CN111544583A - Cs/hpmcp纳米微粒在口服疫苗递送中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用，属于动物病毒学和动物基因工程技术领域。为了检测CS/HPMCP纳米微粒口服递送的免疫效力，本发明选取猪流行性腹泻病毒作为试验对象；本发明通过大肠杆菌表达***表达COE蛋白，进一步通过离子交联方法制备了载有COE的CS/HPMCP纳米颗粒，并且评估了给小鼠口服载有COE的CS/HPMCP纳米微粒后，小鼠的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫；旨在为研发口服型纳米微粒佐剂提供有力的技术支持，同时为PEDV口服型亚单位疫苗的研究奠定前期基础。

Description

CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用
技术领域
本发明涉及动物病毒学和动物基因工程技术领域，更具体的说是涉及CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用。
背景技术
壳聚糖(CS)是甲壳素的部分脱乙酰化形式，由葡萄糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖单体通过β-(1-4)糖苷键连接形成，是一种线性聚合物。甲壳素存在于甲壳类，昆虫和真菌细胞壁的外骨骼中，是自然界中仅次于纤维素的第二大最丰富的多糖。由于其极小的毒性，良好的生物降解性，优异的生物相容性，壳聚糖和壳聚糖衍生物已被广泛应用在抗肿瘤、伤口敷料、化妆品、食品、组织工程和眼科等领域。此外，由于CS的阳离子特性，粘膜吸附特性，免疫刺激特性和瞬时打开上皮紧密连接的能力，其还被用来通过粘膜途径递送重组蛋白。为了进一步提高CS的有效性，CS通常以纳米颗粒的形式应用于药物和疫苗的递送，因为基于纳米颗粒的输送***具有显着的优势，例如可以保护封装的抗原免于降解、控制释放、增强抗原呈递和引发抗原有效的交叉呈递，从而引发CD4+和CD8+T细胞免疫反应。离子交联是制备壳聚糖纳米粒子的最常用方法，而三聚磷酸盐(tripolyphosphate，TPP)是最常用的交联剂。此外，羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯(hydroxypropyl methylcellulose phthalate，HPMCP)是一种被食品和药物管理局(FDA)批准用于人类的肠溶性生物降解材料，也是另一种交联剂。该物质是制药行业广泛使用的肠溶包衣赋形剂之一，仅在PH>5.5时才完全溶解。众所周知，胃肠道的pH值如下：胃(pH2.0-4.0)，十二指肠(pH5.5)，空肠(pH6.0)和回肠(pH7.2-8.0)。因此，当HPMCP用于口服递送蛋白质时，它可以减少胃中蛋白质的降解并增加肠道中蛋白质的吸收。当用HPMCP代替TPP作为交联剂时，CS纳米颗粒表现出更优异的性能，例如增加回肠中纳米颗粒的粘膜吸附性以及酸稳定性。但是该纳米微粒通常用于口服递送胰岛素和肝素，很少被用于蛋白质或疫苗的口服递送，更没有人***地研究影响CS/HPMCP纳米微粒形成的因素。
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种猪易感的急性高度接触性传染性肠道疾病。PEDV主要感染小肠上皮细胞并引起绒毛萎缩，从而导致7-10天大的乳仔猪严重腹泻，呕吐，脱水，厌食和高死亡率。PEDV的刺突(S)蛋白和S蛋白的中和表位区域(COE)是开发抗PEDV亚单位疫苗的主要候选对象。此外，通过粘膜免疫产生的初乳和牛奶中的PEDV特异性分泌型IgA(SIgA)抗体对于预防PEDV的入侵至关重要。并且，通过粘膜途径递送的疫苗比通过肌肉内途径或皮下注射免疫的传统PEDV灭活和减毒疫苗能更有效地诱导粘膜免疫。然而，妊娠母猪的口服疫苗面临几个挑战，即疫苗中的有效成分可能会被胃肠道中的胃酸，胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，而这将使得口服递送的疫苗无法引发针对PEDV感染的有效粘膜免疫反应。
因此，提供CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用，具体步骤如下：
(1)构建目的基因原核表达载体，经诱导表达纯化，获得纯化的目的蛋白；
(2)制备CS/HPMCP/蛋白复合纳米微粒：CS与HPMCP的质量比为0.7：1，壳聚糖的浓度为2mg/ml，HPMCP浓度为4mg/ml，醋酸浓度为0.5mol/L，壳聚糖溶液的pH为5.5；在磁力搅拌器转速为400rpm条件下，将HPMCP溶液和目的蛋白溶液混合后逐滴加入到壳聚糖溶液中，搅拌时间为10min，制备得到CS/HPMCP/蛋白复合纳米微粒。
进一步，CS/HPMCP/蛋白复合纳米微粒在制备疫苗中的应用。
进一步，步骤(1)构建PEDV COE原核表达载体，经诱导表达纯化，获得纯化的COE蛋白，步骤如下：
①扩增PEDV COE基因，引物序列如下：
PEDV-SX-COE-F：5’-TCGGATCCGTTACTTTGCCATCATTTAATG-3’；SEQ ID NO.1；
PEDV-SX-COE-R：5’-TGCTCGAGAACGTCCGTGACACCTTC-3’；SEQ ID NO.2；
②利用酶切位点BamHI和XhoI将PEDV COE基因克隆到pET-32a原核表达载体中，获得pET-32a-COE；
③将测序正确的pET-32a-COE质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞中，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导表达3-4h，获得纯化的COE蛋白。
进一步，CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒在制备预防猪流行性腹泻疫苗中的应用。
猪流行性腹泻病毒仅为一个具体实例，CS/HPMCP纳米微粒还可以包埋其他蛋白质，并将得到的复合微粒用于疫苗和制药等领域。
CS/HPMCP纳米微粒可以应用于疫苗的研发，通过口服、滴鼻和生殖道等粘膜途径递送疫苗。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用，pH敏感的CS/HPMCP纳米颗粒能够用于疫苗的口服递送；为了检测该纳米微粒口服递送的免疫效力，本发明选取猪流行性腹泻病毒作为试验对象；本发明通过大肠杆菌表达***表达COE蛋白，进一步通过离子交联方法制备了载有COE的CS/HPMCP纳米颗粒，并且评估了给小鼠口服载有COE的CS/HPMCP纳米微粒后，小鼠的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫；旨在为研发口服型纳米微粒佐剂提供有力的技术支持，同时为PEDV口服型亚单位疫苗的研究奠定前期基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明COE目的基因的扩增；
其中，M：DNA分子量标准DL8000；1：COE目的基因；
图2附图为本发明目的片段和载体的双酶切结果；
其中，M：DNA分子量标准DL8000；1：目的基因酶切产物；2：载体酶切产物；
图3附图为本发明重组质粒菌液PCR鉴定；
其中，M：DNA分子量标准DL8000；1-8：菌液鉴定；-：阴性对照；+：阳性对照；
图4附图为本发明SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白；
其中，M：蛋白Marker；1，纯化后的蛋白；
图5附图为本发明western-blot鉴定纯化后的蛋白；
其中，M：蛋白Marker；1，纯化后的蛋白；
图6附图为本发明SDS-PAGE鉴定CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒释放的蛋白；
其中，M：蛋白Marker；1，CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒中释放的蛋白；2：CS/HPMCP空载纳米微粒；3：阳性对照；4：未用SDS处理的CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒；
图7附图为本发明western-blot鉴定CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒释放的蛋白；
其中，M：蛋白Marker；1，CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒中释放的蛋白；2：CS/HPMCP空载纳米微粒；3：阳性对照；4：未用SDS处理的CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒；
图8附图为本发明间接ELISA检测血清中抗COE IgG抗体水平；
图9附图为本发明间接ELISA测量血清中抗COE IgA抗体水平；
图10附图为本发明消化道分泌型sIgA检测结果；
图11附图为本发明ELISA试剂盒检测上清IL-4分泌量结果；
图12附图为本发明MTT法检测淋巴细胞增殖效果；
图13附图为本发明ELISA试剂盒检测上清IFN-γ分泌量结果；
图14附图为本发明荧光定量PCR检测IFN-γmRNA相对表达量；
其中，图8-图14中，*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；ns：差异不显著。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1原核表达载体pET32a-SX-COE的构建
(1)PEDV COE基因的扩增
设计COE基因引物，分别在上下游引物5’端引入BamHI和XhoI限制性内切酶位点。引物序列如下：
PEDV-SX-COE-F：5’-TCGGATCCGTTACTTTGCCATCATTTAATG-3’；SEQ ID NO.1；
PEDV-SX-COE-R：5’-TGCTCGAGAACGTCCGTGACACCTTC-3’；SEQ ID NO.2。
提取PED发病猪小肠组织RNA，反转录形成cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增COE基因，COE基因序列如下：
gttactttgccatcatttaatgatcattcttttgttaatattactgtctctgcttcctttggtggtcatagtggtgccaaccttattgcatctgacactactatcaatgggtttagttctttctgtgttgacactagacaatttaccatttcactgttttataacgttacaaacagttatggttatgtgtctaaaacacaggacagtaattgccctttcaccttgcaatctgtcaatgattacctgtcttttagcaaattttgtgtttccaccagccttttggctagtgcctgtaccatagatctttttggttaccctgagtttggtagtggtgttaagtttacgtccctttactttcaattcacagagggtgagttgattactggcacgcctaaaccacttgaaggtgtcacggacgtt；SEQ ID NO.3。
PCR扩增反应体系如下：
Figure BDA0002493960340000061
PCR扩增反应程序：94℃5min；98℃10sec，60℃15sec，68℃1min，35cycles；68℃7min；4℃保存。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切取436bp附近出现的目的条带(图1)，用胶回收试剂盒(杭州博日生物公司)按照说明书进行PCR产物的回收，并利用分光光度计测定回收产物浓度用于后续实验。
(2)双酶切载体及目的片段
A.pET32a载体的双酶切体系如下：
Figure BDA0002493960340000062
B.COEPCR产物双酶切体系如下：
Figure BDA0002493960340000063
分别将上述步骤A和B的酶切混合物置于37℃水浴中，酶切3h。产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图2)。用胶回收试剂盒(杭州博日生物公司)，按照说明书并利用分光光度计测定回收产物浓度用于后续实验。
C.用T4连接酶进行连接载体与目的片段，反应体系如下：
Figure BDA0002493960340000071
混匀后，瞬离，置于16℃连接仪中连接6h。
D.将步骤C所得到的连接产物转化入Trans5α感受态细胞中，按照感受态说明书进行操作。然后取200μL的菌液凃于LB/AMP(100μg/ml)平板，放置于37℃恒温培养箱中过夜培养。
E.挑取形状圆润的单克隆，接种于1mlLB/AMP培养基中，置于37℃恒温摇床中200r/min培养3-4h后用于菌液PCR鉴定。
F.菌液PCR鉴定步骤E所挑取的克隆中是否含有阳性克隆，反应体系为：
Figure BDA0002493960340000072
反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸7min；4℃保持。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆(图3)。
将菌液PCR鉴定为阳性的克隆，随机挑选2个克隆，接种于5ml的LB/AMP中培养12h后提取质粒pET-32a-COE，按照质粒提取试剂盒(杭州博日生物公司)说明书进行，并进行质粒浓度的测定，交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
实施例2重组COE蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定
将测序正确的pET-32a-COE质粒转化入BL21(DE3)表达感受态细胞中，按照感受态说明书进行操作，然后取200μL的菌夜凃于LB/AMP平板，放置于37℃恒温培养箱中培养12-16h。同样的操作进行pET-32a空载体的转化。挑取形状圆润的单克隆(分别挑取pET-32a-COE质粒和pET-32a空载体质粒)，接种于1mlLB/AMP培养基中，置于37℃恒温摇床中200r/min培养8-10h，取出600μL培养物加入400μL无菌50％的甘油，混匀后，-20℃保存，剩余的培养物用于下一步实验。分别取上述剩余的100μL上述培养物，接种于10mlLB/AMP培养基中，置于37℃220r/min恒温摇床中培养至OD值为0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导表达4h。同时设置未诱导组。按照Ni-NTA说明书进行目的蛋白的纯化，SDS-PAGE电泳和westernblot(PEDV阳性小鼠血清为一抗，HRP-羊抗鼠抗体为二抗)鉴定纯化结果(图4-图5)。
实施例3壳聚糖纳米微粒的制备及其特征鉴定
(1)CS/HPMCP纳米微粒的制备：CS与HPMCP的质量比为0.7：1，壳聚糖的浓度为2mg/ml，HPMCP浓度为4mg/ml，醋酸浓度为0.5mol/L，壳聚糖溶液的pH为5.5。在磁力搅拌器转速为400rpm条件下，将HPMCP溶液逐滴加入到壳聚糖溶液中，搅拌时间为10min，制备得到CS-HPMCP纳米微粒。
(2)CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒的制备：CS与HPMCP的质量比为0.7：1，壳聚糖的浓度为2mg/ml，HPMCP浓度为4mg/ml，醋酸浓度为0.5mol/L，壳聚糖溶液的pH为5.5。在磁力搅拌器转速为400rpm条件下，将HPMCP溶液和COE蛋白溶液混合后逐滴加入到壳聚糖溶液中，搅拌时间为10min，制备得到CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒。
(3)纳米微粒的特征鉴定
利用激光纳米粒度仪测定CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒的粒径和电势，并且利用BCA法测定CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒包埋效率和载率。
A、CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒包埋效率和载率测定：将CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒在13000rpm10℃离心20min后，BCA法测定上清中的蛋白含量。蛋白包埋率(EE)＝(总蛋白量-上清蛋白量)/总蛋白，蛋白载率(LE)＝(总蛋白量-上清蛋白量)/复合微粒总质量。结果见表1。
表1 CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒特征
Figure BDA0002493960340000081
B、CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒包埋蛋白完整性验证：按照步骤(2)制备好CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒后，13000rpm 10℃离心20min。沉淀中加入10％SDS，37℃搅拌1h。3000rpm常温离心3min，取上清加入Loading Buffer；同时设定CS/HPMCP空载纳米微粒为对照，未加入SDS溶液的CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒为阴性对照，COE蛋白为阳性对照，并加入等量的Loading Buffer，沸水中煮10min。取两块蛋白胶，依次加入待检测样品。200V跑1h左右，SDS-PAGE检测，结果见图6；图6结果表明微粒释放出来的蛋白仍然保持其完整性。进一步进行Western bolt(PEDV阳性小鼠血清为一抗，HRP-羊抗鼠抗体为二抗)检测，结果见图7；图7结果显示释放出来的蛋白与抗S蛋白的小鼠血清反应性良好，证明该纳米微粒包埋的蛋白仍然保持良好的反应性。
实施例4壳聚糖纳米微粒联合PEDV COE蛋白制作的PEDV亚单位疫苗免疫效果评价
(1)免疫流程：试验小鼠分为5组，每组5只，分别为纳米微粒组(Nano)、商品化佐剂组(S)、单独免疫COE蛋白组(COE，实施例2制备的COE蛋白)、COE蛋白联合纳米微粒组(COE/Nano，实施例3制备的CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒)、COE蛋白联合商品化佐剂组(COE/S)。通过灌胃的方式免疫小鼠，首次免疫200μg蛋白，首次免疫14d和28d后加强免疫一次，免疫蛋白量为100μg。在首次免疫后第0、7、21、35d采集小鼠血清，在第35天分离小鼠脾脏细胞和小鼠肠粘膜。
(2)将0、7、21、35d采集的血清，采用间接ELISA检测血清中抗COEIgG抗体水平，结果见图8；图8结果显示，COE/Nano组在首次免疫后7d、21d产生很高的抗COEIgG抗体，同COE组和COE/S组相比具有显著性差异(P<0.001)；在35d时，COE/S组产生同COE/Nano相当的IgG抗体。表明本发明壳聚糖纳米微粒佐剂具有免疫增强效果且比商品化佐剂好，且壳聚糖纳米微粒联合PEDV COE蛋白制作的PEDV亚单位疫苗免疫产生更高水平的血清IgG。
(3)将0、7、21、35d采集的血清，采用间接ELISA测量血清中抗COEIgA抗体水平，结果见图9；图9结果显示，在第21、35dCOE/S组和COE/Nano组血清IgA水平均显著高于COE组(P<0.05)，COE组虽然也能检测到IgA抗体，但是和对照组相比无显著性差异。表明本发明壳聚糖纳米微粒佐剂具有和商品化佐剂相当的增强血清IgA抗体产生的能力。
(4)消化道分泌型sIgA检测：在首次免疫后35d，通过眼球摘除将小鼠处死后，分离小肠粘膜；并检测小肠粘膜中的SIgA，结果见图10；图10结果显示，COE/Nano组产生SIgA显著高于COE组和COE/S组(P<0.05)；但是COE/S组SIgA的水平相比COE组无显著性差异。表明本发明壳聚糖纳米微粒佐剂比商品化佐剂具有更强的增强粘膜免疫的能力，且壳聚糖纳米微粒联合PEDV COE蛋白制作的PEDV亚单位疫苗免疫产生更高水平的血清SIgA。
(5)在首次免疫后35d，通过眼球摘除将小鼠处死后，分离脾脏淋巴细胞。将分离好的脾脏细胞按5×106个/mL细胞铺到24孔板中，培养6-24h，加入COE蛋白5μg/mL刺激48h，3000g离心10min，取上清备用；ELISA试剂盒(NOVUS)检测上清IL-4分泌量，结果见图11；图11结果显示，COE刺激后，细胞上清中IL-4的含量COE/Nano组显著高于COE组(P<0.05)和COE/S组(P<0.01)。表明本发明壳聚糖纳米颗粒佐剂比商品化佐剂具有更强的体液免疫增强活性，且壳聚糖纳米微粒联合PEDV COE蛋白制作的PEDV亚单位疫苗具有更强的诱导淋巴细胞增殖和分化的能力。
(6)脾脏淋巴细胞增殖试验：在首次免疫后35d，通过眼球摘除将小鼠处死后，分离脾脏淋巴细胞。用ConA和COE蛋白刺激后，MTT法检测淋巴细胞增殖效果，结果见图12；图12结果显示，ConA刺激后，COE/Nano组同COE组没有显著性差异，COE/Nano组显著高于COE/S组(P<0.001)，可能因为商品化佐剂对小鼠脾脏有损伤作用，刀豆蛋白在刺激后增殖活性减弱。表明本发明壳聚糖纳米微粒佐剂比商品化佐剂具有更低的毒性，且壳聚糖纳米微粒联合PEDV COE蛋白制作的PEDV亚单位疫苗免疫免疫小鼠后的小鼠脾脏淋巴细胞具有更强的增殖能力。
(7)细胞上清IFN-γ和细胞中IFN-γmRNA相对表达量的检测：在首次免疫后35d，通过眼球摘除将小鼠处死后，分离脾脏淋巴细胞。将分离好的脾脏细胞按5×106个/mL细胞铺到24孔板中，培养6-24h，加入COE蛋白5μg/mL刺激48h，3000g离心10min。用ELISA试剂盒(NOVUS)检测上清IFN-γ分泌量，结果见图13；图13结果显示，COE/Nano组显著高于COE组(P<0.05)和COE/S组(P<0.001)，COE组和对照组(Nano、S)无显著性差异。
提取细胞中RNA，荧光定量PCR检测IFN-γmRNA相对表达量，结果见图14；图14结果显示，COE/Nano组显著高于COE组(P<0.01)和COE/S组(P<0.001)，COE组显著高于对照组(Nano、S)。表明本发明壳聚糖纳米微粒佐剂比商品化佐剂具有更强的细胞免疫增强活性，且壳聚糖纳米微粒联合PEDV COE蛋白制作的PEDV亚单位疫苗具有更强的诱导淋巴细胞增殖和分化的能力。
(8)血清中和实验：a、将Vero细胞按照1×105个/孔接种到96孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中至长成单层细胞；b、将第35d采集的小鼠血清在56℃处理30min；c、将50μL稀释度为200TCID50的PEDV病毒液分别与50μL稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256的血清混匀，37℃孵育1h；d、将步骤c的混合液接种到步骤a中的Vero细胞上，放置细胞培养箱孵育1h后，弃掉上清，加入新鲜DMEM培养液，继续培养4-6天。记录细胞病变孔。实验结果显示，Nano组和S组血清中和滴度小于1/2，COE组为1/4，COE/Nano组和COE/S组为1/8。表明本发明壳聚糖纳米微粒联合PEDV COE蛋白制作的PEDV亚单位疫苗具有更高的血清中和抗体滴度。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tcggatccgt tactttgcca tcatttaatg 30
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgctcgagaa cgtccgtgac accttc 26
<210> 3
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gttactttgc catcatttaa tgatcattct tttgttaata ttactgtctc tgcttccttt 60
ggtggtcata gtggtgccaa ccttattgca tctgacacta ctatcaatgg gtttagttct 120
ttctgtgttg acactagaca atttaccatt tcactgtttt ataacgttac aaacagttat 180
ggttatgtgt ctaaaacaca ggacagtaat tgccctttca ccttgcaatc tgtcaatgat 240
tacctgtctt ttagcaaatt ttgtgtttcc accagccttt tggctagtgc ctgtaccata 300
gatctttttg gttaccctga gtttggtagt ggtgttaagt ttacgtccct ttactttcaa 360
ttcacagagg gtgagttgat tactggcacg cctaaaccac ttgaaggtgt cacggacgtt 420

Claims (4)

1.CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建目的基因原核表达载体，经诱导表达纯化，获得纯化的目的蛋白；
(2)制备CS/HPMCP/蛋白复合纳米微粒：CS与HPMCP的质量比为0.7：1，壳聚糖的浓度为2mg/ml，HPMCP浓度为4mg/ml，醋酸浓度为0.5mol/L，壳聚糖溶液的pH为5.5；在磁力搅拌器转速为400rpm条件下，将HPMCP溶液和目的蛋白溶液混合后逐滴加入到壳聚糖溶液中，搅拌时间为10min，制备得到CS/HPMCP/蛋白复合纳米微粒。
2.根据权利要求1所述的CS/HPMCP/蛋白复合纳米微粒在制备疫苗中的应用。
3.根据权利要求1所述的CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用，其特征在于，步骤(1)构建PEDV COE原核表达载体，经诱导表达纯化，获得纯化的COE蛋白，步骤如下：
①扩增PEDV COE基因，引物序列如下：
PEDV-SX-COE-F：5’-TCGGATCCGTTACTTTGCCATCATTTAATG-3’；SEQ ID NO.1；
PEDV-SX-COE-R：5’-TGCTCGAGAACGTCCGTGACACCTTC-3’；SEQ ID NO.2；
②利用酶切位点BamHI和Xho I将PEDV COE基因克隆到pET-32a原核表达载体中，获得pET-32a-COE；
③将测序正确的pET-32a-COE质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞中，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导表达3-4h，获得纯化的COE蛋白。
4.CS/HPMCP/COE蛋白复合纳米微粒在制备预防猪流行性腹泻疫苗中的应用。
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