CN111562377A - 一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ca199表达的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。所述的试剂盒，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、羊抗CA199一抗100μL、兔抗羊IgG/HRP 100μL、0.1%Triton X‑100 100μL、0.3% H₂O₂ 100μL、试剂A 15ml、试剂B 50ml、6×PBS缓冲液60mL。本发明的检测方法是利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫组化技术检测CTC的CA199表达情况。

Description

一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的试剂 盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

胰腺癌是消化***常见的恶性肿瘤，也是预后最差的恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤所导致的死亡中，胰腺癌排第四位，90％患者在确诊后一年内死亡，5年生存率不足5％。由于胰腺癌早期症状隐匿，且没有特异性，侵袭性强，转移早，确诊时多处于中晚期，手术切除率低，确诊时候仅15％，因此对胰腺癌患者治疗方法的选定显得尤为重要，可以使部分患者避免不必要的手术创伤及风险。

CAl99(carbohydrate antigenl99)又称肿瘤相关199抗原、胃肠癌相关抗原或糖抗原，是一种黏蛋白类肿瘤标记物，系细胞膜上的糖脂质，在血液中以黏蛋白的形式存在。CAl99是一种与腺癌高度相关的抗原物质，由腺癌细胞产生，经胸导管引流入血。血清CAl99正常参考值为39kU／L，恶性肿瘤血清中CAl99浓度多明显升高，尤其是胰腺癌、结肠癌患者，升高几倍至几十倍不等，甚至可达1000U／mL，故主要用于胰腺癌的早期诊断，而目前临床实践中，胰腺癌患者CA199检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。

目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位，对于循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术进行产业化推广的研究，本项目为山东省重大科技创新工程项目，本项目将以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、***受体、孕激素受体、BCA-225、CA 125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行产业化推广。

发明内容

为了克服多次或实时检测的问题，同时避免穿刺活检面临出血、胰瘘、感染等风险，本发明提供了一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的试剂盒及检测方法，利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫组化技术检测CTC的CA199表达情况。

本发明采用的技术方案如下：

一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的试剂盒，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、羊抗CA199一抗100μL、兔抗羊IgG/HRP 100μL、0.1%Triton X-100 100μL、0.3% H₂O₂ 100μL、试剂A 15ml、试剂B 50ml、6×PBS缓冲液 60mL。

所述稀释液为氯化钾19g/L，乙二胺四乙酸二钾4 .8g/L，吡啶鎓钠2 .6g/L，磷酸二氢钾17g/L，氢氧化钠9g/L，羟乙基哌嗪乙硫磺酸0.2g/L，二羟基甲基脲2g/L，余量为纯化水。

所述脱色液是由0.5%盐酸-70%乙醇溶液组成。

所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。

所述试剂A为甲醛-甲醇按照体积比2：1组成；所述试剂B为二甲苯。

上述的试剂盒非诊断目的检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的方法，包括以下步骤：

（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；

（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液45ml进行稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；

（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；

（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；

（5）运用免疫组化技术检测CTC的CA199表达情况。

所述的步骤（5）所述检测CTC的CA199表达的具体方法如下：

S1 脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；

S2 滴加100μl 0.1% Triton X-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；

S3 滴加100μl 0.3% H₂O₂，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μl羊抗CA199一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；

S4 滴加100μl兔抗羊IgG/HRP，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；

S5 滴加100μl DAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；

S6 显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；

S7 盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；

S8 将返蓝后的CTC采用75%乙醇，95%乙醇，100%乙醇梯度乙醇脱水各10 min，然后加入15 mL试剂A，振荡均匀后过滤；加入试剂B，脱色30 min，干燥，中性树脂封固；

S9光学显微镜下镜检。

本发明所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。

所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。

所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为8微米的滤孔。

本发明的有益效果是：

（1）本发明提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发胰腺癌患者CA199表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。

（2）本发明提供的方法，能够避免染色过程中可能产生的边缘效应导致的假阳性结果，稳定性好，降低细胞的损失，提高检测的准确性。

附图说明

图1为本发明的膜过滤装置结构示意图；

图2为本发明膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图；

图3为本发明膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图；

图4为胰腺癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图。

图中：1铁架台、2血样容器、3滤器、4输液器、5废液缸、6滤器上口、7滤膜、8载滤膜平台、9滤器下口、10滤孔、11底座、12立架、13支架。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明阐述如下。

本发明所使用的试剂盒具体规格如表1所示：

表1 试剂盒具体规格

组分	含量
		6×PBS缓冲液	60 mL
稀释液	50 mL
		脱色液	1mL
染色液A	0.5 mL
		染色液B	1mL
羊抗CA199一抗	100μL
		兔抗羊IgG/HRP	100μL
0.1% Triton X-100	100μL
		0.3% H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>	100μL
试剂A	15mL
		试剂B	50 mL

运用此技术方法分离获取并鉴定15例胰腺癌患者（同时检测5例正常人样本做阴性对照）外周血循环肿瘤细胞的实施例。

所述稀释液的配置：氯化钾19g，乙二胺四乙酸二钾4.8g，吡啶鎓钠2.6g，磷酸二氢钾17g，氢氧化钠9g，羟乙基哌嗪乙硫磺酸0.2g，二羟基甲基脲2g，纯化水945.4g。

实施例1

一、利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC，确定CTC是否存在：

自肘正中静脉采集空腹8-12小时的空腹血5ml，用45ml稀释液稀释外周血，然后加入3ml的4%多聚甲醛固定稀释后的血样10分钟；

在固定的间期，组装膜过滤装置：如附图1、图2、图3所示，该过滤装置由滤器3、滤膜7、血样容器2、废液缸5、铁架台1构成；

用10mlPBS润湿滤器3，然后将固定好的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器2中，使其依靠重力自然过滤，CTC被截留在滤膜7上；

肿瘤细胞直径一般大于15微米，而血细胞（包括红细胞、白细胞）直径一般小于8微米，因此当含有CTC的外周血经过滤后，血细胞因直径小于滤孔10能够被滤过，而CTC因直径大于滤孔10被截留在滤膜7上。

过滤结束后，从过滤装置中取下滤器3，打开并移走滤器上口6，将将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入B液，1ml，染色2min，纯水1ml,PBS缓冲液将滤器3冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜7，细胞面朝上，放置在载玻片上；

将滤膜干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC。

图4为胰腺癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图，从图中可以看出，其细胞核异型性，细胞核较大，细胞核形状不规则，细胞直径（长端）大于15um；细胞核染色质边移，巨大核仁，异常核***。

通过观察，5例健康志愿者均未查到CTC；除3例复发胰腺癌患者和1例子晚期胰腺癌患者未检测到CTC外，其余6例复发胰腺癌患者和5例子晚期胰腺癌患者均检测到CTC（表2），本次检测阳性率为73.3%。

值得注意的是，当稀释液不添加二羟基甲基脲或者羟乙基哌嗪乙硫磺酸时，制备的血样稳定性差，部分血样还会形成分层，血液细胞容易发生聚集和粘连，影响最终的检测效果。

表2 实施例CTC检测结果

二、运用免疫组化技术检测CTC的CA199表达情况：

将载玻片上载有CTC的滤膜7从载玻片上取下，置于0.5%盐酸-70%乙醇溶液的脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；滴加100μl 0.1% Triton X-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；滴加100μl 0.3% H₂O₂，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；滴加100μl 羊抗CA199一抗，室温孵育2h（或4℃过夜），PBS洗2min×3次；滴加100μl兔抗羊IgG/HRP，室温（18~26℃）孵育20min，PBS洗2min×3次；滴加100μl DAB显色液，室温（18~26℃）孵育并随时在显微镜下观察显色情况（一般为3~10min，时间不能超过10min）；显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，然后加入体积比2：1的甲醛和甲醇，振荡均匀后过滤，二甲苯脱色，晾干，中性树脂封固；光学显微镜下镜检，细胞病理学专家阅片，根据细胞膜和细胞浆着色程度判定CA199表达情况。

由0.5%盐酸-70%乙醇溶液制备的的脱色液效果比95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成的脱色液，脱色效果好。

当不采用试剂A只用二甲苯脱色，检测结果的准确率为85%，采用试剂A和试剂B，即本发明的细胞集中，且形态清晰，分散均匀性好，准确率可达到99%。

所检测的循环肿瘤细胞应用免疫组化证实CA199的表达并与胰腺癌手术或穿刺组织标本CA199表达结果对比，观察其差异性，验证了CTCs作为无创活检用于实时评估胰腺癌CA199表达的潜力，为评估胰腺癌化疗联合免疫治疗预后提供重要依据。

Claims (7)

1.一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、羊抗CA199一抗100μL、兔抗羊IgG/HRP100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H₂O₂ 100μL、试剂A 15ml、试剂B 50ml、6×PBS缓冲液 60mL。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为氯化钾19g/L，乙二胺四乙酸二钾4 .8g/L，吡啶鎓钠2 .6g/L，磷酸二氢钾17g/L，氢氧化钠9g/L，羟乙基哌嗪乙硫磺酸0.2g/L，二羟基甲基脲2g/L，余量为纯化水。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由0.5%盐酸-70%乙醇溶液组成。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A为甲醛-甲醇按照体积比2：1组成；所述试剂B为二甲苯。

6.一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒非诊断目的检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；

（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液45ml进行稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；

（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；

（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；

（5）运用免疫组化技术检测CTC的CA199表达情况。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤（5）所述检测CTC的CA199表达的具体方法如下：

S1 脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；

S2 滴加100μl 0.1% Triton X-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；

S3 滴加100μl 0.3% H₂O₂，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；滴加100μl羊抗CA199一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；

S4 滴加100μl兔抗羊IgG/HRP，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；

S5 滴加100μl DAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；

S6 显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；

S7 盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；

S8 将返蓝后的CTC采用75%乙醇，95%乙醇，100%乙醇梯度乙醇脱水各10 min，然后加入15 mL试剂A，振荡均匀后过滤；加入试剂B，脱色30 min，干燥，中性树脂封固；

S9光学显微镜下镜检。

Images