CN111521832A - 一种用于测定25-羟基-维生素d的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于测定25‑羟基‑维生素D的试剂盒，包括第一试剂R1、第二试剂R2和第三试剂R3；所述第一试剂R1包括羊单抗包被的磁珠，所述磁珠上标记有生物素，所述第二试剂R2包括含有碱性磷酸酶标记的25‑OH VD衍生物，所述第三试剂R3包括解离剂，所述解离剂为醋酸钠。本发明所述第三试剂R3中的醋酸钠能够有效的将样本中25‑OH VD与结合蛋白分离，显著提高25‑羟基‑维生素D检测的特异性和灵敏度，进一步提高了检测结果的准确性。

Description

一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒
技术领域
本发明涉及检测试剂盒技术领域，具体涉及一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒。
背景技术
维生素D(vitamin D)为环戊烷多氢菲类化合物，是正常骨骼生长、钙磷代谢所必需，其主要代谢物是25-羟基-维生素D在人体内有两种形式的维生素D，维生素D2与维生素D3，维生素D2少部分由植物源性食物中获得，维生素D3是人体中存在的主要形式，由皮肤中的脱氢胆固醇经阳光照射产生。血清中25-羟基维生素D的高低可以反映维生素D的储存水平，并且与维生素D缺乏的临床症状相关。
25-羟基-维生素D的检测的临床应用与儿童佝偻病、骨软化症、绝经后骨质疏松和肾性骨病的诊断、治疗和监测相关，可用于以上疾病的辅助诊断。现有25-OH VD(25-羟基-维生素D)免疫测定试剂在测定临床样本时经常出现解离效果不好现象，导致检测结果不准确，影响临床使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，解决现有25-OHVD免疫测定试剂解离效果不好导致检测结果不准确的问题。
本发明通过下述技术方案实现：
一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，包括第一试剂R1、第二试剂R2和第三试剂R3；
所述第一试剂R1包括羊单抗包被的磁珠，所述磁珠上标记有生物素，所述第二试剂R2包括含有碱性磷酸酶标记的25-OH VD衍生物，所述第三试剂R3包括解离剂，所述解离剂为醋酸钠。
本发明所述第三试剂R3中的醋酸钠能够有效的将样本中25-OH VD与结合蛋白分离，显著提高25-羟基-维生素D检测的特异性和灵敏度，进一步提高了检测结果的准确性。
本发明通过第一试剂R1和第二试剂R2与第三试剂R3为相互配合，能提高25-羟基-维生素D检测的特异性和灵敏度进一步地，第三试剂R3为酸性缓冲液，所述酸性缓冲液的pH值为3-5。
申请人通过试验发现：在低pH值环境下，醋酸钠的解离效果更加明，且第三试剂R3的稳定性好，但是，当pH值过低，会降低整个体系反应率，且解离效果变差。
进一步地，酸性缓冲液的pH值为3.95-4.05。
pH值在4左右为第三试剂R3的最佳pH值，不仅解离效果达到最佳且稳定性尤为好。
进一步地，酸性缓冲液采用冰醋酸调节pH值。
进一步地，酸性缓冲液的制备方法包括以下步骤：
A、称取醋酸钠与洁净容器中，加入纯化水溶解；
B、向步骤A中获得的溶液中加入冰醋酸调节pH值；
C、用纯化水定容步骤B制备的溶液。
进一步地，羊单抗包被的磁珠为Biotin-25-羟基维生素D单克隆抗体磁珠包被，其中，所述磁珠的包被量为1μg/mg，复溶比为1/50。
包被量含义为：1μg Biotin-25-羟基维生素D单克隆抗体对应1mg磁珠，包被量的意义在于将抗体按一定比例链接到磁珠，这样的比例效果使得反应体系较好；稀释比例(复溶比)含义为：研发的裸磁珠是原倍，1/50就是在原倍的基础上进行50倍稀释，稀释比例的意义在于原倍的裸磁珠在反应体系中浓度过高，与抗体链接时会有所剩余，而稀释比过大却会导致链接抗体时缺失，经反复试验，稀释到1/50能使反应体系更加充分且效果更好。
进一步地，第一试剂R1由1.21g/L Tris、9.00g/L NaCl、约0.7mL/L浓HCl、10.00g/L BSA、1mL/L PC-950、0.5mL/L Tween-20、0.2μg/mL羊抗人25-OH VD特异性单克隆抗体、0.2mg/mL链亲和素磁珠和50ul/mg磁珠封闭液组成。
其中，磁珠封闭液配制步骤为：将D-Biotin放置室温(避光)平衡至室温(10-30min)；取一张干净称量纸置天平上，调节零点；称量D-Biotin 244.5mg于适当容器中，并用50mL DMSO充分溶解，再加入50mL甘油，充分混匀，于-20℃存放，1mg磁珠加50uL封闭液。
进一步地，第二试剂R2由1.21g/L Tris、9.00g/L NaCl、约0.7mL/L浓HCl，10.00g/L BSA、1mL/L PC-950、0.5mL/L Tween-20、10mL/L 0.1M MgCl2、10mL/L 0.01M ZnCl2和1mg/μg碱性磷酸酶活化的25-OH VD衍生物组成。
进一步地，第一试剂R1和第二试剂R2的pH值均为7.35-7.45。
进一步地，第一试剂R1、第二试剂R2和第一试剂R3的反应体系加入量为1:1:1。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明所述试剂盒包括第一试剂R1、第二试剂R2和第三试剂R3，其中第一试剂R1、第二试剂R2分别为羊单抗包被的磁珠和酶工作液，第三试剂R3含醋酸钠解离剂，所述羊单抗包被的磁珠和酶工作液为检测25-羟基-维生素D提供必要条件，所述醋酸钠解离剂能够有效的将样本中25-OH VD与结合蛋白分离，显著提高25-羟基-维生素D检测的特异性和灵敏度，进一步提高了检测结果的准确性。
2、本发明所述试剂盒的第三试剂R3为酸性缓冲液，所述酸性缓冲液的pH值为3-5，采用醋酸钠作为解离剂，采用冰醋酸调节pH值，在低pH值环境下，醋酸钠的解离效果更加明，且第三试剂R3的稳定性好。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，包括第一试剂R1、第二试剂R2和第三试剂R3；
所述第一试剂R1包括羊单抗包被的磁珠，所述磁珠上标记有生物素，所述第二试剂R2包括含有碱性磷酸酶标记的25-OH VD衍生物，所述第三试剂R3为酸性缓冲液，所述酸性缓冲液的pH值为3，所述酸性缓冲液中包括解离剂，解离剂为醋酸钠；所述酸性缓冲液的制备方法如下：
A、准备干净的容器，用实验室天平称取82.03g 1M NaAc，加入纯化水4.5L溶解；
B、往A中所得到的溶液中加入适量冰醋酸，用冰醋酸300mL调节pH值，使得pH调节到2.95-3.05；
C、用纯化水将B中溶液定容至5L，配成0.2mol/L醋酸钠缓冲液；
所述第一试剂R1由1.21g/L Tris、9.00g/L NaCl、约0.7mL/L浓HCl、10.00g/LBSA、1mL/L PC-950、0.5mL/L Tween-20、0.2μg/mL羊抗人25-OH VD特异性单克隆抗体、0.2mg/mL链亲和素磁珠和50ul/mg磁珠封闭液组成；其中，磁珠封闭液配制步骤为：将D-Biotin放置室温(避光)平衡至室温30min；取一张干净称量纸置天平上，调节零点；称量D-Biotin 244.5mg于适当容器中，并用50mL DMSO充分溶解，再加入50mL甘油，充分混匀，于-20℃存放，1mg磁珠加50uL封闭液；
所述第二试剂R2由1.21g/L Tris、9.00g/L NaCl、约0.7mL/L浓HCl，10.00g/LBSA、1mL/L PC-950、0.5mL/L Tween-20、10mL/L 0.1M MgCl2、10mL/L 0.01M ZnCl2和1mg/μg碱性磷酸酶活化的25-OH VD衍生物组成；
所述第一试剂R1和第二试剂R2的pH值均为7.35-7.45；所述第一试剂R1、第二试剂R2和第一试剂R3的反应体系加入量比例为1:1:1。
实施例2：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
所述酸性缓冲液的pH值为4，所述酸性缓冲液的制备方法如下：
A、准备干净的容器，用实验室天平称取1M NaAc，加入纯化水溶解；
B、往A中所得到的溶液中加入适量冰醋酸，用冰醋酸200mL调节pH值，使得pH调节到3.95-4.05；
C、用纯化水将B中溶液定容至5L，配成0.2mol/L醋酸钠缓冲液。
实施例3：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
所述酸性缓冲液的pH值为5，所述酸性缓冲液的制备方法如下：
A、准备干净的容器，用实验室天平称取1M NaAc，加入纯化水溶解；
B、往A中所得到的溶液中加入适量冰醋酸，用冰醋酸100mL调节pH值，使得pH调节到4.95-5.05；
C、用纯化水将B中溶液定容至5L，配成0.2mol/L醋酸钠缓冲液。
对比例1：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
解离剂为柠檬酸钠。
对比例2：
本对比例基于实施例2，与实施例2的区别在于：
解离剂为柠檬酸钠。
对比例3：
本对比例基于实施例3，与实施例3的区别在于：
解离剂为柠檬酸钠。
对比例4：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
不含第三试剂R3。
将实施例2、对比例2和对比例4所述试剂盒用于在同等情况下，试剂盒灵敏度与特异性比较实验：
实验材料：BNHS，0.2mol/L PBS(PH7.4)缓冲液，1mmol/LTris缓冲液，羊抗人25-OHVD特异性单克隆抗体，含有1％BSA的缓冲液Buffer，ALP(碱性磷酸酶)标记的25-OH VD衍生物，解离剂(为醋酸钠或柠檬酸钠或不加解离剂)，裸磁珠，25-OH-VD校准品cal-1,cal-6(Cal-1到Cal-6的浓度为0，10，20，40，80，160ng/mL)，样本S1-S40，底物液，清洗液，贝克曼Access 2全自动化学发光测定仪。
将上述实验材料分别制成实施例2、对比例2和对比例4所述试剂盒，测定25-OH-VD校准品cal-1至cal-6，观察不同抗体的测定曲线及特异性，并测定样本S1-S40，与罗氏值进行比较。
反应模式为：先加入校准品30μL，磁珠50μL，解离剂45μL37℃共同孵育10min后，再加入酶工作液50μL37℃孵育10min，加入清洗液在磁场中清洗分离三次后，加入底物液37℃孵育5min后，于贝克曼Access 2全自动化学发光测定仪上检测。
检测结果如表1和表2所示：
表1
Figure BDA0002469479490000051
表2
Figure BDA0002469479490000052
Figure BDA0002469479490000061
由表1和表2的数据可知：
采用不含第三试剂的试剂盒灵敏度和特异性均较差，采用柠檬酸钠作为解离剂的试剂盒灵敏度和特异性相对而言比较差，可进一步验证不同pH值的柠檬酸钠，试剂盒灵敏度与特异性比较实验，采用醋酸钠作为的解离剂试剂盒曲线基本满足使用，测得样本值能和罗氏值相差不大，且能将高浓度值测出来，灵敏度够用；可进一步验证不同pH值的醋酸钠，试剂盒灵敏度与特异性比较实验。
不同pH值的柠檬酸钠，试剂盒灵敏度与特异性比较实验：
实验材料：BNHS，0.2mol/L PBS(PH7.4)缓冲液，1mmol/LTris缓冲液，羊抗人25-OHVD特异性单克隆抗体，含有1％BSA的缓冲液Buffer，ALP标记的25-OH VD衍生物，解离剂(缓冲液为不同pH值的柠檬酸钠，分别为pH＝3，pH＝4，pH＝5)，裸磁珠，25-OH-VD校准品cal-1,cal-6(Cal-1到Cal-6的浓度为0，10，20，40，80，160ng/mL)，底物液，清洗液，贝克曼Access2全自动化学发光测定仪。
将上述实验材料分别制成对比例1-对比例3所述试剂盒，测定25-OH-VD校准品cal-1至cal-6，观察不同抗体的测定曲线及特异性。
反应模式为：先加入校准品30μL，磁珠50μL，解离剂45μL37℃共同孵育10min后，再加入酶工作液50μL37℃孵育10min，加入清洗液在磁场中清洗分离三次后，加入底物液37℃孵育5min后，于贝克曼Access 2全自动化学发光测定仪上检测。
检测结果如表3所示：
表3
Figure BDA0002469479490000071
由表3的数据可知：
同为柠檬酸钠作为解离剂，但由于pH不同，按相同的标记方法所制备的试剂盒出现的效果不明显，且pH越大，试剂盒的效价越低。
不同pH值的醋酸钠，实施例1-实施例3试剂盒灵敏度与特异性比较实验，实验过程与上述不同pH值的柠檬酸钠，试剂盒灵敏度与特异性比较实验一致，结果如表4所示：
表4
Figure BDA0002469479490000072
由表4数据可知：
同为醋酸钠作为解离剂，在pH为4的时候测定效果较好，且pH越大，试剂盒的效果越低，pH降低，试剂盒的效果也会越低，但效果要高于柠檬酸钠作为解离剂的酸性缓冲液。
同pH值的醋酸钠，试剂盒灵敏度与特异性比较实验：
实验材料：BNHS，0.2mol/L PBS(PH7.4)缓冲液，1mmol/LTris缓冲液，羊抗人25-OHVD特异性单克隆抗体，含有1％BSA的缓冲液Buffer，ALP标记的25-OH VD衍生物，醋酸钠解离剂，裸磁珠，25-OH-VD校准品cal-1,cal-6(Cal-1到Cal-6的浓度为0，10，20，40，80，160ng/mL)，底物液，清洗液，贝克曼Access 2全自动化学发光测定仪。
将上述材料制成实施例2所述试剂盒(2盒)，一份与2-8℃保存，一份于恒温培养箱中37℃保存，6天后取出。分别将磁珠于解离剂(第三试剂R3)和酶工作液(第二试剂R2)配合测定25-OH-VD校准品。第六天于贝克曼Access 2全自动化学发光测定仪观察校准品的发光信号，计算信号保留率，验证醋酸钠分缓(pH＝4)的稳定性。结果如表5所示：
表5
Figure BDA0002469479490000081
由表5的数据可知：
同为醋酸钠分析缓冲液(pH＝4)作为解离剂，2-8℃与37℃存放后信号保留率很好，稳定性更好。
综上，25-OH-VD测定试剂盒在采用醋酸钠作为解离剂时，灵敏度和特异性均有效提高；在作为解离剂与生物素包被好的磁珠反应之前，将醋酸钠缓冲液用冰醋酸调节pH到3.95～4.05时，调节为到一个固定的pH值，可以提高试剂盒的稳定性，pH值再往下时效果反而有所影响，会浪费资源，pH值往上会导致解离效果较差。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，其特征在于，包括第一试剂R1、第二试剂R2和第三试剂R3；
所述第一试剂R1包括羊单抗包被的磁珠，所述磁珠上标记有生物素，所述第二试剂R2包括含有碱性磷酸酶标记的25-OH VD衍生物，所述第三试剂R3包括解离剂，所述解离剂为醋酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，其特征在于，所述第三试剂R3为酸性缓冲液，所述酸性缓冲液的pH值为3-5。
3.根据权利要求2所述的一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，其特征在于，所述酸性缓冲液的pH值为3.95-4.05。
4.根据权利要求2所述的一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，其特征在于，所述酸性缓冲液采用冰醋酸调节pH值。
5.根据权利要求4所述的一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，其特征在于，所述酸性缓冲液的制备方法包括以下步骤：
A、称取醋酸钠与洁净容器中，加入纯化水溶解；
B、向步骤A中获得的溶液中加入冰醋酸调节pH值；
C、用纯化水定容步骤B制备的溶液。
6.根据权利要求1所述的一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，其特征在于，所述羊单抗包被的磁珠为Biotin-25-羟基维生素D单克隆抗体磁珠包被，其中，所述磁珠的包被量为1μg/mg，复溶比为1/50。
7.根据权利要求1所述的一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂R1由1.21g/L Tris、9.00g/L NaCl、约0.7mL/L浓HCl、10.00g/L BSA、1mL/L PC-950、0.5mL/L Tween-20、0.2μg/mL羊抗人25-OH VD特异性单克隆抗体、0.2mg/mL链亲和素磁珠和50ul/mg磁珠封闭液组成。
8.根据权利要求1所述的一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，其特征在于，所述第二试剂R2由1.21g/L Tris、9.00g/L NaCl、约0.7mL/L浓HCl，10.00g/L BSA、1mL/L PC-950、0.5mL/L Tween-20、10mL/L 0.1M MgCl2、10mL/L 0.01M ZnCl2和1mg/μg碱性磷酸酶活化的25-OH VD衍生物组成。
9.根据权利要求1-8任一项所述的一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂R1和第二试剂R2的pH值均为7.35-7.45。
10.根据权利要求1-8任一项所述的一种用于测定25-羟基-维生素D的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂R1、第二试剂R2和第一试剂R3的反应体系加入量为1:1:1。
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