CN111518558A - C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的制备方法及其电致化学发光细胞传感 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分析领域和电致化学发光领域，具体涉及C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的制备方法及其电致化学发光细胞传感，通过原位生长法制备了C3N4纳米球负载CsPbBr3复合材料，并作为电极发光基底；然后设计了一种探针，包含了靶向识别部分和多功能DNA部分，后者又包含了酶切割位点、杂交识别片段、杂交链式反应的引发片段；该探针首先特异性地靶向细胞表面受体，然后使用限制性内切酶Dra I剪切下探针的多功能DNA部分，并在溶液中引发杂交链式反应，产生大量DNA长链用于嵌入罗丹明6G；该产物随后又通过杂交反应被捕获到电极表面；由于复合材料中的CsPbBr3可以和罗丹明6G发生了高效的共振能量转移，引起其电致化学发光信号的下降，从而实现对细胞数量的分析。
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域和电致化学发光领域，具体涉及C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的制备方法及其电致化学发光细胞传感。
背景技术
关于半导体纳米材料的研究是当前材料科学研究的热点之一，其独特的光、电性质使其在多个领域有着广泛的应用。进一步改善纳米材料的性能、开发新型纳米材料独特的光电性质，从而使其更好地应用在实际问题中，一直以来是科研工作者的关注点之一。近年来，卤化铅钙钛矿作为一种全新的半导体材料，其在太阳能电池、发光二极管、激光器、光电检测器、电容器、光催化、等领域得到了广泛的应用(Y.Cao,Z.Zhang,L.Li,J.R.Zhang,J.J.Zhu,Anal.Chem.2019,91,8607)。它们具有优异的光谱和光电特性，例如高光致发光量子产率、窄的发射带宽、可调谐的带隙、强的光学吸收能力、低的激子结合能量、高的电荷载流子迁移率以及长载流子寿命(K.Lin,J.Xing,L.N.Quan,F.P.G.de Arquer,X.Gong,J.Lu,L.Xie,W.Zhao,D.Zhang,C.Yan,W.Li,X.Liu,Y.Lu,J.Kirman,E.H.Sargent,Q.Xiong,Z.Wei,Nature2018,562,245.)，其中，全无机钙钛矿(CsPbX3,X＝Cl,Br,I)尤其展示了不可思议的性能，包括了强而窄的荧光发射，优异的热稳定性，以及低的湿度敏感性。这些理想的特性表明了全无机钙钛矿材料可以被扩展到许多其他光学和电相关领域。
电致化学发光描述了由电极表面调制电位触发的激发物质在能量弛豫过程中发生的光电发射现象，它是电学和光学的结合。理论上，由于全无机钙钛矿材料光电性能，其似乎是量身定做的电致化学发光发射体。然后直到最近其电致化学发光现象才被报道，CsPbBr3纳米晶体可以通过自湮灭或者共反应机理获得ECL信号(Y.Huang,M.Fang,G.Zou,B.Zhang,H.Wang,Nanoscale 2016,8,18734；J.Xue,Z.Zhang,F.Zheng,Q.Xu,J.Xu,G.Zou,L.Li,J.J.Zhu,Anal.Chem.2017,89,8212.)。不幸的是，由于他们对水的固有脆弱性，这些电致化学发光过程都只能在有机体系中实现。因此，深层次的全无机钙钛矿纳米材料的水相性质尚未受到关注，其电化学氧化还原性质、电致化学发光机理以及纳米晶体在水溶液中的表面状态仍有待进一步研究。由于其与水分的内在亲和性，使得电致化学发性能较差，很容易被破坏，阻碍了它们在正常条件下的潜在应用(W.Ke,M.G.Kanatzidis,Nat.Commun.2019,10,965；A.Loiudice,S.Saris,E.Oveisi,D.T.L.Alexander,R.Buonsanti,Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,10696.)。遗憾的是，到目前为止可靠的全无机钙钛矿纳米材料的电致化学发光应用还没有实现。
发明内容
本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料的合成方法，以及一种基于该复合材料的电致化学发光检测细胞数量的分析方法。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下：
一种C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料的合成方法，包括以下步骤：包括以下步骤：
(1)取0.2035g Cs2CO3、5～10mL十八烯、0.5～0.625mL油酸混合后真空干燥；然后在惰性气体氛围中加热至固体完全溶解形成前驱体溶液；
(2)取0.138g PbBr2、1～5mg中空介孔C3N4纳米球、5～10mL十八烯混合后真空干燥；加入油胺和油酸，并在惰性气体氛围中加热到120℃～150℃，形成高温反应液；
(3)取1.0mL步骤(1)中制备的前驱体溶液加入到步骤(2)中的高温反应液中，所述前驱体溶液与高温反应液的体积比为：1:5～10；反应3～5s后置于冰水浴中冷却终止反应，制得粗产物。
优选地，步骤(3)所制得的粗产物的后处理方法为离心后，收集离心固体洗涤，分散在甲苯中保存备用。离心条件优选为以8000rpm转速离心10min。
优选地，所述步骤(1)在惰性气体氛围中加热至150℃直至固体完全溶解形成前驱体溶液。
优选地，所述步骤(1)和步骤(2)真空干燥的条件为：置于100℃下真空干燥箱中1h。
优选地，所述步骤(1)和步骤(2)的惰性气体氛围为N2氛围。
优选地，所述步骤(2)中，油胺和油酸预先置于100℃下真空烘箱中干燥1h。
优选地，所述步骤(2)中在惰性气体氛围中加热到120℃保持40min，然后继续加热至150℃，形成高温反应液。
基于C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料的电致化学发光检测细胞数量的分析方法，包括以下步骤：
a)电极的制备过程：用所述C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料、捕获DNA依次修饰玻碳电极；
b)探针的制备过程：将连接DNA与功能DNA等摩尔混合后置于37℃恒温震荡器中反应；然后加入靶向识别分子、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺在37℃恒温震荡仪中反应；通过离心提纯制得探针；
c)细胞表面受体的评估过程：取步骤b)制得的探针与细胞在37℃的培养箱中温育，离心收集沉淀，洗涤后，分散在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中；随后加入限制性内切酶DraI在恒温器(37℃)中特异性地切割细胞表面的DNA探针40min，离心收集上清液分别加入发卡DNA1和发卡DNA2，并置于37℃恒温震荡器中进行杂交链式反应；最后加入罗丹明6G，并在室温下反应；
d)电致化学发光发光检测过程：将步骤c)中形成的反应产物滴加到步骤a)中所制备的电极表面，并在室温下反应后，进行电致化学发光信号的测量；以阴极恒定的C3N4球的电致化学发光信号作为内标，阳极变化的CsPbBr3的电致化学发光信号作为指示信号，通过两种信号的比率实现内参比的分析策略，该比率与细胞浓度的呈现良好的线性关系。
所述步骤b)中的靶向分子特异性地靶向所述步骤c)的细胞表面受体。
优选地，所述步骤b)中，功能DNA部分包含了酶切割位片段、杂交识别片段、杂交链式反应的引发片段。
优选地，所述步骤d)的电致化学发光测量是在含有1mM抗坏血酸的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中以三电极体系进行，包括了所制备的电极作为工作电极、铂丝作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极。
优选地，所述步骤d)中，电致化学发光信号均由光电倍增管处于同一高压条件下测得。
相对于现有技术，本发明的优点如下，
本发明成功合成了具有优异稳定性和高电致化学发光效率的C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料，并将其应用电致化学发光生物分析，实现了细胞表面受体的评估。
具有如下优点：
(1)通过将CsPbBr3纳米晶体封装入C3N4纳米球内部，不仅改善了CsPbBr3材料不稳定的缺点，还显著提高了其电致化学发光性能，并首次实现CsPbBr3纳米晶体在电致化学发光生物分析中的应用；
(2)双信号放大策略提高了细胞表面受体评估的灵敏度：其一是探针自身的信号放大，因为单个靶向分子可以组装多个功能DNA；其二是基于链式杂交反应的信号放大；
(3)CsPbBr3纳米晶体的电致化学发光具有半峰宽窄的特性，优于目前所有已报道的电致化学发光发射体；因此，利用该性质构建的电致化学发光共振能量转移体系表现出极高的转移效率，得以进一步增加分析过程的灵敏度；
(4)以C3N4纳米球的电致化学发光信号作为内标，CsPbBr3纳米晶体的电致化学发光信号作为指示信号，通过内参比的分析方法提高检测过程的准确度。
附图说明
图1为本发明所制备的C3N4纳米球(A)和C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料(B)的透射电镜表征；
图2为本发明关于MCF-7细胞表面CD44受体评估过程的示意图；
图3为本发明分析过表达CD44的MCF-7细胞的实际电致化学发光检测曲线(A)，其中a-h分别代表了MCF-7细胞浓度是3.2×102,103,3.2×103,104,3.2×104,105,3.2×105,106cells/mL；过表达CD44的MCF-7细胞浓度与电致化学发光强度的线性图(B)。
具体实施方式
实施例1：
本发明提供了一种基于C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料检测过表达CD44的MCF-7细胞浓度的生物分析方法。
C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料的合成方法，包括以下步骤：取0.2035g Cs2CO3、10mL十八烯、0.625mL油酸分别加入到三口烧瓶中，并将其置于100℃下真空干燥箱中1h；然后在N2氛围中加热到150℃直至固体完全溶解形成前驱体溶液。取0.138gPbBr2、1mg中空的介孔C3N4纳米球(图1A)、10mL十八烯分别加入到三口烧瓶中，并将其置于100℃下真空干燥箱中1h；随后再加入预先在100℃下真空中干燥的1.0mL油胺和1.0mL油酸，并在N2氛围中加热到120℃保持40min，然后继续加热至150℃，形成高温反应液。取1.0mL前驱体溶液快速注入到高温反应液中，反应5s后置于冰水浴中冷却终止反应。将反应粗产物以8000rpm转速离心10min，收集离心固体并分别用乙酸乙酯和甲苯各洗一次，最终收集的固体再分散在甲苯中保存备用，其透射电镜表征如图1所示。
过表达CD44的MCF-7细胞浓度的检测(如图2)：将10μL上述C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料滴涂到玻碳电极表面；自然干燥后，滴加10μL捕获DNA；1h后，再滴加10μL巯基己醇封闭材料表面剩余的活性位点；最后使用蒸馏水冲洗干净并在N2氛围中干燥。将5’端带氨基的连接DNA与功能DNA等摩尔混合后置于37℃恒温震荡器中反应4h；然后加入透明质酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在37℃恒温震荡仪中反应5h；最后通过使用3KD的超滤管多次离心提纯探针。取0.5μM探针与MCF-7细胞在37℃的培养箱中温育1h，以1000rpm转速离心5min，并收集到的离心沉淀用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)洗；反复三次后，最终离心沉淀分散在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中；随后加入限制性内切酶DraI在恒温器(37℃)中特异性地切割细胞表面的DNA探针40min，离心收集上清液分别加入2μM发卡DNA1和发卡DNA2，并置于37℃恒温震荡器中持续40min进行杂交链式反应；最后加入2.0mM罗丹明6G，并在室温下反应1h。电致化学发光发光检测过程：将步骤(3)中形成的反应产物滴加到步骤(1)中所制备的电极表面，并在室温下反应75min后，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)冲洗三次后，随后进行电致化学发光信号的测量。电致化学发光测量是在含有1mM抗坏血酸的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中以三电极体系进行，包括了所制备的电极作为工作电极、铂丝作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极。所有的电致化学发光信号均由光电倍增管处于同一高压下测得。所用DNA序列均提供在表1中。如图3A中，以阴极恒定的C3N4球的电致化学发光信号作为内标，阳极变化的CsPbBr3的电致化学发光信号作为指示信号，通过两种信号的比率实现内参比的分析策略，可以排除外界环境的干扰，实现分析方法的准确性，其比率与细胞浓度的线性关系如图3B所示，其检出限是670细胞/mL.
表1.所用DNA的核苷酸序列.
实施例2：
本发明提供了检测过量表达癌胚抗原的HeLa细胞浓度的生物检测方法。
C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料的合成方法，包括以下步骤：取0.2035g Cs2CO3、5mL十八烯、0.5mL油酸分别加入到三口烧瓶中，并将其置于100℃下真空干燥箱中1h；然后在N2氛围中加热到150℃直至固体完全溶解形成前驱体溶液。取0.138gPbBr2、5mg中空的介孔C3N4纳米球(图1A)、5mL十八烯分别加入到三口烧瓶中，并将其置于100℃下真空干燥箱中1h；随后再加入预先在100℃下真空中干燥的1.0mL油胺和1.0mL油酸，并在N2氛围中加热到120℃保持40min，然后继续加热至150℃，形成高温反应液。取1.0mL前驱体溶液快速注入到高温反应液中，反应3s后置于冰水浴中冷却终止反应。将反应粗产物以8000rpm转速离心10min，收集离心固体并分别用乙酸乙酯和甲苯各洗一次，最终收集的固体再分散在甲苯中保存备用。
过表达癌胚抗原的HeLa细胞浓度的检测：将10μLC3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料滴涂到玻碳电极表面；自然干燥后，滴加10μL捕获DNA；1h后，再滴加10μL巯基己醇封闭材料表面剩余的活性位点；最后使用蒸馏水冲洗干净并在N2氛围中干燥。将5’端带羧基的连接DNA与功能DNA等摩尔混合后置于37℃恒温震荡器中反应4h；然后加入癌胚抗体、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在37℃恒温震荡仪中反应5h；最后通过使用3KD的超滤管多次离心提纯探针。取0.5μM探针与HeLa细胞在37℃的培养箱中温育1h，以1000rpm转速离心5min，并收集到的离心沉淀用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)洗；反复三次后，最终离心沉淀分散在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中；随后加入限制性内切酶DraI在恒温器(37℃)中特异性地切割细胞表面的DNA探针40min，离心收集上清液分别加入2μM发卡DNA1和发卡DNA2，并置于37℃恒温震荡器中持续40min进行杂交链式反应；最后加入2.0mM罗丹明6G，并在室温下反应1h。电致化学发光发光检测过程：将步骤(3)中形成的反应产物滴加到步骤(1)中所制备的电极表面，并在室温下反应75min后，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)冲洗三次后，随后进行电致化学发光信号的测量。电致化学发光测量是在含有1mM抗坏血酸的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中以三电极体系进行，包括了所制备的电极作为工作电极、铂丝作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极。所有的电致化学发光信号均由光电倍增管处于同一高压下测得。以阴极恒定的C3N4球的电致化学发光信号作为内标，阳极变化的CsPbBr3的电致化学发光信号作为指示信号，通过两种信号的比率实现内参比的分析策略，可以排除外界环境的干扰，实现分析方法的准确性。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京大学
<120> C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的制备方法及其电致化学发光细胞传感
<140> 2019112642651
<141> 2019-12-11
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> 连接DNA(DNA)
<400> 1
tttttaaaaa 10
<210> 2
<211> 64
<212> DNA
<213> 功能DNA(DNA)
<400> 2
ccaaaccgaa agaacaatgg acccctctcc tctcctctcc tctcctctcc tctcttttta 60
aaaa 64
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 发卡DNA(DNA)
<400> 3
gggtccattg ttctttcggt ttgggtagag ccaaaccgaa agaacaat 48
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 发卡DNA(DNA)
<400> 4
ccaaaccgaa agaacaatgg acccattgtt ctttcggttt ggctctac 48
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 捕获DNA(DNA)
<400> 5
aaaaaaaaaa gagaggagag gagaggagag gagaggagag 40
Claims (10)
1.一种C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：包括以下步骤：
(1)取0.2035g Cs2CO3、5～10mL十八烯、0.5～0.625mL油酸混合后真空干燥；然后在惰性气体氛围中加热至固体完全溶解形成前驱体溶液；
(2)取0.138g PbBr2、1～5mg中空介孔C3N4纳米球、5～10mL十八烯混合后真空干燥；加入油胺和油酸，并在惰性气体氛围中加热到120℃～150℃，形成高温反应液；
(3)取1.0mL步骤(1)中制备的前驱体溶液加入到步骤(2)中的高温反应液中，所述前驱体溶液与高温反应液的体积比为：1:5～10；反应3～5s后置于冰水浴中冷却终止反应，制得粗产物。
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(3)所制得的粗产物的后处理方法为离心后，收集离心固体洗涤，分散在甲苯中保存备用。
3.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)在惰性气体氛围中加热至150℃直至固体完全溶解形成前驱体溶液。
4.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)真空干燥的条件为：置于100℃下真空干燥箱中1h；惰性气体氛围为N2氛围。
5.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)中，油胺和油酸预先置于100℃下真空烘箱中干燥1h。
6.优选地，所述步骤(2)中在惰性气体氛围中加热到120℃保持40min，然后继续加热至150℃，形成高温反应液。
7.如权利要求1所述的合成方法合成的C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料在检测细胞数量中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
a)电极的制备过程：用所述C3N4纳米球负载全无机钙钛矿CsPbBr3的复合材料、捕获DNA依次修饰玻碳电极；
b)探针的制备过程：将连接DNA与功能DNA等摩尔混合后置于37℃恒温震荡器中反应；然后加入靶向识别分子、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺在37℃恒温震荡仪中反应；通过离心提纯制得探针；
c)细胞表面受体的评估过程：取步骤b)制得的探针与细胞在37℃的培养箱中温育，离心收集沉淀，洗涤后，分散在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中；随后加入限制性内切酶DraI在恒温器(37℃)中特异性地切割细胞表面的DNA探针40min，离心收集上清液分别加入发卡DNA1和发卡DNA2，并置于37℃恒温震荡器中进行杂交链式反应；最后加入罗丹明6G，并在室温下反应；
d)电致化学发光发光检测过程：将步骤c)中形成的反应产物滴加到步骤a)中所制备的电极表面，并在室温下反应后，进行电致化学发光信号的测量；以阴极恒定的C3N4球的电致化学发光信号作为内标，阳极变化的CsPbBr3的电致化学发光信号作为指示信号，通过两种信号的比率实现内参比的分析策略，该比率与细胞浓度的呈现良好的线性关系。
所述步骤b)中的靶向分子特异性地靶向所述步骤c)的细胞表面受体。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤b)中，功能DNA部分包含了酶切割位片段、杂交识别片段、杂交链式反应的引发片段。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤d)的电致化学发光测量是在含有1mM抗坏血酸的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中以三电极体系进行，包括了所制备的电极作为工作电极、铂丝作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤d)中，电致化学发光信号均由光电倍增管处于同一高压条件下测得。
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