CN111533759A - 一种手性银纳米簇聚集体的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种手性银纳米簇聚集体的制备方法及其应用，属于手性银纳米簇聚集体杀菌的技术领域。在水中“一步法”制备了原子精确的银纳米簇聚集体。该银纳米簇聚集体对大肠杆菌和沙门菌显示了很好的杀菌性能，与文献相比，其MIC和IC50均很低；但对金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌却没有杀菌性能，即使浓度高于上面MIC的30倍也没有效果，表现出高效的特异性杀菌性能。本发明的最大特点是将新型手性银纳米簇的原子结构和特异性杀菌性能有机地结合在一起，有利于从原子尺度深刻认识手性银纳米簇的特异性杀菌性能。此外，这种手性银纳米簇聚集体毒性低、生物相容性好，因此有望发展成为环境和生物样品中特异性杀菌的实用技术。
Description
技术领域
本发明涉及一种手性银纳米簇聚集体的制备方法及其应用，属于手性银纳米簇聚集体杀菌的技术领域。
背景技术
随着抗生素的大量使用，细菌的耐药性成了一个全球性的问题。因此，深刻认识抗生素的杀菌机理并据此开发新型的抗菌药物成为人们关注的焦点（Tian T, Shi X, ChengL, Luo Y, Dong Z, Gong H, Xu L, Zhong Z, Peng R, Liu Z. Graphene-BasedNanocomposite As an Effective, Multifunctional, and Recyclable AntibacterialAgent, ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6: 8542−8548）。以前，人们发现银离子具有很好的杀菌性能，但其毒性太强，除了杀死细菌细胞，还能杀死正常人体细胞。所以，开发特异性好的含银试剂材料成为一个重要的研究方向。
如何能够高效的利用银离子的杀菌性能同时又能减少它对人体细胞的伤害，这样的分子结构又是怎样的，成为科学家思考的重要问题。一般认为，利用生物相容性好的氨基酸、多肽或蛋白质作为银离子外壳能够有效降低银离子的毒性，特别是制备一种完全由RS-Ag结构（RSH表示含有巯基的氨基酸、多肽或蛋白质）组成的含银纳米聚集体既可以利用银离子的杀菌性能，又能够减小对人体细胞的毒性。
前期实验中，我们在水中首次培养了手性青霉胺稳定的银纳米簇单晶Ag8L8（L表示手性青霉胺），完全由RS-Ag结构单元组成。进一步研究发现，这种银纳米簇聚集体对大肠杆菌和沙门菌显示了很好的杀菌性能，其最低抑菌浓度在1.5 μg/mL−1以下，比以往的含银杀菌剂具有更好的效果（一般在10 μg/mL−1以上；Zheng K, Li K, Chang T.-H., Xie J.,Chen P.-Y. Synergistic Antimicrobial Nanomaterials: Synergistic AntimicrobialCapability of Magnetically Oriented Graphene Oxide Conjugated with GoldNanoclusters, Adv. Funct. Mater.2019, 29: 1904603；Shao W., Liu X., Min H.,Dong G., Feng Q., Zuo S. Preparation, Characterization, and AntibacterialActivity of Silver Nanoparticle-Decorated Graphene Oxide Nanocomposite, ACS Appl. Mater. Interfaces2015, 7: 6966−6973）。然而，这种银纳米簇聚集体对金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌却没有作用，即使浓度达到30μg/mL−1也是如此，这说明我们的银纳米簇聚集体具有高效特异性的杀菌性能。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供杀菌性能高效、特异性好的手性银纳米簇聚集体的单晶制备方法及其应用，这种银纳米簇聚集体毒性低、生物相容性好，有望发展成为环境和生物样品中特异性杀菌的实用技术。
本发明在水中“一步法”制备了原子精确的银纳米簇聚集体。该银纳米簇聚集体对大肠杆菌和沙门菌显示了很好的杀菌性能，与文献相比，其MIC和IC50均很低；但对金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌却没有杀菌性能，即使浓度高于上面MIC的30倍也没有效果，表现出高效的特异性杀菌性能。
本发明的技术方案，一种手性银纳米簇聚集体的制备方法，将手性青霉胺加入双蒸水中，然后加入硝酸银溶液，混匀后在手套箱中静置三天，即得到手性银纳米簇聚集体的单晶；
一种手性银纳米簇聚集体的制备方法，将手性青霉胺加入双蒸水中，然后加入硝酸银溶液，在室温下搅拌，随后离心去除上清液，固体冷冻过夜；随后将过夜后冷冻的固体在真空冷冻离心浓缩仪上抽干，即制备得到手性银纳米簇聚集体的粉末。
具体步骤如下：
（1）将1 mg 手性青霉胺加入5 mL双蒸水中，然后加入67 μL硝酸银溶液（0.1 mol/L−1），混匀后在手套箱中静置三天，得到手性银纳米簇的单晶Ag8L8（L表示手性青霉胺）。
（2）同比例增加（1）中手性青霉胺和硝酸银水溶液的加入量，比如将手性青霉胺（60~260 mg）加入10 mL双蒸水中，然后加入硝酸银水溶液（68.4~296.2 mg，溶于3mL双蒸水中），在室温下搅拌3~4h。
（3）将步骤（2）制备的银纳米簇聚集体9000-11000r/min离心5-15min，除去上清液，固体放在−20℃冰箱中过夜。
（4）将步骤（3）过夜后冷冻的固体在真空冷冻离心浓缩仪上抽干，冷冻温度为-50℃，离心浓缩转速是4000r/min，抽干的手性青霉胺银纳米簇聚集体固体粉末用锡纸包好放在−20℃冰箱中备用。
（5）将市场上购买的营养肉汤培养基按照说明书配成浓度为18g/L的营养肉汤培养液，在121℃、0.11MPa高压灭菌15min，冷却后放在5℃冰箱中备用。
（6）将（5）中的营养肉汤培养液用双蒸水稀释5倍，备用。
（7）将肠道致病菌标准菌株涂抹在血平板或营养琼脂平板上培养24h，然后利用接种环将细菌转移到盛有双蒸水（1.5 mL）的EP管中，涡旋、离心，倒掉上清液，将新的双蒸水加入上述EP管中，重复上述过程三次，得到比较干净的细菌，然后加入1 mL双蒸水，涡旋，得到细菌悬浊液，备用。
（8）将1.2 mg步骤（4）中的银纳米簇加入15 mL离心管中，加入3 mL双蒸水，涡旋并超声2min，得到400 μg/mL的银纳米簇悬浊液，备用。
（9）将5 mL步骤（6）中的稀释后的营养肉汤培养液加入15 mL离心管中，然后加入步骤（7）中的细菌悬浊液，混匀后利用分光光度计测量其在600nm的光学密度，并将光学密度调节到0.030，记录加入细菌悬浊液的体积（V1）。
（10）取12~13根15 mL的离心管，依次加入5 mL步骤（6）中的稀释后的营养肉汤培养液、V1μL步骤（7）中的细菌悬浊液、不同体积步骤（8）中的银纳米簇悬浊液，涡旋，并放在36℃的细菌培养箱中培养。
（11）在不同培养时间（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7h）测量步骤（10）中细菌培养液的光学密度，根据光学密度确定细菌的最低抑菌浓度（MIC）。
（12）将市场上购买的营养琼脂培养基按照说明书配成浓度为32 g/L的营养琼脂培养液，在121℃、0.11MPa高压灭菌15min，冷却后备用。
（13）选取7h后步骤（11）中光学密度变化较大的5个细菌培养液，分别进行五个梯度的逐级稀释：将100 μL细菌培养液加入盛有1mL双蒸水的EP管中，涡旋得细菌溶液，然后取100 μL上述细菌溶液加入盛有1mL双蒸水的EP管中，上述过程重复五次，得到五个梯度的细菌溶液；类似地，其它4个细菌培养液也分别进行五个梯度的逐级稀释。
（14）分别将10 μL步骤（13）中的细菌溶液（5个细菌培养液逐级稀释后的最低浓度）加入平板中，加入20 mL步骤（12）中的营养琼脂培养液，培养液固化后放到细菌培养箱中培养48h，细菌计数，根据计数结果拟合数据，得到半抑制浓度（IC50）。
步骤（1）中手性青霉胺是指D-青霉胺或L-青霉胺。
步骤（2）中手性青霉胺和硝酸银加入的摩尔量相同。
步骤（4）中D-青霉胺和L-青霉胺稳定形成的银纳米簇聚集体分别简写成D1和L1。
步骤（6）、（7）、（8）中的双蒸水是灭菌后的双蒸水。
步骤（6）和（12）中的溶液都是现用现配。
步骤（7）中的肠道致病菌标准菌株是大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。
步骤（10）中不同菌株对应不同体积的银纳米簇悬浊液分别为：大肠杆菌（0, 1,2, 3.1, 4, 5, 6.25, 9.3, 12.5, 19, 25, 37.5 μL，对应银纳米簇的浓度分别是0,0.081, 0.16, 0.25, 0.32, 0.40, 0.50, 0.75, 1, 1.5, 2, 3 μg/mL）；沙门菌（0, 3.1,6.25, 12.5, 19, 25, 37.5 μL，对应银纳米簇的浓度是0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3 μg/mL）；金黄色葡萄球菌（0, 1, 2, 3.1, 4, 5, 6.25, 9.3, 12.5, 19, 25, 37.5, 375 μL，对应银纳米簇的浓度是0, 0.081, 0.16, 0.25, 0.32, 0.40, 0.50, 0.75, 1, 1.5,2, 3, 30 μg/mL）；蜡样芽胞杆菌（0, 1, 2, 3.1, 4, 5, 6.25, 9.3, 12.5, 19, 25,37.5, 375 μL，对应银纳米簇的浓度是0, 0.081, 0.16, 0.25, 0.32, 0.40, 0.50,0.75, 1, 1.5, 2, 3, 30 μg/mL）。
步骤（11）中的最低抑菌浓度（MIC）分别是1 μg/mL（D1对大肠杆菌）、0.4 μg/mL（L1对大肠杆菌）、1.5 μg/mL（D1对沙门菌）、1.5 μg/mL（L1对沙门菌），另外，在研究的浓度范围内，D1和L1对金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌均没有抑菌作用。
步骤（14）中的半抑制浓度（IC50）分别是0.86 μg/mL（D1对大肠杆菌）、0.23 μg/mL（L1对大肠杆菌）、0.42 μg/mL（D1对沙门菌）、0.22 μg/mL（L1对沙门菌）。
本发明的有益效果：本发明的最大特点是将新型手性银纳米簇的原子结构和特异性杀菌性能有机地结合在一起，有利于从原子尺度深刻认识手性银纳米簇的特异性杀菌性能。此外，这种银纳米簇聚集体毒性低、生物相容性好，因此有望发展成为环境和生物样品中特异性杀菌的实用技术。
本发明采用的设备简单，银纳米簇聚集体能够在室温下在水中“一步法”大量制备，而且具有高效的特异性杀菌性能，对进一步研究开发其它具有高效和特异性杀菌性能的材料具有重要参考意义。
附图说明
图1：（a和b）D1的单晶结构Ag8D8（D表示手性D-青霉胺）。
图2：D-青霉胺(DPA)、L-青霉胺(LPA)以及D1和L1的红外光谱图。
图3-a：D1的扫描电镜图。
图3-b：L1的扫描电镜图。
图4-a：D1的X-射线光电子能谱C 1s。
图4-b：D1的X-射线光电子能谱N 1s。
图4-c：D1的X-射线光电子能谱O 1s。
图4-d：D1的X-射线光电子能谱S 2p。
图4-e：D1的X-射线光电子能谱Ag 3d。
图4-f：D1的俄歇电子谱Ag MNN。
图5-a：不同浓度的D1和大肠杆菌培养不同时间后光学密度变化。
图5-b：不同浓度的L1和大肠杆菌培养不同时间后光学密度变化。
图5-c：不同浓度的D1和沙门菌培养不同时间后光学密度变化。
图5-d：不同浓度的L1和沙门菌培养不同时间后光学密度变化。
图5-e：相同浓度的D-青霉胺、银离子、D1和大肠杆菌培养不同时间后光学密度变化。
图5-f：相同浓度的D-, L-青霉胺、银离子、D1、L1和大肠杆菌培养不同时间后光学密度变化。
图6-a：D1和大肠杆菌培养7h后，大肠杆菌数目和D1浓度的关系图。
图6-b：L1和大肠杆菌培养7h后，大肠杆菌数目和L1浓度的关系图。
图6-c：D1和沙门菌培养7h后，沙门菌数目和D1浓度的关系图。
图6-d：L1和沙门菌培养7h后，沙门菌数目和L1浓度的关系图。
图7-a：D1和大肠杆菌培养7h后，逐级稀释五次过程中，大肠杆菌克隆形成单元（cfu）的照片。
图7-b：L1和大肠杆菌培养7h后，逐级稀释五次过程中，大肠杆菌克隆形成单元（cfu）的照片。
图7-c：D1和沙门菌培养7h后，逐级稀释五次过程中，沙门菌克隆形成单元（cfu）的照片。
图7-d：L1和沙门菌培养7h后，逐级稀释五次过程中，沙门菌克隆形成单元（cfu）的照片。
图8-a：不存在（a）和存在（b）D1时，大肠杆菌培养7h后的扫描电镜图。
图8-b：不存在（a）和存在（b）D1时，沙门菌培养7h后的扫描电镜图。
图8-c：不存在（a）和存在（b）D1时，金黄色葡萄球菌培养7h后的扫描电镜图。
图8-d：不存在（a）和存在（b）D1时，蜡样芽胞杆菌培养7h后的扫描电镜图。
具体实施方式
本发明所述的新型手性银纳米簇聚集体的单晶制备方法及其特异性杀菌性能，制备方法简单、而且杀菌高效、特异性好，有望发展成为环境和生物样品中特异性杀菌的实用技术。
以下实施例对本发明做更详细的描述，但所述实施例不构成对本发明的限制。
实施例1 D-青霉胺稳定的手性银纳米簇的单晶制备
将1 mg 手性D-青霉胺加入5 mL双蒸水中，然后加入67 μL硝酸银溶液（0.1 mol/L−1），混匀后在手套箱静置三天，得到手性银纳米簇的单晶Ag8D8。
实施例2 D-青霉胺稳定的手性银纳米簇聚集体D1的制备
将手性D-青霉胺（80 mg）加入10 mL双蒸水中，加入硝酸银水溶液（91 mg硝酸银溶于3mL水中），在室温下搅拌3~4h，得到手性银纳米簇聚集体D1。
表1显示了D1的晶体数据和结构提炼表格。从表格中可以清楚的看出D1的单晶数据。
表1
实施例3 L-青霉胺稳定的手性银纳米簇聚集体L1的制备
将手性L-青霉胺（200 mg）加入10 mL双蒸水中，加入硝酸银水溶液（228 mg硝酸银溶于3 mL水中），在室温下搅拌3~4h，得到手性银纳米簇聚集体L1。
图1显示了手性D-青霉胺稳定的银纳米簇D1的单晶结构。从图中可以看出，银纳米簇主要是通过配体间的多重氢键、范德华力以及Ag(I)-Ag(I)作用组装起来的双螺旋结构，而且每个Ag均与S相连，是完全由Ag-SR结构基元组成（RSH表示D-青霉胺）的手性聚集体。
图2显示了D-青霉胺（DPA）、L-青霉胺（LPA）以及D1和L1的红外光谱。从图中可以看出，D1和L1位于2503和2611 cm−1处的峰均消失了，说明S-H键断裂、S-Ag键形成。
图3显示了D1和L1的扫描电镜图。从图中可以看出，D1和L1均是结构比较规整的纤维状结构，长度有几个微米。
图4显示了D1的X-射线光电子能谱和俄歇电子谱。从图中可以看出，C 1s可以拟合出四条谱线，分别位于284.4，285.3，286.1，288.1 eV，指认为−CH3，−CS(CH3)2，−CH−和−CO−。N 1s、O 1s以及S 2p可以拟合出两条谱线，说明它们均具有两种环境，分别指认为−NH−，−NH3 +，COO−和氨基之间形成的氢键以及和银形成的Ag−O键，Ag-S和S-H。Ag 3d有两个峰，分别位于368.3和374.3 eV，而且Ag的俄歇电子谱峰值位于1131.6和1137.2 eV，说明Ag是+1价。
实施例4 D1特异性杀死大肠杆菌的操作步骤
（1）将大肠杆菌标准菌株涂抹在血平板上，培养24h，然后利用接种环将其转移到EP管中（盛有1.5 mL双蒸水），涡旋、离心，去除上清液，然后再将1.5 mL双蒸水加入到大肠杆菌中，涡旋、离心，此过程重复三次，得到干净的大肠杆菌，加入1 mL双蒸水，涡旋，得到大肠杆菌的悬浊液，备用；
（2）按照说明书配制浓度为18 g/L的营养肉汤培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后放冰箱保存，使用时稀释5倍，备用；
（3）将5 mL稀释的营养肉汤培养液加入15 mL离心管中，然后加入大肠杆菌悬浊液，测量其在600nm的光学密度，并将其光学密度调节到0.030左右，记录加入大肠杆菌悬浊液的体积V1；
（4）将市场上购买的营养琼脂培养基按照说明书配成浓度为32 g/L的营养琼脂培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后备用；
（5）将1.2 mg银纳米簇加入15 mL离心管中，加入3 mL双蒸水，涡旋并超声2min，得到400 μg/mL的银纳米簇悬浊液，备用；取12根15 mL的离心管，依次加入5 mL营养肉汤培养液、V1μL的大肠杆菌悬浊液、不同体积的银纳米簇悬浊液（0, 1, 2, 3.1, 4, 5, 6.25,9.3, 12.5, 19, 25, 37.5 μL），测量不同培养时间（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7小时）大肠杆菌的光学密度，根据光学密度确定大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）。
（6）选5个光学密度变化较大的浓度，逐级稀释五次（每次取100 μL样品，加入装有1 mL双蒸水的EP管中，涡旋，此过程重复五次），然后，分别将10 μL大肠杆菌溶液（5个细菌培养液逐级稀释后的最低浓度）加入平板中，浇筑20 mL新灭菌的营养琼脂培养液，放置到固化，然后将其放到细菌培养箱中培养48h，计算细菌cfu数目，并根据曲线得到D1对大肠杆菌的半抑制浓度（IC50）。
实施例5 L1特异性杀死大肠杆菌的操作步骤
（1）将大肠杆菌标准菌株涂抹在血平板上，培养24h，然后利用接种环将其转移到EP管中（盛有1.5 mL双蒸水），涡旋、离心，去除上清液，然后再将1.5 mL双蒸水加入到大肠杆菌中，涡旋、离心，此过程重复三次，得到干净的大肠杆菌，加入1 mL双蒸水，涡旋，得到大肠杆菌的悬浊液，备用；
（2）按照说明书配制浓度为18 g/L的营养肉汤培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后放冰箱保存，使用时稀释5倍，备用；
（3）将5 mL稀释的营养肉汤培养液加入15 mL离心管中，然后加入大肠杆菌悬浊液，测量其在600nm的光学密度，并将其光学密度调节到0.030左右，记录加入大肠杆菌悬浊液的体积V1；
（4）将市场上购买的营养琼脂培养基按照说明书配成浓度为32 g/L的营养琼脂培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后备用；
（5）将1.2 mg银纳米簇加入15 mL离心管中，加入3 mL双蒸水，涡旋并超声2min，得到400 μg/mL的银纳米簇悬浊液，备用；取12根15 mL的离心管，依次加入5 mL营养肉汤培养液、V1μL的大肠杆菌悬浊液、不同体积的银纳米簇悬浊液（0, 1, 2, 3.1, 4, 5, 6.25,9.3, 12.5, 19, 25, 37.5 μL），测量不同培养时间（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7h）大肠杆菌的光学密度，根据光学密度确定大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）。
（6）选5个光学密度变化较大的浓度，逐级稀释五次（每次取100 μL样品，加入装有1 mL双蒸水的EP管中，涡旋，此过程重复五次），然后，分别将10 μL大肠杆菌溶液（5个细菌培养液逐级稀释后的最低浓度）加入平板中，浇筑20 mL新灭菌的营养琼脂培养液，放置到固化，然后将其放到细菌培养箱中培养48h，计算细菌cfu数目，并根据曲线得到L1对大肠杆菌的半抑制浓度（IC50）。
实施例6 D1特异性杀死沙门菌的操作步骤
（1）将沙门菌标准菌株涂抹在血平板上，培养24h，然后利用接种环将其转移到EP管中（盛有1.5 mL双蒸水），涡旋、离心，去除上清液，然后再将1.5 mL双蒸水加入到沙门菌中，涡旋、离心，此过程重复三次，得到干净的沙门菌，加入1 mL双蒸水，涡旋，得到沙门菌的悬浊液，备用；
（2）按照说明书配制浓度为18 g/L的营养肉汤培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后放冰箱保存，使用时稀释5倍，备用；
（3）将5 mL稀释的营养肉汤培养液加入15 mL离心管中，然后加入沙门菌悬浊液，测量其在600nm的光学密度，并将其光学密度调节到0.030左右，记录加入沙门菌悬浊液的体积V1；
（4）将市场上购买的营养琼脂培养基按照说明书配成浓度为32 g/L的营养琼脂培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后备用；
（5）将1.2 mg银纳米簇加入15 mL离心管中，加入3 mL双蒸水，涡旋并超声2min，得到400 μg/mL的银纳米簇悬浊液，备用；
（6）取7根15 mL的离心管，依次加入5 mL营养肉汤培养液、V1μL的沙门菌悬浊液、不同体积的银纳米簇悬浊液（0, 3.1, 6.25, 12.5, 19, 25, 37.5 μL），测量不同培养时间（1,2, 3, 4, 5, 6, 7h）沙门菌的光学密度，根据光学密度确定沙门菌的最低抑菌浓度（MIC）。选5个光学密度变化较大的浓度，逐级稀释五次（每次取100 μL样品，加入装有1 mL双蒸水的EP管中，涡旋，此过程重复五次），然后，分别将10 μL沙门菌溶液（5个细菌培养液逐级稀释后的最低浓度）加入平板中，浇筑20 mL新灭菌的营养琼脂培养液，放置到固化，然后将其放到细菌培养箱中培养48h，计算细菌cfu数目，并根据曲线得到D1对沙门菌的半抑制浓度（IC50）。
实施例7 L1特异性杀死沙门菌的操作步骤
（1）将沙门菌标准菌株涂抹在血平板上，培养24h时，然后利用接种环将其转移到EP管中（盛有1.5 mL双蒸水），涡旋、离心，去除上清液，然后再将1.5 mL双蒸水加入到沙门菌中，涡旋、离心，此过程重复三次，得到干净的沙门菌，加入1 mL双蒸水，涡旋，得到沙门菌的悬浊液，备用；
（2）按照说明书配制浓度为18 g/L的营养肉汤培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后放冰箱保存，使用时稀释5倍，备用；
（3）将5 mL稀释的营养肉汤培养液加入15 mL离心管中，然后加入沙门菌悬浊液，测量其在600nm的光学密度，并将其光学密度调节到0.030左右，记录加入沙门菌悬浊液的体积V1；
（4）将市场上购买的营养琼脂培养基按照说明书配成浓度为32 g/L的营养琼脂培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后备用；将1.2 mg银纳米簇加入15 mL离心管中，加入3 mL双蒸水，涡旋并超声两分钟，得到400 μg/mL的银纳米簇悬浊液，备用；
（5）取7根15 mL的离心管，依次加入5 mL营养肉汤培养液、V1μL的沙门菌悬浊液、不同体积的银纳米簇悬浊液（0, 3.1, 6.25, 12.5, 19, 25, 37.5 μL），测量不同培养时间（1,2, 3, 4, 5, 6, 7h）沙门菌的光学密度，根据光学密度确定沙门菌的最低抑菌浓度（MIC）。
（6）选5个光学密度变化较大的浓度，逐级稀释五次（每次取100 μL样品，加入装有1 mL双蒸水的EP管中，涡旋，此过程重复五次），然后，分别将10 μL沙门菌溶液（5个细菌培养液逐级稀释后的最低浓度）加入平板中，浇筑20 mL新灭菌的营养琼脂培养液，放置到固化，然后将其放到细菌培养箱中培养48h，计算细菌cfu数目，并根据曲线得到L1对沙门菌的半抑制浓度（IC50）。
实施例8 D1特异性抑制金黄色葡萄球菌的操作步骤
（1）将金黄色葡萄球菌标准菌株涂抹在血平板上，培养24h，然后利用接种环将其转移到EP管中（盛有1.5 mL双蒸水），涡旋、离心，去除上清液，然后再将1.5 mL双蒸水加入到金黄色葡萄球菌中，涡旋、离心，此过程重复三次，得到干净的金黄色葡萄球菌，加入1 mL双蒸水，涡旋，得到金黄色葡萄球菌的悬浊液，备用；
（2）按照说明书配制浓度为18 g/L的营养肉汤培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后放冰箱保存，使用时稀释5倍，备用；
（3）将5 mL稀释的营养肉汤培养液加入15 mL离心管中，然后加入金黄色葡萄球菌，测量其在600nm的光学密度，并将其光学密度调节到0.030左右，记录加入金黄色葡萄球菌悬浊液的体积V1；
（4）将市场上购买的营养琼脂培养基按照说明书配成浓度为32 g/L的营养琼脂培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后备用；
（5）将1.2 mg银纳米簇加入15 mL离心管中，加入3 mL双蒸水，涡旋并超声2min，得到400 μg/mL的银纳米簇悬浊液，备用；
（6）取13根15 mL的离心管，依次加入5 mL营养肉汤培养液、V1μL的金黄色葡萄球菌悬浊液、不同体积的银纳米簇悬浊液（0, 1, 2, 3.1, 4, 5, 6.25, 9.3, 12.5, 19, 25,37.5, 375 μL），测量不同培养时间（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7h）金黄色葡萄球菌的光学密度，根据光学密度确定金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）。
但是发现随着时间的增加，光学密度一直增加，而且与没加银纳米簇聚集体的参比类似，说明D1对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。
实施例9 L1特异性抑制蜡样芽胞杆菌的操作步骤
（1）将蜡样芽胞杆菌标准菌株涂抹在血平板上，培养24h，然后利用接种环将其转移到EP管中（盛有1.5 mL双蒸水），涡旋、离心，去除上清液，然后再将1.5 mL双蒸水加入到蜡样芽胞杆菌中，涡旋、离心，此过程重复三次，得到干净的蜡样芽胞杆菌，加入1 mL双蒸水，涡旋，得到蜡样芽胞杆菌的悬浊液，备用；
（2）按照说明书配制浓度为18 g/L的营养肉汤培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后放冰箱保存，使用时稀释5倍，备用；
（3）将5 mL稀释的营养肉汤培养基加入15 mL离心管中，然后加入蜡样芽胞杆菌，测量其在600nm的光学密度，并将其光学密度调节到0.030左右，记录加入蜡样芽胞杆菌悬浊液的体积V1；
（4）将市场上购买的营养琼脂培养基按照说明书配成浓度为32 g/L的营养琼脂培养液，在121℃高压灭菌15min，冷却后备用；
（5）取1.2 mg银纳米簇加入15 mL离心管中，加入3 mL双蒸水，涡旋2min，得到400 μg/mL的银纳米簇悬浊液，备用；
（6）取13根15 mL的离心管，依次加入5 mL营养肉汤培养液、V1μL的蜡样芽胞杆菌悬浊液、不同体积的银纳米簇悬浊液（0, 1, 2, 3.1, 4, 5, 6.25, 9.3, 12.5, 19, 25,37.5, 375 μL），测量不同培养时间（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7h）蜡样芽胞杆菌的光学密度，根据光学密度确定蜡样芽胞杆菌的最低抑菌浓度（MIC）。
但是发现随着时间的增加，光学密度一直增加，而且与没加银纳米簇聚集体的参比类似，说明L1对蜡样芽胞杆菌没有抑制作用。
图5显示了不同浓度的D1和L1对大肠杆菌和沙门菌在不同培养时间的抑制效果。从图中可以看出，在7h内D1和L1对大肠杆菌和沙门菌的最低抑菌浓度分别是1, 0.4, 1.5, 1μg/mL。与之对比发现，D-青霉胺和L-青霉胺对大肠杆菌和沙门菌几乎没有抑制效果、而银离子具有很强的杀菌性能，说明合成的银纳米簇聚集体既保持了银离子的毒性、又降低了它的毒性。此外，L1比D1的杀菌性能更强，可能由于L1和细菌表面蛋白具有更好的作用。
图6显示了不同浓度的D1和L1对大肠杆菌和沙门菌的毒性图。从图中可以看出，D1和L1对大肠杆菌的半抑制浓度分别是0.86和0.23 μg/mL，对沙门菌的半抑制浓度分别是0.42和0.22 μg/mL。
图7显示了D1（或L1）和大肠杆菌（或沙门菌）培养7h后，逐级稀释五次过程中，大肠杆菌（或沙门菌）克隆形成单元（cfu）的照片。从图中可以看出，逐级稀释过程中大肠杆菌和沙门菌克隆形成单元的变化。
图8显示了在D1和L1存在和不存在的条件下，大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌培养7h后的扫描电镜图。从图中可以看出，D1和L1明显分解了大肠杆菌和沙门菌，但不能破坏金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌，阐明了D1和L1的杀菌机制。
Claims (8)
1.一种手性银纳米簇聚集体的制备方法，其特征在于：将手性青霉胺加入双蒸水中，然后加入硝酸银溶液，在室温下搅拌，随后离心去除上清液，固体冷冻过夜；随后将过夜后冷冻的固体在真空冷冻离心浓缩仪上抽干，即制备得到手性银纳米簇聚集体的粉末。
2.根据权利要求1所述手性银纳米簇聚集体的制备方法，其特征在于：所述手性青霉胺是指D-青霉胺或L-青霉胺。
3.根据权利要求1所述手性银纳米簇聚集体的制备方法，其特征在于：每1mg手性青霉胺加入5mL双蒸水中，然后加入67μL、0.1mol/L的硝酸银溶液；随后同比例增加手性青霉胺和硝酸银水溶液的加入量，手性青霉胺和硝酸银加入的摩尔量相同，在室温下搅拌3~4h；
以9000-11000r/min离心5-15min去除上清液，固体放在-20℃冰箱中过夜；随后将过夜后冷冻的固体在真空冷冻离心浓缩仪上抽干，冷冻温度为-50℃，离心浓缩转速是4000r/min，即制备得到手性银纳米簇聚集体的粉末。
4.根据权利要求1所述手性银纳米簇聚集体的制备方法，其特征在于：将1mg手性青霉胺加入5mL双蒸水中，然后加入67μL、0.1mol/L的硝酸银溶液；混匀后在手套箱中静置三天，即得到手性银纳米簇聚集体的单晶。
5.根据权利要求4所述手性银纳米簇聚集体的制备方法，其特征在于： 手性银纳米簇聚集体的单晶的最小晶胞单元结构式为Ag8L8或Ag8D8。
6.权利要求1制备所得手性银纳米簇聚集体的应用，其特征在于：将其应用于特异性杀菌。
7.根据权利要求6所述手性银纳米簇聚集体的应用，其特征在于：所述特异性杀菌的菌株具体为大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。
8.根据权利要求7所述手性银纳米簇聚集体的应用，其特征在于具体步骤如下：
（1）将标准菌株涂抹在血平板或营养琼脂平板上培养24h，然后利用接种环将细菌转移到盛有1.5mL双蒸水的EP管中，涡旋、离心，倒掉上清液，将新的双蒸水加入上述EP管中，重复上述过程三次，得到比较干净的细菌，然后加入1mL双蒸水，涡旋，得到细菌悬浊液，备用；
（2）取手性银纳米簇聚集体的粉末1.2 mg加入15mL离心管中，加入3mL双蒸水，涡旋并超声2min，得到400μg/mL的手性银纳米簇悬浊液，备用；
（3）取营养肉汤培养基配成浓度为18g/L的营养肉汤培养液，在121℃、0.11MPa高压灭菌15min，冷却后放在5℃冰箱中备用；
（4）取步骤（3）所得营养肉汤培养液用双蒸水稀释5倍，将5 mL稀释后的营养肉汤培养液加入15 mL离心管中，然后加入步骤（1）配置所得细菌悬浊液，混匀后利用分光光度计测量其在600nm的光学密度，并将光学密度调节到0.030，记录加入细菌悬浊液的体积V1；
（5）取12~13根15 mL的离心管，依次加入5 mL步骤（4）稀释的营养肉汤培养液、V1μL步骤（1）配置的细菌悬浊液、不同体积步骤（2）配置的手性银纳米簇悬浊液，涡旋，并放在36℃的细菌培养箱中培养；
（6）在不同培养时间测量步骤（5）中细菌培养液的光学密度，根据光学密度确定细菌的最低抑菌浓度MIC；
（7）选取7h后步骤（6）中光学密度变化较大的5个细菌培养液，分别进行五个梯度的逐级稀释：将100μL细菌培养液加入盛有1mL双蒸水的EP管中，涡旋得细菌溶液，然后取100 μL上述细菌溶液加入盛有1mL双蒸水的EP管中，上述过程重复五次，得到五个梯度的细菌溶液；类似地，其它4个细菌培养液也分别进行五个梯度的逐级稀释；
（8）将营养琼脂培养基配成浓度为32 g/L的营养琼脂培养液，在121℃、0.11MPa高压灭菌15min，冷却后备用；
（9）分别将10μL步骤（7）中的细菌溶液，即5个细菌培养液逐级稀释后的最低浓度，加入平板中，加入20mL步骤（8）配置所得营养琼脂培养液，培养液固化后放到细菌培养箱中培养48h，细菌计数，根据计数结果拟合数据，得到半抑制浓度IC50。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN112647121A (zh) * | 2020-12-03 | 2021-04-13 | 无锡市疾病预防控制中心 | 一种结构和光学性质可调的银簇聚集体的制备方法 |
| CN115555577A (zh) * | 2022-10-17 | 2023-01-03 | 华南理工大学 | 一种高稳定性银纳米团簇荧光探针及其制备方法与应用 |
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| CN115555577B (zh) * | 2022-10-17 | 2023-11-17 | 华南理工大学 | 一种高稳定性银纳米团簇荧光探针及其制备方法与应用 |
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