CN111518767A - 一种胆道肿瘤血清中ctc特异性分选及鉴定检测的方法 - Google Patents

一种胆道肿瘤血清中ctc特异性分选及鉴定检测的方法 Download PDF

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CN111518767A CN202010162771.6A CN202010162771A CN111518767A CN 111518767 A CN111518767 A CN 111518767A CN 202010162771 A CN202010162771 A CN 202010162771A CN 111518767 A CN111518767 A CN 111518767A
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Abstract

本发明提供了一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，取来自胆道肿瘤患者的外周血适量置于抗凝离心管中并混匀全血标本；对采集的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的样品处理；采用HSPG抗体或SDC1亚型抗体或SDC2亚型抗体或GPC1亚型抗体或GPC3亚型抗体结合免疫磁珠捕获HSPG阳性或SDC1阳性或SDC2阳性或GPC1阳性或GPC3阳性的CTC。本发明将HSPG作为胆囊癌以及胆管癌相对特异的CTC分选的功能性肿瘤分子标记，从而提高胆道肿瘤CTC的分选效率，建立一套基于HSPG的CTC分子分型评分体系，获得用于胆道肿瘤高特异度、高敏感度的检测方法，基于高效分选的胆道肿瘤CTC进行下游RNA‑seq、基因NGS检测，获得肿瘤特异性分子信息用于提高特异度。

Description

一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选及鉴定检测的方法
技术领域
本发明涉及生物与医学检测技术领域，尤其涉及到一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选及鉴定检测的方法。
背景技术
人外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)是指从肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。由于超过90％的癌症死亡是由转移造成的，而CTC是肿瘤转移的直接来源，因此从血液中分离CTC并对其进行分子检测越来越引起人们的重视。
目前CTC的检测已从简单的细胞计数，扩展到下游簇分析、分子分型、基因、转录和蛋白层面检测的各个方向，在乳癌、结直肠癌、***癌、肺癌已进入临床实用，但在胆道癌的诊治上仍有大量的空白。在精准医学时代，血液标志物检测因具有如下的特点及优势，对于肿瘤相关的基因突变检测方法提供了新思路，1.取样简单，可提高随访率；2.可多次检测随访观察，可增加恶性肿瘤检出率；3.无放射性及创伤性损害，可降低并发症的发生率；4.可用于治疗后的复发耐药监测，提高治疗的效率。5.降低检查成本，减轻政府和患者的经济压力，有很高的经济效益比。
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparan sulfate proteoglycan，HSPG)是由硫酸乙酰肝素链结合在核心蛋白上的一组糖蛋白，在细胞表面和细胞外基质中均有分布，基质HSPG主要与细胞浸润和迁徙有关；胞膜HSPG主要包括Syndecan和Glypican，功能涉及：作为生长因子的共同受体调节信号转导，与粘附分子共同调节细胞迁移，结合调节胞外基质金属蛋白酶活性等。在肿瘤发生与进展时，HSPG的含量、组分和功能出现异常，膜HSPG可与多种生长因子(如FGF、PDGF、EGF、HGF、IGF等)结合，激活相关通路。HSPG总体表达在胆道癌中少有研究，我们已获得的结果包括：对527例胆囊癌组织标本的研究发现，总HSPG主要表达于胆囊癌细胞表面，总HSPG表达阳性率为77.0％(406/527)。在低分化腺癌中HSPG含量升高，细胞分化程度低、伴有局部转移、临床分期晚期的GBC组织中HSPG硫酸化水平升高，硫酸化HSPG阳性患者化疗反应性更差，生存期更短。
循环肿瘤细胞与组织相比，可以实现无创检测，而与血浆中游离的大分子相比，又具有无可比拟的稳定性，因此，具有很大的优势和潜力。本发明将HSPG作为胆囊癌以及胆管癌相对特异的CTC分选的功能性肿瘤分子标记，从而提高胆道肿瘤CTC的分选效率，建立一套基于HSPG的CTC分子分型评分体系，获得用于胆道肿瘤高特异度、高敏感度的检测方法，基于高效分选的胆道肿瘤CTC进行下游RNA-seq、基因NGS检测，获得肿瘤特异性分子信息用于提高特异度。
发明内容
本发明的目的是提供一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选及鉴定检测的方法，将HSPG作为胆囊癌以及胆管癌相对特异的CTC分选的功能性肿瘤分子标记，从而提高胆道肿瘤CTC的分选效率，建立一套基于HSPG的CTC分子分型评分体系，获得用于胆道肿瘤高特异度、高敏感度的检测方法，基于高效分选的胆道肿瘤CTC进行下游RNA-seq、基因NGS检测，获得肿瘤特异性分子信息用于提高特异度。
本发明采用的技术方案如下：一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，包括如下步骤：
(1)取样：取来自胆道肿瘤患者的外周血适量置于抗凝离心管中并混匀全血标本；
(2)对步骤(1)中采集的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的样品处理；
(3)洗涤磁微粒：吸取适量免疫磁微粒混悬液至于EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清液，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；
(4)抗体孵育：将一定量的免疫磁微粒缓慢加入步骤(2)中处理好的样本中颠倒混匀，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动30min，每10min混匀一次；
(5)富集CTC：将步骤(4)中的处理好的样品转移至新的离心管中，将离心管靠于磁力架上静置，此时捕获CTC的磁珠会吸附在磁力架的一侧，倒置一下磁力架和离心管，实现清洗离心管盖上的样本；
(6)静置10min后，吸弃澄清液，随后加入适量的dd H2O清洗磁球；
(7)加入CF1固定液进行涂片，并在37℃的条件下烘干；
(8)滴加4％多聚甲醛固定8min，然后在装有2×SSC缓冲液的37℃的水浴锅中预热10min；
(9)分别选用75％、85％和无水乙醇进行脱水，分别进行2min，并在室温下风干；
(10)加入10μL荧光探针并封片，随后置于杂交仪中在76℃下杂交10min，并在37℃下杂交1.5h；
(11)用镊子撕去封片胶，放入43℃的甲酰胺中，脱落盖玻片，浸洗10min，然后再采用2×SSC缓冲液浸洗15min，且每5min摇晃一次；
(12)在样本区涂100μL的CK荧光抗体染色液，并在37℃的湿盒避光条件下孵育1h；
(13)洗弃CK荧光抗体染色液，用0.2％BSA洗两次后，加10μLDAPI盖片读片。
优选的，所述步骤(2)中血样处理过程的去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞过程具体为：
S1：去除血浆蛋白及血浆核酸，将采集的血样加入缓冲液，离心去除上清液，随后轻摇离心管，混匀沉淀细胞；
S2：去除红细胞：混匀沉淀细胞后，加入裂解液，将抗凝离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清液，轻摇抗凝离心管，混匀沉淀细胞后补加缓冲液；
S3：分层离心：于新的抗凝离心管中加入分层液，将S2中的抗凝离心管中的物质叠加到该分层液上层，然后用缓冲液清洗S2中的抗凝离心管管壁，并将清洗液同时转移至分层液顶层，随后进行离心处理；
S4：去除白细胞：S3中的抗凝离心管离心处理后可见三层溶液，轻柔的吸取最上的2层溶液于新的离心管内，并加入缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清液，随后加入缓冲液，混匀沉淀细胞。
优选的，所述步骤(3)中的免疫磁微粒为已结合HSPG抗体、SDC1亚型抗体、SDC2亚型抗体、GPC1亚型抗体、GPC3亚型抗体中的一种。
优选的，所述已结合HSPG抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、HSPG。
优选的，所述已结合SDC1亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC1。
优选的，所述已结合SDC2亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC2。
优选的，所述已结合GPC1亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、GPC1。
优选的，所述已结合GPC3亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、GPC3。
优选的，所述步骤(4)中具体为取10μL的免疫磁微粒至于7.5mL的样品中颠倒混匀。
一种胆道肿瘤血清中CTC的鉴定检测方法，采用QIAGEN试剂盒进行基于循环肿瘤细胞的DNA提取的方法，具体步骤如下：
(a)取10ml步骤(2)中处理后的血样并加入2.5倍体积的Solution A，颠倒混匀，在8000rpm下离心5分钟后弃掉上清液，并重复1-2次上述步骤；
(b)按照QIAGEN试剂盒附表提供的信息配制Solution B与Solution C的混合液；
(c)加入5ml Solution B与Solution C的混合液，用一次性塑料吸管吹打均匀，60℃的水浴或孵箱中孵育10分钟，孵育期间颠倒混匀一次，溶液由红色变为黄绿色或棕色；
(d)加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀至出现丝状或絮状DNA；
(e)用移液器将絮状物移到加有800μL、75％酒精的1.5ml EP管中，颠倒数次，然后在12000prm下离心1分钟，弃掉上清液，室温下干燥10～15分钟；
(f)加入1000μL Elution buffer，60℃孵育10～15分钟或过夜溶解DNA，用移液器或一次性塑料吸管吹打均匀，-20℃保存DNA；
(g)采用高通量测序法进行胆道肿瘤血液循环肿瘤细胞来源的DNA突变检测。
本发明的优点在于：本发明采用抗原抗体结合的阳性捕获法，通过免疫磁珠进行CTC的分离富集。采用HSPG抗体或SDC1亚型抗体或SDC2亚型抗体或GPC1亚型抗体或GPC3亚型抗体结合免疫磁珠捕获HSPG阳性或SDC1阳性或SDC2阳性或GPC1阳性或GPC3阳性的CTC，将HSPG作为胆囊癌以及胆管癌相对特异的CTC分选的功能性肿瘤分子标记，从而提高胆道肿瘤CTC的分选效率，建立一套基于HSPG的CTC分子分型评分体系，获得用于胆道肿瘤高特异度、高敏感度的检测方法，基于高效分选的胆道肿瘤CTC进行下游RNA-seq、基因NGS检测，获得肿瘤特异性分子信息用于提高特异度，通过特异性的分选抗体在血液中捕获肿瘤细胞，进而获悉释放的DNA携带的遗传信息的蛛丝马迹并加以检测分析，实现利用无创的液体活检方式及时检测DNA的分析方法。
附图说明
图1为本发明免疫脂质磁微粒的形成过程的示意图。
图2为本发明免疫脂质磁微粒分选鉴定CTC的流程图。
具体实施方式
下面对本发明一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选及鉴定检测的方法作进一步详细描述。
实施例1
一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，包括如下步骤：
(1)取样：取来自胆道肿瘤患者的外周血适量置于抗凝离心管中并混匀全血标本；
(2)对步骤(1)中采集的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的样品处理，具体为：
S1：去除血浆蛋白及血浆核酸，将采集的血样加入缓冲液，离心去除上清液，随后轻摇离心管，混匀沉淀细胞；
S2：去除红细胞：混匀沉淀细胞后，加入裂解液，将抗凝离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清液，轻摇抗凝离心管，混匀沉淀细胞后补加缓冲液；
S3：分层离心：于新的抗凝离心管中加入分层液，将S2中的抗凝离心管中的物质叠加到该分层液上层，然后用缓冲液清洗S2中的抗凝离心管管壁，并将清洗液同时转移至分层液顶层，随后进行离心处理；
S4：去除白细胞：S3中的抗凝离心管离心处理后可见三层溶液，轻柔的吸取最上的2层溶液于新的离心管内，并加入缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清液，随后加入缓冲液，混匀沉淀细胞；
(3)洗涤磁微粒：吸取适量免疫磁微粒即已结合HSPG抗体混悬液至于EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清液，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；
其中，所述已结合HSPG抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、HSPG；
(4)抗体孵育：将10μL的免疫磁微粒缓慢加入步骤(2)中处理好的7.5mL的样品中倒混匀，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动30min，每10min混匀一次；
(5)富集CTC：将步骤(4)中的处理好的样品转移至新的离心管中，将离心管靠于磁力架上静置，此时捕获CTC的磁珠会吸附在磁力架的一侧，倒置一下磁力架和离心管，实现清洗离心管盖上的样本；
(6)静置10min后，吸弃澄清液，随后加入1mL的ddH2O清洗磁球；
(7)加入100μLCF1固定液进行涂片，并在37℃的条件下烘干；
(8)滴加4％多聚甲醛固定8min，然后在装有2×SSC缓冲液的37℃的水浴锅中预热10min；
(9)分别选用75％、85％和无水乙醇进行脱水，分别进行2min，并在室温下风干；
(10)加入10μL荧光探针并封片，随后置于杂交仪中在76℃下杂交10min，并在37℃下杂交1.5h；
(11)用镊子撕去封片胶，放入43℃的甲酰胺中，脱落盖玻片，浸洗10min，然后再采用2×SSC缓冲液浸洗15min，且每5min摇晃一次；
(12)在样本区涂100μL的CK荧光抗体染色液，并在37℃的湿盒避光条件下孵育1h；
(13)洗弃CK荧光抗体染色液，用0.2％BSA洗两次后，加10μLDAPI盖片读片。
一种胆道肿瘤血清中CTC的鉴定检测方法，采用QIAGEN试剂盒进行基于循环肿瘤细胞的DNA提取的方法，具体步骤如下：
(a)取10ml步骤(2)中处理后的血样并加入2.5倍体积的Solution A，颠倒混匀，在8000rpm下离心5分钟后弃掉上清液，并重复1-2次上述步骤；
(b)按照QIAGEN试剂盒附表提供的信息配制Solution B与Solution C的混合液；
(c)加入5ml Solution B与Solution C的混合液，用一次性塑料吸管吹打均匀，60℃的水浴或孵箱中孵育10分钟，孵育期间颠倒混匀一次，溶液由红色变为黄绿色或棕色；
(d)加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀至出现丝状或絮状DNA；
(e)用移液器将絮状物移到加有800μL、75％酒精的1.5ml EP管中，颠倒数次，然后在12000prm下离心1分钟，弃掉上清液，室温下干燥10～15分钟；
(f)加入1000μL Elution buffer，60℃孵育10～15分钟或过夜溶解DNA，用移液器或一次性塑料吸管吹打均匀，-20℃保存DNA；
(g)采用高通量测序法进行胆道肿瘤血液循环肿瘤细胞来源的DNA突变检测。
实施例2
一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，包括如下步骤：
(1)取样：取来自胆道肿瘤患者的外周血适量置于抗凝离心管中并混匀全血标本；
(2)对步骤(1)中采集的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的样品处理，具体为：
S1：去除血浆蛋白及血浆核酸，将采集的血样加入缓冲液，离心去除上清液，随后轻摇离心管，混匀沉淀细胞；
S2：去除红细胞：混匀沉淀细胞后，加入裂解液，将抗凝离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清液，轻摇抗凝离心管，混匀沉淀细胞后补加缓冲液；
S3：分层离心：于新的抗凝离心管中加入分层液，将S2中的抗凝离心管中的物质叠加到该分层液上层，然后用缓冲液清洗S2中的抗凝离心管管壁，并将清洗液同时转移至分层液顶层，随后进行离心处理；
S4：去除白细胞：S3中的抗凝离心管离心处理后可见三层溶液，轻柔的吸取最上的2层溶液于新的离心管内，并加入缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清液，随后加入缓冲液，混匀沉淀细胞；
(3)洗涤磁微粒：吸取适量免疫磁微粒即已结合SDC1亚型抗体混悬液至于EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清液，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；
其中，所述已结合SDC1亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC1；
(4)抗体孵育：将10μL的免疫磁微粒缓慢加入步骤(2)中处理好的7.5mL的样品中倒混匀，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动30min，每10min混匀一次；
(5)富集CTC：将步骤(4)中的处理好的样品转移至新的离心管中，将离心管靠于磁力架上静置，此时捕获CTC的磁珠会吸附在磁力架的一侧，倒置一下磁力架和离心管，实现清洗离心管盖上的样本；
(6)静置10min后，吸弃澄清液，随后加入1mL的dd H2O清洗磁球；
(7)加入100μLCF1固定液进行涂片，并在37℃的条件下烘干；
(8)滴加4％多聚甲醛固定8min，然后在装有2×SSC缓冲液的37℃的水浴锅中预热10min；
(9)分别选用75％、85％和无水乙醇进行脱水，分别进行2min，并在室温下风干；
(10)加入10μL荧光探针并封片，随后置于杂交仪中在76℃下杂交10min，并在37℃下杂交1.5h；
(11)用镊子撕去封片胶，放入43℃的甲酰胺中，脱落盖玻片，浸洗10min，然后再采用2×SSC缓冲液浸洗15min，且每5min摇晃一次；
(12)在样本区涂100μL的CK荧光抗体染色液，并在37℃的湿盒避光条件下孵育1h；
(13)洗弃CK荧光抗体染色液，用0.2％BSA洗两次后，加10μLDAPI盖片读片。
一种胆道肿瘤血清中CTC的鉴定检测方法，采用QIAGEN试剂盒进行基于循环肿瘤细胞的DNA提取的方法，具体步骤如下：
(a)取10ml步骤(2)中处理后的血样并加入2.5倍体积的Solution A，颠倒混匀，在8000rpm下离心5分钟后弃掉上清液，并重复1-2次上述步骤；
(b)按照QIAGEN试剂盒附表提供的信息配制Solution B与Solution C的混合液；
(c)加入5ml Solution B与Solution C的混合液，用一次性塑料吸管吹打均匀，60℃的水浴或孵箱中孵育10分钟，孵育期间颠倒混匀一次，溶液由红色变为黄绿色或棕色；
(d)加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀至出现丝状或絮状DNA；
(e)用移液器将絮状物移到加有800μL、75％酒精的1.5ml EP管中，颠倒数次，然后在12000prm下离心1分钟，弃掉上清液，室温下干燥10～15分钟；
(f)加入1000μL Elution buffer，60℃孵育10～15分钟或过夜溶解DNA，用移液器或一次性塑料吸管吹打均匀，-20℃保存DNA；
(g)采用高通量测序法进行胆道肿瘤血液循环肿瘤细胞来源的DNA突变检测。
实施例3
一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，包括如下步骤：
(1)取样：取来自胆道肿瘤患者的外周血适量置于抗凝离心管中并混匀全血标本；
(2)对步骤(1)中采集的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的样品处理，具体为：
S1：去除血浆蛋白及血浆核酸，将采集的血样加入缓冲液，离心去除上清液，随后轻摇离心管，混匀沉淀细胞；
S2：去除红细胞：混匀沉淀细胞后，加入裂解液，将抗凝离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清液，轻摇抗凝离心管，混匀沉淀细胞后补加缓冲液；
S3：分层离心：于新的抗凝离心管中加入分层液，将S2中的抗凝离心管中的物质叠加到该分层液上层，然后用缓冲液清洗S2中的抗凝离心管管壁，并将清洗液同时转移至分层液顶层，随后进行离心处理；
S4：去除白细胞：S3中的抗凝离心管离心处理后可见三层溶液，轻柔的吸取最上的2层溶液于新的离心管内，并加入缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清液，随后加入缓冲液，混匀沉淀细胞；
(3)洗涤磁微粒：吸取适量免疫磁微粒即已结合SDC2亚型抗体混悬液至于EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清液，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；
其中，所述已结合SDC2亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC2；
(4)抗体孵育：将10μL的免疫磁微粒缓慢加入步骤(2)中处理好的7.5mL的样品中倒混匀，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动30min，每10min混匀一次；
(5)富集CTC：将步骤(4)中的处理好的样品转移至新的离心管中，将离心管靠于磁力架上静置，此时捕获CTC的磁珠会吸附在磁力架的一侧，倒置一下磁力架和离心管，实现清洗离心管盖上的样本；
(6)静置10min后，吸弃澄清液，随后加入1mL的ddH2O清洗磁球；
(7)加入100μLCF1固定液进行涂片，并在37℃的条件下烘干；
(8)滴加4％多聚甲醛固定8min，然后在装有2×SSC缓冲液的37℃的水浴锅中预热
10min；
(9)分别选用75％、85％和无水乙醇进行脱水，分别进行2min，并在室温下风干；
(10)加入10μL荧光探针并封片，随后置于杂交仪中在76℃下杂交10min，并在37℃
下杂交1.5h；
(11)用镊子撕去封片胶，放入43℃的甲酰胺中，脱落盖玻片，浸洗10min，然后再采用2×SSC缓冲液浸洗15min，且每5min摇晃一次；
(12)在样本区涂100μL的CK荧光抗体染色液，并在37℃的湿盒避光条件下孵育1h；
(13)洗弃CK荧光抗体染色液，用0.2％BSA洗两次后，加10μLDAPI盖片读片。
一种胆道肿瘤血清中CTC的鉴定检测方法，采用QIAGEN试剂盒进行基于循环肿瘤细胞的DNA提取的方法，具体步骤如下：
(a)取10ml步骤(2)中处理后的血样并加入2.5倍体积的Solution A，颠倒混匀，在8000rpm下离心5分钟后弃掉上清液，并重复1-2次上述步骤；
(b)按照QIAGEN试剂盒附表提供的信息配制Solution B与Solution C的混合液；
(c)加入5ml Solution B与Solution C的混合液，用一次性塑料吸管吹打均匀，60℃的水浴或孵箱中孵育10分钟，孵育期间颠倒混匀一次，溶液由红色变为黄绿色或棕色；
(d)加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀至出现丝状或絮状DNA；
(e)用移液器将絮状物移到加有800μL、75％酒精的1.5ml EP管中，颠倒数次，然后在12000prm下离心1分钟，弃掉上清液，室温下干燥10～15分钟；
(f)加入1000μL Elution buffer，60℃孵育10～15分钟或过夜溶解DNA，用移液器或一次性塑料吸管吹打均匀，-20℃保存DNA；
(g)采用高通量测序法进行胆道肿瘤血液循环肿瘤细胞来源的DNA突变检测。
实施例4
一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，包括如下步骤：
(1)取样：取来自胆道肿瘤患者的外周血适量置于抗凝离心管中并混匀全血标本；
(2)对步骤(1)中采集的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的样品处理，具体为：
S1：去除血浆蛋白及血浆核酸，将采集的血样加入缓冲液，离心去除上清液，随后轻摇离心管，混匀沉淀细胞；
S2：去除红细胞：混匀沉淀细胞后，加入裂解液，将抗凝离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清液，轻摇抗凝离心管，混匀沉淀细胞后补加缓冲液；
S3：分层离心：于新的抗凝离心管中加入分层液，将S2中的抗凝离心管中的物质叠加到该分层液上层，然后用缓冲液清洗S2中的抗凝离心管管壁，并将清洗液同时转移至分层液顶层，随后进行离心处理；
S4：去除白细胞：S3中的抗凝离心管离心处理后可见三层溶液，轻柔的吸取最上的2层溶液于新的离心管内，并加入缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清液，随后加入缓冲液，混匀沉淀细胞；
(3)洗涤磁微粒：吸取适量免疫磁微粒即已结合GPC1亚型抗体混悬液至于EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清液，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；
其中，所述已结合GPC1亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、GPC1；
(4)抗体孵育：将10μL的免疫磁微粒缓慢加入步骤(2)中处理好的7.5mL的样品中倒混匀，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动30min，每10min混匀一次；
(5)富集CTC：将步骤(4)中的处理好的样品转移至新的离心管中，将离心管靠于磁力架上静置，此时捕获CTC的磁珠会吸附在磁力架的一侧，倒置一下磁力架和离心管，实现清洗离心管盖上的样本；
(6)静置10min后，吸弃澄清液，随后加入1mL的ddH2O清洗磁球；
(7)加入100μLCF1固定液进行涂片，并在37℃的条件下烘干；
(8)滴加4％多聚甲醛固定8min，然后在装有2×SSC缓冲液的37℃的水浴锅中预热10min；
(9)分别选用75％、85％和无水乙醇进行脱水，分别进行2min，并在室温下风干；
(10)加入10μL荧光探针并封片，随后置于杂交仪中在76℃下杂交10min，并在37℃下杂交1.5h；
(11)用镊子撕去封片胶，放入43℃的甲酰胺中，脱落盖玻片，浸洗10min，然后再采用2×SSC缓冲液浸洗15min，且每5min摇晃一次；
(12)在样本区涂100μL的CK荧光抗体染色液，并在37℃的湿盒避光条件下孵育1h；
(13)洗弃CK荧光抗体染色液，用0.2％BSA洗两次后，加10μLDAPI盖片读片。
一种胆道肿瘤血清中CTC的鉴定检测方法，采用QIAGEN试剂盒进行基于循环肿瘤细胞的DNA提取的方法，具体步骤如下：
(a)取10ml步骤(2)中处理后的血样并加入2.5倍体积的Solution A，颠倒混匀，在8000rpm下离心5分钟后弃掉上清液，并重复1-2次上述步骤；
(b)按照QIAGEN试剂盒附表提供的信息配制Solution B与Solution C的混合液；
(c)加入5ml Solution B与Solution C的混合液，用一次性塑料吸管吹打均匀，60℃的水浴或孵箱中孵育10分钟，孵育期间颠倒混匀一次，溶液由红色变为黄绿色或棕色；
(d)加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀至出现丝状或絮状DNA；
(e)用移液器将絮状物移到加有800μL、75％酒精的1.5ml EP管中，颠倒数次，然后在12000prm下离心1分钟，弃掉上清液，室温下干燥10～15分钟；
(f)加入1000μL Elution buffer，60℃孵育10～15分钟或过夜溶解DNA，用移液器或一次性塑料吸管吹打均匀，-20℃保存DNA；
(g)采用高通量测序法进行胆道肿瘤血液循环肿瘤细胞来源的DNA突变检测。
实施例5
一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，包括如下步骤：
(1)取样：取来自胆道肿瘤患者的外周血适量置于抗凝离心管中并混匀全血标本；
(2)对步骤(1)中采集的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的样品处理，具体为：
S1：去除血浆蛋白及血浆核酸，将采集的血样加入缓冲液，离心去除上清液，随后轻摇离心管，混匀沉淀细胞；
S2：去除红细胞：混匀沉淀细胞后，加入裂解液，将抗凝离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清液，轻摇抗凝离心管，混匀沉淀细胞后补加缓冲液；
S3：分层离心：于新的抗凝离心管中加入分层液，将S2中的抗凝离心管中的物质叠加到该分层液上层，然后用缓冲液清洗S2中的抗凝离心管管壁，并将清洗液同时转移至分层液顶层，随后进行离心处理；
S4：去除白细胞：S3中的抗凝离心管离心处理后可见三层溶液，轻柔的吸取最上的2层溶液于新的离心管内，并加入缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清液，随后加入缓冲液，混匀沉淀细胞；
(3)洗涤磁微粒：吸取适量免疫磁微粒即已结合GPC3亚型抗体混悬液至于EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清液，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；
其中，所述已结合GPC3亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、GPC3；
(4)抗体孵育：将10μL的免疫磁微粒缓慢加入步骤(2)中处理好的7.5mL的样品中倒混匀，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动30min，每10min混匀一次；
(5)富集CTC：将步骤(4)中的处理好的样品转移至新的离心管中，将离心管靠于磁力架上静置，此时捕获CTC的磁珠会吸附在磁力架的一侧，倒置一下磁力架和离心管，实现清洗离心管盖上的样本；
(6)静置10min后，吸弃澄清液，随后加入1mL的ddH2O清洗磁球；
(7)加入100μLCF1固定液进行涂片，并在37℃的条件下烘干；
(8)滴加4％多聚甲醛固定8min，然后在装有2×SSC缓冲液的37℃的水浴锅中预热
10min；
(9)分别选用75％、85％和无水乙醇进行脱水，分别进行2min，并在室温下风干；
(10)加入10μL荧光探针并封片，随后置于杂交仪中在76℃下杂交10min，并在37℃
下杂交1.5h；
(11)用镊子撕去封片胶，放入43℃的甲酰胺中，脱落盖玻片，浸洗10min，然后再采用2×SSC缓冲液浸洗15min，且每5min摇晃一次；
(12)在样本区涂100μL的CK荧光抗体染色液，并在37℃的湿盒避光条件下孵育1h；
(13)洗弃CK荧光抗体染色液，用0.2％BSA洗两次后，加10μLDAPI盖片读片。
一种胆道肿瘤血清中CTC的鉴定检测方法，采用QIAGEN试剂盒进行基于循环肿瘤细胞的DNA提取的方法，具体步骤如下：
(a)取10ml步骤(2)中处理后的血样并加入2.5倍体积的Solution A，颠倒混匀，在8000rpm下离心5分钟后弃掉上清液，并重复1-2次上述步骤；
(b)按照QIAGEN试剂盒附表提供的信息配制Solution B与Solution C的混合液；
(c)加入5ml Solution B与Solution C的混合液，用一次性塑料吸管吹打均匀，60℃的水浴或孵箱中孵育10分钟，孵育期间颠倒混匀一次，溶液由红色变为黄绿色或棕色；
(d)加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀至出现丝状或絮状DNA；
(e)用移液器将絮状物移到加有800μL、75％酒精的1.5ml EP管中，颠倒数次，然后在12000prm下离心1分钟，弃掉上清液，室温下干燥10～15分钟；
(f)加入1000μL Elution buffer，60℃孵育10～15分钟或过夜溶解DNA，用移液器或一次性塑料吸管吹打均匀，-20℃保存DNA；
(g)采用高通量测序法进行胆道肿瘤血液循环肿瘤细胞来源的DNA突变检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取样：取来自胆道肿瘤患者的外周血适量置于抗凝离心管中并混匀全血标本；
(2)对步骤(1)中采集的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的样品处理；
(3)洗涤磁微粒：吸取适量免疫磁微粒混悬液至于EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清液，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；
(4)抗体孵育：将一定量的免疫磁微粒缓慢加入步骤(2)中处理好的样本中颠倒混匀，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动30min，每10min混匀一次；
(5)富集CTC：将步骤(4)中的处理好的样品转移至新的离心管中，将离心管靠于磁力架上静置，此时捕获CTC的磁珠会吸附在磁力架的一侧，倒置一下磁力架和离心管，实现清洗离心管盖上的样本；
(6)静置10min后，吸弃澄清液，随后加入适量的dd H2O清洗磁球；
(7)加入CF1固定液进行涂片，并在37℃的条件下烘干；
(8)滴加4％多聚甲醛固定8min，然后在装有2×SSC缓冲液的37℃的水浴锅中预热10min；
(9)分别选用75％、85％和无水乙醇进行脱水，分别进行2min，并在室温下风干；
(10)加入10μL荧光探针并封片，随后置于杂交仪中在76℃下杂交10min，并在37℃下杂交1.5h；
(11)用镊子撕去封片胶，放入43℃的甲酰胺中，脱落盖玻片，浸洗10min，然后再采用2×SSC缓冲液浸洗15min，且每5min摇晃一次；
(12)在样本区涂100μL的CK荧光抗体染色液，并在37℃的湿盒避光条件下孵育1h；
(13)洗弃CK荧光抗体染色液，用0.2％BSA洗两次后，加10μLDAPI盖片读片。
2.根据权利要求1所述的一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，其特征在于：所述步骤(2)中血样处理过程的去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞过程具体为：
S1：去除血浆蛋白及血浆核酸，将采集的血样加入缓冲液，离心去除上清液，随后轻摇离心管，混匀沉淀细胞；
S2：去除红细胞：混匀沉淀细胞后，加入裂解液，将抗凝离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清液，轻摇抗凝离心管，混匀沉淀细胞后补加缓冲液；
S3：分层离心：于新的抗凝离心管中加入分层液，将S2中的抗凝离心管中的物质叠加到该分层液上层，然后用缓冲液清洗S2中的抗凝离心管管壁，并将清洗液同时转移至分层液顶层，随后进行离心处理；
S4：去除白细胞：S3中的抗凝离心管离心处理后可见三层溶液，轻柔的吸取最上的2层溶液于新的离心管内，并加入缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清液，随后加入缓冲液，混匀沉淀细胞。
3.根据权利要求1所述的一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的免疫磁微粒为已结合HSPG抗体、SDC1亚型抗体、SDC2亚型抗体、GPC1亚型抗体、GPC3亚型抗体中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，其特征在于：所述已结合HSPG抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、HSPG。
5.根据权利要求3所述的一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，其特征在于：所述已结合SDC1亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC1。
6.根据权利要求3所述的一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，其特征在于：所述已结合SDC2亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC2。
7.根据权利要求3所述的一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，其特征在于：所述已结合GPC1亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、GPC1。
8.根据权利要求3所述的一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，其特征在于：所述已结合GPC3亚型抗体的免疫磁微粒由如下成分组成：氧化铁纳米颗粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、GPC3。
9.根据权利要求1所述的一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，其特征在于：所述步骤(4)中具体为取10μL的免疫磁微粒至于7.5mL的样品中颠倒混匀。
10.一种胆道肿瘤血清中CTC的鉴定检测方法，其特征在于：采用QIAGEN试剂盒进行基于循环肿瘤细胞的DNA提取的方法，具体步骤如下：
(a)取10ml步骤(2)中处理后的血样并加入2.5倍体积的SolutionA，颠倒混匀，在8000rpm下离心5分钟后弃掉上清液，并重复1-2次上述步骤；
(b)按照QIAGEN试剂盒附表提供的信息配制Solution B与Solution C的混合液；
(c)加入5ml Solution B与Solution C的混合液，用一次性塑料吸管吹打均匀，60℃的水浴或孵箱中孵育10分钟，孵育期间颠倒混匀一次，溶液由红色变为黄绿色或棕色；
(d)加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀至出现丝状或絮状DNA；
(e)用移液器将絮状物移到加有800μL、75％酒精的1.5ml EP管中，颠倒数次，然后在12000prm下离心1分钟，弃掉上清液，室温下干燥10～15分钟；
(f)加入1000μL Elutionbuffer，60℃孵育10～15分钟或过夜溶解DNA，用移液器或一次性塑料吸管吹打均匀，-20℃保存DNA；
(g)采用高通量测序法进行胆道肿瘤血液循环肿瘤细胞来源的DNA突变检测。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113143328A (zh) * 2020-12-22 2021-07-23 上海市闵行区中心医院 无创胃脱落细胞与核酸取样***及其使用方法
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