CN111548307A - 一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法,属于分析检测技术领域。本发明的荧光探针具体化学结构如式(Ⅰ)所示。该荧光探针能够对植物叶片表面噬菌体产生的角质酶进行特异性、抗干扰性检测,且在与角质酶发生反应后该探针的荧光颜色还会发生肉眼可见的红移,可以实现对角质酶的比率型检测。其次,该探针还可广泛的应用于液体环境、气体环境、以及化学品种角质酶的检测。同时,该探针具有稳定性好,且对角质酶的检测具备高灵敏度、高选择性以及特异性的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法,属于分析测试技术领域。
背景技术
角质酶是一种丝氨酸酯酶,此种酶主要作用于水解植物角质中存在的酯键,同时也可作用于如长链脂肪酸、短链脂肪酸的酯类。角质酶可以被细菌、真菌及人工合成等方式产出。角质酶是一种具有α/β水解折叠的共同结构框架的蛋白质,由不同病菌产生出的角质酶其组成结构基本相同。同时,角质酶属于诱导酶,主要成分为糖蛋白,一般是以O-糖苷键与碳水化合物结合。角质酶目前主要的应用领域较为狭窄,主要是食品工业及纺织工业。
多数真菌、细菌在感染植物前需通过一定的手段分解或者破坏植物叶片表面覆盖的角质层以使感染过程顺利进行。分泌角质酶作为一种能够有效分解植物叶片表面角质层的手段,是很多植物病菌感染植物的必要步骤,例如:烟草赤星病菌、稻瘟病菌等。由于分泌角质酶步骤存在于病菌对植物产生实际伤害之前,所以研究对角质酶的快速检测技术对植物保护及相关病害定性、预警具有重要的实际意义。
目前对植物病害的检测手段主要有噬菌体法、血清技术、电镜技术和PCR诊断技术。噬菌体是一种能够侵染病菌的物质,可以通过具有特异性的单价噬菌体完成对病菌的检测与定性。血清技术是通过抗体和抗原特异性结合来实现对病菌快速定性和检测技术。电镜方法是将电子显微镜与血清技术相结合的一种方法。该技术可以分辨出形态相似但不同种的病毒,是一种在超微和分子水平上可以对植物病原物的形态、结构进行研究的精密技术。聚合酶链式反应(PCR),是一种体外扩增特异性DNA技术。应用PCR扩增技术可将很少的病原微生物扩增放大,以此来达到检测病害的目的。
虽然现有的植物病害检测技术已经能够实现对植物病害快速地、准确地检测,不同的方法都具有不同的检测优势。但是,这些检测手段的实施无不建立在精密、昂贵的检测仪器基础上。诸如电泳仪、电子显微镜和高效液相色谱等检测设备价格昂贵、操作复杂极大的影响了植物病害检测技术的推广与应用。此外,由于这些检测手段的专业性较强、检测过程复杂,检测工作只能由受过相关培训的专业人才进行。这也阻碍了现有的检测手段在病虫害检测过程中的应用,不利于相关技术的普及。
发明内容
本发明的目的在于克服上述植物病害检测领域中步骤繁琐,操作手段要求高的缺点,以角质酶为植物病害标志物,提供一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法,检测过程简便、快捷,结果判定直观,有利于非技术人员对该技术的掌握与运用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
第一方面,本发明提供了一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针,其具有如式(Ⅰ)所示结构:
式(Ⅰ)所示探针为N-正丁基-4-(4-顶酰氧基苯乙烯基)-1,8- 萘二酰亚胺,分子式为C28H27NO4,分子量为441.52。该探针为橘黄色无味固体粉末,易溶于二氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醇等有机溶剂。
本发明所示荧光探针是一个稳定的荧光团,在萘环的1位和 8位上的酰胺基团为强力的吸电子基团,而萘环4位上的基团为强力的供电子基团,所以整个荧光探针就构成了一个典型“推-拉”电子的结构从而在荧光下呈现出绿色。当角质酶作用于该荧光探针时改变了萘环4位上取代基团的结构,从而导致整个分子的推拉电子效应变化,最终致使该探针的荧光颜色从绿色转变为橘黄色。在检测过程中,可将探针颜色变化的荧光强度比值作为检测信号从而达到比率型检测角质酶的目的。
根据研究表明,如式(Ⅰ)所示荧光探针的最大吸光位置在 377nm附近。以380nm波长的光作为激发光照射该探针,探针的荧光发射位置在520nm左右呈绿色。当角质酶与探针作用后,探针萘环4位上的酯键断裂致使探针体系的推拉电子效应变化,520nm处的荧光发射峰强度逐渐变小,同时在580nm处出现一个新的荧光发射峰并逐渐增强。在反应约40min后520nm处发射峰趋近于消失,而 580nm处发射峰达到最大强度。至此荧光探针颜色完全转变为橘黄色。
基于本发明的荧光探针具有对角质酶的特异性检测、选择性检测的能力。本探针能够在生物样品、环境样品、化学样品中完成对角质酶的快速、便捷的检测。
第二方面,本发明提供了一种如式(Ⅰ)所示荧光探针的制备方法。其包括如下步骤:
(1)以4-溴-1,8-萘二酰亚胺与正丁胺为原料制得如式(Ⅱ) 所示N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺。
(2)以N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺与4-乙酰氧基苯乙烯为原料制得如式(Ⅲ)所示N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8- 萘二酰亚胺。
(3)将N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺置于KOH提供的碱性条件下制得如式(Ⅳ)N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。
(4)将N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺与丁酸酐反应后制得如式(Ⅰ)所示荧光探针。
作为本发明所述荧光探针的制备方法的优选实施方式,所述荧光探针的制备方法包括以下步骤:
(1)将4-溴-1,8-萘二酰亚胺溶解于乙醇中,随后加入正丁胺,在85℃条件下反应4小时。随后通过旋转蒸发除去乙醇得到固体粉末后经柱层析得到如式(II)所示N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺。
(2)将N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺溶解于三乙胺与乙腈的混合溶液中,三乙胺与乙腈的体积比为7:3。随后加入4-乙酰氧基苯乙烯并在醋酸钯与三(邻甲苯基)膦的催化下于105℃反应12小时。反应完成后通过旋转蒸发除去溶剂,将所得固体粉末经柱层析得如式(Ⅲ)所示N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。
(3)将N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺加入含有KOH的乙醇溶液中并在冰浴中搅拌20min,然后再于室温下继续反应5h。反应结束后,经旋转蒸发与柱层析所得固体粉末即为式(Ⅳ)所示成N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。
(4)将N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺与丁酸酐置于二氯甲烷与吡啶的混合溶液中于冰浴中先反应20min,随后撤去冰浴在室温下反应5h。反应后的溶液通过旋转蒸发的方式除去溶剂,所得固体粉末通过柱层析后得到如式(Ⅰ)所示荧光探针粉末。
作为本发明所示荧光探针制备方法的优选实施方式,所述步骤(1)-(5)中,均采用硅胶层析住对产物进行纯化。
作为本发明所示荧光探针制备方法的优选实施方式,所述步骤(1)中按照每毫摩尔4-溴-1,8-萘二酰亚胺加入13.8毫升正丁胺的比例,将4-溴-1,8-萘二酰亚胺与正丁胺溶于乙醇溶液中。所述步骤(2) 按照每毫摩尔N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺加入1.4毫摩尔4-乙酰氧基、0.006毫摩尔醋酸钯和0.004毫摩尔三(邻甲苯基)膦的比例依次加入三乙胺与乙腈的混合溶液中,其中三乙胺与乙腈的体积比为 3:7。所述步骤(3)中按照每毫摩尔N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺加入1.2毫克乙醇溶液的比例进行混合反应。所述步骤(4)中按照每毫摩尔N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8- 萘二酰亚胺加入142毫摩尔丁酸酐的比例依次溶于乙醇溶液中。
第三方面,本发明提供上述荧光探针可应用于植物叶片表面角质酶的检测。
第四方面,本发明提供一种用于植物叶片表面检测角质酶的方法,其应用方法如下:
(1)将上述探针溶于乙醇溶液中,得到探针溶液。
(2)将探针溶液用喷涂的方式均匀涂布在植物叶片上。
(3)在手持紫外灯照射系完成肉眼检测过程。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明提供了一种用于检测角质酶的荧光探针N-正丁基-4-(4-顶酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。该探针在完成对角质酶的检测后,荧光发射位置会从520nm移动到580nm。与同类荧光探针相比,该种荧光探针具有较长的发射波长。在植物叶片表面应用时能够很好的屏蔽掉植物本身荧光所带来的干扰型号,极大的提高了对角质酶检测的准确性和抗干扰性。
(2)该探针通过与角质酶反应前后荧光光谱的比率型变化实现对角质酶的检测。相比于传统的单信号荧光探针,该检测过程具备两个荧光信号避免了背景荧光干扰的缺点。而且反应的程度可以通过荧光的比率变化来体现,更加准确。
(3)本发明通过涂布的方式将荧光探针应用于植物叶片表面进行角质酶的检测,操作简单,结果方便观察,反应结束后通过手持紫外分析仪即可进行观察同时检测过程在几分钟内即可完,极大地提高了效率。
附图说明
图1为本发明所述荧光探针合成路线。
图2为本发明所述荧光探针N-正丁基-4-(4-顶酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺核磁共振氢谱图。
图3为本发明所述荧光探针N-正丁基-4-(4-顶酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺质谱图。
图4为水分对本发明所述荧光探针影响图。
图5为本发明所述荧光探针与角质酶反应过程荧光光谱图。
图6为本发明所述荧光探针与角质酶反应机理示意图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体事例对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明所述荧光探针及其制备方法的一种实施例,本实施例的荧光探针为N-正丁基-4-(4-顶酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺,其结构式如(Ⅰ)所示:
本实施例的合成路线如图1所示,其具体制备方法如下:
1)先将反应原料4-溴-1,8-萘二酰亚胺(0.5g,1.8mmol)溶于5 ml乙醇中放入25ml两口瓶中并在其中放入搅拌子,然后将两口瓶放置于磁力搅拌器上搅拌15min,待其完全溶解后用移液枪 (100-1000μl)精确量取0.36ml正丁胺(0.36ml,3.6mmol)加入两口瓶内,然后将蛇形回流管组装到两口瓶上,并且通过两口瓶的另一口通入氮气保护,之后将装有导热油的结晶皿放置于磁力搅拌器上,将两口瓶置于其中开始加热并继续搅拌,待其温度升到85℃后开始保温,此阶段持续4个小时。反应结束后,将两口置于大气条件下降至室温,之后用分液漏斗对反应液进行萃取,萃取体系为二氯甲烷和水(1:1,V/V),然后将有机层用茄型瓶收集,用旋转蒸发仪上将溶剂旋除。剩下的固体物质使用柱层析的方式分离纯化,柱层析的固定相为层析硅胶,流动相体系为二氯甲烷。最后将经过柱层析纯化后的产物经过旋转蒸发仪取出溶剂,得到的黄白色粉末就是N-正丁基 -4-溴-1,8-萘二酰亚胺。
2)将N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺(0.37g,0.9mmol)溶解在三乙胺与乙腈的混合液中(3:7,V/V),并且使用超声清洗仪帮助溶解。然后将溶液放入高压瓶中并加入搅拌磁子放置于磁力搅拌器上开始搅拌,然后加入4-乙酰氧基苯乙烯(204μL,1.26mmol),醋酸钯(1.2mg,0.0054mmol)和三(邻甲苯基)膦 (14.4mg,0.036mmol),在通入氮气的情况下搅拌3min,之后撤去氮气并且立刻盖上盖子进行密封。然后进行升温并继续搅拌,待温度升到105℃后开始保温,此阶段持续12小时。待反应结束后,使反应液自然冷却至室温对其进行萃取,萃取体系为二氯甲烷和水(1:1, V/V)。将有机层收集并旋除溶剂,剩余的粉末用柱层析的方式分离出产物,柱层析的固定相为硅胶,流动相体系为二氯甲烷和甲醇(10:1,V/V)。之后将纯化后的产物进行旋干,得到的粉末即为 N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。
3)将KOH(10mg,0.17mmol)放入10ml乙醇中搅拌10 min,待其完全溶解后,将N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺(50mg,0.12 mmol)加入其中,此混合溶液在室温下密封搅拌5小时后,停止搅拌。对反应结束的反应液进行萃取、旋干然后将旋干的有机相进行柱层析,柱层析的固定相为硅胶,流动相体系为纯二氯甲烷。最后得到的粉末即为产物成N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。
将N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺(25 mg,0.07mmol)和丁酸酐(93μL,1mmol)加入反应液中,反应液体系为二氯甲烷和吡啶(7:3,V/V)。然后将反应液置于冰浴中搅拌20 min。搅拌结束后,待其温度到室温继续搅拌,持续5个小时。反应结束后对反应液进行萃取,并对收集的有机相进行柱层析,固定相为硅胶,流动相体系为纯二氯甲烷。得到粉末即为N-正丁基-4-(4-丁酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。核磁共振氢谱如图2所示,质谱图如图3所示,图谱分析如下:1.00(t,J=6Hz,3H),1.09(t,J=7.8Hz,3H),1.47(m,2H),1.75(m,2H),1.83(m,2H),4.21(t,J=11.4Hz,2H),7.19(d, J=18Hz,1H),7.35(d,J=18Hz,1H),7.66(d,J=10.2Hz,2H)7.81(t, J=10.2Hz,1H),7.84(d,J=16.2Hz,1H),8.01(d,J=12Hz,1H),8.57(d, J=8.4Hz,1H),8.61(d,J=10.2Hz,1H),8.65(d,J=6Hz,1H).分子量如图3 所示为MS(ESI)=479.9[M+K]+。通过核磁、质谱分析制得产物确为 N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。且此粉末在二氯甲烷中经365nm紫外光照射有明亮的绿色荧光产生。
实施例2荧光探针的抗水分干扰性
将占体系10%、20%、40%、60%、70%、80%、90%的水分加入N-正丁基-4-(4-丁酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺的乙醇溶液中观察探针的检测过程抗水分干扰的能力。结果如图4所示,该探针能够在环境水分含量小于80%的情况下完成对角质酶的正常检测,具有较高的实际应用潜力。
实施例3N-正丁基-4-(4-丁酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺对环境中角质酶的比率型检测。
以实施例1中所制备的荧光探针N-正丁基-4-(4-丁酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺对环境中的角质酶进行比率型检测。测试时使用4μM浓度的探针溶液,向探针溶液中加入固定浓度的角质酶 (70U/L),在反应不同时间处后记录溶液在520nm和580nm处的荧光强度,并以此为依据计算出检测比率I580/I520,以此达到比率型检测的目的。如图5所示,图中线1-8分别代表探针溶液与角质酶反应时间为0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、 40min时的荧光图。据图可以看出,当反应时间为0min时探针溶液的荧光发射位置在520nm左右。随着反应时间的增加520nm处的荧光发射峰逐渐减弱,580nm处的荧光峰逐渐增加。体现在比率上为 I580/I520数值逐渐增大。这说明,该探针能够在与角质酶反应后实现荧光颜色由绿变黄的明显转变,由此可以实现对角质酶的快速检测。
荧光探针N-正丁基-4-(4-丁酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺在检测角质酶时,角质酶对探针的作用会导致探针酯键的断裂。由于探针推拉电子效应的变化,探针的荧光发射位置逐渐由520nm转变为580nm。其原理如图6所示。
实施例4N-正丁基-4-(4-丁酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺对真菌分泌角质酶模拟检测
本实施例将实施例1所制备的荧光探针溶液与乙醇溶液中,并将浓度调整到8μM涂布到植物叶片上。随后将能够分泌角质酶的真菌接种于植物叶片上。在室温条件下用手持紫外分析仪观察植物叶片在6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时荧光颜色。结果表明,随着时间增加角质酶在植物叶片上的存在量增加,植物叶片表面荧光探针的颜色逐渐由绿色变为了黄色。说明本发明所述探针确实能够在现实条件下检测快速、便捷的检测到植物叶片表面存在的角质酶。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳的实施例对本发明做了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针,其特征在于:所述荧光探针具有如式(Ⅰ)所表示的结构。
2.一种如权利要求1所述的可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)以4-溴-1,8萘二酰亚胺和正丁胺为原料在氮气保护下制得如式(Ⅱ)所示的N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺;
(2)以步骤(1)所制得的N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺为原料,将原料与4-乙酰氧基苯乙烯在醋酸钯和三邻甲苯基膦的催化下反应制得如式(Ⅲ)所示的N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺;
(3)以步骤(2)所制得的N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺为原料,在KOH的乙醇溶液中(每1毫升乙醇中加入1mgKOH)中制得如式(Ⅳ)所示的N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺;
(4)以步骤(3)所制得的N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺为原料,将原料与丁酸酐共反应制得如式(Ⅰ)所示的荧光探针N-正丁基-4-(4-顶酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺;
3.如权利要求2所述的一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)将4-溴-1,8-萘二酰亚胺溶解于乙醇溶液中,然后将正丁胺加入其中并在85℃的条件下反应4小时。然后经柱层析、旋转蒸发所得到的固体粉末即为N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺。
(2)将N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺按照3:7的溶解比例溶解于三乙胺与乙腈的混合溶液中。然后将4-乙酰氧基苯乙烯加入其中,在醋酸钯、。和三(邻甲苯基)膦的催化下于105℃反应12小时。反应完成后对其进行萃取、柱层析、旋转蒸发,所得固体粉末即为N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。
(3)将N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺置于KOH的乙醇溶液中(每1毫升乙醇中加入1mgKOH),在室温下搅拌5小时。随后对其进行柱层析、旋转蒸发,所得固体为N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。
(4)将N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺与丁酸酐依次加入二氯甲烷与吡啶的混合溶液中。在冰浴条件下反应20分钟后撤去冰浴,并继续在室温下反应5小时。随后对其进行柱层析、旋转蒸发,所得固体粉末即为式(Ⅰ)所示荧光探针N-正丁基-4-(4-顶酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。
4.如权利要求3所述的一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法,其特征在于:所述(1)-(5)步骤中均使柱层析、旋转蒸发来进行化合物的纯化。
5.如权利要求3所述一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法,其特征在于所述步骤(1)中按照每毫摩尔4-溴-1,8-萘二酰亚胺加入13.8毫升正丁胺的比例,依次将4-溴-1,8-萘二酰亚胺和正丁胺加入于乙醇溶液中;所述步骤(2)按照每毫摩尔N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺加入1.4毫摩尔4-乙酰氧基、0.006毫摩尔醋酸钯和0.004毫摩尔三(邻甲苯基)膦将其依次加入于三乙胺与乙腈的混合溶液中,其中三乙胺与乙腈的体积比为3:7。所述步骤(3)中按照每毫摩尔N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺加入1.2毫克的乙醇溶液中。所述步骤(4)中按照每毫摩尔N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺加入142毫摩尔丁酸酐的比例,依次将N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺和丁酸酐加入乙醇溶液中。
6.如权利要求1中所示一种荧光探针可用于检测植物叶片表面角质酶及其他含角质酶的各类产品。
7.如权利要求1所示的一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针,其特征在于:所述检测植物叶片表面角质酶的具体步骤如下:(1)将如权利要求1中所示探针溶解于乙醇或甲醇溶液中。(2)将该探针溶液以喷涂的方式均匀涂布于植物叶片表面。(3)在手持紫外灯照射系完成肉眼检测过程。
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