CN111518071B - 一种半胱氨酸近红外荧光探针的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及了一种半胱氨酸(Cys)近红外荧光探针的制备和应用，该荧光探针的结构式为：
Figure DDA0002500522610000011
本发明提供了以6‑甲氧基‑2,3‑二氢‑1H‑氧杂蒽‑4‑甲醛、2‑(3,5,5‑三甲基环己烯‑2‑乙烯基)丙二腈、丙烯酰氯等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种近红外半胱氨酸荧光探针；首先，该荧光探针具有大的斯托克斯位移，为180nm；另外，该荧光探针可以高灵敏的检测Cys，与Cys反应之后荧光强度显著增强6倍；然后，该荧光探针可以高选择性检测Cys，不受其他生物硫醇，氨基酸，阳离子，活性氧以及活性硫的干扰；其次，该荧光探针对Cys的响应时间为10min；并且，该荧光探针可以监控活细胞内Cys含量的变化。

Description

一种半胱氨酸近红外荧光探针的制备和应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种半胱氨酸近红外荧光探针的制备和应用。
背景技术
半胱氨酸(Cys)是一种小分子生物硫醇，在调节生理过程和维持生物***平衡方面起着重要的作用，与生物的自解毒，蛋白质的合成，人体的新陈代谢等生命过程息息相关(Y.Li,W.Liu,P.Zhang,H.Zhang,J.Wu,J.Ge,P.Wang,Biosens.Bioelectron.,2017,90,117-124；M.Li,N.Kang,C.Zhang,W.Liang,G.Zhang,J.Jia,C.Dong,Spectrochim.Acta.A.Mol.Biomol.Spectrosc.,2019,222,117262；Y.Dai,Y.Zheng,T.Xue,F.He,H.Ji,Z.Oi,Spectrochim.Acta.A.Mol.Biomol.Spectrosc.,2020,225,117490；X.Song,Y.Yang,J.Ru,Y.Wang,F.Qiu,Y,Feng,W.Liu,Talanta,2019)。近年来研究表明，Cys的异常水平会导致肝损伤，生长迟缓，皮肤损伤。此外，Cys水平与心血管并发症、神经毒性、阿尔茨海默病、帕金森病密切相关(X.Lu,W.Wang,Q.Dong,X.Bao,X.Lin,W.Zhang,W.Zhao,Chem.Commun.,2015,51,1498-1501；X.Ren,H.Tian,L.Yang,L.He,Y.Geng,X.Liu,X.Song,Sens.Actuators.B.Chem.,2018,273,1170-1178；C.F.Yang,L.Y.Zeng,B.K.Ning,J.Y.Wang,H.Zhang,Z.H.Zhang,Spectrochim.Acta.A.Mol.Biomol.Spectrosc.,2020,225,117482；S.Yang,C.Guo,Y.Li,J.Guo,J.Xiao,Z.Qing,ACS Sens.,2018,3,2415-2422)。所以，我们迫切需要开发一种能在生物***中准确、高效地检测Cys的方法。
近年来，荧光探针由于高灵敏度、无创性、高时空分辨率受到人们广泛的关注和应用。到目前为止，已成功开发出许多用于Cys检测的探针。这些探针多是以萘酰亚胺、荧光素、咔唑等为荧光团，发射波长较短(K.B.Li,W.B.Qu,Q.Shen,S.Zhang,W.Shi,L.Dong,D.M.Han,Dyes Pigments.,2020,173,107918；H.Song,J.Zhang,X.Wang,Y.Zhou,C.Xu,SensActuators B Chem.,2018,259,233-240；X.Hou,Z.Li,B.Li,C.Liu,Z.Xu,Sens.Actuators.B.Chem.,2018,260,295-302；Y.Huang,Q.Ren,S.Li,Y.Feng,W.Zhang,G.Fang,Sens.Actuators.B.Chem.,2019,293,247-255.)。然而，以新型萘荧光素、吲哚类染料为荧光团的探针，虽然具有近红外发射波长，但是斯托克斯位移小(S.Xue,S.Ding,Q.Zhai,H.Zhang,G.Feng,Biosens.Bioelectron.,2015,68；316-321；S.J.Li,Y.J.Fu,C.Y.Li,Y.F.Li,L.H.Yi,J.Ou-Yang,Anal.Chim.Acta.,2017,994,73-81)。因此，设计和合成一种具有近红外发射波长，大斯托克斯位移的Cys荧光探针是十分有意义的。
异佛尔酮衍生物与发色团结合，可以使所合成的荧光团具有大的斯托克斯位移。荧光探针的斯托克斯位移大具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小、样品穿透性强、检测灵敏度高等优点。目前，有工作将异佛尔酮衍生物与对甲氧基苯甲醛、6-羟基-2-萘醛合成具有大斯托克斯位移的荧光探针用来测定Cys，但是，其发射波长较短，不足以满足生物成像的要求(J.Hou,P.Cai,C.Wang,Y.Shen,Tetrahedron.Lett.,2018,59,2581-2585；W.Zhang,J.Liu,Y.W.Yu,Q.R.Han,T.Cheng,J.Shen,B.X.Wang,Y.L.Jiang,Talanta,2018,185,477-482)。因此，设计并合成一种基于异佛尔酮衍生物-氧杂蒽染料的长波长探针用于检测Cys是迫切需要的。
发明内容
根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种半胱氨酸近红外荧光探针，该探针具有较大的斯托克斯位移。
本发明的技术方案是，一种半胱氨酸近红外荧光探针，其结构式如下：
Figure BDA0002500522590000021
一种半胱氨酸近红外荧光探针的制备方法。步骤如下：
1)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的固体化合物6-甲氧基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-甲醛溶于6～10mL乙酸酐，随后向其加入1当量的固体化合物2-(3,5,5-三甲基环己烯-2-乙烯基)丙二腈和2当量的碳酸钾，反应混合物在N2氛围下于80℃下搅拌13～15h，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为1:1二氯甲烷/石油醚洗脱剂进行柱层析，得到固体化合物(IX-OMe)(产率50％)。2)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的固体化合物IX-OMe溶于20～30mL无水二氯甲烷，在N2氛围下置于0℃的冰水混合物中，随即缓慢滴加20当量的三溴化硼，反应混合物室温下搅拌15～17h，停止反应，0℃下，滴加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取水层，得到有机层，干燥，过滤，通过减压蒸馏除去有机层溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到固体化合物(IX-OH)(产率60％)。3)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的固体化合物IX-OH溶于20～30mL无水二氯甲烷，加入2当量的三乙胺和2当量的烯丙酰氯，反应混合物室温下搅拌15～20分钟，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到固体产物(IX)(产率71％)，即为所述的荧光探针。
本发明的有益效果是，一种半胱氨酸近红外荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究荧光探针IX的荧光光谱。荧光探针本身，在590nm激发下，在743nm处you微弱的近红外发射峰；加入Cys之后，在770nm处出现了新的的近红外发射峰。并且随着Cys浓度的增大，荧光探针在770nm处的近红外荧光强度不断增强。斯托克斯位移较大，为180nm。当Cys浓度为70μM，IX的荧光强度增强6倍。然后，记录荧光探针IX的紫外吸收光谱。荧光探针IX自身在534nm处出现吸收带；加入70μM Cys之后，吸收峰发生红移，移动至570nm。其次，评估荧光探针IX对Cys的选择性。分别测定探针与半胱氨酸、生物硫醇(Hcy,GSH)、氨基酸(His,Ala,IIe,Leu,Met,Ser,Thr,Tyr,Asp,Phe,Pro,Trp,Val,Asn,Gln,Gly,Glu,Arg,Lys)、阳离子(K+,Na+,Mg2+,Ca2+)，活性氧(H2O2,HClO)，活性硫(H2S,S2-)的荧光响应。荧光探针IX对Hcy,GSH有微弱的响应，对其他竞争物基本没有响应。只有在Cys存在的情况下，探针IX的荧光强度显著增强。接着，考察pH值对IX检测Cys的影响，荧光探针IX测定Cys的适宜pH范围为7.0-10.0。最后，测定荧光探针IX对Cys的响应时间，在10min之内。
一种半胱氨酸近红外荧光探针的应用。在细胞中只加入荧光探针，红色通道有微弱荧光，这说明探针可以检测细胞内源性Cys。细胞中加入N-乙基马来酰亚胺(NEM)进行预处理，随后加入探针培育，红色通道没有荧光，这是因为NEM清除了活细胞内源性Cys。细胞中加入NEM预处理，在加入Cys培育，最后加入探针培育，红色通道有强烈的荧光。因此荧光探针IX能够检测细胞内Cys并监控Cys浓度的变化，有望成为监控Cys含量和诊断Cys相关疾病的有利工具。
附图说明
图1为荧光探针IX的合成路线。
图2为荧光探针IX与不同浓度的Cys反应后的荧光光谱图。
横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针IX浓度为10μM，Cys浓度分别为：0,10,20,30,40,50,60,70μM。荧光激发波长为590nm。
图3为荧光探针IX与各种浓度Cys的线性响应图。
图4为荧光探针IX与Cys反应后的紫外可见吸收光谱图。
图5为荧光探针IX的选择性图。
荧光探针IX浓度为10μM，Cys浓度为70μM，其他分析物浓度为400μM。
图6为pH对荧光探针IX的影响图。
图7为荧光探针IX与不同浓度Cys反应后的时间响应图。
图8为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针IX的浓度，纵坐标为细胞的存活率。
图9为荧光探针IX与Cys反应后的细胞成像图。(a)细胞与探针培育1h；(b)细胞先用NEM培育30min，加入探针培育1h；(c)细胞先用NEM培育30min，加入Cys培育30min，最后加入探针培育1h；(d)(a)的荧光强度图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
实施例1：
荧光探针IX的合成
合成路线如图1。化合物IX-OMe合成：在100mL的圆底烧瓶中，将固体化合物6-甲氧基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-甲醛(0.24g，1.0mmol)溶于10mL乙酸酐，随后向其加入固体化合物2-(3,5,5-三甲基环己烯-2-乙烯基)丙二腈(0.22g，1.2mmol)和碳酸钾(0.28g，2.0mmol)，反应混合物在N2氛围下，于80℃下搅拌14h，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为1:1二氯甲烷/石油醚洗脱剂进行柱层析，得到固体化合物(0.21g，产率：50％)，即为化合物IX-OMe。
化合物IX-OH合成：在100mL的圆底烧瓶中，将固体化合物IX-OMe(0.21g，0.5mmol)溶于30mL无水二氯甲烷，在N2氛围下，置于0℃的冰水混合物中，随即缓慢滴加三溴化硼(0.95mL，10mmol)，反应混合物室温下搅拌16h，停止反应，0℃下滴加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，静置分层，用二氯甲烷萃取水层，得到有机层，干燥，过滤，通过减压蒸馏除去有机层溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到固体化合物(0.12g，产率：60％)，即为化合物IX-OH。
荧光探针IX的合成：在100mL的圆底烧瓶中，将固体化合物IX-OH(0.41g，1.0mmol)溶于30mL无水二氯甲烷，加入三乙胺(0.28mL，2.0mmol)和丙烯酰氯(0.16mL，2.0mmol)，反应混合物在室温下搅拌15min，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到固体产物(0.32g，产率；71％)，即为荧光探针。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ7.56(d,J＝16.0Hz,1H),7.09(d,J＝8.0Hz,1H),6.96(s,1H),6.81(d,J＝8.0Hz,1H),6.75(s,1H),6.66(d,J＝17.2Hz,1H),6.43-6.31(m,3H),6.08(d,J＝10.4Hz,1H),2.60-2.47(m,8H),1.83(t,J＝6.0Hz,2H),1.11(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm):δ169.0,164.3,155.4,153.2,150.9,150.7,133.3,132.0,130.5,127.6,126.5,126.3,122.5,122.1,120.2,114.4,113.6,112.5,109.0,75.5,43.0,39.2,32.1,28.1,24.6,20.7.MS(TOF):450.2.
实施例2：
荧光探针和Cys溶液配制
探针溶液的制备：称取一定量荧光探针溶解在乙腈中，配置成2×10-4mol·L-1的探针溶液。Cys溶液的配制：称取一定量Cys溶解在二次蒸馏水中，转移到250mL的容量瓶中，用二次蒸馏水定容，配置成1×10-3mol·L-1的半胱氨酸水溶液。将0.5mL的探针溶液，3.5mL乙腈和0.4-3.6mL的半胱氨酸水溶液加入到10mL的容量瓶中，用PBS缓冲溶液定容，配置成1.0×10-5mol·L-1荧光探针，4.0×10-5mol·L-1-3.6×10-4mol·L-1Cys的混合待测溶液。
实施例3：
荧光探针与Cys反应后的荧光光谱的测定
图2为荧光探针IX与不同浓度Cys反应后的荧光光谱，荧光探针浓度为10μM，Cys浓度分别为：0,10,20,30,40,50,60,70μM。激发波长为590nm，发射波长为680-880nm。狭缝宽度为10.0nm/20.0nm，采用日立F4600荧光分光光度计测量。只有探针的存在时，在743nm处有微弱近红外发射峰。加入Cys，发射峰红移至770nm，探针的斯托克斯位移达到180nm。这是因为Cys与探针反应，使丙烯基甲酸酯断裂，释放荧光团IX-OH，并且荧光强度与Cys浓度呈正相关。当Cys的加入量为70μM，探针的荧光强度增强6倍。图3为探针对各种浓度Cys的荧光线性响应图，探针的荧光强度与Cys的浓度存在良好的线性关系。从以上结论可知，荧光明探针IX可以高灵敏检测Cys。
实施例4：
荧光探针与Cys反应前后的紫外可见吸收光谱的测定
图4为荧光探针与Cys反应前后的紫外可见吸收光谱，荧光探针的浓度为10μM，Cys的浓度为70μM。采用安捷伦Cary60紫外可见分光光度计进行测量。只有探针存在的情况下，在534nm处有吸收峰；加入Cys后，吸收峰移动至570nm。
实施例5：
荧光探针对Cys的选择性
图5为荧光探针对Cys的选择性。分别测定荧光探针(10μM)与Cys(70μM)、生物硫醇(Hcy,GSH)、氨基酸(His,Ala,IIe,Leu,Met,Ser,Thr,Tyr,Asp,Phe,Pro,Trp,Val,Asn,Gln,Gly,Glu,Arg,Lys)、阳离子(K+,Na+,Mg2+,Ca2+)，活性氧(H2O2,HClO)，活性硫(H2S,S2-)(400μM)的荧光发射光谱，发现只有在Cys存在的情况下才能使探针产生强烈的荧光发射。因此，荧光探针IX可以高选择性检测Cys。
实施例6：
pH值对荧光探针检测Cys的影响
图6为pH值对荧光探针的影响。分别测定荧光探针(10μM)与Cys(70μM)在不同pH值条件下(2.0-12.0)反应前后的荧光发射光谱。溶液的pH值对于探针自身的荧光强度基本没有影响。但是，加入Cys后，只有当pH＝7.0-10.0时，探针才产生强烈的荧光发射。从以上结论可知，探针可以在pH＝7.0-10.0范围内检测Cys。因此，荧光探针IX可以在生理条件下检测细胞内的Cys。
实施例7：
荧光探针与Cys反应的时间响应
图7为荧光探针对Cys的时间响应。荧光探针IX对Cys的响应时间在10min以内，10min后，探针的荧光强度不再增加。由此，我们知道荧光探针IX可以实时检测Cys。
实施例8：
荧光探针在活细胞中的应用
首先，我们采用MTT方法来评估荧光探针的细胞毒性。从图8中可以看出，当加入0～30μM Cys探针时，肝癌细胞HepG2的成活率均高于90％，并没有受到太大影响，这证明了荧光探针IX的细胞毒性较小，可以用于活细胞中Cys的检测。接着，我们研究了荧光探针在HepG2细胞中的应用。从图9中可以看出，当细胞与探针培育1h，红色通道有荧光产生(图9a)，这表明探针可以检测活细胞内源性Cys。细胞用N-乙基马来酰亚胺(NEM)预先培育30min，然后加入荧光探针培育1h，红色通道没有发现任何荧光(图9b)，因为NEM清除了活细胞的内源性Cys。细胞用NEM培育30min，然后加入Cys培育30min，最后加入探针培育1h，红色通道有强烈的荧光(图9c)。然后，我们对细胞的荧光强度进行分析，a、b、c荧光成像图的相对荧光强度分别为1、0.1、4.3(图9d)。综上所述，荧光探针IX可以监测活细胞内Cys浓度的变化，并有潜力成为一个强大的工具来诊断与Cys有关的疾病。

Claims (3)

1.一种半胱氨酸近红外荧光探针，其结构如下：
Figure FDA0004024776610000011
2.根据权利要求1所述的一种半胱氨酸近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：
1)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的固体化合物6-甲氧基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-甲醛溶于6～10mL乙酸酐，随后向其加入1当量的固体化合物2-(3,5,5-三甲基环己烯-2-乙烯基)丙二腈和2当量的碳酸钾，反应混合物在N2氛围下于80℃下搅拌13～15h，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为1:1二氯甲烷/石油醚洗脱剂进行柱层析，得到固体化合物IX-OMe，其结构如下：
Figure FDA0004024776610000012
2)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的固体化合物IX-OMe溶于20～30mL无水二氯甲烷，在N2氛围下，置于0℃的冰水混合物中，随即缓慢滴加20当量的三溴化硼，反应混合物室温下搅拌15～17h，停止反应，0℃下，滴加饱和碳酸氢钠溶液，淬灭反应，静置分层，用二氯甲烷萃取水层，得到有机层，干燥，过滤，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到固体化合物IX-OH，其结构如下：
Figure FDA0004024776610000013
3)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的固体化合物IX-OH溶于20～30mL无水二氯甲烷，加入2当量的三乙胺和2当量的丙烯酰氯，反应混合物室温下搅拌15～20分钟，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到固体产物IX，即为所述的荧光探针。
3.根据权利要求1所述的一种半胱氨酸近红外荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针具有大的斯托克斯位移并应用于非疾病诊断与治疗目的的活细胞内半胱氨酸含量的检测。
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