CN111518726B - 一株铜绿假单胞菌及其筛选方法和应用 - Google Patents

一株铜绿假单胞菌及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

一株铜绿假单胞菌及其筛选方法和应用，所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的菌株号为LYT‑4，于2018年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15519；所述筛选方法为：（1）将自然堆积发酵的植物粕加水搅拌均匀，静置；（2）梯度稀释，涂布接种，恒温培养；（3）将长出的菌落挑出，反复划线接种，筛选产氨基态氮含量高的菌株，16SrDNA鉴定为铜绿假单胞菌。将所述铜绿假单胞菌应用于植物粕蛋白发酵或拮抗植物病原真菌。本发明方法方便、快捷，筛选菌株纯度高。本发明应用操作简便，成本低，适宜于农业化生产。

Description

一株铜绿假单胞菌及其筛选方法和应用
技术领域
本发明具体涉及一株铜绿假单胞菌及其筛选方法和应用。
背景技术
饼粕是榨取植物油后所留下的植物残渣，其蛋白质含量虽高，但由于难以利用，大多丢弃。比如，油桐饼粕（桐粕）是油桐籽经榨取桐油后剩余的主要副产品，其蛋白质含量可达36～45%，从中提取的氨基酸含量和必须氨基酸含量分别可达93.8%和45.4%，是一种可供开发利用的优良植物蛋白质资源。除了高含量的蛋白质，桐粕中还含有1～3%的磷与1～2%的钾等植物所需的微量元素，是一种可开发利用的理想植物肥料基质。虽然我国桐油产量居世界首位，桐粕年产量达50万吨，但目前对于桐粕资源的利用率不足20%，大部分被丢弃，不但没有发挥其资源本身应用价值，还有可能成为新的污染源。随着全球绿色农林业可持续发展潮流的兴起，立足我国当前化肥农药零增长的战略需求，利用相关功能微生物将桐粕发酵成高附加值的氨基酸有机肥料是目前极具前景的桐粕利用方式。目前鲜有关于铜绿假单胞菌蛋白发酵特别是桐粕中粗蛋白的报道。
拮抗植物病原真菌是保证农作物高产的关键因素。由于滥用农药不符合人们对绿色食品的普遍追求，因此，微生物杀菌剂是抑制植物病虫害的天然选择。
CN109439561A公开了一株铜绿假单胞菌及其应用，所述铜绿假单胞菌对包括甘蓝黑斑病菌、甘蔗凤梨病菌、金橘沙皮病菌、水稻胡麻叶斑病菌及亚麻立枯病菌等显示出了较强的拮抗性能，但是，并没有对亚麻炭疽病菌（Colletotrichum lini）及尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）等的拮抗性能进行实验，更没有对该菌应用于植物粕发酵进行研究。
CN110616179 A公开了一株铜绿假单胞菌DGNK-JL2及其应用，所述铜绿假单胞菌显示出了较好的解磷效果，但是，并没有研究其发酵植物粕的能力；所述铜绿假单胞菌对病源真菌辣椒炭疽病与苦瓜枯萎病有一定的拮抗作用，但是并没有提及抑菌率多少，且没有对亚麻炭疽病菌（Colletotrichum lini）、亚麻炭疽病菌（Colletotrichum lini）及尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）进行拮抗性能研究。
目前鲜有关于兼具桐粕粗蛋白发酵和拮抗植物病原真菌能力的微生物资源报道，对于这种具有双重功能的菌株资源的筛选与开发，不仅有助于高值化利用高蛋白植物粕资源，提升植物油加工产业的经济活力，将其开发成兼具供肥和防治功能的饼粕基有机肥还能在一定程度上规避作物对化学肥料和农药的依赖。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株兼具植物粕蛋白发酵以及拮抗植物病原真菌功能的铜绿假单胞菌。
本发明进一步所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种方便、快捷，筛选菌株纯度高的铜绿假单胞菌的筛选方法。
本发明更进一步所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种植物粕蛋白发酵的氨基酸转化率高，拮抗植物病原真菌效果明显，操作简便，成本低，适宜于农业化生产的铜绿假单胞菌的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一株铜绿假单胞菌，所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的菌株号为LYT-4，于2018年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 15519。所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4的16S rDNA（GenBank: MF967440.1）的序列如SEQ IDNO:1所示。
所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4的菌体形状呈杆状，菌体平均大小为0.5μm×1.5μm～1μm×4μm，革兰氏染色为阴性，具端鞭毛，无荧光特性；在NA培养基上的菌落呈黄绿色润泽，扁平湿润，边缘不整齐，表面光滑。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种铜绿假单胞菌的筛选方法，包括以下步骤：
（1）将自然堆积发酵的植物粕加入无菌水中，搅拌均匀后，静置，得菌种原液；
（2）将步骤（1）所得菌种原液经梯度稀释后，涂布接种于NA培养基上，恒温培养；
（3）将步骤（2）NA培养基上长出的菌落挑出，反复划线接种至新的NA培养基上，筛选产氨基态氮含量高的菌株，16SrDNA鉴定为铜绿假单胞菌。
优选地，步骤（1）中，所述自然堆积发酵的植物粕的发酵条件为室外自然堆积。
优选地，步骤（1）中，所述植物粕中的蛋白质含量为36～45%。
优选地，步骤（1）中，所述植物粕为桐粕等。
优选地，步骤（1）中，所述植物粕与无菌水的质量体积比（g/mL）为1:8～10。
优选地，步骤（1）中，所述搅拌的时间为10～30 min。
优选地，步骤（1）中，所述静置的时间为25～35min。
优选地，步骤（2）中，所述梯度稀释的倍数为10-8～10-9。
优选地，步骤（2）中，所述恒温培养的温度为25～35℃，时间为30～40h。
优选地，步骤（2）、（3）中，所述NA培养基的配方为：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，琼脂15.0 g/L，pH 7.0～7.2。
优选地，步骤（3）中，所述反复划线接种的次数为3～4次。
步骤（3）中，结合菌落形态特征、生理生化特征和基于16S rDNA基因序列的***分析结果，鉴定筛选产氨基态氮含量高的菌株为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。
本发明更进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种铜绿假单胞菌的应用，将所述铜绿假单胞菌应用于植物粕蛋白发酵或拮抗植物病原真菌。本发明铜绿假单胞菌能分泌高活性蛋白酶将植物粕中的粗蛋白分解成氨基酸，通过检测氨基态氮含量来衡量产生氨基酸的含量变化，产生的氨基酸来自于粗蛋白的降解；此外，铜绿假单胞菌还可以分泌嗜铁素、吩嗪类、藤黄绿脓菌素等多种具有抑菌效果的次级代谢产物，通过这些次级代谢产物来拮抗病原真菌。
优选地，所述植物粕中的蛋白质含量为36～45%。
优选地，所述植物粕为桐粕等。
优选地，所述植物粕蛋白发酵的具体操作为：将所述铜绿假单胞菌的种子液接种至植物粕固体发酵培养基中，混合均匀后，发酵，得发酵产物。在发酵过程中，铜绿假单胞菌株利用植物粕为碳源和能源物质生长，且其分泌的蛋白酶能降解植物粕中的粗蛋白，生成氨基酸小分子。
优选地，所述种子液与植物粕接种的体积质量比（mL/g）为8～12:100。接种体积过小或过大可能会影响粗蛋白降解效果。
优选地，所述固体发酵培养基由植物粕和无机盐溶液以质量体积比（g/mL）为2.5～3.5:1组成。所述发酵为固态发酵，植物粕同时作为碳源，无机盐溶液使得植物粕的含水量达到50%以上。
优选地，所述无机盐溶液的配方为：(NH4)2SO4 1.5～2.5g/L，K2HPO4 1.5～2.5g/L，KH2PO4 1.5～2.5g/L，MgSO4 0.15～0.25g/L，CaCl2 0.05～0.15g/L，MnSO4 0.015～0.025g/L，FeSO4 0.045～0.055g/L，pH 7.0～7.2。所述配方中的无机盐离子能提供菌株生长所需的微量元素。
优选地，所述发酵的温度为25～35℃，相对湿度为70～80%，时间为5～6天。所述发酵条件更有利于菌株的生长、产蛋白酶和降解植物粕中的粗蛋白。
优选地，所述植物病原真菌为亚麻炭疽病菌（Colletotrichum lini）、亚麻立枯病菌（Rhizoctonia solani）或尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）等中的一种或几种。铜绿假单胞菌可以分泌嗜铁素、吩嗪类、藤黄绿脓菌素等多种具有抑菌效果的次级代谢产物，通过这些次级代谢产物来拮抗病原真菌。
优选地，所述拮抗植物病原真菌的具体操作为：将所述铜绿假单胞菌的种子液接种至生长了所述植物病原真菌的PDA培养基上，倒置培养，即成。
优选地，所述铜绿假单胞菌的种子液的接种量为80～120μL。
优选地，所述接种的位置为距平板中央十字交叉点2～3 cm处。优选接种的位置之间为等距离。
优选地，所述倒置培养的温度为20～30℃，时间为4～6天。
优选地，生长了所述植物病原真菌的PDA培养基的制备方法为：将所述植物病原真菌接种至PDA培养基中央，在20～30℃下，倒置培养20～30h至菌丝长出。
优选地，所述PDA培养基的配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L。
优选地，所述种子液的浓度为3.0×106～3.0×108cfu/mL。
优选地，所述种子液是将所述铜绿假单胞菌接种至NB液体培养基中，培养至对数期所得。
优选地，所述NB液体培养基的配方为：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，pH 7.2～7.5。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4发酵桐粕后的蛋白酶活可高达2.18 U/mL，相当于自然发酵最大酶活值的1.7倍，发酵5天后释放出的氨基态氮含量可高达37.3 mg/mL，相当于自然发酵的1.4倍，发酵6天后桐粕中的氨基酸含量有显著性的提高，并高于自然发酵；且铜绿假单胞菌LYT-4能有效拮抗亚麻炭疽病菌（Colletotrichum lini）、亚麻立枯病菌（Rhizoctonia solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）等植物病原真菌；说明本发明筛选出的铜绿假单胞菌LYT-4，兼具植物粕蛋白发酵以及拮抗植物病原真菌功能，属于优良的微生物资源，具有作为生防菌开发的潜能；
（2）本发明筛选方法方便、快捷，筛选菌株纯度高；
（3）本发明铜绿假单胞菌LYT-4应用广泛，蛋白发酵的氨基酸转化率高，拮抗植物病原真菌效果明显，可将植物粕转化成高附加值的具有生防功能的氨基酸有机肥，操作简便，成本低，适宜于农业化生产。
生物材料保藏信息说明：生物材料的分类命名：铜绿假单胞菌；生物材料的拉丁文学名：Pseudomonas aeruginosa；保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2018年3月26日；保藏编号：CGMCC No. 15519。
附图说明
图1是本发明铜绿假单胞菌LYT-4在NA培养基上的菌落形态图；
图2是本发明铜绿假单胞菌LYT-4基于16S rDNA序列的***发育树图；
图3是本发明铜绿假单胞菌LYT-4发酵与自然发酵桐粕过程中蛋白酶活性的变化对比图；
图4是本发明铜绿假单胞菌LYT-4发酵与自然发酵桐粕过程中氨基态氮含量的变化对比图；
图5是本发明铜绿假单胞菌LYT-4发酵与自然发酵后及未发酵桐粕中的氨基酸含量的对比图；
图6是本发明铜绿假单胞菌LYT-4与亚麻炭疽病菌（Colletotrichum lini）、亚麻立枯病菌（Rhizoctonia solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的平板对峙图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的桐粕购于湖南郴州国盛生物能源股份有限公司，蛋白质含量为41%；所使用的自然堆积发酵的桐粕的发酵条件为室外自然堆积；所使用的NA培养基的配方为：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，琼脂15.0 g/L，pH 7.2；所使用的NB液体培养基的配方为：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.2；所使用的亚麻炭疽病菌（Colletotrichum lini）、亚麻立枯病菌（Rhizoctonia solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）购于中国农业科学院麻类研究所；所使用的PDA培养基的配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L；本发明实施例所使用的原料、菌种和化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
一株铜绿假单胞菌及其筛选方法实施例
一种铜绿假单胞菌的筛选方法，包括以下步骤：
（1）将10g自然堆积发酵的桐粕加入90mL无菌水中，搅拌20min至均匀后，静置30min，得菌种原液；
（2）将步骤（1）所得菌种原液经10-8倍梯度稀释后，涂布接种于NA培养基上，在30℃下，恒温培养36h；
（3）将步骤（2）NA培养基上长出的菌落挑出，反复划线接种4次至新的NA培养基上，筛选产氨基态氮含量高的菌株，16SrDNA鉴定为铜绿假单胞菌。
将所得铜绿假单胞菌进行菌落形态特征分析、生理生化实验和16SrDNA序列分析。
a、菌落形态特征分析：
将本发明实施例铜绿假单胞菌菌株单菌落划线接种至NA培养基上，然后将NA培养基倒置于30℃的恒温培养箱中，培养18h，观察长出的菌落形态。
经检测，本发明实施例铜绿假单胞菌菌体形状呈杆状，菌体平均大小为0.5μm×1.5μm～1μm×4μm，革兰氏染色为阴性，具端鞭毛，无荧光特性；如图1所示，本发明实施例铜绿假单胞菌在NA培养基上的菌落呈黄绿色润泽，扁平湿润，边缘不整齐，表面光滑。
b、菌株的生理生化实验分析：
对本发明实施例铜绿假单胞菌菌株分别进行柠檬酸利用、硝酸盐还原、产硫化氢实验、V-P实验、甲基红实验、产吲哚实验、氧化酶检测、明胶水解和溶磷实验的生理生化实验检测，结果如表1所示。
表1 本发明实施例铜绿假单胞菌菌株的生理生化实验检测结果表
Figure 402264DEST_PATH_IMAGE001
注：表中“+”为阳性，“-”为阴性。
由表1可知，本发明实施例铜绿假单胞菌菌株可以利用柠檬酸盐、还原硝酸盐、产硫化氢、可产氧化酶、水解明胶和溶磷，不产吲哚、V-P实验和甲基红实验呈阴性，这些生理生化特征与Pseudomonas aeruginosa菌属基本一致。
c、菌株的16S rDNA分析：
采用细菌基因组DNA提取试剂盒（购于天根生化科技有限公司），抽提本发明实施例铜绿假单胞菌菌株的基因组DNA，以此为模板，利用细菌16S rDNA通用引物27F/1492R通过PCR反应扩增本发明实施例铜绿假单胞菌菌株的16S rDNA序列片段，扩增得到的片段由上海生工生物工程有限公司进行测序（16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示，GenBank:MF967440.1）；将测序得到的铜绿假单胞菌菌株的16S rDNA序列与NCBI的核酸数据库进行BLAST比对分析，采用MEGA 5.1软件基于临近法构建基于16S rDNA序列的***发育树（如图2所示），得出：所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有SEQ ID NO:1所示的16SrDNA （GenBank: MF967440.1），与Pseudomonas aeruginosa S3的同源性最高，为99.79%，说明菌株与该菌的相似度最高，即属于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌属。
综上，结合菌落形态特征、生理生化特征和基于16S rDNA基因序列的***分析结果，本发明实施例铜绿假单胞菌鉴定为Pseudomonas aeruginosa菌属，菌株号为LYT-4，于2018年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 15519。
一种铜绿假单胞菌的应用实施例
将所述铜绿假单胞菌LYT-4接种至NB液体培养基中，培养至对数期，得浓度为3.9×107cfu/mL的铜绿假单胞菌LYT-4的种子液。
（1）植物粕蛋白发酵应用：将5mL所述铜绿假单胞菌LYT-4的种子液接种至植物粕固体发酵培养基（桐粕50g，无机盐溶液17mL）中，混合均匀后，在30℃、相对湿度为75%条件下，发酵5天，得LYT-4发酵产物；所述无机盐溶液的配方为：(NH4)2SO4 2.0g/L，K2HPO4 2.0g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4 0.20g/L，CaCl2 0.10g/L，MnSO4 0.020g/L，FeSO4 0.050g/L，pH7.2。
自然发酵对比例：在与上述所有条件相同的前提下，仅将所述植物粕蛋白发酵应用中的铜绿假单胞菌LYT-4的种子液替换为无菌水，得自然发酵产物。
为了研究桐粕的最佳发酵天数，在桐粕发酵6天的过程中，每隔24h分别取铜绿假单胞菌LYT-4发酵产物和自然发酵产物，将发酵产物与去离子水以质量体积比（g/L）为1:10的比例混合置于摇床上，170rpm摇荡24 h后，于12000 rpm，4℃下，离心10min后，取上清液进行蛋白酶活性和氨基态氮含量的检测分析，发酵6天后分别检测发酵终产物中的氨基酸含量。
a、蛋白酶活性变化分析：
蛋白酶活性检测采用酪蛋白为底物，检测方法如下：往离心管中加入1 mL稀释至100倍后的离心后的发酵液上清液，置于40℃水浴中预热10 min，再加入1 mL预热至40℃的质量浓度为2%的酪蛋白溶液，准备及时保温10 min；随后加入2 mL、0.4 mol/L的三氯乙酸溶液，混匀静置15 min后离心，取1 mL上清液，加入5 mL、0.4 mol/L的碳酸钠溶液，最后加入1 mL福林-酚试剂并混匀，置于40℃水浴中显示20 min，于680 nm波长下测定吸光度，以失活后的酶样品作空白对照；发酵过程中的蛋白酶活性变化结果如图3所示。
由图3可知，在发酵过程的前3天，自然发酵和LYT-4发酵产生的蛋白酶活均保持上升趋势；自然发酵过程中的蛋白酶活值在第4天出现微弱下降后，于第5天升高，并达到最大值1.29 U/mL；而LYT-4发酵过程中的蛋白酶活值一直上升直至第5天达到最大值，为2.18U/mL，相当于自然发酵最大酶活值的1.7倍，这表明LYT-4在发酵过程中能产生活性较高的蛋白酶，且缩短了达到最高蛋白酶活的时间。
b、氨基态氮含量变化分析：
氨基态氮的含量由氨基酸（AA）检测试剂盒（茚三酮比色法）（购于北京雷根生物技术有限公司）检测，检测步骤参照其说明书进行；发酵过程中的氨基态氮含量的变化结果如图4所示。
由图4可知，在发酵过程中，自然发酵和LYT-4发酵产生的氨基态氮含量一直在升高直至发酵的第5天后，LYT-4发酵过程中的氨基态氮含量均显著高于自然发酵，其释放出的氨基态氮含量可高达37.3 mg/mL，是自然发酵（25.8 mg/mL）的1.4倍，这表明LYT-4发酵过程中通过蛋白酶降解桐粕中的粗蛋白所释放出的氨基酸含量高于自然发酵，即LYT-4具有较强的粗蛋白降解能力。
c、氨基酸含量比较分析：
氨基酸含量检测样品预处理方法：在1 mL发酵产物溶液中加入2 mL、6mol/L的盐酸，并加入苯酚作为保护剂，于110℃下水解23 h，水解液去酸3次，然后溶于0.1mol/L稀盐酸中，并过0.45 μm微孔滤膜后，用于后续氨基酸检测分析。
氨基酸检测采用高效液相色谱法：Agilent 1260 高效液相色谱仪（AgilentTechnologies, USA）；Symmetry C18柱；柱温37℃；流速为2.0mL/min；激发波长250 nm，发射波长395 nm；进样量10μL；流动相：A为磷酸盐缓冲液，B为纯乙腈，C为超纯水，梯度洗脱程序为：0 min，100%A；0.5 min，98%A+2.0%B；0.5～9.0 min，96.5%A+3.5%B；9.0～9.5 min，95.0%A+5.0%B；9.5～11.5 min，91.5%A+8.5%B；11.5～13.0 min，83.0%A+17.0%B；13.0～19.0 min，60.0%B+40%C；19.0～23.0 min，100%A；根据氨基酸标准品的保留时间以及标准曲线方程对样品中的氨基酸进行定性与定量分析，结果如图5所示。
由图5可知，与未发酵桐粕相比，经自然发酵和LYT-4发酵后的产生的17种氨基酸含量均有所增加，特别是LYT-4发酵产生的氨基酸含量百分比达到55.5%，高于自然发酵的46.5%，与前面的蛋白酶活及氨基态氮含量结果一致，进一步证实了LYT-4降解桐粕粗蛋白为氨基酸的能力。
（2）拮抗植物病原真菌应用：分别将100μL所述铜绿假单胞菌LYT-4的种子液在距平板中央十字交叉点2.5cm处，等距离接种至生长了亚麻炭疽病菌（Colletotrichum lini）、亚麻立枯病菌（Rhizoctonia solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的PDA培养基上，接种后置于25℃下，倒置培养5天，即成；生长了所述植物病原真菌的PDA培养基的制备方法为：用直径0.5cm的打孔器将所述植物病原真菌接种至PDA培养基中央，在25℃下，倒置培养24h至菌丝长出。
空白对照：在与上述所有条件相同的前提下，仅将所述拮抗植物病原真菌应用中的铜绿假单胞菌LYT-4的种子液替换为无菌水。
如图6所示，铜绿假单胞菌LYT-4对亚麻炭疽病菌（Colletotrichum lini）、亚麻立枯病菌（Rhizoctonia solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的抑制率分别达到40.1%、31.3%和35.5%，表现出了较好的拮抗性能；铜绿假单胞菌的基因组由高度保守的核心基因组和不同的附加基因组组成，由于附加基因组元件来源于不同种或属细菌的遗传物质横向转移，因此，赋予了不同铜绿假单胞菌产生不同次生代谢产物的能力，而本发明铜绿假单胞菌LYT-4表现出的这种较好的拮抗性能，预示其很可能分泌出具有抗菌性能较好的次级代谢产物，这表明本发明铜绿假单胞菌LYT-4具有作为生防菌开发的潜能。
序列表
<110> 中南林业科技大学
湖南省林业科学院
<120> 一株铜绿假单胞菌及其筛选方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1444
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 1
ggcctgtgcg ggcaggccta cacatgcagt cgagcggatg aagggagctt gctcctggat 60
tcagcggcgg acgggtgagt aatgcctagg aatctgcctg gtagtggggg ataacgtccg 120
gaaacgggcg ctaataccgc atacgtcctg agggagaaag tgggggatct tcggacctca 180
cgctatcaga tgagcctagg tcggattagc tagttggtgg ggtaaaggcc taccaaggcg 240
acgatccgta actggtctga gaggatgatc agtcacactg gaactgagac acggtccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgaaagcctg atccagccat 360
gccgcgtgtg tgaagaaggt cttcggattg taaagcactt taagttggga ggaagggcag 420
taagttaata ccttgctgtt ttgacgttac caacagaata agcaccggct aacttcgtgc 480
cagcagccgc ggtaatacga agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc 540
gcgtaggtgg ttcagcaagt tggatgtgaa atccccgggc tcaacctggg aactgcatcc 600
aaaactactg agctagagta cggtagaggg tggtggaatt tcctgtgtag cggtgaaatg 660
cgtagatata ggaaggaaca ccagtggcga aggcgaccac ctggactgat actgacactg 720
aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780
atgtcgacta gccgttggga tccttgagat cttagtggcg cagctaacgc gataagtcga 840
ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa 900
gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttacctgg ccttgacatg 960
ctgagaactt tccagagatg gattggtgcc ttcgggaact cagacacagg tgctgcatgg 1020
ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gtaacgagcg caacccttgt 1080
ccttagttac cagcacctcg ggtgggcact ctaaggagac tgccggtgac aaaccggagg 1140
aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc ccttacggcc agggctacac acgtgctaca 1200
atggtcggta caaagggttg ccaagccgcg aggtggagct aatcccataa aaccgatcgt 1260
agtccggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgtgaat 1320
cagaatgtca cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga 1380
gtgggttgct ccagaagtag ctagtctaac cgcaaggggg acggttacca cgagtattcc 1440
tttt 1444

Claims (6)

1.一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4，其特征在于：所述铜绿假单胞菌LYT-4于2018年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 15519。
2.一种如权利要求1所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4的应用，其特征在于：将所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4应用于植物粕蛋白发酵或拮抗植物病原真菌；所述植物病原真菌为亚麻炭疽病菌（Colletotrichum lini）、亚麻立枯病菌（Rhizoctonia solani）或尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4的应用，其特征在于：所述植物粕中的蛋白质含量为36～45%；所述植物粕为桐粕；所述植物粕蛋白发酵的具体操作为：将所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4的种子液接种至植物粕固体发酵培养基中，混合均匀后，发酵，得发酵产物。
4.根据权利要求3所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4的应用，其特征在于：所述种子液与植物粕接种的体积质量比为8～12:100；所述固体发酵培养基由植物粕和无机盐溶液以质量体积比为2.5～3.5:1组成；所述无机盐溶液的配方为：(NH4)2SO4 1.5～2.5g/L，K2HPO4 1.5～2.5g/L，KH2PO4 1.5～2.5g/L，MgSO4 0.15～0.25g/L，CaCl2 0.05～0.15g/L，MnSO4 0.015～0.025g/L，FeSO4 0.045～0.055g/L，pH 7.0～7.2；所述发酵的温度为25～35℃，相对湿度为70～80%，时间为5～6天。
5.根据权利要求2所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4的应用，其特征在于：所述拮抗植物病原真菌的具体操作为：将所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4的种子液接种至生长了所述植物病原真菌的PDA培养基上，倒置培养，即成；所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4的种子液的接种量为80～120μL；所述接种的位置为距平板中央十字交叉点2～3 cm处；所述倒置培养的温度为20～30℃，时间为4～6天；生长了所述植物病原真菌的PDA培养基的制备方法为：将所述植物病原真菌接种至PDA培养基中央，在20～30℃下，倒置培养20～30h至菌丝长出；所述PDA培养基的配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L。
6.根据权利要求3～5之一所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4的应用，其特征在于：所述种子液的浓度为3.0×106～3.0×108cfu/mL；所述种子液是将所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LYT-4接种至NB液体培养基中，培养至对数期所得；所述NB液体培养基的配方为：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，pH 7.2～7.5。
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铜绿假单胞菌降解油茶饼(粕)中茶皂素的研究;黄浦等;《粮食与饲料工业》;20150630;第44-47页，参见全文 *
高产申嗪霉素和吩嗪-1-酰胺的水稻根际铜绿假单胞菌PA1201分离、鉴定与应用潜力;周莲等;《微生物学报》;20150404;第55卷(第4期);第401-411页，参见全文 *

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