CN111518288A - 一种复合水凝胶伤口敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种复合水凝胶伤口敷料及其制备方法,其是以胺化胶原蛋白和氧化海藻酸钠为基材,并载入多粘菌素B硫酸盐与杆菌肽两种多肽类抗生素,通过席夫碱反应制备AC/OSA‑PB复合水凝胶敷料,本发明制备方法操作简单,对反应条件要求也低,可在短时间内成胶,利于大规模生产,且所制得的伤口敷料不仅具有良好的杀菌作用,还能够最大程度的提高HSF细胞迁移率和HSF细胞增殖率,具有极好的促伤口愈合能力,同时还具有适用于皮肤伤口的力学性能与机械性能。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域,具体涉及一种复合水凝胶伤口敷料及其制备方法。
背景技术
皮肤创伤修复是目前医疗领域面临的重大挑战之一,据世界卫生组织统计资料显示,全世界每年约有数百万人受到皮肤损伤,其中,约有18万人死于烧伤,而非致命烧伤是主要致病因素。大面积的非致命创伤破坏了皮肤正常的生理功能,在没有得到及时且有效的治疗时,伤口极有可能会被微生物侵入而感染,从而延缓伤口愈合,严重时则会造成生命危险。因此,有效控制伤口感染、快速促进伤口愈合是减少患者死亡的重要途径。全层皮肤伤口组织在愈合过程中会经历止血、炎症、增殖、组织重塑和瘢痕形成的复杂过程。在没有药物或者其他方式的治疗作用下,受损皮肤的伤口愈合效果是缓慢的,尤其是中老年人及患有潜在性疾病如糖尿病患者的伤口。
自体皮肤移植是治疗大面积烧伤及创伤等皮肤损伤常用的方法,但该方法手术时间长且治疗费用昂贵,还可能存在很多副作用,如:血液循环障碍、继发出血或炎症感染等。在手术成功以后,还可能出现移植皮肤区域与周围皮肤颜色差异大、影响美观等问题。迄今为止,伤口敷料是处理皮肤深度创伤的最实用的方法之一。水凝胶伤口敷料与众多伤口敷料如纱布、电纺纤维、薄膜和海绵等相比,其优势在于可以保持伤口湿润环境,防止伤口脱水,吸收额外的分泌物,允许气体交换并且容易移除而不对伤口造成二次损伤。
近年来,大量文献报道了不同类型的水凝胶伤口敷料。这些水凝胶伤口敷料主要以天然高分子材料与合成高分子材料为基材,单独使用两种类型材料中一种或者将两种复合,根据基材的特征辅以抗菌或者止血的药物来制备具有不同功效的水凝胶。“鱼皮胶原蛋白-壳聚糖复合海藻酸盐水凝胶敷料对烧烫伤创面的促愈合作用”(宋文山等,《中国海洋药物》,2019年)报道了以海藻酸钠为原料,复配壳聚糖与鱼皮胶原蛋白,通过Ca2+交联制备成海藻酸盐水凝胶敷料。所制得鱼皮胶原蛋白-壳聚糖复合海藻酸盐水凝胶敷料能有效缩短愈合周期,消除伤口炎症,抑制瘢痕生成,在伤口护理方面有着良好的前景和应用方向,但是,上述方法也存在诸多缺陷,具体如下:(1)采用海藻酸钠、鱼皮胶原蛋白、聚乙烯醇与甘油制备凝胶液,聚乙烯醇为有机化合物,对人体有害;(2)水凝胶需要在4℃条件下放置2小时,之后再添加由壳聚糖和无水氯化钙制备的交联剂进行交联反应,整个交联过程通常需要数小时才能实现成胶,成胶时间较长,影响生产效率,并且,交联步骤繁琐,从而增加不确定因素;(3)与其他水凝胶相比,Ca2+交联制备的水凝胶具有不均匀、更硬与更脆等特点,不利于伤口的舒适性。此外,掺入钙离子杂质,对伤口的愈合有一定的影响;(4)壳聚糖作为天然抗菌剂,与抗生素相比,其抑菌效果欠佳,并且壳聚糖的抑菌浓度和抗菌性能与其制备工艺、分子量和分子结构密切相关,而目前壳聚糖主要通过提取法获取,对原料和生产工艺的控制要求很高,使得壳聚糖的生产稳定性很难把握,这也导致了市面上所售壳聚糖产品的抗菌效果参差不齐,增加了对壳聚糖进行筛选的麻烦。
发明内容
为了解决现有技术中存在的不足,本发明旨在提供了一种复合水凝胶伤口敷料及其制备方法,其操作简单,对反应条件要求也低,可在短时间内成胶,利于大规模生产,且所制得的伤口敷料具有良好的生物相容性和极好的促伤口愈合能力,同时还具有适用于皮肤伤口的力学性能与机械性能。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的目的之一是提供一种复合水凝胶伤口敷料的制备方法,其包括如下步骤:
S1,将胺化胶原蛋白、多粘菌素B硫酸盐与杆菌肽溶解在缓冲溶液中,得到含药胺化胶原蛋白溶液;
S2,将氧化海藻酸钠溶解于缓冲溶液中,得到氧化海藻酸钠溶液;
S3,将步骤S1中得到的含药胺化胶原蛋白溶液与步骤S2中氧化海藻酸钠溶液混合,立即超声除去气泡,静置固化成胶,得到所述复合水凝胶伤口敷料。
其中,所用多粘菌素B硫酸盐、杆菌肽与氧化海藻酸钠的质量比为1:1:(75~150),所用胺化胶原蛋白与氧化海藻酸钠的质量比为(1-3):3,更优选的,所用胺化胶原蛋白与氧化海藻酸钠的质量比为(1.5-2.5):3。本发明通过对胺化胶原蛋白的浓度进行控制,既能避免胺化胶原蛋白含量太低,难以固化成胶,又可避免胺化胶原蛋白含量太高,使得胺化胶原蛋白的投入成本过高,并且,固化成胶时间太短,容易导致固化成胶前物料混合不够均匀,影响水凝胶伤口敷料的质量。
所述胺化胶原蛋白是以乙二胺作为改性剂在胶原蛋白分子链上接枝氨基而制得,其具体是乙二胺与天然胶原蛋白中的羧基发生酰胺化反应形成改性胶原蛋白。所述胺化胶原蛋白的接枝率为10-27%。其制备方法是将胶原蛋白溶于缓冲溶液中,待溶解后按质量体积比1:(1-3)g/mL加入乙二胺,充分混匀后调节pH至5.0-6.0;然后按与胶原蛋白的质量比为1:(0.5-3)加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,反应4-8 h,以活化胶原蛋白上的羧基,将得到的反应液进行透析、冷冻干燥,得到乙二胺接枝修饰的胶原蛋白。
所述胺化胶原蛋白优选采用胺化鱼鳞胶原蛋白,即以鱼鳞胶原蛋白为原料进行制备,所述鱼鳞胶原蛋白的分子量大于80KDa,可具有更好的凝胶性能。
所述氧化海藻酸钠的制备方法为:
(1)将5-25 g海藻酸钠分散在100 mL无水乙醇中制得海藻酸钠溶液,将5-20 g高碘酸钠溶于100 mL去离子水中并缓慢倒入海藻酸钠溶液中,然后在20-40 ℃下避光反应4-8 h,再加入乙二醇终止反应,得到反应液;
(2)向步骤(1)得到的反应液中加入无水乙醇,以析出氧化海藻酸钠,将析出的氧化海藻酸钠进行抽滤,然后将抽滤得到的氧化海藻酸钠溶于去离子水中,经透析,冷冻干燥,即得。
海藻酸钠的每个单分子结构中均含有顺式邻二醇羟基,这种顺式邻二醇羟基能够与强氧化剂高碘酸钠反应,使海藻酸钠单分子结构中的C-C键断裂而被氧化为活性醛基或者酮。
上述所用缓冲溶液为1mol/L、pH=6.0-7.2的磷酸钠缓冲溶液、PBS中的任意一种。
优选的,步骤S1~S3均在10-50 ℃条件下进行,以避免温度太低,胺化胶原蛋白和氧化海藻酸钠难以完全溶解,影响反应速度,也避免温度过高带来副反应的发生。更优选的,步骤S1 ~S3在30-40 ℃条件下进行。
优选的,步骤S3中静置固化成胶时间为40-210 s,既可避免成胶时间太长,降低生产效率,同时也可避免成胶时间太短,物料混合操作时间短,带来产品质量问题。
本发明的另一目的是提供一种按上述方法制得的复合水凝胶伤口敷料。
本发明的有益效果有:
(1)席夫碱反应主要是指由醛或酮(活性羰基)与氨或胺缩合生成含有亚胺或甲亚胺基团(-RC=N-)的一类有机化合物的反应。本发明所用氧化海藻酸钠上含有大量活性醛基,胺化胶原蛋白上含有大量氨基,两者在温和的条件下可迅速进行席夫碱反应,生成酰胺键而形成水凝胶,因此,本发明的水凝胶伤口敷料制备方法简单,可在短时间内成胶,且不需要复杂的反应条件,可进行大规模生产。
(2)本发明载入多粘菌素B硫酸盐与杆菌肽两种无耐药性的多肽类抗生素,与天然抗菌剂相比,该两种抗菌剂的抗菌性能更好,且性能稳定,其中多粘菌素B硫酸盐对革兰氏阴性细菌具有杀菌作用,杆菌肽对***具有杀菌作用,两者联合使用具有广谱杀菌效果,并且,这两种抗菌剂几乎没有耐药性且与其他抗生素不产生交叉耐药性。
(3)由于多粘菌素B硫酸盐结构上的阳离子脂肽可与细菌细胞膜发生相互作用,导致细胞内渗透压发生改变而使细胞裂解死亡,因此,本领域普通技术人员通常会认为多粘菌素B硫酸盐浓度与HSF(人表皮成纤维细胞)细胞增殖率负相关。但在对抗菌剂浓度进行考察时,发明人意外发现:随着多粘菌素B硫酸盐和杆菌肽浓度的不断提升,HSF细胞在本发明水凝胶伤口敷料上的增殖效果出现先增后减的变化趋势,这说明一定浓度的多粘菌素B硫酸盐与杆菌肽联合使用,不仅可使所制得的水凝胶伤口敷料具有良好的杀菌作用,能够避免伤口感染,而且还能够最大程度的提高HSF细胞迁移率和HSF细胞增值率,从而能够最大程度的促进伤口愈合,并最终确定其适宜浓度是多粘菌素B硫酸盐、杆菌肽与氧化海藻酸钠的质量比为1:1:(75~150)。
(4)本发明伤口敷料天然无毒且具有良好的生物相容性。
(5)本发明胶原蛋白基材优选采用分子量大于80KDa的鱼鳞胶原蛋白,大分子胶原蛋白具有更好的凝胶性能,能使所制得的伤口敷料具有更好的机械性能;
(6)本发明还通过明确将胺化胶原蛋白与氧化海藻酸钠的质量比控制在(1-3):3,以进一步缩短固化成胶的时间,且其可在固化成胶之前为物料混合均匀提供足够的时间,避免物料混合不均影响水凝胶伤口敷料的质量。
附图说明
图1为实施例所制得的氧化海藻酸钠与海藻酸钠的红外光谱对比图;
图2为实施例所制得的胺化鱼鳞胶原蛋白与鱼鳞胶原蛋白的红外光谱对比图;
图3为实施例所制得AC/OSA水凝胶的红外光谱图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
所用主要化学试剂的来源见表1。
表1
实施例
1. 胺化胶原蛋白的制备:将5 g鱼鳞胶原蛋白溶于200 mL PBS缓冲溶液中,待溶解后按质量体积比1:1加入乙二胺,充分混匀后调节pH至5.5;然后按与胶原蛋白的质量比为1:1加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,反应6 h,得到反应液,并将反应液进行透析、冷冻干燥,得到胺化鱼鳞胶原蛋白,其接枝率为27%。
2. 氧化海藻酸钠的制备:
(1)将5 g海藻酸钠分散在50 mL无水乙醇中制得海藻酸钠溶液,将5 g高碘酸钠溶于100 mL去离子水中并缓慢倒入海藻酸钠溶液中,然后在25 ℃下避光反应6 h,再加入5 mL乙二醇终止反应,得到反应液;
(2)向步骤(1)得到的反应液中加入500 mL无水乙醇,以析出氧化海藻酸钠,将析出的氧化海藻酸钠进行抽滤,然后将抽滤得到的氧化海藻酸钠溶于去离子水中,经透析,冷冻干燥,即得。
3. 复合水凝胶伤口敷料的制备,具体包括如下步骤:
S1,将上述制备的胺化鱼鳞胶原蛋白溶解于PBS中,再加入多粘菌素B硫酸盐和杆菌肽,溶解后得到含药胺化鱼鳞胶原蛋白溶液;
S2,将氧化海藻酸钠溶解于PBS中,得到氧化海藻酸钠溶液;
S3,将步骤S1中得到的含药胺化鱼鳞胶原蛋白溶液与步骤S2中氧化海藻酸钠溶液混合,立即超声除去气泡,静置固化成胶,得到复合水凝胶伤口敷料;
其中,多粘菌素B硫酸盐、杆菌肽与氧化海藻酸钠的质量比为1:1:150。
需要说明的是,本发明所述胺化胶原蛋白不限于采用实施例中具体的乙二胺接枝修饰胶原蛋白,其也可以选用通过其他的胶原蛋白氨基化方式制得的胺化胶原蛋白,例如:与碱金属的氨基化合物共热而发生胺化等。当然,本发明的胺化胶原蛋白的原料也不限于实施例中鱼鳞胶原蛋白,其也可以为鱼皮胶原蛋白等其他类型的胶原蛋白。
同样的,本发明所述的氧化海藻酸钠不限于采用实施例中具体的采用高碘酸钠的氧化方法获得氧化海藻酸钠,其也可以选用通过其他的氧化方式制得的氧化海藻酸钠,例如:将海藻酸钠溶于水中,之后直接加入高碘酸钠,接着再加入乙二醇和氯化钠终止反应,从而获得氧化海藻酸钠等。同时,本发明采用经高碘酸钠氧化的氧化海藻酸钠的制备方法并不限于采用实施例中的具体参数值,本领域普通技术人员可根据试验情况进行适当调整。
实施例步骤S1、S2、S3均在30-40 ℃条件下进行,但是其也不限于在此温度下进行,温度主要影响溶解效率和反应效率,本发明胺化鱼鳞胶原蛋白和氧化海藻酸钠在10-50℃下均能溶解于缓冲溶液中,且不会发生变性,因此,本发明的步骤S1、S2与S3在10-50 ℃下均可以。
当然,实施例步骤S1和步骤S2的缓冲溶液均不限于PBS,其也可以为1M磷酸钠缓冲溶液(pH=6.0-7.2)中任一种。
分别对实施例所制得的氧化海藻酸钠(简称“OSA”)与海藻酸钠(简称“SA”)进行红外光谱测试,结果如图1所示。由图1可见,与SA不同的是,OSA在1739 cm-1处出现了吸收峰,该吸收峰归因于醛基的伸缩振动,表明海藻酸钠氧化成功。并且,采用盐酸羟胺点位滴定法测定-CHO取代度,结果为:SA的醛基含量为0%,而OSA的醛基含量为87.0±1.5%。
分别对实施例所制得的胺化鱼鳞胶原蛋白(简称“AC”)与鱼鳞胶原蛋白(简称“COL”)进行红外光谱测试,结果如图2所示。由图2可见,COL和AC均在1660 cm-1,1533 cm-1与1236 cm-1处出现了吸收峰,分别为酰胺I谱带,酰胺II谱带,酰胺III谱带,并且,AC的上述三个特征吸收峰相对于COL有所增强。同时,根据标准曲线方程与测定吸光值计算出COL与AC中的氨基含量,结果为:COL中氨基含量为22.64±2.31 mg/g,AC中氨基含量为30.95±1.87 mg/g,表明COL上成功修饰了氨基。
OSA溶液与AC溶液在10-50 ℃下均呈液态,在30-40 ℃下溶解快,且与人体温度相差不大。当两者在30-40 ℃下充分反应几十秒到几百秒之后,由于OSA上的醛基与AC上的氨基结合生成酰胺键,混合溶液由液态转变为固态而形成水凝胶。
对单独由AC溶液与OSA溶液混合制得的纯水凝胶敷料(即AC/OSA水凝胶敷料)进行红外光谱测试,结果如图3所示。结果显示:AC/OSA水凝胶敷料在1739 cm-1处的吸收峰相对OSA有所减弱,而在1660 cm-1的C=O伸缩振动吸收峰明显增强,表明部分OSA上醛基的断裂以及叔酰胺键形成,证明了OSA与AC混合能够发生席夫碱反应形成水凝胶三维网络结构。
对实施例所制得的复合水凝胶伤口敷料进行机械性能测试。拉伸与压缩应力应变测试显示,复合水凝胶伤口敷料的最高拉伸强度为0.01 MPa,最大断裂应变为75%,断裂应变与人体皮肤相当;根据压缩应变曲线,水凝胶伤口敷料可在30%-70%的应变下被压缩而不发生变形,在60%应变下,经过50次压缩循环测试,没有观察到明显的变形与强度下降,具有良好的柔韧性与回弹性;流变性能测试结果显示,水凝胶伤口敷料的最大储能模量约为3000 Pa,高于现有的胶原蛋白水凝胶伤口敷料的储能模量(10-1000 Pa)。
分别配制浓度为0.025 g/ml、0.05 g/ml、0.075 g/ml、0.10 g/ml、0.125 g/ml、0.15 g/ml与0.175 g/ml的AC溶液与浓度为0.15 g/ml的OSA溶液,将两者在30-40 ℃恒温条件下搅拌混合至溶解。然后将OSA溶液与AC溶液按照体积比为1:1充分混匀(即AC与OSA的比例分别为0.5:3、1:3、1.5:3、2:3、2.5:3、3:3与3.5:3),在30-40 ℃下反应成胶,每间隔10s反转试管,观察混合溶液是否凝固形成凝胶,记录等待固化成胶时间。结果见表2。
表2
从表2可看出:AC与OSA的比例优选控制在(1-3):3,既能使成胶时间更短,同时也能避免AC溶液比例过低或过高,使得水凝胶的机械性能过低或过硬。优选地,静置等待固化成胶时间为40-210 s。
通过MTT法定量检测HSF细胞的增殖率,以考察HSF细胞在不同的多粘菌素B硫酸盐与氧化海藻酸钠的质量比以及抗菌肽与氧化海藻酸钠的质量比制得的复合水凝胶伤口敷料(AC/OSA-PB)上的生长、增殖情况,并以空白组细胞的存活率作为对照。同时对复合水凝胶伤口敷料(AC/OSA-PB)的抑菌效果进行考察比较。结果见表3。
表3
由上述试验数据可以看出:当联合使用多粘菌素B硫酸盐和杆菌肽两种抗菌剂,且多粘菌素B硫酸盐与氧化海藻酸钠的质量比为1:(75~150),杆菌肽与氧化海藻酸钠的质量比为1:(75~150)时,HSF细胞的增殖率均最高,无细胞毒性,且抑菌效果良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种复合水凝胶伤口敷料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1,将胺化胶原蛋白、多粘菌素B硫酸盐与杆菌肽溶解在缓冲溶液中,得到含药胺化胶原蛋白溶液;
S2,将氧化海藻酸钠溶解于缓冲溶液中,得到氧化海藻酸钠溶液;
S3,将步骤S1中得到的含药胺化胶原蛋白溶液与步骤S2中氧化海藻酸钠溶液混合,立即超声除去气泡,静置固化成胶,得到所述复合水凝胶伤口敷料;
其中,所用多粘菌素B硫酸盐、杆菌肽与氧化海藻酸钠的质量比为1:1:(75~150),胺化胶原蛋白与氧化海藻酸钠的质量比为(1-3):3。
2. 根据权利要求1所述的一种复合水凝胶伤口敷料的制备方法,其特征在于,所述胺化胶原蛋白的制备方法是将胶原蛋白溶于缓冲溶液中,待溶解后按质量体积比1:(1-3)g/mL加入乙二胺,充分混匀后调节pH至5.0-6.0;然后按与胶原蛋白的质量比为1:(0.5-3)加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,反应4-8 h,得到反应液,再将反应液进行透析、冷冻干燥,得到乙二胺接枝修饰的胶原蛋白;所用缓冲溶液为1mol/L、pH=6.0-7.2的磷酸钠缓冲溶液、PBS中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的一种复合水凝胶伤口敷料的制备方法,其特征在于,所述胺化胶原蛋白具体采用胺化鱼鳞胶原蛋白,即以鱼鳞胶原蛋白为原料进行制备,所述鱼鳞胶原蛋白的分子量大于80KDa。
4.根据权利要求1所述的一种复合水凝胶伤口敷料的制备方法,其特征在于,所述氧化海藻酸钠的制备方法为:
(1)将5-25 g海藻酸钠分散在100 mL无水乙醇中制得海藻酸钠溶液,将5-20 g高碘酸钠溶于100 mL去离子水中并缓慢倒入海藻酸钠溶液中,然后在20-40 ℃下避光反应4-8 h,再加入乙二醇终止反应,得到反应液;
(2)向步骤(1)得到的反应液中加入无水乙醇,以析出氧化海藻酸钠,再进行抽滤,然后将抽滤得到的氧化海藻酸钠溶于去离子水中,经透析,冷冻干燥,即得。
5.根据权利要求1所述的一种复合水凝胶伤口敷料的制备方法,其特征在于,所用缓冲溶液为1mol/L、pH=6.0-7.2的磷酸钠缓冲溶液、PBS中的任意一种。
6. 根据权利要求1所述的一种复合水凝胶伤口敷料的制备方法,其特征在于,步骤S1~S3均在10-50 ℃条件下进行。
7.一种如权利要求1~6中任一项所述方法制得的复合水凝胶伤口敷料。
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