链。在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-08(SEQ ID NO:511)的序列的轻链和包含HC-14(SEQ IDNO:532)的序列的重链。在其他实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-09(SEQID NO:512)的序列的轻链和包含HC-15(SEQ ID NO:533)的序列的重链。在仍其他的实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-10(SEQ ID NO:513)的序列的轻链和包含HC-16(SEQ ID NO:534)的序列的重链。在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-11(SEQ ID NO:514)的序列的轻链和包含HC-17(SEQ ID NO:535)的序列的重链。在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-12(SEQ ID NO:515)的序列的轻链和包含HC-17(SEQ ID NO:535)的序列的重链。在一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-13(SEQ ID NO:516)的序列的轻链和包含HC-14(SEQ ID NO:532)的序列的重链。在另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-14(SEQ ID NO:517)的序列的轻链和包含HC-18(SEQ ID NO:536)的序列的重链。在又另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-06(SEQ ID NO:509)的序列的轻链和包含HC-14(SEQ ID NO:532)的序列的重链。在仍另一个实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含：包含LC-15(SEQ ID NO:518)的序列的轻链和包含HC-12(SEQ ID NO:530)的序列的重链。
在一些实施例中，这些抗PAC1抗体包含轻链，该轻链包含与表4A中轻链(即，轻链选自LC-01至LC-15)的序列不同的连续氨基酸序列，仅有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基，其中每个这样的序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、***或取代，其中这些缺失、***和/或取代导致相对于前述轻链序列不超过15个氨基酸变化。在一些抗PAC1抗体中的轻链包含与SEQ ID NO:504至518的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列(即，在表4A中的轻链)。
在这些和其他实施例中，这些抗PAC1抗体包含重链，该重链包含与表4B中重链(即，重链选自HC-01至HC-18)的序列不同的连续氨基酸序列，仅有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基，其中每个这样的序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、***或取代，其中这些缺失、***和/或取代导致相对于前述重链序列不超过15个氨基酸变化。在一些抗PAC1抗体中的重链包含与SEQ ID NO:519至536的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列(即，表4B中的重链)。
本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合的抗体、或多特异性的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，该抗PAC1抗体是单克隆抗体。在这样的实施例中，该抗PAC1抗体可以是具有人免疫球蛋白恒定结构区的嵌合的抗体、人源化抗体、或全人源抗体。在这些和其他的实施例中，该抗PAC1抗体是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。因此，该抗PAC1抗体在一些实施例中可以具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定结构区。在一个实施例中，该抗PAC1抗体是单克隆人IgG1抗体。在另一个实施例中，该抗PAC1抗体是单克隆人IgG2抗体。在又另一个实施例中，该抗PAC1抗体是单克隆人IgG4抗体。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”(或“mAb”)是指从基本上均质抗体群体中获得的抗体，即构成群体的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单独抗原位点或表位，与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反。单克隆抗体可以使用本领域已知的任何技术产生，例如，通过在免疫程序完成后使从动物收获的脾细胞永生化。使用本领域已知的任何技术，例如通过用脾细胞与骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤可以使这些脾细胞永生化。参见，例如，Antibodies[抗体]；Harlow和Lane,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),第1版(例如1988年)，或第2版(例如2014年)。用于在产生杂交瘤的融合程序中使用的骨髓瘤细胞优选地是非抗体产生的，具有高融合效率和酶缺陷，使得它们不能在某些选择性培养基中生长，该培养基仅支持所需融合细胞(杂交瘤)的生长。在与小鼠细胞融合中使用的适合的细胞系的实例包括但不限于，Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul。用于与大鼠细胞融合的适合的细胞系的实例包括但不限于R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。用于细胞融合的其他细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
在一些情况下，通过以下产生杂交瘤细胞系：通过使用PAC1免疫原(参见，例如WO2014/144632)对动物(例如，具有人免疫球蛋白序列的兔、大鼠、小鼠或转基因动物)进行免疫；从这些免疫动物中收获脾细胞；将收获的脾细胞与骨髓瘤细胞系融合，从而产生杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，并鉴定产生与PAC1结合的抗体的杂交瘤细胞系。另一种用于产生单克隆抗体的有用的方法是在Babcook等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],第93卷:7843-7848,1996中描述的SLAM方法。
由杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体可以使用本领域已知的任何技术(例如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)进行纯化。可以进一步筛选杂交瘤上清液或mAb以鉴定具有特定性质的mAb，例如结合PAC1(例如，人PAC1、食蟹猴PAC1或大鼠PAC1)的能力；对其他PAC1家族成员的交叉反应性(例如，人VPAC1或人VPAC2)；阻断或干扰PACAP配体与PAC1结合的能力，或功能性地阻断PACAP诱导的PAC1受体的激活的能力，例如如本文所述的cAMP测定。
在一些实施例中，基于本文所述的这些抗体的CDR和可变区序列，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段是嵌合的或人源化抗体或其抗原结合片段。嵌合抗体是由来自不同抗体的蛋白质区段组成的抗体，这些抗体共价连接以产生功能性免疫球蛋白轻链或重链或其结合片段。通常，重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源，而该(这些)链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源。对于涉及嵌合抗体的方法，参见，例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:6851-6855，这二者通过引用以其全部内容并入本文。
通常，制备嵌合抗体的目的是产生嵌合体，其中来自预期物种的氨基酸数量最大化。一个实例是“CDR移植”的抗体，其中该抗体包含来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的一个或多个CDR，而该(这些)抗体链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源。例如，在美国专利号6,180,370、号5,693,762、号5,693,761、号5,585,089和号5,530,101中描述了CDR移植。为了在人类中使用，来自啮齿动物或兔抗体的可变区或所选的CDR通常被移植到人抗体中，代替人抗体的天然存在的可变区或CDR。
嵌合抗体的一种有用的类型是“人源化的”抗体。通常，人源化抗体是由最初在非人动物(例如啮齿动物或兔)中得到的单克隆抗体而产生。该单克隆抗体中的某些氨基酸残基，通常来自抗体的非抗原识别部分，被修饰为与相应同种型的人抗体中的相应残基同源。例如，可以例如使用各种方法通过用啮齿动物或兔的可变区的至少一部分取代人抗体的相应区域来进行人源化(参见，例如，美国专利号5,585,089和号5,693,762；Jones等人,1986,Nature[自然]321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature[自然]332:323-27；和Verhoeyen等人,1988,Science[科学]239:1534-1536)。
在一方面，本文提供的这些抗体的轻链和重链可变区的CDR(参见，表1A和1B)从来自相同或不同***发育物种的抗体移植到框架区(FR)。例如，表1A和1B中列出的重链和轻链可变区的CDR可以移植到共有人FR上。为产生共有人FR，可以比对来自若干种人重链或轻链氨基酸序列的FR以鉴定共有氨基酸序列。可替代地，来自一条重链或轻链的移植可变区可以与恒定区一起使用，该恒定区不同于本文披露的特定重链或轻链的恒定区。在其他实施例中，这些移植的可变区是单链Fv抗体的一部分。
在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段是完全人抗体或其抗原结合片段。在WO 2014/144632中描述的免疫原或其片段可以产生特异性地结合人PAC1的完全人抗体，例如由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的序列组成的多肽。“全人源抗体”是包含衍生自或指示人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。提供用于实施完全人抗体的一种特定手段是小鼠体液免疫***的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入其中内源Ig基因已经失活的小鼠中是在小鼠中产生完全人单克隆抗体(mAb)的一种方法，小鼠是可以用任何所需抗原进行免疫的动物。使用完全人抗体可以最小化免疫原性和过敏反应，该免疫原性和过敏反应有时可以通过将小鼠mAb或小鼠衍生的mAb作为治疗剂给予人而引起。
可以通过免疫转基因动物(通常是小鼠)来产生完全人抗体，这些转基因动物能够在内源性免疫球蛋白产生缺失的情况下产生人抗体库。用于此目的的抗原典型地具有六个或更多个连续氨基酸，并且任选地与载体缀合，例如半抗原。参见，例如，Jakobovits等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:2551-2555；Jakobovits等人,1993,Nature[自然]362:255-258；和Bruggermann等人,1993,Year in Immunol.[免疫学之年]7:33。在这种方法的一个实例中，通过以下方法产生转基因动物：使编码其中的小鼠重和轻免疫球蛋白链的内源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，并将包含编码人重链和轻链蛋白质的基因座的人基因组DNA的大片段***小鼠基因组中。然后将具有少于人免疫球蛋白基因座的全部补体的部分经修饰的动物杂交以获得具有全部所需免疫***修饰的动物。当给予免疫原时，这些转基因动物产生对免疫原具有免疫特异性但具有人氨基酸序列而不是鼠氨基酸序列的抗体(包括可变区)。有关此类方法的更多详细信息，参见，例如，WO 96/33735和WO 94/02602。用于生成人抗体涉及转基因小鼠的另外的方法描述于美国专利号5,545,807；美国专利号6,713,610；号6,673,986；号6,162,963；美国专利号5,939,598；号5,545,807；号6,300,129；号6,255,458；号5,877,397；号5,874,299和号5,545,806；PCT公开号WO91/10741、WO 90/04036、WO 94/02602、WO 96/30498、WO 98/24893和EP 546073 B1和EP546073 A1中。
上述转基因小鼠，被称为“HuMab”小鼠，包含编码未经重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，以及使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变(Lonberg等人,1994,Nature[自然]368:856-859)。因此，小鼠表现出小鼠IgM和κ蛋白的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg和Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.[国际免疫学综述]13:65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N.YAcad.Sci.[纽约科学院年报]764:536-546)。HuMab小鼠制备的细节描述如下：在Taylor等人,1992,Nucleic Acids Research[核酸研究]20:6287-6295；Chen等人,1993,International Immunology[国际免疫学]5:647-656；Tuaillon等人,1994,J.Immunol.[免疫学杂志]152:2912-2920；Lonberg等人,1994,Nature[自然]368:856-859；Lonberg,1994,Handbook of Exp.Pharmacology[实验药理学手册]113:49-101；Taylor等人,1994,International Immunology[国际免疫学]6:579-591；Lonberg和Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.[国际免疫学综述]13:65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N.YAcad.Sci.[纽约科学院年报]764:536-546；Fishwild等人,1996,Nature Biotechnology[自然生物技术]14:845-851；前述参考文件通过引用以其全部内容并入本文。参见，另外的美国专利号5,545,806；美国专利号5,569,825；美国专利号5,625,126；美国专利号5,633,425；美国专利号5,789,650；美国专利号5,877,397；美国专利号5,661,016；美国专利号5,814,318；美国专利号5,874,299；和美国专利号5,770,429；以及美国专利号5,545,807；国际公开号WO 93/1227；WO 92/22646；和WO 92/03918，其全部披露均通过引用以其全部内容并入本文。在这些转基因小鼠中用于产生人抗体利用的技术还在WO 98/24893，和Mendez等人,1997,Nature Genetics[自然遗传学]15:146-156中进行了披露，其通过引用并入本文。例如，HCo7和HCo12转基因小鼠株可用于产生完全人抗PAC1抗体。适合于产生完全人抗PAC1抗体的一个特定的转基因小鼠系是在以下中描述的
Figure BDA0002576823830001211
转基因小鼠系：美国专利号6,114,598；6,162,963；6,833,268；7,049,426；7,064,244；Green等人,1994,Nature Genetics[自然遗传学]7:13-21；Mendez等人,1997,Nature Genetics[自然遗传学]15:146-156；Green和Jakobovitis,1998,J.Ex.Med[实验医学杂志],188:483-495；Green,1999,Journal of ImmunologicalMethods[免疫学方法杂志]231:11-23；Kellerman和Green,2002,Current Opinion in Biotechnology[生物技术的新见]13,593-597，其全部均通过引用以其全部内容并入本文。
还可以使用噬菌体展示技术产生人源抗体。噬菌体展示描述于，例如，Dower等人,WO 91/17271,McCafferty等人,WO 92/01047，以及Caton和Koprowski,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],87:6450-6454中，将其各自通过引用以其全部内容并入本文。由噬菌体技术产生的抗体通常作为抗原结合片段产生，例如，在细菌中的Fv或Fab片段，因此缺乏效应子功能。效应子功能可以通过以下两种策略之一引入：如果需要，可以将片段工程化为用于在哺乳动物细胞中表达的完整抗体，或工程化为具有能够触发效应子功能的第二结合位点的双特异性抗体片段。典型地，抗体的Fd片段(VH-CH1)和轻链(VL-CL)通过PCR分别克隆并在组合噬菌体展示文库中随机重组，然后可以选择其与特定抗原结合。抗体片段在噬菌体表面上表达，并且通过抗原结合对Fv或Fab(因此含有编码抗体片段的DNA的噬菌体)的选择通过若干轮抗原结合和再扩增来完成，该过程称为淘选。对抗原具有特异性的抗体片段被富集并最终分离。噬菌体展示技术还可在用于啮齿动物单克隆抗体的人源化方法中使用，称为“引导选择”(参见Jespers,L.S.等人,1994,Bio/Technology[生物/技术]12,899-903)。为此，可以将小鼠单克隆抗体的Fd片段与人轻链文库组合展示，并然后可以用抗原选择所得杂合Fab文库。因此，小鼠Fd片段提供了指导选择的模板。随后，将所选的人轻链与人Fd片段文库组合。选择所得文库完全产生人Fab。
一旦使用任何以上描述的免疫和其他技术已经获得了根据本发明产生抗PAC1抗体的细胞，可以通过根据本文所述的标准程序从中分离和扩增DNA或mRNA来克隆特异性抗体基因。可以对由其产生的抗体进行测序并鉴定CDR，并且可以如本文所述操纵编码CDR的DNA以产生根据本发明的其他抗PAC1抗体或抗原结合片段。
在某些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段可以包含对恒定区的一个或多个突变或修饰。例如，这些抗PAC1抗体的重链恒定区或Fc区可以包含影响抗体的糖基化、效应子功能、和/或Fcγ受体结合的一个或多个氨基酸取代。术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C末端区域，该区域可以通过木瓜蛋白酶消化完整抗体而产生。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构区(CH2结构域和CH3结构域)，并任选地包含CH4结构域。在某些实施例中，该Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的Fc区。在一些实施例中，该Fc区包含来自人IgG1或人IgG2免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。Fc区可以保留效应子功能，例如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和吞噬作用。在其他实施例中，如下文进一步详细描述的，可以修饰Fc区以减少或消除效应子功能。
除非通过参考特定序列另有说明，否则在整个说明书和权利要求中，免疫球蛋白重链或轻链中氨基酸残基的编号是根据如Honegger和Pluckthun,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]309(3):657-670；2001中描述的AHo编号；或如Edelman等人,Proc.Natl.Acad.USA[美国国家科学院院刊],第63卷:78-85(1969)中描述的EU编号。如本文使用的，当提及可变区内氨基酸的位置时典型地使用AHo编号方案，然而当提及具有免疫球蛋白恒定区的氨基酸的位置时通常使用EU编号方案。
氨基酸序列中的氨基酸取代在本文中典型地用特定位置中的氨基酸残基的单字母缩写表示，然后是相对于原始目的序列的数字氨基酸位置，然后是其中取代的氨基酸残基的单字母缩写。例如，“T30D”表示相对于原始目的序列，在氨基酸位置30处由天冬氨酸残基取代苏氨酸残基。另一个实例，“S218G”表示相对于原始目的氨基酸序列，在氨基酸位置218处由甘氨酸残基取代丝氨酸残基。
免疫球蛋白Fc区的功能之一是当免疫球蛋白结合其靶标时与免疫***进行通讯。这通常被称为“效应子功能”。通讯导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。ADCC和ADCP通过Fc区与免疫***细胞表面上的Fc受体的结合来介导。CDC通过Fc区与补体***的蛋白质(例如C1q)的结合来介导。在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体在Fc区中包含一个或多个氨基酸取代以增强效应子功能，包括ADCC活性、CDC活性、ADCP活性、和/或抗体的清除或半衰期。可以增强效应子功能的示例性氨基酸取代(根据EU编号方案)包括但不限于E233L、L234I、L234Y、L235S、G236A、S239D、F243L、F243V、P247I、D280H、K290S、K290E、K290N、K290Y、R292P、E294L、Y296W、S298A、S298D、S298V、S298G、S298T、T299A、Y300L、V305I、Q311M、K326A、K326E、K326W、A330S、A330L、A330M、A330F、I332E、D333A、E333S、E333A、K334A、K334V、A339D、A339Q、P396L，或任何前述的组合。
在其他实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含Fc区中的一个或多个氨基酸取代以降低效应子功能。可以降低效应子功能的示例性氨基酸取代(根据EU编号方案)包括但不限于、C220S、C226S、C229S、E233P、L234A、L234V、V234A、L234F、L235A、L235E、G237A、P238S、S267E、H268Q、N297A、N297G、V309L、E318A、L328F、A330S、A331S、P331S，或任何前述的组合。
糖基化可以有助于抗体的效应子功能，特别是IgG1抗体。因此，在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体可包含影响抗体的糖基化水平或类型的一个或多个氨基酸取代。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的附接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸附接，尽管还可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
在某些实施例中，通过添加一个或多个糖基化位点，例如向抗体的Fc区中添加，本文所描述的这些抗PAC1抗体的糖基化。通过改变氨基酸序列使其含有一个或多个以上描述的三肽序列(针对N-连接的糖基化位点)，可以方便地完成向抗体中添加糖基化位点。还可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加至或取代起始序列(针对O-连接的糖基化位点)来进行改变。方便起见，可以通过在DNA水平上的变化来改变抗体氨基酸序列，特别是通过在预选的碱基处使编码靶多肽的DNA发生突变，从而产生将转化成所需氨基酸的密码子。
本发明还涵盖产生具有导致效应子活性变化的改变的碳水化合物结构的抗体分子，包括表现出改进的ADCC活性的具有缺失的或降低的岩藻糖基化的抗体。在本领域中已知各种方法来降低或消除岩藻糖基化。例如，ADCC效应子活性是通过抗体分子与FcγRIII受体的结合介导的，已显示该活性依赖于CH2结构域的N297残基处N-连接的糖基化的碳水化合物结构。非岩藻糖基化的抗体以增加的亲和力与该受体结合并且比天然的岩藻糖基化抗体更有效地触发FcγRIII介导的效应子功能。例如，在已经敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶的CHO细胞中非岩藻糖基化抗体的重组产生导致抗体具有100倍增加的ADCC活性(参见Yamane-Ohnuki等人,Biotechnol Bioeng.[生物技术与生物工程]87(5):614-22,2004)。类似的效果可以通过以下来实现：通过降低岩藻糖基化途径中α-1,6-岩藻糖基转移酶或其他酶的活性，例如通过siRNA或反义RNA处理，使细胞系工程化以敲除一种或多种酶或与选择性糖基化抑制剂培养(参见Rothman等人,Mol Immunol.[分子免疫学]26(12):1113-23,1989)。一些宿主细胞株(例如Lec13或大鼠杂交瘤YB2/0细胞系)天然产生具有较低岩藻糖基化水平的抗体(参见Shields等人,J Biol Chem.[生物化学杂志]277(30):26733-40,2002和Shinkawa等人,J Biol Chem.[生物化学杂志]278(5):3466-73,2003)。等分碳水化合物水平的增加，例如通过在过表达GnTIII酶的细胞中重组产生抗体，也已经确定增加ADCC活性(参见Umana等人,Nat Biotechnol.[自然生物技术]17(2):176-80,1999)。
在其他实施例中，通过去除一个或多个糖基化位点(例如从抗体的Fc区)降低或消除本文所描述的这些抗PAC1抗体的糖基化。在一些实施例中，该抗PAC1抗体是未糖基化的人单克隆抗体，例如未糖基化的人IgG1单克隆抗体。消除或改变N-连接的糖基化位点的氨基酸取代可以减少或消除抗体N-连接的糖基化。在某些实施例中，本文所描述的这些抗PAC1抗体包含位置N297处(根据EU编号方案)的重链突变，例如N297Q、N297A或N297G。在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含来自人IgG1抗体的Fc区，该人IgG1抗体具有位置N297处的突变。在一个具体的实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含来自人IgG1抗体的Fc区，该人IgG1抗体具有N297G突变。例如，在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含SEQ ID NO:324的序列。
为改善包含N297突变的分子的稳定性，可以进一步使抗PAC1抗体的Fc区工程化。例如，在一些实施例中，Fc区中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸取代以促进二聚体状态中的二硫键形成。对应于IgG1Fc区中的V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332(根据EU编号方案)的残基可以因此被半胱氨酸取代。优选地，特定残基对被半胱氨酸取代，使得它们优先彼此形成二硫键，因此限制或防止二硫键杂乱。优选的残基对包括但不限于，A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C、以及V323C和I332C。在某些实施例中，本文所描述的这些抗PAC1抗体包含来自人IgG1抗体的Fc区，该人IgG1抗体具有突变R292C和V302C。在这样的实施例中，该Fc区还可以包含N297突变，例如N297G突变。在一些实施例中，本发明的这些抗PAC1抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含SEQ ID NO:325的序列。
以下对本发明的这些抗PAC1抗体进行修饰来增加血清半衰期还可能是所希望的：例如，通过掺入或添加补救受体结合表位(例如，通过使适当的区域发生突变或通过将表位掺入肽标签中，然后在任一端或在中间与抗体融合，例如通过DNA或肽合成；参见，例如WO96/32478)或添加如PEG或其他水溶性聚合物(包括多糖聚合物)的分子。该补救受体结合表位优选构成其中来自Fc区的一个或两个环的任何一个或多个氨基酸残基被转移至抗体中类似位置的区域。甚至更优选地，转移来自Fc区的一个或两个环的三个或更多个残基。仍更优选地，表位取自Fc区(例如，IgG Fc区)的CH2结构域并转移至抗体的CH1、CH3或VH区，或多于一个这样的区。可替代地，该表位取自Fc区的CH2结构域并转移至抗体的CL区或VL区或两者。参见国际申请WO 97/34631和WO 96/32478针对Fc变体及其与补救受体的相互作用的描述。
本发明包括一个或多个分离的多核苷酸或编码本文所述的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段的分离的核酸。另外，本发明涵盖包含这些核酸的载体、包含这些核酸的宿主细胞或细胞系，以及制备本发明的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段的方法。这些核酸包含：例如，编码抗体或抗原结合片段的全部或部分的多核苷酸；例如，本发明的抗体的单链或双链，或其片段、衍生物或变体；足够用作杂交探针的多核苷酸；用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物；用于抑制多核苷酸表达的反义寡核苷酸，以及前述互补序列。核酸可以是适合于所需用途或功能的任何长度，并且可以包含一种或多种另外的序列，例如调节序列，和/或较大核酸的一部分(例如载体)。本发明的核酸分子包括处于单链和双链形式的DNA和RNA，以及相应的互补序列。DNA包括，例如cDNA、基因组DNA、化学合成的DNA、由PCR扩增的DNA、及其组合。本发明的这些核酸分子包括全长基因或cDNA分子以及其片段的组合。本发明的这些核酸可以源自人来源以及非人物种。
可以通过直接蛋白质测序确定来自免疫球蛋白或其区域(例如可变区，Fc区等)或目的多肽的相关氨基酸序列，并且可以根据通用密码子表设计适合的编码核苷酸序列。可替代地，可以使用常规的程序(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)从产生这些抗体的细胞中分离和测序编码本发明的单克隆抗体或其结合片段的基因组或cDNA。
本文中与“分离的多核苷酸”可互换地使用的“分离的核酸”是在核酸从天然存在的来源分离的情况下，已经从生物的基因组中存在的相邻遗传序列分离的核酸，该生物的核酸是分离的。在从模板或化学上酶促合成核酸的情况下，如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸，例如应理解由这些过程产生的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子是指处于单独片段形式的核酸分子或作为较大核酸构建体的组分。在一个优选的实施例中，这些核酸基本上不含污染的内源物质。核酸分子优选衍生自以基本上纯的形式和按能够通过标准生物化学方法(例如在Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册],第2版,冷泉港实验室,纽约冷泉港(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY)(1989)中概述的那些)鉴定、操作和回收其组分核苷酸序列的数量或浓度分离至少一次的DNA或RNA。此类序列优选以不受内部非翻译序列或内含子中断的开放阅读框的形式提供和/或构建，这些内部非翻译序列或内含子典型地存在于真核基因中。非翻译DNA的序列可以存在于开放阅读框的5'或3'，其中开放阅读框不会干扰编码区的操纵或表达。除非另有说明，否则本文讨论的任何单链多核苷酸序列的左手端是5’；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5’方向。新生RNA转录物的5'至3'产生方向被称为转录方向；DNA链上具有与RNA转录物相同的序列，该序列是RNA转录物的5'到5'端的序列区被称为“上游序列”；DNA链上具有与RNA转录物相同的序列，该序列是RNA转录物的3'到3'端的序列区被称为“下游序列”。
本发明还包括在中等严格条件下，和更优选高严格条件下与编码如本文所述的多肽的核酸杂交的核酸。影响杂交条件的选择的基本参数以及有关设计适合条件的指导由以下陈述：Sambrook,Fritsch和Maniatis(1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验指南]，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约，第9和11章；及Current Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验技术],1995,Ausubel等人编,约翰&威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.),第2.10和6.3-6.4节)，并且可以由本领域的普通技术人员基于例如该DNA的长度和/或碱基组成容易地确定。实现中等严格条件的一种方式涉及使用含有5xSSC、0.5％SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)的预洗涤溶液，约50％甲酰胺、6xSSC的杂交缓冲液以及约55℃的杂交温度(或其他类似的杂交溶液，如含有约50％甲酰胺的杂交溶液，其中杂交温度为约42℃)以及约60℃、在0.5xSSC、0.1％SDS中的洗涤条件。通常，高严格条件被定义为如上的杂交条件，但其中在大约68℃、0.2xSSC、0.1％SDS中进行洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中SSPE(lx SSPE是0.15MNaCl、10mM NaH2PO4、和1.25mM EDTA、pH7.4)可以代替SSC(lx SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后，将洗涤进行15分钟。应当理解，通过应用控制杂交反应和双链体稳定性的基本原理，可以根据需要调节洗涤温度和洗涤盐浓度以达到所需的严格程度，如本领域技术人员已知的并进一步描述如下(参见，例如Sambrook等人,1989)。
当将核酸与未知序列的靶核酸杂交时，假定杂交长度是杂交核酸的长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过比对这些核酸的序列并鉴定最佳序列互补性的一个或多个区域来确定杂交体长度。预期长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度应比杂交体的解链温度(Tm)低5℃至10℃，其中Tm根据下列等式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(#A+T碱基)+4(#G+C碱基)。对于长度大于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中的碱基数，并且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度([Na+]对于lxSSC＝0.165M)。优选地，每个这样的杂交核酸具有的长度为至少15个核苷酸(或更优选地至少18个核苷酸、或至少20个核苷酸、或至少25个核苷酸、或至少30个核苷酸、或至少40个核苷酸、或最优选地至少50个核苷酸)，或与其杂交的本发明的核酸长度的至少25％(更优选地至少50％、或至少60％、或至少70％，和最优选地至少80％)，并且具有与其杂交的本发明的核酸的至少60％序列同一性(更优选地至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、和最优选地至少99.5％)，其中如上文更详细描述的通过在比对时比较杂交核酸的序列来确定序列同一性，以便最大化重叠和同一性，同时最小化序列空位。
本文所述的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段的变体可以按如下来制备：使用盒或PCR诱变或本领域熟知的其他技术，例如在实例3中描述的那些，通过编码多肽的DNA中核苷酸的定点诱变，以产生编码变体的DNA，并在此之后如本文所概述在细胞培养物中表达重组DNA。然而，可以使用已建立的技术通过体外合成制备包含具有多达约100-150个残基的变体CDR的抗体或抗原结合片段。这些变体通常表现出与天然存在的类似物相同的定性生物活性，例如与抗原结合。这样的变体包括，例如抗体的氨基酸序列内残基的缺失和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以达到最终构建体，条件是最终的构建体具有所希望的特征。氨基酸变化还可以改变抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置。在某些实施例中，制备抗体变体以意图修饰直接参与表位结合的那些氨基酸残基。在其他实施方案中，出于本文讨论的目的，不直接参与表位结合的残基或以任何方式不参与表位结合的残基的修饰是所希望的。任何CDR区和/或框架区内的诱变被预期。本领域技术人员可以采用协方差分析技术来设计抗体的氨基酸序列中有用的修饰。参见，例如，Choulier,等人,Proteins[蛋白质]41:475-484,2000；Demarest等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]335:41-48,2004；Hugo等人,Protein Engineering[蛋白质工程]16(5):381-86,2003；Aurora等人,美国专利公开号2008/0318207 A1；Glaser等人,美国专利公开号2009/0048122 A1；Urech等人,WO 2008/110348 A1；Borras等人,WO 2009/000099 A2。通过协方差分析确定的这种修饰可以改进抗体的效力、药代动力学、药效学和/或可制造性特征。
表4A和4B分别显示本文所述的抗PAC1抗体的编码全长轻链和重链的示例性核酸序列。表5A和5B显示本文所述的抗PAC1抗体的分别编码轻链和重链可变区的示例性核酸序列。可以使用编码抗PAC1可变区的多核苷酸，与任选地分别编码表2和3中列出的轻链和重链恒定区的核酸以构建本发明的这些抗体和抗原结合片段。
表5A.示例性抗PAC1抗体轻链可变区核酸序列
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表5B.示例性抗PAC1抗体重链可变区核酸序列
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编码本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段的分离的核酸可以包含与表4A、4B、5A和5B中列出的任何核苷酸序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，编码抗PAC1抗体轻链可变区的分离的核酸包含与选自SEQ ID NO:328至342的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少98％同一性的序列。在其他实施例中，编码抗PAC1抗体轻链可变区的分离的核酸包含与选自SEQ ID NO:343至363的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少98％同一性的序列。在某些实施例中，编码抗PAC1抗体轻链可变区的分离的核酸包含选自SEQ ID NO:328至342的序列。在某些其他的实施例中，编码抗PAC1抗体轻链可变区的分离的核酸包含选自SEQ ID NO:343至363的序列。在相关的实施例中，编码抗PAC1抗体重链可变区的分离的核酸包含与选自SEQ ID NO:364至468的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少98％同一性的序列。在其他相关的实施例中，编码抗PAC1抗体重链可变区的分离的核酸包含与选自SEQ ID NO:469至485的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，编码抗PAC1抗体重链可变区的分离的核酸包含选自SEQ ID NO:364至468的序列。在其他实施例中，编码抗PAC1抗体重链可变区的分离的核酸包含选自SEQ IDNO:469至485的序列。
在一些实施例中，编码抗PAC1抗体轻链的分离的核酸包含与选自SEQ ID NO:537至541的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少98％同一性的序列。在其他实施例中，编码抗PAC1抗体轻链的分离的核酸包含与选自SEQ ID NO:542至551的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少98％同一性的序列。在某些实施例中，编码抗PAC1抗体轻链的分离的核酸包含选自SEQ ID NO:537至541的序列。在某些其他的实施例中，编码抗PAC1抗体轻链的分离的核酸包含选自SEQ ID NO:542至551的序列。在相关的实施例中，编码抗PAC1抗体重链的分离的核酸包含与选自SEQID NO:552至562的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少98％同一性的序列。在其他相关的实施例中，编码抗PAC1抗体重链的分离的核酸包含与选自SEQ ID NO:563至569的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少98％同一性的序列。在一些实施例中，编码抗PAC1抗体重链的分离的核酸包含选自SEQID NO:552至562的序列。在其他实施例中，编码抗PAC1抗体重链的分离的核酸包含选自SEQID NO:563至569的序列。
表4A、4B、5A和5B中提供的核酸序列仅是示例性的。如本领域技术人员将理解的，由于遗传密码的简并性，可以制备极大量的核酸，所有这些核酸都编码本文所述的这些抗体和抗原结合片段的CDR、可变区、以及重链和轻链或其他组分。因此，在鉴定了特定的氨基酸序列后，本领域技术人员可以通过简单地以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式修饰一个或多个密码子的序列来制备任何数量的不同核酸。
本发明还包括载体，这些载体包含编码本发明的这些抗体或抗原结合片段(例如，可变区、轻链和重链)的一个或多个组分的一个或多个核酸。术语“载体”是指用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、细菌噬菌体或病毒)。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、非游离基因的哺乳动物载体和表达载体(例如重组表达载体)。如本文使用的术语“表达载体”或“表达构建体”是指含有所需编码序列的重组DNA分子和用于在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所必需的适合的核酸控制序列。表达载体可包括但不限于影响或控制转录、翻译的序列，并且如果存在内含子，则影响与其可操作连接的编码区的RNA剪接。用于在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子，任选地操纵序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子、和终止子以及多腺苷酸化信号。
分泌信号肽序列还可以任选地由表达载体编码，与目的编码序列可操作地连接，使得表达的多肽可以由重组宿主细胞分泌，如果需要，以便更容易地从细胞中分离目的多肽。例如，在一些实施例中，信号肽序列可以附加/融合至表1A和1B中列出的任何可变区多肽序列或表4A和4B中列出的任何全链多肽序列的氨基端。在某些实施例中，具有MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(SEQ ID NO:486)的氨基酸序列的信号肽与表1A和1B中的任何可变区多肽序列或表4A和4B中的全链多肽序列的氨基端融合。在其他实施例中，具有MAWALLLLTLLTQGTGSWA(SEQ ID NO:487)的氨基酸序列的信号肽与表1A和1B中的任何可变区多肽序列或表4A和4B中的全链多肽序列的氨基端融合。在仍其他的实施例中，具有MTCSPLLLTLLIHCTGSWA(SEQ ID NO:488)的氨基酸序列的信号肽与表1A和1B中的任何可变区多肽序列或表4A和4B中的全链多肽序列的氨基端融合。可以与本文所述的可变区多肽序列或全链多肽序列的氨基端融合的其他适合的信号肽序列包括：MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:489)、MEWTWRVLFLVAAATGAHS(SEQ ID NO:490)、METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQID NO:491)、METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:492)、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO:493)、MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO:494)、MDIRAPTQLLGLLLLWLPGAKC(SEQ ID NO:495)、MDIRAPTQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:496)、MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF(SEQ ID NO:497)、MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:498)、METGLRWLLLVAVLKGVQC(SEQ ID NO:499)、METGLRWLLLVAVLKGVQCQE(SEQ ID NO:500)、以及MDMRAPTQLLGLLLLWLPGARC(SEQ IDNO:501)。其他信号或分泌肽是本领域技术人员已知的，并且可以与表1A和1B中列出的任何可变区多肽链或表4A和4B中的全链多肽序列融合，例如，以促进或优化特定宿主细胞中的表达。
通常，在宿主细胞中用于产生本发明的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段的表达载体将含有用于质粒维持和用于克隆和表达编码抗体和抗原结合片段的组分的外源核苷酸序列的序列。在某些实施例中，这些序列(统称为“侧翼序列”)将通常包括一个或多个以下的核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整的内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于***编码待表达多肽的核酸的多接头区，以及选择标记元件。这些序列中的每一个讨论如下。
任选地，载体可含有“标签”-编码序列，即，位于多肽编码序列的5'或3'端的寡核苷酸分子；寡核苷酸标签序列编码polyHis(例如hexaHis)、FLAG、HA(血凝素流感病毒)、myc或另一种存在的可商购的抗体的“标签”分子。该标签通常在多肽表达时与多肽融合，并且可以用作用于亲和纯化或从宿主细胞检测多肽的手段。可以例如通过使用针对标签的抗体作为亲和基质的柱色谱法来完成亲和纯化。任选地，随后可以通过各种方法从纯化的多肽中去除标签，例如使用某些肽酶进行切割。
侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)；异源的(即，来自宿主细胞物种或菌株以外的物种)；杂交体(即来自不止一种侧翼序列的组合)；合成的或原生的。因此，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物、任何脊椎动物或无脊椎动物、或任何植物，条件是侧翼序列在宿主细胞机器中起作用并且可以被宿主细胞机器激活。
在本发明载体中有用的侧翼序列可通过本领域熟知的若干种方法中的任何一种获得。通常，先前通过作图和/或通过限制性内切核酸酶消化鉴定本文中有用的侧翼序列，并可以因此可使用适当的限制性内切核酸酶从合适的组织来源分离。在一些情况下，侧翼序列的完整核苷酸序列可能是已知的。在此，可以使用用于核酸合成或克隆的常规方法合成侧翼序列。
无论是全部还是仅部分侧翼序列是已知的，可以使用聚合酶链式反应(PCR)和/或通过用适合的探针(例如寡核苷酸和/或来自相同或另外物种的侧翼序列片段)筛选基因组文库来获得。在侧翼序列未知的情况下，含有侧翼序列的DNA片段可以从较大的DNA片段中分离，该片段可以包含例如编码序列或甚至另一个或多个基因。可以通过限制性内切核酸酶消化以产生合适的DNA片段，然后使用琼脂糖凝胶纯化、
Figure BDA0002576823830001601
柱色谱(查茨沃思(Chatsworth)，加利福尼亚州)或本领域技术人员已知的其他方法进行分离来完成分离。为了实现该目的，选择合适的酶对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
复制起点通常是可商购的那些原核表达载体的一部分，并且起点有助于在宿主细胞中载体的扩增。如果选择的载体不含复制起点位点，可以基于已知序列化学合成复制起点位点，并连接到载体中。例如，来自质粒pBR322(新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs)，贝弗利，马萨诸塞州)的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌和各种病毒来源(如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水疱性口腔病毒(VSV)、或***瘤病毒(如HPV或BPV))可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(例如，通常仅使用SV40起源因为它还含有病毒早期启动子)。
转录终止序列通常位于多肽编码区的3'端，并用于终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段，其后是聚T序列。虽然序列易于从文库中克隆或甚至作为载体的一部分可商购，但它还可以使用已知的核酸合成方法容易地合成。
选择性标记基因编码在选择性培养基中生长的对于宿主细胞的存活和生长所必需的蛋白质。典型的选择性标记基因编码的蛋白质(a)赋予抗生素或其他毒素，例如氨苄青霉素、四环素或卡那霉素对原核宿主细胞的抗性；(b)补充细胞的营养缺陷型缺陷；或(c)提供复杂或特定介质无法获得的关键营养素。特异的选择性标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利地，新霉素抗性基因还可同时用于在原核和真核宿主细胞中进行选择。
其他可选择的基因可用于扩增将表达的基因。扩增是这样的过程，其中产生对生长或细胞存活至关重要的蛋白质所需的基因在重组细胞的连续世代的染色体内串联重复。用于哺乳动物细胞的适合的选择性标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子胸苷激酶基因。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中由于载体中存在的可选择基因仅使转化体独特地适应存活。通过在培养基中选择剂浓度连续增加的条件下培养转化细胞来施加选择压力，从而导致可选择基因和编码另一种基因(例如本文所述的这些抗体或抗原结合片段的一个或多个组分)的DNA的扩增。因此，从扩增的DNA合成增加量的多肽。
核糖体结合位点通常是mRNA翻译起始所必需的，并且其特征在于Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。该元件典型地位于启动子的3’端和待表达多肽的编码序列的5’端。在某些实施例中，一个或多个编码区可以与内部核糖体结合位点(IRES)可操作地连接，允许从单个RNA转录物翻译两个开放阅读框。
在某些情况下，例如其中在真核宿主细胞表达***中糖基化是所希望的情况下，可以操纵各种前序列或原序列(prosequence)以改进糖基化或产量。例如，可以改变特定信号肽的肽酶切割位点，或添加原序列，这还可以影响糖基化。最终的蛋白质产物可以在-1位置(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)具有一个或多个偶然表达的另外的氨基酸，该氨基酸可能尚未被完全去除。例如，最终的蛋白质产物可以在肽酶切割位点中发现具有一个或两个氨基酸残基，与氨基端附接。可替代地，如果酶在成熟多肽内的这样的区域切割，那么使用一些酶切割位点可导致所需多肽的略微截短形式。
本发明的表达和克隆载体将通常含有被宿主生物识别并与编码多肽的分子可操作连接的启动子。如本文使用的，术语“可操作地连接”是指两个或更多个核酸序列按如下方式的连接：这样的方式使得产生能够指导给定基因的转录和/或合成所需蛋白质分子的核酸分子。例如，将与蛋白质编码序列“可操作地连接”的载体中的控制序列连接到其上，以便在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。更具体地，如果启动子和/或增强子序列(包括顺式作用转录控制元件的任何组合)在合适的宿主细胞或其他表达***中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子和/或增强子序列与编码序列可操作地连接。
启动子是位于结构基因起始密码子上游(即5')的非转录序列(通常在约100-1000bp内)，控制结构基因的转录。常规地将启动子分为两类(诱导型启动子和组成型启动子)之一。响应于培养条件的某些变化(例如营养物的存在或缺失或温度的变化)，在诱导型启动子控制下启动来自DNA的转录水平增加。另一方面，组成型启动子均匀地转录它们可操作地连接的基因，其中对基因表达控制很少或没有控制。由各种潜在宿主细胞识别的大量启动子是熟知的。通过由限制酶消化从源DNA中去除启动子并将所需启动子序列***到载体中，将合适的启动子与编码例如重链、轻链或本发明的这些抗体和抗原结合片段的其他组分的DNA可操作地连接。
适用于酵母宿主的启动子也是本领域熟知的。酵母增强剂有利地与酵母启动子一起使用。用于哺乳动物宿主细胞的适合的启动子是熟知的，并且包括但不限于从病毒基因组获得的那些，例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒血清型2、8或9)、牛***瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。其他合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如，热休克启动子和肌动蛋白启动子。
可能是目的启动子的其他特定启动子包括但不限于：SV40早期启动子(Benoist和Chambon,1981,Nature[自然]290:304-310)；CMV启动子(Thornsen等人,1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.[美国国家科学院院刊]81:659-663)；劳斯氏肉瘤病毒的3'长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等人,1980,Cell[细胞]22:787-797)；疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]78:1444-1445)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调节序列(Prinster等人,1982,Nature[自然]296:39-42)；和原核生物启动子，例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]80:21-25)。同样令人感兴趣的是以下动物转录控制区，这些控制区展示出组织特异性并已用于转基因动物：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人,1984,Cell[细胞]38:639-646；Ornitz等人,1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.[冷泉港定量生物学研讨会]50:399-409；MacDonald,1987,Hepatology[肝脏学]7:425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan,1985,Nature[自然]315:115-122)；在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人,1984,Cell[细胞]38:647-658；Adames等人,1985,Nature[自然]318:533-538；Alexander等人,1987,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]7:1436-1444)；在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等人,1986,Cell[细胞]45:485-495)；在肝中有活性的清蛋白基因控制区(Pinkert等人,1987,Genes and Devel.[基因与发育]1:268-276)；在肝脏中有活性的α-胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人,1985,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]5:1639-1648；Hammer等人,1987,Science[科学]253:53-58)；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人,1987,Genes and Devel.[基因与发育]1:161-171)；在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等人,1985,Nature[自然]315:338-340；Kollias等人,1986,Cell[细胞]46:89-94)；在大脑中少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等人,1987,Cell[细胞]48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani,1985,Nature[自然]314:283-286)；以及在下丘脑中有活性的***释放激素基因控制区(Mason等人,1986,Science[科学]234:1372-1378)。
可以将增强子序列***载体中以增加由高等真核生物对编码这些抗体或抗原结合片段(例如，轻链、重链或可变区)的组分的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常长度为约10-300bp，作用于启动子以增加转录。增强子相对于方向和位置无关，已经在转录单元的5'和3'位置发现。可从哺乳动物基因中获得的若干增强子序列是已知的(例如，球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。然而，通常使用来自病毒的增强子。本领域已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是用于激活真核生物启动子的示例性增强元件。虽然增强子可以位于编码序列的5'或3'的载体中，但它通常位于启动子的5'位点。可以将编码合适的天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列掺入表达载体中，以促进如上所述的抗体或抗原结合片段的细胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于其中待产生的抗体或抗原结合片段的宿主细胞的类型，并且异源信号序列可以代替天然信号序列。如上描述了信号肽的实例。在哺乳动物宿主细胞中有功能的其他信号肽包括：在美国专利号4,965,195中描述的白细胞介素-7(IL-7)的信号序列；在Cosman等人,1984,Nature[自然]312:768中描述的白细胞介素-2受体的信号序列；在EP专利号0367566中描述的白细胞介素-4受体信号肽；在美国专利号4,968,607中描述的I型白细胞介素-1受体信号肽；以及EP专利号0460846中描述的II型白细胞介素-1受体信号肽。
提供的表达载体可以由起始载体构建，例如可商购的载体。这些载体可以包含或不包含所有所需的侧翼序列。当本文所述的一个或多个侧翼序列尚未存在于载体中时，它们可以单独获得并连接到载体中。用于获得每个侧翼序列的方法是本领域技术人员熟知的。可以将表达载体引入宿主细胞中，从而产生蛋白质，包括如本文所述的由核酸编码的抗体和抗原结合片段。
在某些实施例中，可以将编码本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段的不同组分的核酸***相同的表达载体中。例如，可以将编码抗PAC1抗体轻链或可变区的核酸克隆到与编码抗PAC1抗体重链或可变区的核酸相同的载体中。在这样的实施例中，两个核酸可以由内部核糖体进入位点(IRES)分离并且在单个启动子的控制下，使得轻链和重链从相同的mRNA转录物表达。可替代地，两种核酸可以在两个单独的启动子的控制下，使得轻链和重链从两个单独的mRNA转录物表达。在一些实施例中，编码抗PAC1抗体轻链或可变区的核酸被克隆到一种表达载体中，并且编码抗PAC1抗体重链或可变区的核酸被克隆到第二表达载体中。在这样的实施例中，可以将宿主细胞与两种表达载体共转染以产生本发明的完整抗体或抗原结合片段。
在载体已经被构建并且编码本文所述的这些抗体和抗原结合片段的组分的一个或多个核酸分子已经被***一个或多个载体中的一个或多个合适的位点后，可以将完成的一个或多个载体***适合的宿主细胞中以进行扩增和/或多肽表达。因此，本发明涵盖分离的宿主细胞或细胞系，该宿主细胞或细胞系包含编码本文所述的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段的组分的一个或多个表达载体。如本文使用的，术语“宿主细胞”是指已经用核酸转化或是能够转化的细胞，从而表达目的基因。该术语包括亲本细胞的后代，无论该后代在形态上或在遗传构成上是否与原始亲本细胞相同，只要存在目的基因即可。包含本发明的分离的核酸，优选地与至少一个表达控制序列(例如，启动子或增强子)可操作地连接的宿主细胞是“重组宿主细胞”。
可以通过以下熟知的方法完成将抗PAC1抗体或抗原结合片段的表达载体转化到所选的宿主细胞中，这些方法包括：转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他已知的技术。所选择的方法将是待使用的宿主细胞类型的部分功能。这些方法和其他适合的方法对于本领域技术人员是熟知的，并且列出在例如，在Sambrook等人,2001中。
当在适当条件下培养时，宿主细胞合成抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段随后可从培养基(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)中收集或直接从产生它的宿主细胞中收集(如果是未分泌的)。合适的宿主细胞的选择将取决于各种因素，例如所需的表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)以及易于折叠成生物活性分子。
示例性宿主细胞包括原核生物细胞、酵母或高等真核细胞。原核生物宿主细胞包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))、志贺氏菌属(Shigella)以及芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))，假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)。真核微生物(如丝状真菌或酵母)是用于重组多肽的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是在低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株在本文中通常可获得且是有用的，例如毕赤酵母属(Pichia)(例如，毕赤酵母(P.pastoris))粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、亚罗酵母属(Yarrowia)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如像脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)以及曲霉属(Aspergillus)宿主(例如，构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger))。
用于表达糖基化抗体和抗原结合片段的宿主细胞可以来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体以及来自以下宿主的相应的许可性昆虫宿主细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染此类细胞的多种病毒株是公开可获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株。
脊椎动物宿主细胞还可以是合适的宿主，并且来自这些细胞的抗体和抗原结合片段的重组产生已成为常规程序。可用作表达的宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，并且包括但不限于可从美国种质保存中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括CHOK1细胞(ATCCCCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216,1980)；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚胎肾系(亚克隆293或293细胞用于在悬浮培养中生长(Graham等人,J.GenVirol.[普通病毒学杂志]36:59，1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；小鼠塞托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学]23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1、ATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587)；人***细胞(HELA,ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442)；人类肺细胞(W138，ATCCCCL75)；人肝癌细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562,ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等人,AnnalsN.YAcad.Sci.[纽约科学院年报]383:44-68,1982)；MRC5细胞或FS4细胞；哺乳动物骨髓瘤细胞，以及许多其他的细胞系。在某些实施例中，可以通过确定哪些细胞系具有高表达水平并组成性地产生具有PAC1结合特性的抗体和抗原结合片段来选择细胞系。在另一个实施例中，可以选择来自B细胞谱系的细胞系，该细胞系不产生其自身抗体但具有产生和分泌异源抗体的能力。在一些实施例中，CHO细胞是优选的宿主细胞，用于表达本发明的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段。
用上述核酸或载体转化或转染宿主细胞以产生抗PAC1抗体或抗原结合片段，并在适当改进的常规营养介质中培养用于诱导启动子、选择转化子、或扩增编码所需的序列的基因。此外，具有由选择性标记分离的转录单位的多拷贝的新颖的载体和经转染的细胞系对抗体和抗原结合片段的表达特别有用。因此，本发明还提供了用于产生本文所述抗PAC1抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在允许由一个或多个表达载体编码的抗体或抗原结合片段表达的条件下，在培养基中培养包含本文所述的一个或多个表达载体的宿主细胞；以及从培养基或宿主细胞中回收抗体或抗原结合片段。
可以将用于产生本发明的这些抗体或抗原结合片段的宿主细胞在各种介质中进行培养。以下可商购的介质适用于培养宿主细胞：Ham'sF10(西格玛公司(Sigma))、极限必需培养基(MEM，西格玛公司)、RPMI-1640(西格玛公司)和达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，西格玛公司)。另外，在Ham等人,Meth.Enz.[酶学方法]58:44,1979；Barnes等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]102:255,1980；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90103430；WO 87/00195；或美国专利登记号30,985中描述的可以用作宿主细胞的培养基的任何介质。任何这些介质都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)；盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)；缓冲液(如HEPES)；核苷酸(如腺苷和胸苷)；抗生素(如庆大霉素TM药物)；微量元素(被定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等效能源。还可以按本领域技术人员已知的适当浓度包含任何其他必需的补充剂。培养条件(例如温度，pH等)是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员将是显而易见的。
在培养宿主细胞后，抗体或抗原结合片段可以在细胞内、周质间隙中产生，或直接分泌到介质中。如果在细胞内产生抗体或抗原结合片段，作为第一步骤，例如通过离心或超滤去除宿主细胞或裂解的片段的颗粒状碎片。使用以下来纯化抗体或抗原结合片段：例如，羟磷灰石层析、阳离子或阴离子交换层析法、或优选地亲和层析，使用一种或多种目的抗原或蛋白A或蛋白G作为亲和力配体。可以将蛋白A用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的包含多肽的蛋白质(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.[免疫学方法杂志]62:1-13,1983)。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人,EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]5:1567-1575,1986)。亲和配体所附接的基质通常是琼脂糖，但也可以使用其他基质。机械稳定的基质，例如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，与用琼脂糖相比，可以实现更快的流速和更短的加工时间。当蛋白质包含CH3结构域时，BakerbondABXTM树脂(J.T.Baker，菲利普斯堡，新泽西州)可用于纯化。用于蛋白质纯化的其他技术如乙醇沉淀、反相HPLC、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可能的，这取决于待回收的特定抗体或抗原结合片段。
在某些实施例中，本发明提供了组合物(例如，药物组合物)，该组合物包含一种或多种本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段(例如，抗PAC1单克隆抗体或其结合片段)以及药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。该药物组合物可用于本文所述的任何方法中。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干的组合物。“药学上可接受的”是指在给予人的剂量和浓度下对人类接受者无毒和/或在给予人时不产生过敏或不良反应的分子、化合物和组合物。在一些实施例中，药物组合物可含有用于改变、维持或保存组合物的以下特性的配制品材料：例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。在这样的实施例中，适合的配制品材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他糖类(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克类(pluronic)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、氚核、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物、优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药用物佐剂。用于配制用于治疗用途的分子的方法和适合的材料在制药领域中是已知的，并进行了描述，例如，在REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES[雷明顿的药物科学],第18版,(A.R.Genrmo,编辑),1990,马克出版公司(Mack PublishingCompany)。
在一些实施例中，本发明的药物组合物包含标准药物载体，例如无菌磷酸盐缓冲盐水溶液，抑菌水等。可以使用多种水性载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等，并且可以包括用于增强稳定性的经受温和的化学修饰等的其他蛋白质，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。
在配制品中这些抗体或抗原结合片段的示例性浓度可以在从约0.1mg/ml至约200mg/ml、或从约0.1mg/mL至约50mg/mL、或从约0.5mg/mL至约25mg/mL、或可替代地从约2mg/mL至约10mg/mL的范围中。抗体或抗原结合片段的水性配制品可以在pH-缓冲溶液中制备，例如，在从约4.5至约6.5、或从约4.8至约5.5、或可替代地约5.0的pH范围内。适合于该范围内的pH的缓冲剂的实例包括乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。缓冲液浓度可以是约1mM至约200mM，或约10mM至约60mM，这取决于例如缓冲液和配制品的所需等渗性。
张度剂也可以包含在配制品中，可稳定抗体或抗原结合片段。示例性张度剂包括多元醇，例如甘露醇、蔗糖或海藻糖。优选水性配制品是等渗的，尽管高渗或低渗溶液可能是合适的。配制品中多元醇的示例性浓度可以在从约1％至约15％w/v的范围内。
还可以将表面活性剂添加到配制品中以减少配制的抗体或抗原结合片段的聚集和/或使制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。示例性表面活性剂包括非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)或泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)。表面活性剂的示例性浓度可以在从约0.001％至约0.5％、或从约0.005％至约0.2％、或可替代地从约0.004％至约0.01％w/v的范围。
在一个实施例中，配制品含有上述试剂(即，抗体或抗原结合片段、缓冲剂、多元醇和表面活性剂)，并且基本上不含一种或多种防腐剂(例如苯甲醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇和苄索氯铵)。在另一个实施例中，防腐剂可以包含在配制品中，例如按从约0.1％至约2％、或可替代地从约0.5％至约1％的范围内的浓度。一个或多个其他药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(如在REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明顿的药物科学],第18版(A.R.Genrmo,编辑),1990,马克出版公司(Mack Publishing Company)中描述的那些)可包括在配制品中，条件是它们不会不利地影响配制品的所需特性。
通过将具有所需纯度的抗体或抗原结合片段与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明顿的药物科学],第18版,(A.R.Genrmo,编辑),1990,马克出版公司(Mack Publishing Company))以冻干配制品或水溶液的形式混合，制备抗体或抗原结合片段的治疗配制品用于储存。在所用的剂量和浓度下，可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者无毒，并且包括以上描述的那些，如缓冲剂(例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸)；抗氧化剂(例如抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲基氯化铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)；儿茶酚；间苯二酚，环己醇，3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖、麦芽糖或糊精)；螯合剂，如EDTA；糖类(如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)；成盐抗衡离子(如钠)；金属络合物(例如，锌-蛋白质配合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)或泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；或聚乙二醇(PEG)。
在一个实施例中，本发明的适合的配制品含有等渗缓冲剂(如磷酸盐、乙酸盐或TRIS缓冲剂)，与张力剂(例如多元醇、山梨糖醇、蔗糖或氯化钠)组合，该配制品具有张力和稳定作用。这样的张度剂的一个实例是5％山梨糖醇或蔗糖。此外，该配制品可任选地包含例如按0.01％至0.02％wt/vol的表面活性剂，以防止聚集或改进稳定性。该配制品的pH可以在从4.5至6.5或4.5至5.5的范围内。针对抗体和抗原结合片段的药物配制品的其他示例性描述可以在美国专利公开号2003/0113316和美国专利号6,171,586中发现，这些申请各自通过引用以其全部内容并入本文。
用于体内给予的配制品必须是无菌的。本发明的组合物可以通过常规的，众所周知的灭菌技术灭菌。例如，通过无菌过滤膜过滤可以容易地完成灭菌。所得溶液可以被包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制剂在给予前与无菌溶液组合。
冷冻干燥的过程通常用于稳定多肽以长期储存，特别是当多肽在液体组合物中相对不稳定时。冻干循环通常由三个步骤组成：冷冻、初步干燥和二次干燥(参见Williams和Polli,Journal of Parenteral Science and Technology[肠外科学与技术杂志],第38卷,第2期,第48-59页,1984)。在冷冻步骤中，将溶液冷却直至其充分冷冻。溶液中的大量水在此阶段形成冰。冰在初级干燥阶段升华，其通过使用真空将腔室压力降低至低于冰的蒸气压来进行。最后，在减压室压力和升高的搁板温度下，在二次干燥阶段除去吸附水或结合水。该过程产生被称为冻干饼的材料。此后，该冻干饼可在使用前重构。冻干材料的标准重构操作是反加一定体积的纯水(通常相当于冻干过程中去除的体积)，尽管抗菌剂的稀释溶液有时被用于制备用于肠胃外给予的药物(参见Chen,Drug Development and IndustrialPharmacy[药品开发与工业制药],第18卷:1311-1354,1992)。
在某些情况下，已经注意到赋形剂可作为冷冻干燥产品的稳定剂(参见Carpenter等,第74卷:225-239,1991)。例如，已知的赋形剂包括多元醇(包括甘露醇、山梨糖醇和甘油)；糖类(包括葡萄糖和蔗糖)和氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。此外，多元醇和糖也经常用于保护多肽免受冷冻和干燥诱导的损伤，并增强在干燥状态下储存期间的稳定性。通常，糖(特别是二糖)在冷冻干燥过程和储存期间都是有效的。其他分子的类别，包括单糖和二糖以及聚合物(如PVP)，也已被报道为冻干产品的稳定剂。
对于注射，药物配制品和/或药物可以是适合用如上所述的适当溶液重构的粉末。这些的实例包括但不限于冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末；无定形粉末；颗粒；沉淀物或颗粒。对于注射，配制品可任选地包含稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些的组合。
可以制备持续释放的制剂。持续释放的制剂的适合的实例包括含有抗体或抗原结合片段的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质处于成型制品的形式(例如薄膜或微胶囊)。持续释放的基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如LupronDepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球))以及聚-D-(-)-3-羟丁酸。虽然聚合物(如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的)能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间更短。当封装的多肽长时间保留在体内时，它们可能由于暴露于37℃的水分而变性或聚集，导致生物活性的丧失和免疫原性可能的变化。可以根据所涉及的机理设计合理的策略以实现稳定。例如，如果发现聚集机理是通过硫代-二硫化物交换的分子间S-S键形成，则可以通过改变巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂以及开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
如本文所述，本发明的配制品可以被设计为短效、快速释放、长效或持续释放。因此，药物配制品也可以配制用于控释或缓释。
具体的剂量可根据待治疗的疾病、病症或病状(例如发作性偏头痛、慢性偏头痛或丛集性头痛)；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；剂量间隔；给药途径；***率和药物组合进行调整。
本发明的这些抗PAC1抗体或抗原结合片段可以通过任何合适的方式给予，包括肠胃外、皮下、静脉内、腹膜内、肺内和鼻内，并且如果需要用于局部治疗，病灶内给药。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮内或皮下给药。另外，抗体或抗原结合片段适合通过脉冲输注给药，特别是用递减剂量的抗体或抗原结合片段给药。优选地，通过注射给予给药，最优选静脉内或皮下注射，部分取决于给药是短暂的还是慢性的。考虑了其他给药方法，包括局部给药，特别是透皮给药、经粘膜给药、直肠给药、口服给药或所在地给药(例如通过放置在靠近所需部位的导管)。本发明的抗体或抗原结合片段可以在生理溶液中以0.01mg/kg至100mg/kg之间的剂量范围，按从每日至每周至每月的频率范围给予。
本文所述的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段用于在有需要的患者中治疗或缓解与PAC1受体的生物活性相关的病情中是有用的。因此，本文披露了用于在治疗方法中使用的本发明的抗PAC1抗体和抗原结合片段。术语“患者”包括人类患者，并且可与术语“受试者”互换地使用。如本文使用的，术语“治疗(treating或treatment)”是为了预防疾病的发展或改变疾病的病理而进行的干预。因此，“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防御性措施。需要治疗的患者包括已经诊断患有或患有病症或病状的患者以及需要预防病症或病状的患者。“治疗”包括改善损伤、病理或病状的任何成功的标志，包括任何客观或主观的参数，例如减少、缓解、减轻症状，或使损伤、病理或病症对患者更可忍受，减缓退化或衰退的速度，使退化的终点更弱，或改善患者的身心健康。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数，包括身体检查的结果、患者的自我报告、神经精神检查、和/或精神病学评估。
因此，在一些实施例中，本发明提供了用于在有需要的患者中治疗或预防与PAC1受体的生物活性相关的病情(例如，与PACAP诱导的PAC1受体的激活相关的病情)的方法，该方法包括向该患者给予有效量的本文所述的抗PAC1抗体或其抗原结合片段。PACAP/PAC1信号传导途径已经涉及各种生理过程，包括心血管功能、代谢和内分泌功能、炎症、应激反应、血管舒缩张力的调节和自主神经***的调节，特别是交感神经***和副交感神经***之间的平衡。参见，例如，Tanida等人,Regulatory Peptides[调节肽],第161卷:73-80,2010；Moody等人,Curr.Opin.Endocrinol.Diabetes Obes.[内分泌学、糖尿病和肥胖症的新见],第18卷:61-67,2011；和Hashimoto等人,Current Pharmaceutical Design[当代药物设计],第17卷:985-989,2011。与PACAP/PAC1信号传导途径的异常或过度激活相关的病情包括但不限于，头痛病况，如偏头痛、丛集性头痛、紧张型头痛、偏瘫性偏头痛、和视网膜性偏头痛；炎性皮肤病症；慢性疼痛，如神经性疼痛；焦虑障碍肠道易激综合征；以及血管舒张症状，如热潮红、面部潮红、出汗和盗汗。因此，可以将本发明的这些抗PAC1抗体及其抗原结合片段给予患者以预防、改善或治疗任何与异常或过量的PAC1受体生物活性相关的这些病症或障碍或其他病症。在某些实施例中，本发明提供了用于在有需要的患者中治疗或预防头痛病况(例如，发作性偏头痛、慢性偏头痛、丛集性头痛、紧张型头痛、偏瘫性偏头痛和视网膜性偏头痛)的方法，该方法包括向该患者给予本文所述的有效量的抗PAC1抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，本发明提供了在患有头痛病况的患者中用于抑制人PAC1受体的激活的方法，该方法包括向患者给予有效量的本文所述的抗PAC1抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，该患者患有偏头痛的头痛病况(如发作性偏头痛或慢性偏头痛)。在另一个实施例中，该患者患有丛集性头痛病况。
“有效量”通常是由特定条件产生或与特定条件相关的足以降低症状的严重性和/或频率、消除症状和/或潜在原因、预防症状和/或其潜在原因的发生、和/或改善或补救损害的量。在一些实施例中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足以治疗疾病状态或一种或多种症状的量，特别是与疾病状态相关的状态或一种或多种症状，或以其他方式预防、阻碍、延缓或逆转疾病状态或以任何方式与疾病相关的任何其他不良症状(即提供“治疗功效”)的进展。“预防有效量”是当给予受试者时将具有预期的预防效果的抗体或抗原结合片段的量，例如，预防或延迟病症的发作(或复发)，或减少病症发作(或复发)的可能性。完整的治疗或预防效果不一定通过一个剂量的给药而出现，而是可以仅在一系列剂量的给药之后出现。因此，可按一次或多次给药的形式给予治疗或预防的有效量。
在某些实施例中，本发明提供了用于在有需要的患者中抑制血管舒张的方法，该方法包括向患者给予有效量的本文所述的抗PAC1抗体或其抗原结合片段。PAC1受体的配体(如PACAP38和VIP)，是有效的血管扩张剂，并阻断这些配体与PAC1受体的结合可以抑制血管舒张，并且改善与异常或过度血管舒张相关的病况(如头痛病况、热潮红和潮红)。在一个实施例中，该患者患有头痛病况(如偏头痛或丛集性头痛)。在另一个实施例中，该患者患有血管舒张症状(例如，热潮红、面部潮红、出汗或盗汗)。在相关的实施例中，该患者患有与更年期相关的血管舒张症状。
在本发明的方法的一些实施例中，待治疗、预防或改善的头痛病况是偏头痛。因此，本发明包括用于在有需要的患者中治疗、预防或缓解偏头痛的方法，该方法包括向该患者给予有效量的本文所述抗PAC1抗体或其抗原结合片段。偏头痛是持续约4至约72小时的复发性头痛，其特征在于单侧、搏动、和/或中度至重度疼痛、和/或由身体活动加剧的疼痛。偏头痛常伴有恶心、呕吐、和/或对光(畏光)、声音(声音恐怖症)或气味敏感。在一些患者中，先兆在偏头痛发作之前。先兆通常是表明头痛很快就会发生的视觉、感觉、语言或运动障碍。本文所述的方法预防、治疗或改善人患者中存在和不存在先兆的偏头痛的一种或多种症状。
PACAP38，通过其受体的激活诱导血管舒张，尤其是硬脑膜血管***的血管舒张(Schytz等人,Neurotherapeutics[神经治疗学],第7卷(2):191-196,2010)。特别地，PACAP38/PAC1受体信号级联放大与偏头痛病理生理学有关(Amin等人,Brain[脑],第137卷:779-794,2014)。PACAP38(相比VPAC1和VPAC2受体，对PAC1受体具有更高的亲和力)的输注引起偏头痛患者的偏头痛样头痛(Schytz等人,Brain[脑]，132:16-25,2009；Amin等人,Brain[脑],第137卷:779-794,2014；Guo等人,Cephalalgia[头痛杂志],第37卷:125-135,2017)。此外，在患有偏头痛发作的患者的颅内循环中PACAP38水平升高，并且在使用曲坦类治疗偏头痛症状后PACAP38水平降低(Tuka等人,Cephalalgia[头痛杂志],第33卷,1085-1095,2013；Zagami等人,Ann.Clin.Transl.Neurol.[临床和转化神经病学年鉴],第1卷:1036-1040,2014)。这些报告表明，PACAP38的内源性释放是偏头痛的重要触发因素，并且其作用主要通过PAC1受体的激活介导。
在一些实施例中，根据本发明的方法治疗的患者具有、患有或被诊断患有发作性偏头痛。当具有偏头痛病史(例如，至少五次偏头痛的终生发作)的患者每月有14个或更少个偏头痛日时，诊断出发作性偏头痛。“偏头痛日”包括患者经历“偏头痛”的发作、持续或复发的任何日历天数，其中有或没有持续超过30分钟的先兆。“偏头痛”是与恶心或呕吐或对光或声音有关的头痛，和/或特征在于以下的疼痛特征中至少两种的头痛：单侧疼痛、搏动性疼痛、中度至重度疼痛强度，或因身体活动而加剧的疼痛。在某些实施例中，具有、患有或被诊断患有发作性偏头痛的患者每月有至少4个，但小于15个偏头痛日。在相关的实施例中，具有、患有或被诊断患有发作性偏头痛的患者平均每月有少于15个头痛日。如本文使用的，“头痛日”是患者经历如本文所定义的偏头痛或任何持续超过30分钟或需要急性头痛治疗的头痛的任何日历天数。
在某些实施例中，根据本发明的方法治疗的患者具有、患有或被诊断患有慢性偏头痛。当偏头痛患者(即至少五次终生发作偏头痛的患者)每月有15个或更多个头痛日且至少有8个头痛日是偏头痛日时，就诊断出慢性偏头痛。在一些实施例中，具有、患有或被诊断患有慢性偏头痛的患者平均每月有15或更多偏头痛日。在本文所述方法的某些实施例中，给予本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段预防、减少或延迟患者中发作性偏头痛向慢性偏头痛的进展。
在一些实施例中，本发明提供了用于在有需要的患者中治疗、预防或缓解丛集性头痛的方法，该方法包括向该患者给予有效量的本文所述的抗PAC1抗体或其抗原结合片段。丛集性头痛是一种病症，其最重要的特征是头部一侧复发的严重性头痛，通常在眼睛周围(参见Nesbitt等人,BMJ[英国医学杂志],第344卷:e2407,2012)。丛集性头痛经常周期性地发生：疼痛的自发性缓解中断活跃期。丛集性头痛通常伴有颅内自主神经症状，例如流泪、鼻塞、眼睑下垂、瞳孔收缩、面部发白、出汗和眼周肿胀，通常局限于具有疼痛的头部一侧。丛集性头痛发作的平均年龄是约30-50岁。丛集性头痛在男性中更为普遍，其中男性与女性比例为约2.5:1至约3.5:1。蝶腭神经节(SPG)刺激已被用于治疗丛集性头痛。神经刺激***向SPG提供低水平(但高频率，生理阻断)电刺激，已证明在最近的临床试验中有效缓解丛集性头痛的急性衰弱性疼痛(参见Schoenen J,等人,Cephalalgia[头痛杂志],第33卷(10):816-30,2013)。鉴于该证据并且因为PACAP是SPG中的主要神经递质之一，预期用本文所述的抗PAC1抗体或其抗原结合片段抑制PACAP/PAC1信号传导具有在治疗人丛集性头痛中具有功效。
与PACAP/PAC1信号传导途径相关的可以根据本发明的方法治疗的其他病症包括但不限于，炎性皮肤病症(如酒糟鼻(参见美国专利公开号20110229423))、慢性疼痛综合征(如神经性疼痛(参见Jongsma等人,Neuroreport[神经学报告],第12卷:2215-2219,2001；Hashimoto等人,Annals of the New York Academy of Sciences[纽约科学院年报],第1070卷:75-89,2006))、紧张型头痛、偏瘫性偏头痛、视网膜性偏头痛、焦虑障碍(如创伤后应激障碍(参见Hammack和May,Biol.Psychiatry[生物精神病学],第78卷(3):167-177,2015))、肠道易激综合征，以及血管舒张症状(例如，热潮红、面部潮红、出汗和盗汗)，如与更年期相关的那些症状。在一个实施例中，通过给予本发明的抗PAC1抗体或其抗原结合片段治疗的病状是慢性疼痛。在另一个实施例中，通过给予本发明的抗PAC1抗体或其抗原结合片段治疗的病状是神经性疼痛。
在本文所述的任何方法中，治疗可以包括预防性治疗。预防性治疗是指在病症发作或发作之前(例如在偏头痛发作或丛集性头痛偶发之前)进行的治疗，以减少患者中的症状(例如偏头痛或丛集性头痛)的频率、严重性和/或长度。
在一些实施例中，用于治疗或预防患者中头痛病况的本发明的方法包括向患者给予本文所述的抗PAC1抗体或其抗原结合片段与适合用于急性或预防性治疗本文所述的偏头痛或其他头痛障碍的一个或多个试剂的组合。如本文使用的，术语“组合疗法”涵盖以顺序方式(即，每种化合物以任何顺序在不同时间给予)给予两种化合物(例如，抗PAC1抗体和另外的药剂)以及以基本上同时的方式给予两种化合物。基本上同时给予包括同时给予并且可以通过给予包含两种化合物的单个配制品(例如包含两种化合物的固定比例的单个配制品或具有每种化合物的固定比例的预填充注射器)或同时给予包含每种化合物的单独配制品来实现。因此，在某些实施例中，本发明的这些方法包括将本文所述的抗PAC1抗体或其抗原结合片段与第二头痛治疗剂一起给予。
在某些实施例中，该第二头痛治疗剂可以是用于头痛或偏头痛的急性治疗的急性头痛治疗剂。在一些实施例中，该急性头痛治疗剂是血清素(5-羟色胺；5-HT)受体激动剂，例如5HT1受体激动剂。该急性头痛治疗剂可以是5HT1B、5HT1D和/或5HT1F血清素受体的激动剂。这样的血清素受体激动剂包括但不限于，曲坦类(例如，阿莫曲坦夫罗曲坦、利扎曲坦、舒马曲坦、那拉曲坦、依立曲坦和佐米曲坦)；麦角胺(例如，双氢麦角胺和酒石酸麦角胺)，和5HT1F-选择性血清素受体激动剂(如拉司米地坦(lasmiditan))。其他合适的急性头痛治疗剂包括非甾体抗炎药(例如乙酰水杨酸、布洛芬、萘普生、吲哚美辛和双氯芬酸)和阿片样物质(例如可待因、***、氢可酮、芬太尼、哌替啶和羟考酮)。在一个实施例中，与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予的急性头痛治疗剂是曲坦。在另一个实施例中，与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予的急性头痛治疗剂是麦角胺。在又另一个实施例中，与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予的急性头痛治疗剂是非甾体抗炎药。在仍另一个实施例中，与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予的急性头痛治疗剂是阿片样物质。
在一些实施例中，第二头痛治疗剂是用于头痛或偏头痛的预防性治疗的预防性头痛治疗剂。在一个实施例中，该预防性头痛治疗剂三抗癫痫药，如双丙戊酸钠、丙戊酸钠、丙戊酸、托吡酯或加巴喷丁。在另一个实施例中，该预防性头痛治疗剂是β-受体阻滞剂，如***、噻吗洛尔、阿替洛尔、美托洛尔或纳多洛尔。在又另一个实施例中，该预防性头痛治疗剂是抗抑郁剂，如三环抗忧郁药(例如，阿米替林、去甲替林、多塞平和氟西汀)。在仍另一个实施例中，该预防性头痛治疗剂是肉毒杆菌素A。
在某些实施例中，本发明的方法包括给予本文所述的抗PAC1抗体或其抗原结合片段与降钙素基因相关肽(CGRP)信号传导途径(即，由CGRP配体抑制CGRP受体的激活或信号传导)的拮抗剂。例如，在有需要的患者中可以将本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段与CGRP途径拮抗剂组合给予来治疗或预防头痛病况(例如，偏头痛或丛集性头痛)。在一些实施例中，该CGRP途径拮抗剂是人CGRP受体的拮抗剂。CGRP受体拮抗剂包括CGRP受体的小分子抑制剂，例如在以下描述的那些：美国专利申请号20060142273和美国专利号7,842,808；7,772,244；7,754,732；7,569,578；8,685,965；8,569,291；8,377,955；8,372,859；8,143,266；7,947,677；和7,625,901，其全部通过引用以其全部内容并入本文中。CGRP受体拮抗剂还可以包括受体的肽拮抗剂，如在美国专利号8,168,592中描述的那些，其通过引用以其全部内容并入本文。在某些实施例中，与本发明的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段一起给予的CGRP受体拮抗剂是特异性地结合人CGRP受体的单克隆抗体，如在美国专利号9,102,731和美国专利公开号20160311913中描述的抗体，这二者通过引用以其全部内容并入本文。在本发明的方法的一个具体的实施例中，本文所述的抗PAC1抗体或其抗原结合片段与抗CGRP受体单克隆抗体组合给予来治疗或预防患者的头痛病况(例如，偏头痛或丛集性头痛)，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:502的序列(以下提供的序列)的轻链可变区以及包含SEQ ID NO:503的序列(以下提供的序列)的重链可变区。在本发明的方法的另一个具体的实施例中，与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段组合给予以治疗或预防的头痛病况(例如，偏头痛或丛集性头痛)的抗CGRP受体单克隆抗体是厄瑞奴单抗。
示例性抗CGRP受体单克隆抗体的轻链可变区序列：
Figure BDA0002576823830001821
示例性抗CGRP受体单克隆抗体的重链可变区序列：
Figure BDA0002576823830001822
在一些实施例中，与本发明的抗PAC1抗体或抗原结合片段一起给予的以治疗或预防患者的头痛病况(例如，偏头痛或丛集性头痛)的CGRP途径拮抗剂是CGRP配体的拮抗剂。CGRP配体拮抗剂可以是诱饵或可溶性CGRP受体或与CGRP配体结合的其他蛋白质(如抗CGRP配体抗体)。抗CGRP配体抗体是本领域已知的，并且描述于例如，在WO 2007/054809；WO2007/076336；WO 2011/156324；和WO 2012/162243中，其全部均通过引用以其全部内容并入本文。在某些实施例中，与本发明的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段一起给予的CGRP配体拮抗剂是特异性地结合人α-CGRP和/或人β-CGRP的单克隆抗体。在一个实施例中，该抗CGRP配体抗体是瑞玛奈珠单抗。在另一个实施例中，该抗CGRP配体抗体是伽奈珠单抗。在又另一个实施例中，该抗CGRP配体抗体是依普奈珠单抗。
本发明还包括抗PAC1抗体和抗原结合片段在本文披露的任何方法中的用途。例如，在某些实施例中，本发明提供了用于在有需要的患者中治疗或预防头痛病况的方法中使用的本文所述的抗PAC1抗体或抗原结合片段。在一些这样的实施例中，该头痛病况是偏头痛。该偏头痛可以是发作性偏头痛或慢性偏头痛。在其他实施例中，该头痛病况是丛集性头痛。在一些实施例中，用于治疗或预防头痛病况的方法包括将第二头痛治疗剂与抗PAC1抗体或其抗原结合片段组合给予。在一个实施例中，该第二头痛治疗剂是急性头痛治疗剂，如5HT1B、5HT1D和/或5HT1F血清素受体拮抗剂(例如，曲坦或麦角胺)、非甾体抗炎药或阿片样物质。在另一个实施例中，该第二头痛治疗剂是预防性头痛治疗剂，如抗癫痫药、β-受体阻滞剂、抗抑郁剂、肉毒杆菌素A、或CGRP途径拮抗剂。在一些实施例中，该CGRP途径拮抗剂是人CGRP受体拮抗剂。在一个具体的实施例中，该人CGRP受体拮抗剂是特异性地结合人CGRP受体的单克隆抗体，如厄瑞奴单抗。在其他实施例中，该CGRP途径拮抗剂是CGRP配体的拮抗剂，如特异性地结合人α-CGRP和/或人β-CGRP的单克隆抗体。在某些实施例中，该抗CGRP配体抗体是瑞玛奈珠单抗、伽奈珠单抗或依普奈珠单抗。
在一些实施例中，本发明提供了用于在有需要的患者中抑制血管舒张的方法中使用的本文所述的抗PAC1抗体或抗原结合片段。在这样的实施例中，该患者可以被诊断为具有或患有头痛病况，如偏头痛(例如，发作性或慢性偏头痛)或丛集性头痛。在其他实施例中，本发明提供了用于在患有头痛病况的患者中抑制人PAC1受体激活的方法中使用的本文所述的抗PAC1抗体或抗原结合片段。该头痛病况可以是偏头痛(例如，发作性或慢性偏头痛)或丛集性头痛。
特别考虑了抗PAC1抗体或其抗原结合片段用于制备根据本文披露的任何方法进行给予的药物的用途。例如，在一些实施例中，本发明涵盖本文所述的抗PAC1抗体或抗原结合片段在制备用于治疗或预防有需要的患者的头痛病况的药物中的用途。在一些这样的实施例中，该头痛病况是偏头痛。该偏头痛可以是发作性偏头痛或慢性偏头痛。在其他实施例中，该头痛病况是丛集性头痛。在某些实施例中，该抗PAC1抗体或其抗原结合片段被配制为与第二头痛治疗剂一起给予。在一个实施例中，该第二头痛治疗剂是急性头痛治疗剂，如5HT1B、5HT1D和/或5HT1F血清素受体拮抗剂(例如，曲坦或麦角胺)、非甾体抗炎药或阿片样物质。在另一个实施例中，该第二头痛治疗剂是预防性头痛治疗剂，如抗癫痫药、β-受体阻滞剂、抗抑郁剂、肉毒杆菌素A、或CGRP途径拮抗剂。在一些实施例中，该CGRP途径拮抗剂是人CGRP受体拮抗剂。在一个具体的实施例中，该人CGRP受体拮抗剂是特异性地结合人CGRP受体的单克隆抗体，如厄瑞奴单抗。在其他实施例中，该CGRP途径拮抗剂是CGRP配体的拮抗剂，如特异性地结合人α-CGRP和/或人β-CGRP的单克隆抗体。在某些实施例中，该抗CGRP配体抗体是瑞玛奈珠单抗、伽奈珠单抗或依普奈珠单抗。
在一些实施例中，本发明包括本文所述的抗PAC1抗体或抗原结合片段在制备用于在有需要的患者中抑制血管舒张的药物中的用途。在这样的实施例中，该患者可以被诊断为具有或患有头痛病况，如偏头痛(例如，发作性或慢性偏头痛)或丛集性头痛。在其他实施例中，本发明包括本文所述的抗PAC1抗体或抗原结合片段在制备用于在患有头痛病况的患者中抑制人PAC1受体激活的药物中的用途。该头痛病况可以是偏头痛(例如，发作性或慢性偏头痛)或丛集性头痛。
本发明的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段也可用于检测生物样品中人PAC1和鉴定表达人PAC1的细胞或组织。例如，这些抗PAC1抗体和抗原结合片段可用于诊断测定，例如检测和/或定量组织或细胞中表达的PAC1的免疫测定。此外，本文所述的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段可用于抑制PAC1与PACAP形成复合物，从而调节细胞或组织中PAC1的生物活性。这种生物活性包括细胞内cAMP的升高和血管舒张。
本文所述的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段可用于诊断目的，以检测、诊断或监测与PAC1相关的疾病和/或病症，包括偏头痛、丛集性头痛和焦虑障碍(如创伤后应激障碍)。还提供了使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测样品中PAC1的存在的方法(例如，Tijssen,1993,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays[酶免疫测定的实践与理论],第15卷(R.H.Burdon和P.H.van Knippenberg编，爱思唯尔，阿姆斯特丹(Elsevier,Amsterdam))；Zola,1987,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques[单克隆抗体：技术手册],第147-158页(CRC出版社公司)；Jalkanen等人,1985,J.Cell.Biol.[细胞生物学杂志]101:976-985；Jalkanen等人,1987,J.CellBiol.[细胞生物学杂志]105:3087-3096)。可用于检测PAC1存在的方法的实例包括使用本文所述的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段进行的免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。PAC1的检测可以在体内或体外进行。
对于诊断应用，可以用可检测的标记基团标记抗PAC1抗体或抗原结合片段。适合的标记基团包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)；荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)；酶组(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光基团；生物素基基团；或由二级报告基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施例中，标记基团通过各种长度的间隔臂与抗体或抗原结合片段偶联，以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法是本领域已知的并且可以使用。
在另一个实施例中，本文所述的这些抗PAC1抗体和抗原结合片段可用于鉴定表达PAC1的一种或多种细胞。在一个具体的实施例中，用标记基团标记抗体或抗原结合片段，并检测标记的抗体或抗原结合片段与PAC1的结合。这些抗体或抗原结合片段还可以在生物样品中用于免疫沉淀测定。在另外具体的实施例中，抗体或抗原结合片段与PAC1的结合在体内检测。在另外具体的实施例中，该抗体或抗原结合片段是分离的并使用本领域已知的技术来测定。参见，例如，Harlow和Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验手册],纽约：冷泉港(New York:Cold Spring Harbor)(1991编和定期增刊)；JohnE.Coligan,编辑,1993,Current Protocols In Immunology[免疫学现代方法]纽约：约翰·威利父子出版公司(New York:John Wiley&Sons)。
以下实例，包括进行的实验和实现的结果，仅用于说明目的，并不应解释为限制所附权利要求的范围。
实例
实例1.人PAC1抗体的晶体结构-指导设计
确定了人PAC1的胞外结构域(ECD)与人抗PAC1中和抗体(29G4v9)的Fab片段之间复合物的晶体结构。将人PAC1 ECD和抗PAC1Fab分开纯化，并然后以1:1摩尔比复合在一起。该样品随后经凝胶过滤柱跑胶，在20mM TRIS(pH7.5)、50mMNaCl、5mM EDTA中平衡，并浓缩至35mg/ml并过滤。
以下列出了Fab片段的重链(包含可变区(VH)、CH1恒定区、上铰链和半胱天冬酶III切割位点)以及轻链(包含可变区(VL)和CL恒定区)的序列。以下提供了人PAC1 ECD构建体的序列，并且包含人PAC1(SEQ ID NO:1)的氨基酸26至143减去氨基酸89-109之间的区域。
29G4v9 Fab的重链的氨基酸序列(由以下构成：VH区(氨基酸：1-120)；CH1区(氨基酸：121-218)；上铰链区(氨基酸219-221)，和半胱天冬酶III切割位点(222-226)：
Figure BDA0002576823830001871
29G4v9 Fab的轻链的氨基酸序列(由以下构成：VL区(氨基酸：1-108)和CL区(氨基酸：109-214)：
Figure BDA0002576823830001872
人PAC1 ECD构建体的氨基酸序列：
Figure BDA0002576823830001873
经纯化的人PAC1 ECD和抗PAC1Fab最初使用坐滴式蒸汽扩散(sitting dropvapor diffusion)方法与可商购的筛共结晶。使用悬滴式蒸汽扩散法进一步扩展结晶条件(Qiagen MPD Suite Screen#61(134561))。在4℃下，将蛋白质和结晶缓冲液(0.1M柠檬酸、pH4.0，40％MPD)按1:1以1μl悬滴于结晶缓冲液的储器溶液中。棒状晶体在几周内形成。
晶体在作为低温保护剂的结晶缓冲液中平衡，并在液氮中冷冻，运往劳伦斯伯克利国家实验室(Lawrence Berkeley National Laboratories)进行数据收集。在ADSC-Q315rCCD检测器
Figure BDA0002576823830001881
在高级光源同步加速器波束线(Advanced Light SourceSynchrotron Beamline)5.0.2上收集数据集。使用HKL2000(Otwinowski和Minor,MethodsEnzymology[酶学方法],第276卷,307-326,1997)整合数据并度量，并且99.8％完成至
Figure BDA0002576823830001882
其中R合并为0.081(98.0％完成最后的壳
Figure BDA0002576823830001883
其中I/σ＝2.35)。晶体属于正交空间群P21212，其中晶胞尺寸为
Figure BDA0002576823830001884
α＝90°、β＝90°、γ＝90°。使用PhaserMR通过分子置换可以解析晶体结构(Winn等人,Acta Crystallogr.,Sect.D:Biol.Crystallogr.[晶体学报D辑：生物晶体学],第67卷:235-242,2011)。使用专有的Fab结构作为解决抗PAC1Fab组分的第一研究模型。随后的分子置换使用PDBID:2JOD(Sun等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],第104卷:7875,2007)、人PAC1ECD NMR结构作为初始模型来解决人PAC1ECD组分。在不对称的单元中存在一个ECD分子和一个Fab分子。使用Refmac5(Winn等人,Acta Crystallogr.,Sect.D:Biol.Crystallogr.[晶体学报D辑：生物晶体学],第67卷:235-242,2011；Murshudov等人,Acta Crystallogr.,Sect.D:Biol.Crystallogr.[晶体学报D辑：生物晶体学],第67卷:355-367,2011)和Phenix.refine(Adams等人,Acta Crystallogr.,Sect.D:Biol.Crystallogr.[晶体学报D辑：生物晶体学],第66卷:213-221,2010)将结构精制，并且使用制图程序Coot进行模型建立(Emsley和Cowtan,Acta Crystallogr.,Sect.D:Biol.Crystallogr.[晶体学报D辑：生物晶体学],2004,第60卷:2126-2132,2004)。
人PAC1 ECD:抗PAC1 Fab复合物的结构被精制为
Figure BDA0002576823830001885
其中R-因子为20％并且R自由为23％。复合物的结构的前视图和侧视图分别示出在图1A和1B中。29G4v9 Fab和PAC1ECD之间的相互作用由疏水、静电和氢键相互作用组成。29G4v9 Fab和PAC1 ECD之间的相互作用具有对于抗体-抗原相互作用典型的隐藏表面积
Figure BDA0002576823830001891
和形状互补性值(0.695)。在29G4v9 Fab中在离非氢原子
Figure BDA0002576823830001892
或更小的距离处包含至少一个非氢原子的PAC1 ECD中的所有氨基酸被确定为是PAC1 ECD中的核心界面氨基酸。用PyMOL程序计算原子的距离(DeLano,W.L.The PyMOL Molecular Graphics System.[PyMOL分子制图***](帕洛阿尔托(Palo Alto),2002))。PAC1 ECD中的核心界面氨基酸包括：具有相对于SEQ ID NO:1的氨基酸位置号的Asp59、Asn60、Ile61、Arg116、Asn117、Thr119、Asp121、Gly122、Trp123、Ser124、Glu125、Pro126、Phe127、Pro128、His129、Tyr130、Phe131、Asp132和Gly135。
分析晶体结构中29G4v9 Fab和PAC1 ECD之间的界面以鉴定两个分子之间的相互作用次优的区域。基于结构分析，设计轻链和重链可变区中氨基酸的突变以增强Fab和PAC1ECD之间的这些区域中的相互作用来改进抗体的结合亲和力和/或抑制效力。特别地，对Fab轻链和PAC1 ECD之间的相互作用的分析揭示了四个区域，其中Fab轻链中的突变可能改进与PAC1相互作用。在区1(含有PAC1 ECD氨基酸Glu120和Asp121的区域)中，提出了轻链CDR1(SEQ ID NO:3)中Gln27突变为赖氨酸、酪氨酸或精氨酸以提供更好的电荷互补性或与Glu120和Asp121PAC1氨基酸的氢键潜力(图2A)。区2是具有正静电势的区域，并且提出了轻链CDR1(SEQ ID NO:3)中Ser28突变为谷氨酸以提供更好的电荷互补性(图2A)。区3是含有PAC1ECDPhe127残基并具有氢键潜力的疏水区。轻链CDR1中的Gly30、Arg31和Ser32位于远离区3的位置(图2A)。因此，如下表6中总结的，在这三个位点处提出了多个突变，以改进这三个残基与PAC1ECD的该区之间的疏水或氢键相互作用。轻链CDR3中的Arg93坐落在具有负静电势的PAC1残基的口袋中(区4；图2B)。然而，由于几何结构，Arg93与PAC1残基不形成任何直接的氢键。提出了轻链CDR3中Arg93突变为谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸或天冬酰胺以提供与PAC1 ECD中的残基的可替代的电荷互补性或氢键电势(图2B)。
对29G4v9 Fab重链和PAC1 ECD之间相互作用的分析揭示了三个主要的区域，其中Fab重链中的突变可以改进与PAC1 ECD的相互作用。如图3A中所示，区5涵盖PAC1氨基酸Phe131，并且可以被分成位于Phe131任一侧的两个亚区。重链CDR1中的Arg31和Phe32位于这些亚区中，并且提出这些位点处的突变以改进与PAC1 Phe131残基的疏水相互作用或提供可替代的电荷互补性相互作用。参见表6突变的列表。在区6中，该区包括PAC1 ECD残基Asn60和Ile61(相对于SEQ ID NO:1)，提出了重链CDR2残基Tyr53、Asp54和Gly56的突变改进疏水相互作用或提供与Asn60和Ile61 PAC1残基的可替代的氢键(图3B)。在区7(具有疏水残基和一些负静电势的区域)中，提出了如在表6中列出的重链CDR3残基Val102、Leu103和Thr104的突变以改进疏水相互作用或提供可替代的氢键相互作用(图3C)。
基于对Fab/PAC1 ECD复合物的晶体结构的分析，将提出改进抗PAC1抗体和人PAC1受体之间相互作用的特定突变的汇总提供在以下表6中。
表6.PAC1抗体可变区中基于结构的突变的汇总
Figure BDA0002576823830001901
Figure BDA0002576823830001911
1相对于SEQ ID NO:3的轻链的氨基酸位置和相对于SEQ ID NO:2的重链的氨基酸位置。
除了通过对如上所述的抗PAC1Fab和人PAC1 ECD之间相互作用的氨基酸的分析而设计的突变之外，使用晶体结构还进行了计算机模拟亲和力成熟分析以鉴定另外的突变来改进抗PAC1抗体的结合亲和力和/或抑制效力。通过目测上述复合物的晶体结构鉴定涉及与人PAC1 ECD的结合的29G4v9 Fab中的氨基酸残基。选择抗体的这些界面残基用于除半胱氨酸之外的所有其他氨基酸的实质突变。通过使用来自Biovia的Discovery Studio分子建模软件计算特定残基突变后结合自由能(ΔΔG结合)中的变化来评估突变对抗体/PAC1 ECD结合相互作用的影响。与亲本分子相比，ΔΔG结合的负值表明突变导致与PAC1 ECD的更强结合。这些计算确定了大约65个导致ΔΔG结合负值的突变。基于用PAC1 ECD对这些变体的“建模”结构进行目测和分析，将这65个突变进一步缩小至50个(轻链18个和重链32个)。基于结合自由能计算，预测增加抗体对PAC1的结合亲和力的这50个突变汇总在下表7中。
表7.由计算机模拟分析预测的PAC1抗体可变区中突变的汇总
Figure BDA0002576823830001912
Figure BDA0002576823830001921
1相对于SEQ ID NO:3的轻链的氨基酸位置和相对于SEQ ID NO:2的重链的氨基酸位置。
与基于结构的分析相比，计算机模拟方法导致在根据不同的氨基酸以及轻链和/或重链内不同位置方面鉴定另外的突变。
通过重组生产将该实例中描述的突变掺入抗PAC1抗体中，并在如本文实例3中所述的体外基于细胞的测定中测试抑制PACAP诱导的人PAC1激活的能力。
实例2. 29G4v10人PAC1抗体的酵母展示亲和力成熟
亲和力成熟的一种有效方法涉及构建酵母展示抗体Fab突变体文库，并通过荧光辅助细胞分选(FACS)选择改进的结合物(图4)。为产生具有改进的抑制效力的抗PAC1抗体，通过酵母展示Fab文库的FACS将29G4v10抗体(SEQ ID NO:191的VH区；SEQ ID NO:52的VL区)进行亲和力成熟化。文库设计由人PAC1 ECD和29G4v9 Fab之间的复合物的实例1中描述的经解析的共晶结构引导，其该复合物的CDR与29G4v10的CDR几乎相同。结构分析最初分别在轻链(LC)和重链(HC)内鉴定了六个和七个CDR位置用于诱变，并且提出了用于亲和力增强的策略。突变体被设计为以改善疏水相互作用和电荷互补性，并在界面上提供交替的氢键相互作用。参见实例1。这些点突变体发起了一种工程方法，该方法涉及生产的迭代轮次、表征和有益突变的合理组合。酵母文库设计试图通过更全面地探索13个位置中的突变组合并在每个所选位置处增加多样化策略来补充实例1中描述的线性方法。
通过制作单独的LC和HC文库，理论上的多样性被保持在可掌控的<107的大小。设计LC文库以在六个选定位置中的五个(SEQ ID NO:52的Gln27、Gly30、Arg31、Ser32和Arg93)处利用MIX19饱和诱变。MIX19代表编码除半胱氨酸外的所有氨基酸的三聚体亚磷酰胺(密码子)混合物。在剩余的轻链位置(SEQ ID NO:52的Ser28)处，使用针对丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸或终止密码子的突变。为探索在一个文库中的所有七个HC位置(SEQ ID NO:191的Arg31、Phe32、Tyr53、Gly56、Val102、Leu103和Thr104)，我们设计了九个密码子的常规混合物(MIX9)用于在七个重链CDR的五个位置处(SEQ ID NO:191的Arg31、Phe32、Tyr53、Val102和Leu103)多样化。常规的MIX9包含疏水氨基酸、碱性氨基酸、和氢键供体和受体(例如，F、L、Y、M、Q、H、K、R和S)。重要的是，常规的MIX9排除了半胱氨酸、天冬酰胺和色氨酸，以减少可能造成下游可制造性风险的序列倾向性的引入。对剩余的两个重链位置(SEQ IDNO:191的Gly56和Thr104)进行甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸的突变。总之，对于第一次活动，设计了理论多样性为8.5x106的mutHC文库和理论多样性为9.9x106的mutLC文库，并且所构建的文库对理论多样性过采样>9倍。
使用FACS富集两个构建的mutHC和mutLCFab文库用于与人PAC1 ECD结合，通过降低用于结合的ECD的浓度来增加每个连续轮次的严格性(第1轮：30nM PAC1 ECD；第2轮：0.67nMPAC1 ECD；和第3轮：0.2nM PAC1 ECD)。常规使用经相同处理的29G4v10Fab-酵母样品来特异性地门控相对于亲本Fab表现出改进的结合的酵母克隆。通过将每个克隆的中值荧光结合信号除以每个克隆的中值荧光显示信号来计算每个克隆的标准化结合/显示比率。通过第3轮，从mutHC文库而不是mutLC文库富集改进的结合物。来自mutHC第3轮库的约200个酵母克隆的简单筛选产生11个适当改进的结合物(表8)。如实例3中所述，重组产生改进的亲和力变体并评估体外功能活性。幸运地是，29G4v10亲本Fab中的天冬氨酸异构化位点是可制造性的潜在倾向性，在所有这11种独特的突变体中得到了修复。
表8.来自MutHC文库筛选的最佳改进的结合物
Figure BDA0002576823830001941
Figure BDA0002576823830001951
1对于任何这些变体，相对于29G4v10抗体轻链序列没有变化。
为产生进一步的亲和力改进，还构建了链改组的文库，该文库组合来自mutHC和mutLC分选的库的富集的突变。为改进最佳结合克隆之间的区分，实施了结合解离速率驱动的选择和筛选策略(图5)。首先将展示突变体Fab的酵母细胞用生物素化的人PAC1 ECD浸透，并充分洗涤，然后在含有过量未标记的人PAC1 ECD的缓冲液中长时间孵育(长达24小时)。与未标记的人PAC1 ECD一起孵育，该孵育发生在25℃至37℃的温度范围内，使得细胞的解离事件不可逆。在用荧光链霉抗生物素蛋白缀合物染色后，通过FACS对保留与生物素化的PAC1结合最多的细胞进行分离，从而表现出最慢的解离速率(图5)。显示出最慢解离速率的Fab的酵母克隆是高度荧光的。
在解离速率驱动的链改组文库分选中，在与未标记的PAC1竞争过夜后，使用经相同处理的29G4v10 Fab-酵母样品来特异性地分离具有更高生物素化的PAC1结合的细胞。从在不同门控严格条件下收集的两个池中，使用结合解离速率测定筛选约600个单独的酵母克隆，并鉴定了相比亲本29G4v10 Fab具有更高的剩余PAC1结合的190个克隆。通过证实克隆与无关受体(程序性细胞死亡蛋白1(PD1)和胃抑制性多肽受体(GIPR))的ECD不存在结合来评估这些有希望的克隆的结合特异性。在筛选过程中相对于起始29G4v10序列还去除了含有另外的半胱氨酸异常、N-连接的糖基化、天冬氨酸异构化、天冬酰胺脱酰胺和色氨酸氧化位点的突变体。表9中显示了最佳的30个结合突变体，具有来自亲本29G4v10抗体的CDR中的序列变化和解离速率测定后人PAC1 ECD结合的百分比。PAC1 ECD结合的较高百分比结合表明突变体Fab具有较慢的解离速率。
表9.来自链改组文库的解离速率驱动的筛选的最佳改进的结合物
Figure BDA0002576823830001961
Figure BDA0002576823830001971
Figure BDA0002576823830001981
Figure BDA0002576823830001991
1相对于29G4v10轻链可变区序列(SEQ ID NO:52)的位置34处的组氨酸残基在这些突变体中缺失。
设计了一组第二代文库以产生进一步的亲和力改进。上述第一代文库聚焦于晶体结构中PAC1 ECD的
Figure BDA0002576823830001992
内的29G4v10亲本抗体CDR位置的子集处的多样化(实例1)。对于第二代文库，探索了在第一代文库中基本未触及的区域中的诱变，例如轻链的CDR2和CDR3。对于已在第一代文库中探索过的若干个位置，测序趋势被用于多样化到三轮分选后出现的有限的中性/有益突变组。最后，一些可能影响CDR构象的隐藏框架残基被靶向用于有限的多样化，其中突变策略有利于经常在其他人VH3和VK3种系中的相同位置处发现的氨基酸。
总计四个第二代Fab文库被设计为靶向24个重链CDR残基(SEQ ID NO:191的氨基酸27、29、31-34、49、52-57、70、72、77、79、98、100-104、和106)和17个轻链CDR残基(SEQ IDNO:52的氨基酸27、28、30-32、34、46、49-54、92-94、和96)用于多样化。许多靶向位置处的受限多样性使得能够在一个文库内询问更多CDR位置，以及HCDR1与HCDR3和LCDR1与LCDR3的共同优化。构建的四个库提供了从7x106至1x107的范围的理论多样性的8-24x的覆盖范围。
如上所述，使用FACS富集四个构建的Fab文库以与人PAC1 ECD结合。到第3轮，仅mutHCDR2和mutLCDR1-LCDR3文库产生了与亲本29G4v10抗体具有相同或更高结合的库。因此，这两个库被接下来用于制备mutH2/mutL1L3链改组的文库用于进一步改进亲和力。为了富集最高亲和力的突变体，使用来自第一代文库(表9)的表现最佳的酵母克隆2B10来设置更严格的分选门。在30℃或37℃下与未标记的PAC1进行过夜的解离速率竞争后，可以分选出与2B10克隆相比具有显著降低的解离速率的酵母克隆。约200个克隆的受限筛选揭示了约100个克隆比2B10具有更慢的解离速率，但是大多数有希望的结合物在HCDR2内含有潜在的天冬酰胺脱酰胺倾向。对于筛选的所有克隆，对PD1或GIPR的ECD的非特异性结合是最小的。应用严格的结合和序列过滤器产生10个最佳突变体，这些突变体具有相比2B10克隆显著改进的PAC1结合(在37℃过夜竞争后>2x高的百分比结合)并且没有任何潜在的序列倾向(表10)。在30℃和37℃下解离速率测定后，对于这些最佳的十个突变体的来自亲本29G4v10抗体的序列变化和人PAC1 ECD结合百分比显示在表10中。百分比结合被计算为解离速率测定后的标准化结合除以未解离速率测定的标准化结合。PAC1 ECD结合的较高百分比结合表明突变体Fab具有较慢的解离速率。
表10.来自第二代链改组的文库的解离速率筛选的最佳改进的结合物
Figure BDA0002576823830002001
Figure BDA0002576823830002011
如在表10中所示，所有这些最佳的十个结合突变体含有在CDRL1中的Q27K突变，并且除了一个之外的全部含有在CDRL1中的R31W突变。所有突变体在CDRH2中的氨基酸位置D54和N57处具有突变，并且大多数突变体还在CDRH2中的氨基酸位置G56处具有突变。在这十个突变体中的许多中还分别观察到在重链框架2(FR2)和框架3(FR3)区中氨基酸位置49和70处的保守突变。
总之，在与29G4v9 Fab(29G4v22和29G4v10抗PAC1中和抗体的密切相关的变体)复合的PAC1 ECD的结构的指导下，设计并分选29G4v10突变体的组合文库用于改进与PAC1ECD的结合。为了分离最改进的结合物，通过构建CDR改组的和/或链改组文库来组合富集的突变，用于在更严格的条件下进行选择。分选后单个酵母Fab克隆的筛选产生改进的人PAC1ECD结合物，与29G4v10亲本抗体相比具有显著更慢的结合解离速率和最小的非特异性结合。如实例3所述，将改进的亲和力变体的亚组经重组生产并评估体外功能活性。
实例3.人PAC1抗体变体的体外功能活性
为评估通过共晶结构(实例1)或酵母展示文库(实例2)的分析鉴定的重链和轻链可变区中突变对抗PAC1抗体的抑制效力的影响，通过重组表达方法产生变体作为完整的二价体单克隆抗体和/或作为单价体Fab-Fc融合物(例如与二聚体IgG Fc区融合的Fab区)，并如下文更详细描述的在基于细胞的cAMP测定中进行评估。单克隆抗体和Fab片段的轻链包含来自指定抗体变体的轻链可变区，该抗体变体与具有SEQ ID NO:318或SEQ ID NO:319的序列的人κ轻链恒定区融合。单克隆抗体和Fab-Fc融合物的重链包含来自指定抗体变体的重链可变区，该抗体变体与未糖基化的、二硫化物稳定的、具有SEQ ID NO:325的序列的人IgG1z恒定区融合。
在SDM不成功的情况下，通过定点诱变(SDM)或通过金门组装(GGA)产生PAC1抗体变体序列。定点诱变利用侧翼突变位点的成对诱变引物。使用双链质粒DNA模板进行全载体PCR反应。将特定克隆中所有所需突变的引物组合成主引物混合物，其中将一至若干个突变掺入单独反应中。扩增后，通过用DpnI消化去除模板质粒DNA，DpnI是一种优先切割甲基化DNA的核酸内切酶。然后将SDM产物转化到感受态细胞中用于生长和通过测序筛选。遵循制造商的说明，使用QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(QuikChange Lightning多定点诱变试剂盒)(安捷伦公司(Agilent))进行SDM反应。
在SDM不成功的地方，使用了可替代的克隆策略。简言之，GGA依靠II型限制酶和T4DNA连接酶来切割并将多个DNA片段无缝连接在一起。(Engler等人,PLOS One[公共科学图书馆综合],第3卷(11):e3647,2008)。在该实例中，多个DNA片段由以下组成：(i)编码Kozak共有序列、信号肽序列和抗体可变区序列的合成核酸序列(gBlock,整合的DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)，科拉尔维尔，爱荷华州)；(ii)从部分载体(Partsvector)释放的抗体恒定结构域片段；和(iii)表达载体骨架。GGA反应由以下组成：10ng的gBlock、10ng的部分载体(Part vector)、10ng的表达载体、1μl10xFast Digest ReactionBuffer(快速消化反应缓冲液)+0.5mM ATP(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、0.5μlFastDigest(快速消化)Esp3I(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、1μl T4 DNA连接酶(5U/μl，赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)并添加水至10μl。反应经15个循环进行，包括在37℃下2分钟的消化步骤和在16℃下3分钟的连接步骤。在15个循环之后进行最后5分钟37℃消化步骤和在80℃下5分钟酶灭活步骤。
克隆后，通过用相应的cDNA瞬时转染293个HEK细胞，产生其前22个氨基酸是VK1信号肽(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC；SEQ ID NO:486)的PAC1抗体多肽。用0.5mg/LDNA(在pTT5载体中0.5mg/LPAC1)或(在pTT5载体中0.1mg/L PAC1，其中0.4mg/L空白pTT5载体)(Durocher等人,NRCC,Nucleic Acids.Res.[核酸研究],第30卷:e9,2002)与4mlPEI/mgDNA在F17介质(赛默飞世尔科技公司)中转染处于1.5x106个细胞/ml的细胞。转染后1小时，将酵母提取物(Yeastolate)和葡萄糖添加到培养物中，然后使用补充有0.1％Kolliphor、6mML-谷氨酰胺和50μg/ml遗传霉素的F17表达介质使细胞在悬浮液中生长6天，之后收获条件培养基用于净化。
使用蛋白质A亲和层析(MabSelect SuRe，GE医疗集团生命科学公司(GEHealthcare Life Sciences)，Little Chalfont，白金汉郡，英国)从条件培养基中纯化PAC1抗体变体，随后通过阳离子交换层析(SP交联琼脂糖高效柱(SPHP)(GE医疗集团生命科学公司)。使用NanoDrop 2000(赛默飞世尔科技公司，罗克福德，伊利诺伊州，美国)，通过在280nm处的UV吸光度(A280)测定的每个经纯化的库中的蛋白质浓度。在4℃下，使用20kDaMWCO Slide-A-Lyzer透析烧瓶(赛默飞世尔科技公司)将经纯化的库用2L的10mM乙酸钠、9％蔗糖、pH5.2(A52Su)透析2小时，在搅拌板上伴随温和搅拌。倾析掉用过的透析液，添加新鲜的2L的A52Su并透析过夜。透析后，使用30kDa MWCO超滤浓缩器(赛默飞世尔科技公司)在浮桶式转子中以2,000xg离心浓缩样品，直至每个样品基于A280大约为40mg/mL。使用Caliper LabChip GXII微细管电泳(珀金埃尔默公司(PerkinElmer)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)和尺寸排阻层析，用ACQUITY UPLC蛋白质BEH SEC柱，
Figure BDA0002576823830002041
4.6x300mm(沃特斯公司(Waters Corporation)，米尔福德，马萨诸塞州，美国)分析终产物的主峰纯度。使用Endosafe-MCS(查尔斯河实验室(Charles River)，威明顿市，马萨诸塞州，美国)和0.05EU/mL PTS柱(查尔斯河实验室)测量内毒素含量。
使用基于细胞的PAC1受体cAMP活性测定评估经纯化的单克隆抗体或Fab-Fc融合蛋白的功能活性。PACAP38和PACAP27二者都是PAC1受体的激动剂，其激活导致细胞内cAMP的增加。该测定使用获得自ATCC(ATCC号CRL-2266；“CRL-2266细胞”)的人神经母细胞瘤衍生的细胞系(SH-SY5Y；BiedlerJL等人,CancerRes.[癌症研究],第38卷:3751-3757,1978)。CRL-2266细胞内源性地表达人PAC1受体(Monaghan等人,JNeurochem.[神经化学杂志],第104卷(1):74-88,2008)。另外，稳定表达大鼠PAC1受体(GenBank登录号NM_133511.2)或食蟹猴PAC1受体(NCBI参考序列XP_015303041.1)的CHO细胞系代替CRL2266细胞用于测定来评估在大鼠和食蟹猴PAC1受体上的抗PAC1抗体或Fab-Fc融合物的物种交叉反应性。将LANCE Ultra cAMP测定试剂盒(珀金埃尔默公司，波士顿，马萨诸塞州)用于测量cAMP浓度。
在测定的当天，在37℃下将冷冻的CRL-2266细胞解冻，并且用测定缓冲液洗涤一次。将10μL含有2,000个细胞的细胞悬浮液添加进96孔半区白板。添加5μL的抗PAC1变体单克隆抗体或Fab-Fc融合蛋白(10个点的剂量反应曲线：从1μM至0.5fM的浓度范围)后，将该混合物在室温下孵育30分钟。然后，添加5μL的人PACAP38(10pM终浓度)作为激动剂，并且将该混合物在室温下进一步孵育15分钟。人PACAP38刺激后，添加20μL的检测混合物并且在室温下孵育45分钟。在发射波长665nm下，将这些板在EnVision仪(珀金埃尔默公司，波士顿，马萨诸塞州)上读数。数据由Prizm(图形软件公司(GraphPad SoftwareInc.))处理和分析，以显示POC(对照的百分比，其中对照被定义为测定中使用的激动剂的活性)作为测试的拮抗剂(例如，抗PAC1变体抗体或Fab-Fc融合蛋白)浓度的函数，并用标准非线性回归曲线拟合以产生IC50值。POC被计算如下：
Figure BDA0002576823830002051
产生具有表6和7中汇总的突变的单价体Fab-Fc融合蛋白，并在上述基于细胞的cAMP测定中测试功能活性。将突变体Fab-Fc融合蛋白分成两个独立的组：与亲本分子相比，改进对人PAC1受体的抑制效力的突变和表征为中性的突变(表11)。如果突变具有的平均效力相比亲本分子是小于1.5x弱的，则突变被表征为中性，并且在相同的运行中至少一种效力测量比亲本分子更紧密。
表11.单个突变体Fab-Fc融合蛋白的体外抑制效力
Figure BDA0002576823830002061
1相对于SEQ ID NO:52的轻链(LC)的氨基酸位置和相对于SEQ ID NO:191的重链(HC)的氨基酸位置。
提供针对人PAC1受体的抑制效力增加的突变位于抗体表面上三维空间的三个不同区域。通过组合这三个区域中的突变产生第二轮的变体抗体和Fab-Fc融合蛋白，以潜在地提供效力上的额外增加。此外，掺入了一些中性突变，因为它们可能对结合没有显著影响，但可能提供修饰抗体生物物理特征的机制。将含有所需突变的可变区掺入具有人未糖基化的IgG1Fc区和/或单价体Fab-Fc融合蛋白的二价体单克隆抗体中。未糖基化的人IgG1抗体Fc区包含根据EU编号具有N297G、R292C和V302C突变的人IgG1zFc区的序列(SEQ IDNO:325)。在基于细胞的cAMP测定中评估具有突变组合的这些变体抗体和Fab-Fc融合蛋白的功能活性。这些结果显示在以下表12中。
表12.变体抗体和Fab-Fc融合蛋白的体外抑制效力
Figure BDA0002576823830002071
Figure BDA0002576823830002081
Figure BDA0002576823830002091
Figure BDA0002576823830002101
Figure BDA0002576823830002111
Figure BDA0002576823830002121
Figure BDA0002576823830002131
1该值代表如与格式化为mAb或Fab-Fc融合蛋白的29G4v10亲本分子的IC50值相比IC50的倍数增加，该亲本分子与每个变体分子平行运行。
2该值代表如与格式化为mAb或Fab-Fc融合蛋白的29G4v10亲本分子的平均IC50值相比IC50的倍数增加
ND＝未确定
当抗体具有轻链可变区中位置Q27(Q27K)处的突变和重链可变区中位置D54(D54I、D54Q或D54N)和/或位置G56(G56R或G56N)处的突变时，观察到效力的最大改进。SEQID NO:52的轻链可变区中的Q27对应于AHo编号中的氨基酸位置29。SEQ ID NO:191的重链可变区中的D54和G56分别对应于AHo编号中的氨基酸位置61和66。假定轻链可变区中位置Q27处的碱性氨基酸(如赖氨酸或精氨酸)提供与PAC1 ECD中的酸性氨基酸Glu120和Asp121的改进的电荷互补性(参见图2A中的区1)。重链可变区中位置D54处的疏水残基(例如，异亮氨酸)或中性亲水残基(例如，谷氨酰胺或天冬酰胺)以及重链可变区中位置G56处的碱性残基s(例如，精氨酸)或中性亲水残基(例如，天冬酰胺)似乎改进与PAC1 ECD中的氨基酸残基Asn60和Ile61的疏水相互作用或氢键(参见图3B中的区6)。
来自MutHC文库筛选的最佳的十一个突变体(表8)被格式化为如上所述的未糖基化的IgG1单克隆抗体和单价体Fab-Fc分子，用于在cAMP测定中产生和功能测试(表13)。对于这组变体，适度改进的酵母结合转化为针对11种mAb中的4种和11种Fab-Fcs中的7种的改进的PAC1受体阻断功能。然而，作为抗体，与亲本29G4v10抗体相比，iPS:421873突变体显示出PAC1阻断功能的约4倍的改进。这些突变体的活性排行在两种形式中大致一致，其中Fab-Fcs始终显示出比mAb更弱的功能(更高的IC50值)，可能是由于亲合力的丧失。
表13.来自MutHC文库筛选的变体的体外抑制效力
Figure BDA0002576823830002141
1该值代表如与格式化为mAb或Fab-Fc融合蛋白的29G4v10亲本分子的IC50值相比IC50的倍数增加，该亲本分子与每个变体分子平行运行。
2该值代表如与格式化为mAb或Fab-Fc融合蛋白的29G4v10亲本分子的平均IC50值相比IC50的倍数增加
将来自链改组的文库(表9和10)的29G4v10突变体亚组转化为未糖基化的IgG1单克隆抗体并在基于细胞的cAMP测定中测试功能活性。这些结果显示在以下表14中。
表14.来自链改组的酵母展示文库的变体的体外抑制效力
Figure BDA0002576823830002151
129G4v22是另一种抗PAC1中和抗体，该抗体与29G4v10共享显著的结构相似性。29G4v22的VL和VH序列分别提供于SEQ ID NO:53和192。
2从先前测定获得的历史值并且包括用于比较目的。
当格式化为单克隆抗体(mAb)时，与来自第一代链改组的文库的突变体(表9)相比，来自第二代链改组的文库(表10)的29G4v10突变体是PAC1的更有效的拮抗剂，表明增强的PAC1阻断功能与改进的结合相关，并且特别减缓结合解离速率。然而，令人惊奇地，大多数突变体作为mAb相比抗体iPS:421873(来自mutHC文库筛选的最有效的突变体)(表13)活性更弱，尽管假定它们与人PAC1 ECD具有增强的结合。然而，如分别与29G4v10亲本抗体和29G4v22对照抗体相比，30_D05突变体展示出在功能上约10倍和67倍的改进。由高效力S8_30_D05和iPS:421873mAb共享的一个共同的特征是HCDR2中的D54R突变，该突变在所有其他效力较低的mAb突变体中不存在。有趣地是，与29G4v10亲本抗体和29G4v22对照抗体相比，所有亲和力成熟的变体显示出与大鼠PAC1受体的交叉反应性(表14)。
实例4.人PAC1抗体变体的体内功能活性
Maxadilan是一种血管舒张肽和PAC1受体的激动剂。当皮内给药时，maxadilan引起可通过激光多普勒成像测量的局部皮肤血流增加。PAC1拮抗剂(例如抗PAC1抗体)对这种作用的抑制可以作为PAC1生物活性拮抗作用的翻译药效学模型。当格式化为来自实例3的单克隆抗体时，通过使用大鼠皮肤血流模型测试在体内抑制PAC1受体激活的PAC1变体的子集的功效，该PAC1变体展示出改进的体外抑制效力。
体内药效学模型
处于8-12周龄的幼年雄性Sprague Dawley大鼠购买自查尔斯河实验室(CharlesRiverLaboratories)。本实例中的所有程序均遵照动物福利法(Animal WelfareAct)、实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)以及实验动物福利办公室(Office of Laboratory Animal Welfare)进行。在安进公司的实验动物评估和认可委员会(AAALAC)认可的设施中，将动物分组饲养在非无菌、通风的微隔离住所中。通过自动供水***动物可随意获得颗粒饲料(Harlan Teklad 2020X，印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis，IN))和水(现场反渗透产生)。
使用激光多普勒成像在大鼠maxadilan诱导的皮肤血流增加(MIIBF)药效学(PD)模型中测试抗PAC1抗体的亚组。通过在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释maxadilan储备溶液(0.5mg/mL)至终浓度为0.5μg/mL来每天新鲜制备maxadilan(巴亨公司(Bachem)，H6734.0500)的给药溶液。取决于实验所需的剂量，按不同浓度在10mM乙酸钠、9％蔗糖、pH5.2(A52Su)中制备所有的抗PAC1抗体(Ab)，并在通过激光多普勒成像测量皮肤血流(DBF)前一天，经单次静脉快速注射给药。
使用激光多普勒成像仪(LDI-2,莫尔仪器公司(Moor Instruments,Ltd)，威明顿市，特拉华州)，用由633nm氦-氖灯泡产生的低功率激光束测量大鼠腹部的剃光斑块上的DBF。测量分辨率为0.2mm至2mm，其中仪器孔与组织表面之间的扫描距离为30cm。测量DBF并表示为％自基线的变化[100x(单独maxadilan后通量-单独基线通量)/单独基线通量]或％DBF抑制[媒介物％自基线的变化的平均值-单独抗体处理的大鼠的％自基线的变化)/媒介物％自基线的变化的平均值]以量化抗体效应的大小。
在测试当天，在用丙泊酚麻醉后，将大鼠的腹部区域剃毛并且将每只动物以仰卧位置放置在温度受控的循环温水垫上以在研究期间维持稳定的体温。在10至15分钟的稳定期后，将橡胶O形环(内径0.925cm，O-RingsWest，雅图，华盛顿州)置于大鼠腹部(不直接将其定位在可见血管上)。在所选区域上放置O形环后，进行基线(BL)DBF测量。在BL扫描后，通过皮内注射(20μL的0.5μg/mL)在O形环的中心施用PAC1激动剂maxadilan。在maxadilan注射后30分钟或在抗体处理后24±1.5小时测量DBF。O形环限定了进行DBF分析的目的区域。
所有的DBF结果均表示为平均值±SEM。使用单因素方差分析，之后使用邓尼特多重比较检验(MCT)来评估PAC1Ab相对于媒介物处理的统计学显著性。p值<0.05，用于确定两组之间的显著性。
单剂量静脉内(i.v.)筛选评估
用7种不同抗PAC1抗体(420653、420845、420943、421873、420889(PL-50347)、421091(PL-50350)和421051(PL-50351))中的一种对大鼠预处理24小时，然后maxadilan按0.1mg/kg或0.3mg/kg的剂量激发(20μl的0.5μg/mL)，与媒介物(A52Su)处理组相比导致MIIBF的降低。在maxadilan治疗后30分钟，对于测试的七种抗体中的五种，与媒介物组相比，处于0.3mg/kg的MIIBF具有统计学显著的抑制作用(图6)。在24±1.5小时，针对七种抗体中六种的终末的血清浓度列出在以下表15中。
表15.单次注射(筛选)研究的终末血清浓度
Figure BDA0002576823830002181
剂量-反应评估
用4种不同的抗PAC1抗体(420653、420845、420943和421873)对大鼠预处理24小时，然后按从0.01mg/kg至30mg/kg的剂量范围进行maxadilan激发(20μl的0.5μg/mL)。对于四种抗体中的每一种，与媒介物处理组相比，观察到MIIBF的剂量依赖性减少(图7A-7D)。按低至0.06mg/kg的剂量，Ab420653产生了显著的效果，其中在0.06mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg下抑制作用分别为44％、68％、86％、95％和101％(图7A)。按0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的剂量，Ab420845产生了显著的效果，其中在抑制分别为79％、102％和107％(图7B)。与Ab420845和Ab420653相比，Ab420943和421873略微更不有效，但仍在1mg/kg产生显著的抑制作用。在DBF中Ab420943的％抑制在1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg分别是56％、46％、52％和81％(图7C)。在DBF中Ab421873的％抑制在1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg下分别是34％、55％、72％和100％(图7D)。
如通过皮肤血流测定(PAC1-介导的血管舒张模型)的评估，在该实例中所述的实验结果显示有效抑制配体诱导的PAC1受体体外激活的抗体还抑制体内PAC1受体的激活。
实例5.人PAC1抗体变体的药代动力学特征
用幼年雄性Sprague-Dawley大鼠和幼年雄性食蟹猴进行四种抗PAC1抗体(420653、420845、420943和421873)的初步药代动力学(PK)研究。评估29G4v10亲本抗体或结构上相关的29G4v22抗体(包含SEQ ID NO:53的VL和包含SEQ ID NO:192的VH)作为对照。通过静脉推注给药将测试抗体给药以研究动物。在给药后的指定时间点收集血液样品并加工成血清。将所有血清样品储存在约-70℃(±10℃)直至转移用于后续分析。
为测量给药后来自大鼠和食蟹猴的血清样品中测试抗体的量，使用针对人IgG Fc(安进公司(Amgen,Inc.)，加利福尼亚州，美国)的鼠单克隆抗体(mAb)开发比色酶联免疫吸附测定(ELISA)。用2μg/mL的鼠抗人Fc mAb包被微量滴定板。用I-block(应用生物***公司(Applied Biosystems)，加利福尼亚州，美国)封闭包被的微量滴定板。通过将测试抗体掺入来自研究物种的100％血清中来制备测定标准品(STD)和质量控制品(QC)。将STD、QC、空白和研究样品在测定缓冲液(具有1MNaCl的1XPBS、1％BSA和0.5％Tween20)中按1:30稀释。将稀释的STD、QC、空白和研究样品在包被的微量滴定板上在25℃下孵育1小时而不搅拌。在洗涤步骤后，将测定缓冲液中30ng/mL的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的鼠抗人FcmAb添加至微量滴定板中，并在25℃下孵育1小时而不搅拌。在最后的洗涤步骤后，将四甲基联苯胺(TMB)过氧化物底物溶液(KPL公司，马里兰州(MD)，美国)加入微量滴定板中。在HRP的存在下，TMB产生比色信号，该信号与在STD、QC和研究样品中存在的结合人Fc的量成比例。显色时间依赖于分析物，并通过添加2N硫酸终止。使用SpectraMax 340PC微量滴定板读数器(分子器械公司(Molecular Devices)，加利福尼亚州，美国)和SoftMax Pro软件，参照650nm在450nm下测量光密度(OD)。使用逻辑(自动估计)回归模型(其中加权因子为1/y)对测定数据进行回归。测定动态范围是从20ng/mL至2000ng/mL。
对于大鼠和食蟹猴PK研究，使用
Figure BDA0002576823830002201
(6.4版；切尔塔拉，新泽西州，美国)对单独血清浓度-标称时间数据进行非房室分析。单个浓度值小于定量下限(LLOQ，20ng/mL)报告为低于定量限(BQL)，并设置为零用于计算汇总统计。平均浓度值低于LLOQ时不报告或绘制。从非房室分析中排除了低于LLOQ的所有浓度值。标称剂量和标称采样时间用于PK分析。估算以下PK参数：
·静脉内施用后的初始浓度(C0)值通过使用前2个观察到的下降浓度值的反向外推至时间零来估计。
·通过线性梯形法计算从时间零到无穷大(AUCinf)的浓度-时间曲线下面积。
·终末相半衰期(t1/2,z)被计算为ln2/λz，λz是与曲线的末端部分相关的药物的一级速率常数。
·按如下计算***清除率(CL)：CL＝静脉给药后剂量/AUCinf
·按如下估算稳态分布容积(Vss)：Vss＝CL x MRTinf(从时间零到无穷大的平均停留时间)
四种抗体以及29G4v10亲本抗体和29G4v22对照抗体针对人PAC1、大鼠PAC1和犬PAC1的体外抑制效力的汇总提供在以下表16中。使用实例3所述的cAMP测定，评估抗体抑制配体诱导的(PACAP38或maxadilan)来自不同物种的PAC1受体的激活的能力。
表16.PAC1变体抗体的体外抑制效力的汇总
Figure BDA0002576823830002202
Figure BDA0002576823830002211
大鼠被静脉内给予按1mg/kg、5mg/kg和25mg/kg剂量的四种抗体中的一种。在给药后的不同时间点收集血液样品，并使用上述ELISA测定在每个时间点测量血清样品中的抗体浓度。大鼠研究的PK参数汇总在下表17中，并且每种剂量的血清浓度-时间曲线显示在图8A-8C中。
表17.大鼠中PAC1变体抗体的PK参数的汇总
Figure BDA0002576823830002212
食蟹猴被静脉内给予按10mg/kg的剂量的四种抗体中的一种。在给药后的不同时间点收集血液样品，并使用上述ELISA测定在每个时间点测量血清样品中的抗体浓度。食蟹猴研究的PK参数汇总在以下表18中，并且将血清浓度-时间曲线示出在图9中。示出29G4v22抗体的PK曲线用于比较。
表18.食蟹猴中PAC1变体抗体的PK参数的汇总
Figure BDA0002576823830002221
在该剂量下，所有四种PAC1变体抗体具有相比29G4v22对照抗体更长的血清半衰期。有趣地是，尽管与29G4v22对照抗体相比，所有四种PAC1变体抗体对PAC1受体展现出更高的体外抑制效力(表16)，但一些变体的PK曲线在食蟹猴中不太有利。例如，与29G4v22对照抗体相比，Ab420845具有更快的清除率和更低的总暴露。然而，Ab420653具有与29G4v22对照抗体相当的PK曲线(图9)，表明Ab420653可以在相同给药频率下以较低剂量施用以实现类似的药理学效果。
实例6. 19H8人PAC1抗体的酵母展示亲和力成熟
为产生具有改进的抑制效力的抗PAC1抗体，使用实例2所述的方法，通过酵母展示Fab文库的FACS将19H8抗体(SEQ ID NO:296的VH区；SEQ ID NO:67的VL区)进行亲和力成熟化。19H8抗体在结构上与29G4v9、29G4v10和29G4v22抗体不同，但还表现出对人PAC1受体的非常有效的中和活性。
因为最初没有可用于PAC1 ECD-19H8 Fab复合物的晶体结构信息，所以产生同源模型以鉴定每个CDR环内的表面暴露的残基。因为预期PAC1 ECD将与表面暴露的CDR残基直接接触，所以假设通过全面诱变改变这些接触的性质或产生新的接触可以引起抗体与PAC1ECD的改进的结合。为将每个文库的理论多样性限制在可掌控的106-107，针对MIX19饱和诱变鉴定了每个CDR多达五个位置，并为每个CDR构建了一个单独的文库。由于考虑到建模的CDRH3环构象的准确性，无法可靠地鉴定该环内最多的溶剂暴露的残基。因此，考虑了CDRH3内11个CDR残基中8个处的多样化，排除了环的开始和结束时的残基。为了将饱和诱变的位置数缩小到5，避免了CDRH3中的两个色氨酸和一个苯丙氨酸，因为芳香族残基通常是蛋白质-蛋白质相互作用的关键介质。总计，六个单独的CDR Fab文库被设计以靶向16个重链和15个轻链CDR残基用于多样化，并且所构建的文库对理论多样性过采样4.5至46倍。如下提供了对每个CDR文库的靶向位置的汇总：
重链CDR文库(相对于SEQ ID NO:296的氨基酸位置)：
·CDRH1文库：Asp27(在FR1中位于CDRH1的附近)、Ser31、Asn32、Ser33和Thr35
·CDRH2文库：Tyr54、Tyr55、Ser57、Lys58、Ser60和His62
·CDRH3文库：Thr103、Lys105、Gln106、Leu107和Leu110
轻链CDR文库(相对于SEQ ID NO:67的氨基酸位置)：
·CDRL1文库：Ser28、Ser30、Arg31、Tyr32和Asn34
·CDRL2文库：Tyr49(在FR2中位于CDRL2的附近)、Ala50、Ala51、Ser52和Ser53
·CDRL3文库：Ser91、Tyr92、Ser93、Pro94和Phe96
使用FACS富集6个单独的CDR Fab文库用于与人PAC1 ECD结合，通过降低用于结合的PAC1 ECD的浓度来增加每个连续轮次的严格性(第1轮：30nM PAC1 ECD；第2轮：0.67nMPAC1 ECD；和第3轮：0.2nM PAC1 ECD)。为进一步改进亲和力，还构建了组合了来自单个CDR文库(一个用于重链，一个用于轻链)的富集突变的两个CDR改组的Fab文库以及组合了来自每个CDR改组文库的富集突变的最终的链改组的文库。使用实例2中描述的和图5中描绘的解离速率结合选择方法，在更严格的条件下对CDR改组和链改组的文库进行PAC1 ECD结合的选择。链改组文库的最终解离速率分选表明，与亲本19H8抗体相比，该库中的大多数酵母克隆在PAC1 ECD结合中显著改进。
筛选了大约800个单独的酵母克隆用于改进与人PAC1 ECD的结合。去除具有序列倾向的突变序列(例如半胱氨酸异常、N-连接的糖基化位点、天冬氨酸异构化、天冬酰胺脱酰胺和色氨酸氧化位点)。顶部约200个独特的粘合剂被推进到二次筛选，其中它们通过结合解离速率进行排序并评估非特异性结合。在30℃下，用未标记的PAC1ECD过夜竞争后，在二次筛选中，相比亲本19H8抗体，如由生物素化的人PAC1 ECD的更高百分比结合测量的，>80％的克隆具有更慢的结合解离速率。测量值代表解离速率改进的下限，因为生物素化的PAC1 ECD在30℃竞争仅1小时后完全与亲本19H8解离。因为没有经筛选的克隆表现出与不相关的PD1和GIPR受体的ECD结合，为了进一步缩小克隆库，应用额外的序列过滤器去除突变体，这些突变体的CDR包含弗林蛋白酶(furin)切割位点、另外的色氨酸残基以及比亲本19H8抗体更多的协方差违规(covariance violation)。用生物素化的人VPAC2ECD进行另外的结合测定以确定与人VPAC2(与人PAC1受体的结构相关受体)的非特异性结合程度，用于对克隆进行排序。表现出对人PAC1 ECD的最慢结合解离速率的前20种突变体和进入二次筛选的酵母克隆中最少量的人VPAC2结合列于下表19中。PAC1 ECD结合的较高百分比结合表明突变体Fab具有较慢的解离速率。
表19.针对19H8亲本抗体的来自酵母展示文库的最佳改进的结合物
Figure BDA0002576823830002241
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由重组表达方法产生的改进的亲和力变体作为完整的二价体单克隆抗体和/或作为单价体Fab-Fc融合物(例如，与二聚体IgG Fc区融合的Fab区)并在实例3中描述的基于细胞的cAMP测定中评估体外功能活性。功能测定的结果示出在以下表20中。
表20.19H8变体抗体和Fab-Fc融合蛋白的体外抑制效力
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1从先前测定获得的历史值并且包括用于比较目的。
当格式化为Fab-Fc融合蛋白时，如与亲本19H8 Fab-Fc融合蛋白相比，19H8变体展示出抑制效力的2倍至58倍增加。当格式化为Fab-Fc融合蛋白时，20H8变体中的许多比29G4v10变体更有效(针对Fab-Fc融合蛋白，将表19中的结果与表12中的结果进行比较)。当格式化为二价体单克隆抗体时，19H8变体还展现出有效的人PAC1中和活性，其中IC50值在个位数纳摩尔或皮摩尔范围内。
实例7.食蟹猴中人PAC1抗体变体的体内功能活性
为评估抗PAC1抗体420653在体内的靶参与，评估了抗体抑制maxadilan诱导的食蟹猴中皮肤血流增加的能力。Maxadilan是PAC1受体的选择性拮抗剂，并且可以激活啮齿动物、食蟹猴和人类的受体。如实例4中所述，maxadilan的皮内给药引起可通过激光多普勒成像测量的局部皮肤血流的增加。抗PAC1抗体对这种作用的抑制可以作为PAC1生物活性拮抗作用的翻译药效学模型。
将5至8岁之间的雄性食蟹猴用于该研究。通过在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释maxadilan储备溶液(0.5mg/mL)来每天新鲜制备maxadilan(巴亨公司(Bachem)，H6734.0500)的给药溶液。作为对照测试的抗PAC1抗体420653或29G4v22在不同浓度的10mM乙酸钠、9％蔗糖、0.01％Tween-80、pH5.2(A52SuT)中制备，这取决于实验所需的剂量，并通过静脉内(i.v.)输注给予。
使用激光多普勒成像仪(LDI2-IR,莫尔仪器公司(Moor Instruments,Ltd)，威明顿市，特拉华州)，用由633nm氦-氖灯泡产生的低功率激光束测量腹侧前臂或大腿内部皮肤的剃光斑块上的皮肤血流(DBF)。将红外波长与可见红色瞄准光束相结合，以给出对更深的皮肤(0.6至1mm)中的血流的更高权重。入射光被静态组织和移动的血液散射。在微血管***中移动的血液引起多普勒光移位。然后将来自移动的血液的移位光和来自组织的未移位的光导向2平方律检测器。然后处理经检测的强度波动以给出通量(与组织血流成比例)和浓度(与移动的血细胞的浓度成比例)的参数。测量分辨率为0.2mm至2mm，仪器孔与组织表面之间的扫描距离为20cm至100cm。
DBF被测量为通量(相对单元)并表示为给予maxadilan后30min％自基线的变化[100x(单独maxadilan后通量-单独基线通量)/单独基线通量]。来自两个独立O形环的通量单元针对每个测试期间被平均在一起。抗PAC1抗体对maxadilan诱导的个体动物的血流的增加(MIIBF)的抑制效果被表示为％抑制[100x(第0天％自基线的变化的平均值-经单独抗体处理的动物％自基线的变化)/第0天％自基线的变化的平均值]。
在麻醉和生命体征稳定15至20分钟后，将橡胶O形环(内径0.925cm，O-RingsWest，西雅图，华盛顿州)放置在腹侧前臂或大腿内部的预先剃光的皮肤上，彼此间隔约0.6cm至1cm，而不是直接定位在可见血管上。用于每个测试阶段的肢是预先确定的，其中在该研究的不同测试日使用不同的肢。将O形环放置在皮肤上后，进行基线测量。在基线扫描后，在O形环的中心注射1ng在20μL媒介物(PBS)中的maxadilan溶液。在数据分析期间，O形环充当目的区域。
在给予抗PAC1抗体之前，在第0天获得MIIBF的时程。在食蟹猴中基于先前maxadilan剂量反应的结果选择1ng的maxadilan剂量。在前maxadilan基线DBF测量之后，通过在maxadilan施用后5、10、15、20、25和30分钟获得激光多普勒扫描来评估DBF反应对maxadilan皮内注射的时程。为了鉴定maxadilan应答者并消除包含在研究中的非应答者，实施抗体施用前的筛选前程序。如果动物具有DBF流变化≥60个通量单位(在30分钟内maxadilan后DBF的平均值-基线平均值)则被认为是maxadilan应答者并且包括在该研究中。
在第0天，被鉴定为maxadilan应答者的24只食蟹猴接受按0.1mg/kg或3mg/kg剂量的抗体420653或按10mg/kg剂量的抗体29G4v22。经静脉注射，通过注射器输注泵以1mL/min的速率输注到隐静脉来给予抗体。使用不同的肢，在第2、4、7、10、14、21、28和36天进行maxadilan后DBF测量。在每种情况下，在1ng maxadilan皮内注射后，通过激光多普勒成像测量DBF30分钟。在多个时间点(包括抗体给药前，抗体治疗后30分钟，1、2、4、7、10、14、21、28、35或36和42天)采集用于药代动力学(PK)分析的全血样品。
如图10A所示，与第0天(抗体处理前)相比，在第2、第7、第14和第21天(抗体处理后)以3mg/kg而不是0.1mg/kg的抗体420653显著抑制了MIIBF(n＝8只动物/组；经邓尼特调整的p值＝0.0087)。在第2和第7天，以10mg/kg的抗体29G4v22显著地抑制了MIIBF(n＝8只动物/组)(图10A)。在第2天，3mg/kg的抗体420653的最大抑制效果具有96％抑制，然而在第4天处于0.1mg/kg的抗体420653产生的最大抑制为39％，该值在统计学上不显著(图10B)。第7天，10mg/kg的抗体29G4v22产生的最大抑制为63％(图10B)。在相同的时间点，抗体420653(3mg/kg)和抗体29G4v22(10mg/kg)的比较在第2、第7、第14、和第21天显示出显著差异(图10B)。
在进行DBF测量的当天，将抗体420653和抗体29G4v22的抗体血清浓度显示在下表21中。定量下限(LLOQ)或低于定量水平(BQL)针对抗体420653为10ng/mL，针对抗体29G4v22为50ng/mL。
表21.抗体处理后，食蟹猴中抗体420653和29G4v22的血清浓度
Figure BDA0002576823830002331
*较小的PK数据点是由于具有LLOQ/BQL的一些样品
总之，这些结果表明当以3mg/kg的剂量给予时，在食蟹猴中抗体420653显著减弱MIIBF。处于3mg/kg的抗体420653对MIIBF的抑制作用比处于10mg/kg较高剂量下的抗体29G4v22更强。
本文讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其全部内容并入本文。应当理解的是，所披露的发明不限于所描述的具体的方法学，方案和材料，因为这些是可以变化的。还应当理解的是，本文使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的，并且不旨在限制所附权利要求书的范围。
本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同物。此类等效物旨在由以下权利要求所涵盖。
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Claims (56)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合人垂体腺苷酸环化酶激活多肽I型受体(PAC1)(SEQ ID NO:1)，其中该抗体或其抗原结合片段包含：(i)轻链可变区，其中根据AHo编号在位置29处的氨基酸是与人PAC1的氨基酸Glu120或Asp121相互作用的碱性氨基酸；和(ii)重链可变区，其中根据AHo编号在位置61处的氨基酸是与人PAC1的氨基酸Asn60或Ile61相互作用的疏水、碱性或中性亲水氨基酸，并且其中该抗体或其抗原结合片段抑制PACAP诱导的人PAC1的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的，IC50小于500pM。
2.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中在该轻链可变区中位置29处的氨基酸是赖氨酸或精氨酸。
3.如权利要求1或权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中在该重链可变区中位置61处的氨基酸是异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中在该抗体或其抗原结合片段的重链可变区中根据AHo编号在位置66处的氨基酸是与人PAC1的氨基酸Asn60或Ile61相互作用的碱性或中性亲水氨基酸。
5.如权利要求4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中在该重链可变区中在位置66处的氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段在表位处与人PAC1结合，该表位进一步包含选自以下的一个或多个氨基酸：SEQID NO:1的Asp59、Arg116、Asn117、Thr119、Gly122、Trp123、Ser124、Glu125、Pro126、Phe127、Pro128、His129、Tyr130、Phe131、Asp132和Gly135。
7.如权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该轻链可变区包含与SEQ ID NO:52的序列具有至少90％同一性的序列，并且该重链可变区包含与SEQ IDNO:191的序列具有至少90％同一性的序列。
8.一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合人PAC1，其中该抗体或其抗原结合片段包含：包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1包含选自SEQID NO:5-16的序列；CDRL2包含SEQ ID NO:26的序列；CDRL3包含选自SEQ ID NO:36-38的序列；CDRH1包含选自SEQ ID NO:88-96的序列；CDRH2包含选自SEQ ID NO:106-166的序列；并且CDRH3包含选自SEQ ID NO:171-177的序列。
9.如权利要求8所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中：
(a)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:7、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、108和171的序列；
(b)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:7、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、116和171的序列；
(c)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:5、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、134和171的序列；
(d)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:5、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:92、145和174的序列；
(e)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:7、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、108和172的序列；
(f)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:5、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、128和172的序列；
(g)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:7、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、134和171的序列；
(h)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:12、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、153和171的序列；
(i)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:12、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、154和171的序列；或
(j)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:13、26和36的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:88、155和171的序列。
10.如权利要求8或9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该轻链可变区包含(i)与选自SEQ ID NO:54-66的序列具有至少90％同一性的序列，(ii)与选自SEQ ID NO:54-66的序列具有至少95％同一性的序列，或(iii)选自SEQ ID NO:54-66的序列。
11.如权利要求8至10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该重链可变区包含(i)与选自SEQ ID NO:191-295的序列具有至少90％同一性的序列，(ii)与选自SEQID NO:191-295的序列具有至少95％同一性的序列，或(iii)选自SEQ ID NO:191-295的序列。
12.如权利要求8至11中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中：
(a)该轻链可变区包含SEQ ID NO:54的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:194的序列；
(b)该轻链可变区包含SEQ ID NO:54的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:203的序列；
(c)该轻链可变区包含SEQ ID NO:55的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:228的序列；
(d)该轻链可变区包含SEQ ID NO:55的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:274的序列；
(e)该轻链可变区包含SEQ ID NO:54的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:214的序列；
(f)该轻链可变区包含SEQ ID NO:55的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:240的序列；
(g)该轻链可变区包含SEQ ID NO:54的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:228的序列；
(h)该轻链可变区包含SEQ ID NO:62的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:282的序列；
(i)该轻链可变区包含SEQ ID NO:62的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:283的序列；或
(j)该轻链可变区包含SEQ ID NO:63的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:284的序列。
13.一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合人PAC1，其中该抗体或其抗原结合片段包含：包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区以及包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRL1包含选自SEQID NO:17-25的序列；CDRL2包含选自SEQ ID NO:27-35的序列；CDRL3包含选自SEQ ID NO:39-51的序列；CDRH1包含选自SEQ ID NO:97-105的序列；CDRH2包含选自SEQ ID NO:167-170的序列；并且CDRH3包含选自SEQ ID NO:178-190的序列。
14.如权利要求13所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中：
(a)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:25、31和42的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:98、168和190的序列；
(b)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:20、30和44的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:100、168和182的序列；
(c)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、33和42的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:99、168和187的序列；
(d)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:23、31和50的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:97、167和178的序列；
(e)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、31和44的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:98、168和189的序列；
(f)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、27和39的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:100、168和182的序列；
(g)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:18、31和46的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:98、168和179的序列；
(h)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:17、28和40的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:98、168和179的序列；
(i)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:18、30和43的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:100、168和182的序列；或
(j)CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:22、28和49的序列，并且CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:102、169和182的序列。
15.如权利要求13或14所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该轻链可变区包含(i)与选自SEQ ID NO:68-87的序列具有至少90％同一性的序列，(ii)与选自SEQ ID NO:68-87的序列具有至少95％同一性的序列，或(iii)选自SEQ ID NO:68-87的序列。
16.如权利要求13至15中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该重链可变区包含(i)与选自SEQ ID NO:296-312的序列具有至少90％同一性的序列，(ii)与选自SEQ ID NO:296-312的序列具有至少95％同一性的序列，或(iii)选自SEQ ID NO:296-312的序列。
17.如权利要求13至16中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中：
(a)该轻链可变区包含SEQ ID NO:85的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:312的序列；
(b)该轻链可变区包含SEQ ID NO:72的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:300的序列；
(c)该轻链可变区包含SEQ ID NO:81的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:307的序列；
(d)该轻链可变区包含SEQ ID NO:78的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:296的序列；
(e)该轻链可变区包含SEQ ID NO:83的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:310的序列；
(f)该轻链可变区包含SEQ ID NO:87的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:300的序列；
(g)该轻链可变区包含SEQ ID NO:74的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:297的序列；
(h)该轻链可变区包含SEQ ID NO:68的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:297的序列；
(i)该轻链可变区包含SEQ ID NO:71的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:300的序列；或
(j)该轻链可变区包含SEQ ID NO:77的序列，并且该重链可变区包含SEQ ID NO:304的序列。
18.如权利要求1至17中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
19.如权利要求18所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段、或全人源抗体或其抗原结合片段。
20.如权利要求18或19所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体包含轻链，该轻链包含人κ恒定区。
21.如权利要求20所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该人κ恒定区包含SEQ IDNO:318或SEQ ID NO:319的序列。
22.如权利要求18或19所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体包含轻链，该轻链包含人λ恒定区。
23.如权利要求22所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该人λ恒定区包含SEQ IDNO:315的序列。
24.如权利要求18至23中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
25.如权利要求24所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体是人IgG1抗体。
26.如权利要求25所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体是未糖基化的人IgG1抗体。
27.如权利要求26所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体包含在其重链中根据EU编号在氨基酸位置N297处的突变。
28.如权利要求27所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该突变是N297G。
29.如权利要求27或28所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体进一步包含在其重链中根据EU编号的R292C和V302C突变。
30.如权利要求26所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含SEQ ID NO:324或SEQ ID NO:325的序列。
31.如权利要求1至30中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段抑制PACAP诱导的大鼠PAC1的激活，其中如通过基于细胞的cAMP测定测量的，IC50小于10nM。
32.一种特异性地结合人PAC1的分离的抗体，其中该抗体包含轻链和重链，其中：
(a)该轻链包含SEQ ID NO:506的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:521的序列；
(b)该轻链包含SEQ ID NO:506的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:522的序列；
(c)该轻链包含SEQ ID NO:504的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:523的序列；
(d)该轻链包含SEQ ID NO:504的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:524的序列；
(e)该轻链包含SEQ ID NO:506的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:525的序列；
(f)该轻链包含SEQ ID NO:504的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:526的序列；
(g)该轻链包含SEQ ID NO:506的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:523的序列；
(h)该轻链包含SEQ ID NO:507的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:527的序列；
(i)该轻链包含SEQ ID NO:507的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:528的序列；
(j)该轻链包含SEQ ID NO:508的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:529的序列；
(k)该轻链包含SEQ ID NO:510的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:531的序列；
(l)该轻链包含SEQ ID NO:511的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:532的序列；
(m)该轻链包含SEQ ID NO:512的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:533的序列；
(n)该轻链包含SEQ ID NO:513的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:534的序列；
(o)该轻链包含SEQ ID NO:514的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:535的序列；
(p)该轻链包含SEQ ID NO:515的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:535的序列；
(q)该轻链包含SEQ ID NO:516的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:532的序列；
(r)该轻链包含SEQ ID NO:517的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:536的序列；
(s)该轻链包含SEQ ID NO:509的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:532的序列；或
(t)该轻链包含SEQ ID NO:518的序列，并且该重链包含SEQ ID NO:530的序列。
33.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1至32中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的赋形剂。
34.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码如权利要求1至32中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
35.一种表达载体，该表达载体包含如权利要求34所述的多核苷酸。
36.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求35所述的表达载体。
37.一种产生特异性地结合人PAC1的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在允许该抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养如权利要求36所述的宿主细胞；以及从该培养基或宿主细胞中回收该抗体或其抗原结合片段。
38.一种用于在有需要的患者中抑制血管舒张的方法，该方法包括向该患者给予有效量的如权利要求1至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
39.如权利要求38所述的方法，其中该患者患有头痛病况。
40.一种用于在患有头痛病况的患者中抑制人PAC1受体激活的方法，该方法包括向该患者给予有效量的如权利要求1至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
41.一种用于在有需要的患者中治疗或预防头痛病况的方法，该方法包括向该患者给予有效量的如权利要求1至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
42.如权利要求39至41中任一项所述的方法，其中该头痛病况是偏头痛。
43.如权利要求42所述的方法，其中该偏头痛是发作性偏头痛。
44.如权利要求42所述的方法，其中该偏头痛是慢性偏头痛。
45.如权利要求39至41中任一项所述的方法，其中该头痛病况是丛集性头痛。
46.如权利要求41至45中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段作为预防性治疗被给予至该患者。
47.如权利要求41至45中任一项所述的方法，该方法进一步包括向该患者给予第二头痛治疗剂。
48.如权利要求47所述的方法，其中该第二头痛治疗剂是急性头痛治疗剂。
49.如权利要求48所述的方法，其中该急性头痛治疗剂是5HT1B、5HT1D和/或5HT1F血清素受体激动剂。
50.如权利要求49所述的方法，其中该血清素受体激动剂是曲坦或麦角胺。
51.如权利要求48所述的方法，其中该急性头痛治疗剂是非甾体抗炎药或阿片样物质。
52.如权利要求47所述的方法，其中该第二头痛治疗剂是预防性头痛治疗剂。
53.如权利要求52所述的方法，其中该预防性头痛治疗剂是抗癫痫药、β-受体阻滞剂、抗抑郁剂、肉毒杆菌素A、或CGRP途径拮抗剂。
54.如权利要求53所述的方法，其中该CGRP途径拮抗剂是人CGRP受体拮抗剂。
55.如权利要求54所述的方法，其中该人CGRP受体拮抗剂是特异性地结合人CGRP受体的单克隆抗体。
56.如权利要求55所述的方法，其中该抗CGRP受体单克隆抗体是厄瑞奴单抗。
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