CN111521474A - 一种检测法医溶血血液样本中尿素及肌酐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于血液样本检测方法，尤其涉及一种检测法医溶血血液样本中尿素及肌酐的方法。其解决了溶血样本中血红蛋白产生的颜色干扰，也得以使常规生化方法可以更加稳定。包括以下步骤：步骤1、应用超滤装置对全溶血样品进行超滤处理，得到超滤液；步骤2、对超滤液进行尿素及肌酐的检测；步骤3、对超滤液中的尿素及肌酐的含量值进行校正；步骤4、得到法医溶血样本中尿素及肌酐的含量值。
Description
技术领域
本发明属于血液样本检测方法，尤其涉及一种检测法医溶血血液样本中尿素及肌酐的方法。
背景技术
死后血液中尿素、肌酐的浓度，在肾功能衰竭、致命性高低温损伤、高渗性脱水等法医学死因推断中有重要的辅助诊断意义，特别是尿素及肌酐在死后诊断肾功能衰竭中起着非常重要的作用。目前，法医死后检验中尿素及肌酐的检测主要基于分离的血清样本利用试剂盒联合酶标仪手工检测等生化学方法检测其在体液中的浓度。然而，在法医学实践中，尸体血液常因溶血无法分离出满足检测需要的血清。研究证实，溶血将严重干扰生化学检测，无法获得稳定且具有实用诊断意义的检测值。因此，建立死后溶血血液样品的预处理、以及处理后样本中肌酐、尿素的有效检测方法具有重要的法医学实用意义。
对于溶血血液样本的预处理，以往采用高速离心、倍比稀释的方法处理溶血血液样本，但溶血血液样本经过高速离心后得到的液体依然呈现严重的红色外观，无法得到可供生化学检测使用的血液样本；而将溶血血液样本倍比稀释后，虽然可以减轻溶血所造成的血液颜色的影响，但是在检测中发现尿素与肌酐并不与稀释倍数成正比，且稀释后的样本浓度若低于仪器检测方法的下限值，则无法进行检测，这使得倍比稀释后的血液样本无法真正反映出原血液中尿素与肌酐的真实浓度。
发明内容
本发明就是针对现有技术存在的缺陷，提供一种检测法医溶血血液样本中尿素及肌酐的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，一种检测法医溶血血液样本中尿素及肌酐的方法，包括以下步骤。
步骤1、应用超滤装置对全溶血样品进行超滤处理，得到超滤液。
步骤2、对超滤液进行尿素及肌酐的检测。
步骤3、对超滤液中的尿素及肌酐的含量值进行校正。
步骤4、得到法医溶血样本中尿素及肌酐的含量值。
进一步地，一种超滤装置；其特征在于，其包括中空纤维超滤组件、一号注射器、二号注射器、三号注射器、垂直超滤组件及离心机；所述一号注射器、二号注射器用于容纳溶血待处理样品，所述三号注射器用于收集一次超滤液A；中空纤维超滤组件的一端分别与一号注射器及三号注射器相连，中空纤维超滤组件的另一端与二号注射器相连；所述垂直超滤组件用于容纳超滤液A，所述离心机用于对垂直超滤组件内的超滤液A离心。
进一步地，所述中空纤维超滤组件采用美国Spectrum Laboratories公司出产的MicroKros®，mPES型超滤组件，孔径为50 KD，接触面积为20 cm2。
进一步地，所述垂直超滤组件采用美国Merck Millipore公司的Amicon® Ultra-0.5 30 KD型垂直超滤组件。
进一步地，所述中空纤维超滤组件的两端各具有一个连接接头；其中，第一连接接头的内芯与一号注射器相连，外管与三号注射器相连；第二连接接头的内芯与二号注射器相连。
进一步地，所述步骤1包括以下步骤。
步骤1.1、使用一号注射器抽取定量（3 mL）全溶血样品，反复推动一号、二号注射器对中空纤维超滤组件中液体进行一次超滤，使用三号注射器收集至少500μL淡红色超滤液，得到超滤液A。
步骤1.2、将500μL超滤液A转移至垂直超滤组件（Amicon® Ultra-0.5 30KD超滤管）内芯中，利用固定角转子离心机（以14000g，10min）进行二次超滤，弃去内芯残留物收集外管无色透明超滤液，得到超滤液B。
进一步地，所述步骤2包括以下步骤：利用生化分析仪、尿素（UREA）测定试剂盒、肌酐（CREA）测定试剂盒对超滤处理后的超滤液B进行尿素及肌酐的检测。
更进一步地，生化分析仪采用Heal Force MOL-300全自动生化分析仪，尿素（UREA）测定试剂盒采用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司尿素（UREA）测定试剂盒（紫外-谷氨酸脱氢酶法），肌酐（CREA）测定试剂盒采用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司肌酐（CREA）测定试剂盒（酶法）。
进一步地，所述步骤3包括以下步骤。
步骤3.1、检测尸体未溶血时血清中尿素（Y）、肌酐浓度（N）分别标记为Y1、Y2、Y3……及N1、N2、N3……。
步骤3.2、将步骤3.1中血清对应的全血样本进行冻融处理、制备全溶血样本。
步骤3.3、用超滤装置对全溶血样品进行超滤处理，得到超滤液。
步骤3.4、利用生化分析仪、尿素测定试剂盒及肌酐（CREA）测定试剂盒对所述超滤液进行尿素及肌酐的检测；得到超滤液中的尿素（X）及肌酐的浓度（M），分别标记为X1、X2、X3……及……M1、M2、M3……。
步骤3.5、对每组尿素检测得到的X与Y值、肌酐检测得到的M与N值进行回归分析（利用SPSS软件），分别建立尿素线性回归方程Y=αX+β、肌酐的线性回归方程N=γM+δ，分别得到尿素线性回归方程系数α的值及系数β的值及肌酐的线性回归方程系数γ的值及系数δ的值。
步骤3.6、根据尿素线性回归方程系数α的值及系数β的值及肌酐的线性回归方程系数γ的值及系数δ的值及线性回归方程对超滤液中的尿素及肌酐含量值进行校正。
与现有技术相比本发明有益效果。
在样品预处理方面，本发明首次采用中空纤维超滤联合垂直超滤组件对溶血样品进行两步超滤处理，通过超滤膜对溶血样品的大分子量干扰成分进行截留，并滤过目的指标，使处理后超滤液呈现无色透明性状，解决了溶血样本中血红蛋白产生的颜色干扰，也得以使常规生化方法可以更加稳定、准确地检测超滤液中尿素、肌酐浓度。
在检测技术方面，本发明中采用的全自动生化分析仪对超滤液中尿素及肌酐进行检测，可以最大程度的降低以往法医检测中各种原因导致的检测误差，并准确的检测出样本中的尿素及肌酐水平。同时，根据本技术中的超滤及检测方法，建立了校正方程，完善地解决了法医实际工作中溶血因素对尿素、肌酐死后生化学检测的影响。
本发明首次提出了将法医学溶血血液样本进行两步超滤处理后，使用全自动生化学检测的方法进行尿素及肌酐的检测。可真实反映法医溶血血液样本中尿素及肌酐的浓度。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。本发明保护范围不仅局限于以下内容的表述。
图1是本发明超滤装置结构示意图。
图2是本发明超滤液与血清尿素检测值线性回归图。
图3是本发明超滤液与血清肌酐检测值线性回归图。
具体实施方式
如图1-3所示， 本超滤方法以中空纤维超滤组件(MicroKros®，mPES，50 000 D，20 cm2，美国Spectrum Laboratories公司)搭配一次性注射器及Amicon® Ultra-0.530KD垂直超滤组件(美国Merck Millipore公司)对溶血样品进行超滤处理，具体说明如下。
一、超滤装置的组装。
超滤装置的组装：将中空纤维超滤组件和3个注射器如图1所示组装。其中，一号、二号注射器作为超滤血样使用，3号注射器作为收集第一步超滤液使用。
二、具体超滤过程。
（1）使用一号注射器抽取3 mL全溶血样品，反复推动一号、二号注射器对超滤组件中液体进行第一步超滤，使用3号注射器收集至少500μL淡红色超滤液，即如图所示超滤液A。
（2）将500μL超滤液A转移至Amicon® Ultra-0.5 30KD超滤管内芯中，利用固定角转子离心机以14000g，10min进行第二步超滤，弃去内芯残留物收集外管无色透明超滤液，即如图所示超滤液B。
三、尿素及肌酐的检测。
利用Heal Force MOL-300全自动生化分析仪、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司尿素（UREA）测定试剂盒（紫外-谷氨酸脱氢酶法）、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司肌酐（CREA）测定试剂盒（酶法）对超滤处理后的超滤液B进行尿素及肌酐的检测。
以往申报的溶血样本中IgE检测的方法中采用的是电化学发光的方法对进行IgE检测，而本技术中涉及的尿素及肌酐无法使用电化学发光的方法进行检测。
此外，以往尿素及肌酐的法医检测还采用96孔板的检测试剂盒配合酶标仪进行检测，但此种检测方法多为手工操作，误差较大，也受操作者的技术熟练程度影响较大。本技术中所采用的全自动生化检测仪器检测技术成熟，检测过程稳定，受人为因素影响很小，是各医院实验室检验常用的检测方法，可准确检测出样本中的尿素及肌酐浓度。
在国内领域，我们首次提出了将法医学溶血血液样本进行两步超滤处理后，使用全自动生化学检测的方法进行尿素及肌酐的检测。经过多年的前期摸索与实践，本方法可以真实反映法医溶血血液样本中尿素及肌酐的浓度。
四、超滤液与血清中尿素、肌酐含量的进行校正。
在应用本技术进行检测后，需要根据各自实验室的检测样本建立校正公式，方法如下。
1、检测尸体未溶血时血清中尿素（Y）、肌酐浓度（N），分别标记为Y1、Y2、Y3……及N1、N2、N3……。
2、将上述血清对应的全血样本进行冻融处理制备全溶血样本。
3、按照本技术中所采用的两步超滤方法对溶血样本进行处理得到超滤液。
4、检测超滤液中的尿素（X）及肌酐的浓度（M），分别标记为X1、X2、X3……及……M1、M2、M3……。
对每组尿素检测得到的X与Y值、肌酐检测得到的M与N值进行回归分析（可利用SPSS软件），分别建立尿素线性回归方程Y=αX+β、肌酐的线性回归方程N=γM+δ。
举例，如图2、图3所示，应用39例非冷冻尸体解剖案例心血样本对超滤液与血清的尿素、肌酐相关性进行分析，获得了良好的相关性(尿素r2=0.9651；肌酐r2=0.9795)（图3）并建立了超滤液与血清尿素、肌酐的校正方程：超滤液中尿素浓度 (X)与未溶血血清中尿素浓度 (Y) Y=0.9971X + 0.8922；超滤液中肌酐浓度 (M)与未溶血血清中肌酐浓度 (N) N=0.9717M + 21.52。
超滤液中的检测值经校正后可以较可靠的反映其在溶血前血清中的水平。如我们利用本超滤技术处理溶血样本，并用生化学方法检测了超滤液中尿素的浓度（X值）、肌酐的浓度分别为（M值）13.2mmol/L、47.17μmol/L，代入校正公式后可推测血清中尿素的浓度（Y值）、肌酐浓度（N值）约为14.05mmol/L、67.36μmol/L。
超滤技术可以根据超滤膜孔径的大小，分离溶液中不同分子量的物质。因其操作简便、高效等原因目前已经广泛应用在水质净化、血液透析、生物样本制备等诸多领域。本发明中，根据尿素与肌酐的分子量均很小（远小于30KD），我们选择孔径为50 KD的切向流中空纤维超滤膜柱联合孔径为30 KD的垂直超滤组件进行两步超滤处理，不仅能有效对产生颜色干扰的血红蛋白及其他大分子量杂质进行截留使处理后样品呈现无色透明性状，保证处理后能应用常规生化学方法准确检测，并通过建立校正方程在很大程度上还原至溶血前血清水平。
在以往的IgE超滤处理中，由于IgE的分子量为196 000，我们选用孔径为100 KD的切向流中空纤维超滤膜柱对其进行单次超滤处理，此时IgE会保留在中空纤维超滤组件的内芯中。而本发明中我们选用了孔径为50 KD的切向流中空纤维超滤膜柱联合孔径为30 KD的垂直超滤组件进行两步超滤处理，根据尿素及肌酐的分子量<30 KD，在两步超滤处理中我们均保留超滤组件中的外芯液体，用于下一步的生化学检测。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种检测法医溶血血液样本中尿素及肌酐的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、应用超滤装置对全溶血样品进行超滤处理，得到超滤液；
步骤2、对超滤液进行尿素及肌酐的检测；
步骤3、对超滤液中的尿素及肌酐的含量值进行校正；
步骤4、得到法医溶血样本中尿素及肌酐的含量值。
2.一种实施权利要求1的方法的超滤装置，其特征在于：包括中空纤维超滤组件、一号注射器、二号注射器、三号注射器、垂直超滤组件及离心机；所述一号注射器、二号注射器用于容纳溶血待处理样品，所述三号注射器用于收集一次超滤液A；中空纤维超滤组件的一端分别与一号注射器及三号注射器相连，中空纤维超滤组件的另一端与二号注射器相连；所述垂直超滤组件用于容纳超滤液A，所述离心机用于对垂直超滤组件内的超滤液A离心。
3.根据权利要求2所述的超滤装置，其特征在于：所述中空纤维超滤组件采用美国Spectrum Laboratories公司出产的MicroKros®，mPES型超滤组件，孔径为50 KD，接触面积为20 cm2。
4.根据权利要求2所述的超滤装置，其特征在于：所述垂直超滤组件采用美国MerckMillipore公司的Amicon® Ultra-0.5 30 KD型垂直超滤组件。
5.根据权利要求2所述的超滤装置，其特征在于：所述中空纤维超滤组件的两端各具有一个连接接头；其中，第一连接接头的内芯与一号注射器相连，外管与三号注射器相连；第二连接接头的内芯与二号注射器相连。
6.根据权利要求1所述的一种检测法医溶血血液样本中尿素及肌酐的方法，其特征在于：所述步骤1包括以下步骤：
步骤1.1、使用一号注射器抽取定量全溶血样品，反复推动一号、二号注射器对中空纤维超滤组件中液体进行一次超滤，使用三号注射器收集至少500μL淡红色超滤液，得到超滤液A；
步骤1.2、将500μL超滤液A转移至垂直超滤组件内芯中，利用固定角转子离心机进行二次超滤，弃去内芯残留物收集外管无色透明超滤液，得到超滤液B。
7.根据权利要求1所述的一种检测法医溶血血液样本中尿素及肌酐的方法，其特征在于：所述步骤2包括以下步骤：利用生化分析仪、尿素测定试剂盒、肌酐测定试剂盒对超滤处理后的超滤液B进行尿素及肌酐的检测。
8.根据权利要求1所述的一种检测法医溶血血液样本中尿素及肌酐的方法，其特征在于：生化分析仪采用Heal Force MOL-300全自动生化分析仪，尿素测定试剂盒采用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司尿素测定试剂盒，肌酐测定试剂盒采用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司肌酐测定试剂盒。
9.根据权利要求1所述的一种检测法医溶血血液样本中尿素及肌酐的方法，其特征在于：所述步骤3包括以下步骤：
步骤3.1、检测尸体未溶血时血清中尿素、肌酐浓度分别标记为Y1、Y2、Y3……及N1、N2、N3……；
步骤3.2、将步骤3.1中血清对应的全血样本进行冻融处理、制备全溶血样本；
步骤3.3、用超滤装置对全溶血样品进行超滤处理，得到超滤液；
步骤3.4、利用生化分析仪、尿素测定试剂盒及肌酐测定试剂盒对所述超滤液进行尿素及肌酐的检测；得到超滤液中的尿素及肌酐的浓度，分别标记为X1、X2、X3……及……M1、M2、M3……；
步骤3.5、对每组尿素检测得到的X与Y值、肌酐检测得到的M与N值进行回归分析，分别建立尿素线性回归方程Y=αX+β、肌酐的线性回归方程N=γM+δ，分别得到尿素线性回归方程系数α的值及系数β的值及肌酐的线性回归方程系数γ的值及系数δ的值；
步骤3.6、根据尿素线性回归方程系数α的值及系数β的值及肌酐的线性回归方程系数γ的值及系数δ的值及线性回归方程对超滤液中的尿素及肌酐含量值进行校正。
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| CN202010387317.0A Pending CN111521474A (zh) | 2020-05-09 | 2020-05-09 | 一种检测法医溶血血液样本中尿素及肌酐的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111521474A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150260747A1 (en) * | 2012-12-09 | 2015-09-17 | Chromedx Corp. | Automated ultra-filtration system |
| CN110938139A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-03-31 | 中国医科大学 | 一种用于法医溶血样本总IgE检测的中空纤维超滤方法 |
-
2020
- 2020-05-09 CN CN202010387317.0A patent/CN111521474A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150260747A1 (en) * | 2012-12-09 | 2015-09-17 | Chromedx Corp. | Automated ultra-filtration system |
| CN110938139A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-03-31 | 中国医科大学 | 一种用于法医溶血样本总IgE检测的中空纤维超滤方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 贾宇晴: "溶血对样本中含氮化合物、N 末端脑利钠肽前体死后生化学检测的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
| 高卫民等: "尿素氮、肌酐和尿酸死后生化学检测的法医学应用", 《中国法医学杂志》 * |
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