CN111512160A - Htra1 rna拮抗剂的伴随诊断 - Google Patents
Htra1 rna拮抗剂的伴随诊断 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111512160A CN111512160A CN201880082677.0A CN201880082677A CN111512160A CN 111512160 A CN111512160 A CN 111512160A CN 201880082677 A CN201880082677 A CN 201880082677A CN 111512160 A CN111512160 A CN 111512160A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- htra1
- htra1mrna
- antagonist
- subject
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title claims abstract description 92
- 102100021119 Serine protease HTRA1 Human genes 0.000 claims abstract description 226
- 101001041393 Homo sapiens Serine protease HTRA1 Proteins 0.000 claims abstract description 199
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 66
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 claims abstract description 65
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 58
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 185
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 176
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 129
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 115
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 84
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 76
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 70
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 59
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 55
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 42
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 39
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 32
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 claims description 30
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 28
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 24
- 208000008069 Geographic Atrophy Diseases 0.000 claims description 18
- 208000011325 dry age related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 18
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 16
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 13
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 claims description 11
- 208000000208 Wet Macular Degeneration Diseases 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 8
- 206010063381 Polypoidal choroidal vasculopathy Diseases 0.000 claims description 8
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 claims description 8
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 claims description 8
- 208000005590 Choroidal Neovascularization Diseases 0.000 claims description 7
- 206010060823 Choroidal neovascularisation Diseases 0.000 claims description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 7
- 201000005667 central retinal vein occlusion Diseases 0.000 claims description 6
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 claims description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 206010055665 Corneal neovascularisation Diseases 0.000 claims description 3
- 206010012688 Diabetic retinal oedema Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002563 Histoplasmosis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010073286 Pathologic myopia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007135 Retinal Neovascularization Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 claims description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 3
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011190 diabetic macular edema Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014801 endophthalmitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 abstract description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 81
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 56
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 56
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 43
- -1 methoxy, ethoxy, n-propoxy (n-propoxy) Chemical class 0.000 description 40
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 101150007028 HTRA1 gene Proteins 0.000 description 34
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 31
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 28
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 27
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 25
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 19
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 19
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000002585 base Substances 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 description 16
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 14
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 14
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 13
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 12
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 12
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 description 10
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 8
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 210000005157 neural retina Anatomy 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 7
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 7
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 7
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 7
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 6
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 6
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 6
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012001 immunoprecipitation mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 6
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100178820 Homo sapiens HTRA1 gene Proteins 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 5
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 5
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 5
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical compound SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N tetracaine Chemical compound CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002372 tetracaine Drugs 0.000 description 4
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 3
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 3
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 125000003302 alkenyloxy group Chemical group 0.000 description 3
- 125000004183 alkoxy alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000004448 alkyl carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 3
- 210000001775 bruch membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 3
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 3
- 125000000025 triisopropylsilyl group Chemical group C(C)(C)[Si](C(C)C)(C(C)C)* 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- SDTORDSXCYSNTD-UHFFFAOYSA-N 1-methoxy-4-[(4-methoxyphenyl)methoxymethyl]benzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1COCC1=CC=C(OC)C=C1 SDTORDSXCYSNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033282 ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 2
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 2
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- 206010011906 Death Diseases 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 2
- 101100229963 Drosophila melanogaster grau gene Proteins 0.000 description 2
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000927511 Homo sapiens ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WLDHEUZGFKACJH-UHFFFAOYSA-K amaranth Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C12=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(O)=C1N=NC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C12 WLDHEUZGFKACJH-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 2
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 208000003464 asthenopia Diseases 0.000 description 2
- 125000003725 azepanyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002785 azepinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002393 azetidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N buprenorphine Chemical compound C([C@]12[C@H]3OC=4C(O)=CC=C(C2=4)C[C@@H]2[C@]11CC[C@]3([C@H](C1)[C@](C)(O)C(C)(C)C)OC)CN2CC1CC1 RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N 0.000 description 2
- 229960001736 buprenorphine Drugs 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 2
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- HRLIOXLXPOHXTA-NSHDSACASA-N dexmedetomidine Chemical compound C1([C@@H](C)C=2C(=C(C)C=CC=2)C)=CN=C[N]1 HRLIOXLXPOHXTA-NSHDSACASA-N 0.000 description 2
- 229960004253 dexmedetomidine Drugs 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 125000001028 difluoromethyl group Chemical group [H]C(F)(F)* 0.000 description 2
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 2
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 2
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 2
- 125000004216 fluoromethyl group Chemical group [H]C([H])(F)* 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 125000005347 halocycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002632 imidazolidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003312 immunocapture Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- NSPJNIDYTSSIIY-UHFFFAOYSA-N methoxy(methoxymethoxy)methane Chemical compound COCOCOC NSPJNIDYTSSIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 125000001715 oxadiazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000160 oxazolidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 2
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003386 piperidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000010344 pupil dilation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N quinoxaline Chemical compound N1=CC=NC2=CC=CC=C21 XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 108010052833 ribonuclease HI Proteins 0.000 description 2
- 102210034792 rs11200638 Human genes 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 108010062513 snake venom phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003718 tetrahydrofuranyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004632 tetrahydrothiopyranyl group Chemical group S1C(CCCC1)* 0.000 description 2
- 125000001113 thiadiazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001984 thiazolidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004568 thiomorpholinyl group Chemical group 0.000 description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 2
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- 125000004973 1-butenyl group Chemical group C(=CCC)* 0.000 description 1
- GPAAEZIXSQCCES-UHFFFAOYSA-N 1-methoxy-2-(2-methoxyethoxymethoxymethoxy)ethane Chemical compound COCCOCOCOCCOC GPAAEZIXSQCCES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006017 1-propenyl group Chemical group 0.000 description 1
- XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole-4,5-dicarbonitrile Chemical compound N#CC=1N=CNC=1C#N XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004206 2,2,2-trifluoroethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C(F)(F)F 0.000 description 1
- YQTCQNIPQMJNTI-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropan-1-one Chemical group CC(C)(C)[C]=O YQTCQNIPQMJNTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-hydroxypyrimidine Chemical compound NC1=NC=CC(O)=N1 XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004974 2-butenyl group Chemical group C(C=CC)* 0.000 description 1
- HBJGQJWNMZDFKL-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-7h-purin-6-amine Chemical compound NC1=NC(Cl)=NC2=C1NC=N2 HBJGQJWNMZDFKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004777 2-fluoroethyl group Chemical group [H]C([H])(F)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- QWYTUBPAXJYCTH-UHFFFAOYSA-N 2-trimethylsilylethyl carbamate Chemical compound C[Si](C)(C)CCOC(N)=O QWYTUBPAXJYCTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004975 3-butenyl group Chemical group C(CC=C)* 0.000 description 1
- YWZHEXZIISFIDA-UHFFFAOYSA-N 5-amino-1,2,4-dithiazole-3-thione Chemical compound NC1=NC(=S)SS1 YWZHEXZIISFIDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)NC1=O UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 7h-purine-2,8-diamine Chemical compound NC1=NC=C2NC(N)=NC2=N1 VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl carbamate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N)C3=CC=CC=C3C2=C1 ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038568 Age-related maculopathy susceptibility protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091029792 Alkylated DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000249058 Anthracothorax Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- DCERHCFNWRGHLK-UHFFFAOYSA-N C[Si](C)C Chemical compound C[Si](C)C DCERHCFNWRGHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N Cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N 0.000 description 1
- 101150018489 DNA-C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000808726 Homo sapiens Age-related maculopathy susceptibility protein 2 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 201000006165 Kuhnt-Junius degeneration Diseases 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTLZVHNRZJPSMI-UHFFFAOYSA-N N-ethylpiperidine Chemical compound CCN1CCCCC1 HTLZVHNRZJPSMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCLANYCVBBTKTO-UHFFFAOYSA-N Proparacaine Chemical compound CCCOC1=CC=C(C(=O)OCCN(CC)CC)C=C1N KCLANYCVBBTKTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N R-2-phenyl-2-hydroxyacetic acid Natural products OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 206010038848 Retinal detachment Diseases 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 1
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N Tropicamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CO)C(=O)N(CC)CC1=CC=NC=C1 BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 125000000641 acridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 201000002538 age related macular degeneration 7 Diseases 0.000 description 1
- 125000005083 alkoxyalkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 125000003785 benzimidazolyl group Chemical group N1=C(NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000004604 benzisothiazolyl group Chemical group S1N=C(C2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000004603 benzisoxazolyl group Chemical group O1N=C(C2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000000499 benzofuranyl group Chemical group O1C(=CC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000005874 benzothiadiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001164 benzothiazolyl group Chemical group S1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000004196 benzothienyl group Chemical group S1C(=CC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000004541 benzoxazolyl group Chemical group O1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001951 carbamoylamino group Chemical group C(N)(=O)N* 0.000 description 1
- 125000000609 carbazolyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 235000013985 cinnamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930016911 cinnamic acid Natural products 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N ctk1a3526 Chemical compound NP(N)(N)=O DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000582 cycloheptyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000640 cyclooctyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 125000005959 diazepanyl group Chemical group 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004852 dihydrofuranyl group Chemical group O1C(CC=C1)* 0.000 description 1
- 125000005050 dihydrooxazolyl group Chemical group O1C(NC=C1)* 0.000 description 1
- 125000005043 dihydropyranyl group Chemical group O1C(CCC=C1)* 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000006419 fluorocyclopropyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940083124 ganglion-blocking antiadrenergic secondary and tertiary amines Drugs 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 125000003187 heptyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000625 hexosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002636 imidazolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000001977 isobenzofuranyl group Chemical group C=1(OC=C2C=CC=CC12)* 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000904 isoindolyl group Chemical group C=1(NC=C2C=CC=CC12)* 0.000 description 1
- 125000000555 isopropenyl group Chemical group [H]\C([H])=C(\*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005956 isoquinolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001786 isothiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003965 isoxazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N methyl p-hydroxycinnamate Natural products OC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L methylphosphonate(2-) Chemical compound CP([O-])([O-])=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CPZBTYRIGVOOMI-UHFFFAOYSA-N methylsulfanyl(methylsulfanylmethoxy)methane Chemical compound CSCOCSC CPZBTYRIGVOOMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 125000002757 morpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000002971 oxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 229960003981 proparacaine Drugs 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 125000003373 pyrazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003072 pyrazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003226 pyrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002098 pyridazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000002294 quinazolinyl group Chemical group N1=C(N=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 125000005493 quinolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004621 quinuclidinyl group Chemical group N12C(CC(CC1)CC2)* 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012313 reversal agent Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102200139266 rs10490924 Human genes 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 239000000932 sedative agent Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001981 tert-butyldimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([H])(C([H])([H])[H])[*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005942 tetrahydropyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005958 tetrahydrothienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005190 thiohydroxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N thiouracil Chemical compound O=C1C=CNC(=S)N1 ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 description 1
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 125000004306 triazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001425 triazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YFTHZRPMJXBUME-UHFFFAOYSA-N tripropylamine Chemical compound CCCN(CCC)CCC YFTHZRPMJXBUME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004791 tropicamide Drugs 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 230000006496 vascular abnormality Effects 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 208000006542 von Hippel-Lindau disease Diseases 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/334—Modified C
- C12N2310/3341—5-Methylcytosine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21108—HtrA2 peptidase (3.4.21.108)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/16—Ophthalmology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Abstract
本发明涉及HTRA1 mRNA拮抗剂在治疗眼病症如黄斑变性中的用途,以及在房水和玻璃体液中HTRA1水平作为诊断性生物标记用于用HTRA1 mRNA拮抗剂治疗受试者的合适性的用途。
Description
发明领域
本发明涉及HTRA1 mRNA拮抗剂在治疗眼病症如黄斑变性中的用途,以及在房水和玻璃体液中HTRA1水平作为诊断性生物标记用于用HTRA1 mRNA拮抗剂治疗受试者的合适性的用途。
背景技术
人高温需求A(human high temperature requirement A,HTRA)家族的丝氨酸蛋白酶普遍表达的PDZ蛋白酶,其通过结合蛋白酶和分子伴侣的双重功能,参与维持细胞外区室的蛋白质稳态。HTRA蛋白酶与细胞外基质的组织,细胞增殖和衰老有关。HTRA活性的调节与严重疾病有关,所述严重疾病包括迪谢内肌营养不良(Bakay等2002,Neuromuscul.Disord.12:125-141),关节炎(诸如骨关节炎(Grau等2006,JBC 281:6124-6129)),癌症,家族性缺血性脑小血管疾病和年龄相关性黄斑变性,以及帕金森病和阿尔茨海默病。人HTRA1含有***(IGF)结合结构域。已经提出其调节IGF的可用性和细胞生长(Zumbrunn和Trueb,1996,FEES Letters398:189-192)并展现出肿瘤抑制特性。HTRA1表达在转移性黑色素瘤中下调,并因此可能指示黑色素瘤的进展程度。转移性黑素瘤细胞系中HTRA1的过表达减少了体外增殖和侵袭,并且在异种移植小鼠模型中减少了肿瘤的生长(Baldi等,2002,Oncogene 21:6684-6688)。在卵巢癌中,HTRA1表达也下调。在卵巢癌细胞系中,HTRA1过表达诱导细胞死亡,而反义HTRA1表达促进锚定非依赖性生长(Chien等,2004,Oncogene23:1636-1644)。
除了对IGF途径的作用外,HTRA1还抑制TGFβ家族生长因子的信号传导(Oka等,2004,Development 131:1041-1053)。HTRA1能够切割淀粉样前体蛋白(APP),HTRA1抑制剂引起Aβ肽在培养细胞中的积累。因此,HTRA1也与阿尔茨海默病有关(Grau等,2005,Proc.Nat.Acad.Sci.USA.102:6021-6026)。
此外,已经观察到HTRA1上调并且似乎与迪谢内肌营养不良(Bakay等2002,Neuromuscul.Disord.12:125-141)和骨关节炎(Grau等2006,JBC281:6124-6129)和AMD(Fritsche,等Nat Gen 2013 45(4):433-9)有关。
HTRA1启动子区域(rs11200638)中的单核苷酸多态性(SNP)与发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的风险增加了10倍有关。此外,HTRA1 SNP与发展年龄相关性黄斑变性(AMD)的风险增加有关的ARMS2 SNP(rs10490924)存在连锁不平衡。风险等位基因与HTRA1 mRNA和蛋白质表达增加2-3倍相关,并且HTRA在AMD患者的玻璃疣中存在(Dewan等,2006,Science314:989-992;Yang等,2006,Science 314:992-993)。HtrA1的过表达在小鼠中诱导AMD样表型。hHTRA转基因小鼠(Veierkottn,PlosOne 2011)揭示了Bruch膜弹性层的降解,确定脉络膜血管异常(Jones,PNAS,2011年),并增加了息肉状脉络膜血管病变(Polypoidalchoroidal vasculopathy,PCV)病变(Kumar,IOVS 2014)。此外,已报道hHTRA1 Tg小鼠中的Bruch膜损伤,这决定了其暴露于香烟烟雾后增加CNV 3倍(Nakayama,IOVS 2014)。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是65岁以上人群不可逆视力丧失的主要原因。随着AMD的发作,眼后部的光敏感光感受器细胞,在代谢上支持它们的下层色素上皮细胞以及它们提供的清晰的中央视觉逐渐丧失。年龄是AMD发病的主要危险因素:55岁后患AMD的可能性增至三倍。吸烟,浅的虹膜颜色,性别(女性风险更大),肥胖以及反复暴露于UV辐射也会增加患AMD的风险。AMD进展可分为三个阶段:1)早期AMD,2)中期AMD和3)晚期AMD。晚期AMD有两种形式:干性AMD(也称为地图状萎缩,GA)和湿性AMD(也称为渗出性AMD)。干性AMD的特征在于光感受器和视网膜色素上皮细胞的丧失,其导致视觉丧失。湿性AMD与病理性脉络膜的(也称为视网膜下的)新血管形成有关。在此过程中形成的异常血管的泄漏会破坏黄斑并损伤视力,最终导致失明。在某些情况下,患者可以表现出与两种类型的晚期AMD相关的病理。湿性AMD的治疗策略需要频繁注射到眼睛中,并且主要集中在延迟疾病的进展上。目前尚无用于干性AMD的批准的治疗。
WO2017/075212总体上涉及抗HtrA1抗体及其使用方法,包括使用抗Htra1抗体作为用于选择患者的生物标记。
Tosi等,IOVS 20017,p162–167报道了患有新生血管性年龄相关性黄斑变性的患者房水中HTRA1浓度升高,经雷珠单抗和靶向VEGF-A的抗体治疗后,房水中HTRA1的水平正常化。
WO 2008/013893要求保护用于治疗患有年龄相关性黄斑变性的受试者的组合物,所述组合物包含含有与HTRA1基因或mRNA杂交的反义序列的核酸分子:没有公开反义分子。WO2009/006460提供靶向HTRA1的siRNA及其在治疗AMD中的用途。
PCT/EP2017/065937和EP17173964.2,其均通过引用以其整体并入,公开反义寡核苷酸,所述反义寡核苷酸是HTRA1 mRNA的有效体内抑制剂,及其治疗用途,包括用于治疗黄斑变性的用途。
发明概述
本发明人已经确定,在来自用HTRA1 mRNA拮抗剂治疗的受试者的视网膜上皮细胞中HTRA1 mRNA的抑制与受试者的房水和玻璃体液中HTRA1蛋白水平之间存在直接相关性。直接相关性允许HTRA1作为用于诊断或预后的生物标记的用途,以确定受试者对用HTRA1mRNA拮抗剂治疗的合适性,以及用HTRA1 mRNA拮抗剂治疗的伴随诊断,例如在患者监测中。
本发明提供了确定受试者对施用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗的合适性的方法,所述方法包括步骤:
i)确定从所述受试者获得的房水或玻璃体液的样品中HTRA1的水平
ii)将步骤i)获得的HTRA1的水平与一个或更多个参考样品或参考值比较;
以确定该受试者是否可能或适于用HTRA1 mRNA拮抗剂治疗,
其中所述受试者患有或处于发生眼部病症诸如黄斑变性的风险。
本发明提供了确定受试者对施用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗的合适性的诊断和预后方法,所述方法包括步骤:
i)确定从所述受试者获得的房水或玻璃体液的样品中HTRA1的水平
ii)将步骤i)获得的HTRA1的水平与一个或更多个参考样品或参考值比较;
以确定该受试者是否可能或适于用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗,
其中所述受试者患有或处于发生眼部病症(诸如黄斑变性)的风险。
本发明提供了确定HTRA1 mRNA拮抗剂对需要用HTRA1 mRNA拮抗剂治疗的受试者的合适剂量方案的方法,所述方法包括步骤:
i)确定从所述受试者获得的房水或玻璃体液的样品中HTRA1的水平
ii)将步骤i)获得的HTRA1的水平与一个或更多个参考样品或参考值比较;
以确定该受试者是否可能或适于用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗,
其中所述受试者患有或处于发生眼部病症(诸如黄斑变性)的风险。
有利地,从本发明的方法或用途中提及的从受试者获得的样品是受试者房水的样品。
本发明提供治疗需要用HTRA1 mRNA拮抗剂治疗的受试者,例如患有黄斑变性或处于发生黄斑变性风险的受试者的方法,所述方法包括:
i)测定从所述受试者获得的房水或玻璃体液样品中HTRA1的水平
ii)将步骤i)获得的HTRA1的水平与一个或更多个参考样品或参考值比较;
iii)以确定该受试者是否可能或适于用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗,
iv)向所述受试者施用有效量的HTRA1 mRNA拮抗剂。
本发明提供HTRA1抗体作为用于HTRA1 RNA拮抗剂治疗的伴随诊断的用途。
本发明提供了HTRA1抗体在检测从受试者获得的房水或玻璃体液样品中HTRA1水平中的用途,所述受试者正在经历用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗,或正在被评价用HTRA1mRNA拮抗剂治疗的合适性。
本发明提供生物标记在确定受试者对包含HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗剂的可能应答中的用途,其中所述生物标记包含与从健康受试者的参考样品获得的HTRA1的水平相比,从受试者的房水或玻璃体液获得的生物样品中HTRA1的水平升高。
附图简述
图1:HTRA1的示例性LNA反义寡核苷酸拮抗剂(SEQ ID NO 13,化合物ID#13,1)
图2:HTRA1的示例性LNA反义寡核苷酸拮抗剂(SEQ ID NO 15,化合物ID#15,3)
图3:HTRA1的示例性LNA反义寡核苷酸拮抗剂(SEQ ID 17,化合物ID#17)
图4:HTRA1的示例性LNA反义寡核苷酸拮抗剂(SEQ ID NO 18,化合物ID#18)
图5:HTRA1的示例性LNA反义寡核苷酸拮抗剂(SEQ ID NO 19,化合物ID#19)
图6:使用图2所示化合物(化合物ID#15,3)的非人灵长类(NHP)PK/PD研究-参见实施例1,IVT施用,25μg/眼。A)通过qPCR在视网膜中测量的HTRA1 mRNA水平。B)通过ISH说明的HTRA1 mRNA水平。C-D)通过IP-MS分别定量视网膜和玻璃体中的HTRA1蛋白水平。点显示个体动物的数据。误差棒显示技术重复(n=3)的标准偏差。
图7.使用图3(化合物ID#73,1)、4(化合物ID#86)和5(化合物ID#67)中所示化合物的NHP PK/PD研究(实施例2):IVT施用,25μg/眼。A)通过qPCR在视网膜中测量的HTRA1 mRNA水平。B)通过寡核苷酸ELISA测量的视网膜中的寡核苷酸含量。C)通过ISH说明的HTRA1mRNA水平。D-E)通过IP-MS分别定量视网膜和玻璃体中HTRA1蛋白水平。点显示个体动物的数据。误差棒显示了技术重复的标准误差(n=3)。F-G)视网膜和玻璃体中HTRA1蛋白水平的减少,其分别通过蛋白质印迹(western blot)进行了说明。
图8.HTRA1蛋白定量-免疫捕获和LC-MS方法。8A该方法的示意图,8B在施用靶向HTRA1 mRNA的LNA反义化合物后,通过LC-MS定量视网膜、玻璃体和房水(vitreous andaqueous humor)中HTRA蛋白水平。8CHTRA1蛋白在视网膜、玻璃体和房水中减少。8D.在IVT25μg单次给药后2、7、14和21天采集的一系列房水样品中的PD分析。
图9A.在食蟹猴(cynomolgus monkeys)中玻璃体内施用化合物#15,3和#17,并在注射后第3,8,15和22天收集房水样品。来自未稀释样品的蛋白质使用Peggy Sue装置(Protein Simple)通过毛细管电泳分析。HTRA1使用定制的多克隆兔抗血清检测。呈现了来自动物#J60154(赋形剂),J60158(C.Id#15,3),J60162(C.Id#17)的数据。
图9B.通过与纯化的重组(S328A突变体)HTRA1蛋白(Origene,#TP700208)进行比较来量化信号强度。此处显示校准曲线。
图9C.上图:来自个体动物的计算出的HTRA1房水浓度针对注射后的时间作图。下图:确定了每个时间点上赋形剂组的平均HTRA1浓度,并计算了治疗动物的相应相对浓度。空心圆:个体值,实心圆:组平均值。指示了第22天的%HTRA1减少。
图10.在用各种靶向HTRA1转录本的LNA分子处理过的食蟹猴的房水(蓝色菱形)或视网膜(红色方块)中,HTRA1 mRNA针对HTRA1蛋白水平作图。值表示为相对于PBS对照标准化的百分比。
图11.在用各种靶向HTRA1转录本的LNA分子处理的食蟹猴房水中的HTRA1蛋白与(A)视网膜中HTRA1蛋白和(B)视网膜中HTRA1 mRNA的相关性。值表示为相对于PBS对照标准化的百分比。
图12A.IVT LNA应用后第36天的平均HTRA1蛋白水平。
HTRA1抑制百分比以蓝色表示。误差棒:组sd。
图12B.在对照(○)和LNA治疗(●)动物中,眼后部组织中HTRA1浓度与眼房水(AH)相比。
图13.房水中HTRA1浓度的动态。
填充符号:活性处理,空符号:赋形剂处理。
个体的标准化值。
图14.在LNA处理和没有LNA处理的情况下,HTRA1 mRNA在不同区室中的表达水平。HTRA1 mRNA水平显示为每百万测序读数的每千碱基读数(RPKM)。误差棒代表至少3只动物的平均RPKM周围的标准偏差。星号表示统计学显著性(错误发现率<0.05)。柱上方的数字显示HTRA1mRNA水平降低百分比。
发明详述
在本说明书中,术语“烷基”,单独或组合地,表示具有1至8个碳原子的直链或支链烷基基团,特别是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基基团,更特别是具有1至4个碳原子的直链或支链烷基基团。直链和支链C1-C8烷基基团的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异构戊基、异构己基、异构庚基和异构辛基,特别是甲基、乙基、丙基、丁基和戊基。烷基的具体实例是甲基、乙基和丙基。
术语“环烷基”,单独或组合地,表示具有3至8个碳原子的环烷基环,特别是具有3至6个碳原子的环烷基环。环烷基的实例是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基,更特别是环丙基和环丁基。“环烷基”的一个具体实例是环丙基。
术语“烷氧基”,单独或组合使用时,表示式烷基-O-的基团,其中术语“烷基”具有前面给出的含义,例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基(n-propoxy)、异丙氧基、正丁氧基(n-butoxy)、异丁氧基、仲丁氧基(sec.butoxy)和叔丁氧基。特别的“烷氧基”是甲氧基和乙氧基。甲氧基乙氧基是“烷氧基烷氧基”的一个具体实例。
单独或组合使用的术语“氧基”表示-O-基团。
术语“烯基”,单独或组合,表示包含烯键和多至8个,优选多至6个,特别优选多至4个碳原子的直链或支链烃残基。烯基基团的例子是乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基和异丁烯基。
术语“炔基”,单独或组合,表示包含三键和多至8个,优选多至6个,特别优选多至4个碳原子的直链或支链烃残基。
术语“卤素(halogen)”或“卤代(halo)”,单独或组合,表示氟、氯、溴或碘,特别是氟、氯或溴,更特别是氟。术语“卤代”,与另一基团组合,表示所述基团用至少一个卤素取代,特别是用一至五个卤素取代,特别是用一至四个卤素,即一个、两个、三个或四个卤素取代。
术语“卤代烷基”,单独或组合地,表示用至少一个卤素取代的烷基,特别是用一至五个卤素,特别是一至三个卤素取代的烷基。卤代烷基的实例包括一氟-、二氟-或三氟-甲基、乙基或丙基,例如3,3,3-三氟丙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟甲基或三氟甲基。氟甲基、二氟甲基和三氟甲基是特别的“卤代烷基”。
术语“卤代环烷基”,单独或组合地,表示用至少一个卤素取代的如上所定义的环烷基基团,特别是用一至五个卤素,特别是一至三个卤素取代。“卤代环烷基”的具体实例是卤代环丙基,特别是氟环丙基、二氟环丙基和三氟环丙基。
术语“羟基”和“羟基”,单独或组合,表示-OH基团。
术语“硫代羟基”和“硫代羟基的”,单独或组合,表示-SH基团。
术语“羰基”,单独或组合,表示-C(O)-基团。
术语“羧基(carboxy)”或“羧基(carboxyl)”,单独或组合,表示-COOH基团。
术语“氨基”,单独或组合,表示伯氨基(-NH2)、仲氨基(-NH-),或叔氨基(-N-)。
术语“烷基氨基”,单独或组合地,表示用一个或两个如上定义的烷基取代的如上定义的氨基基团。
术语“磺酰基”,单独或组合,是指-SO2基团。
术语“亚磺酰基”,单独或组合,表示-SO-基团。
术语“硫烷基(sulfanyl)”,单独或组合,表示-S-基团。
术语“氰基”,单独或组合,表示-CN基团。
术语“叠氮基”,单独或组合,表示-N3基团。
术语“硝基”,单独或组合,表示NO2基团。
术语“甲酰基”,单独或组合地,表示-C(O)H基团。
术语“氨基甲酰基”,单独或组合地,表示-C(O)NH2基团。
术语“脲基(cabamido)”,单独或组合,表示-NH-C(O)-NH2基团。
术语“芳基”,单独或组合,表示单价芳族碳环单环或双环环系,其包含6至10个碳环原子,任选被1至3个取代基取代,所述取代基独立地选自卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲酰基。芳基的实例包括苯基和萘基,特别是苯基。
术语“杂芳基”,单独或组合,表示5至12个环原子的单价芳族杂环单环或双环环系,其包含选自N、O和S的1、2、3或4个杂原子,剩下的环原子是碳,所述碳任选被1至3个取代基取代,所述取代基独立地选自卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲酰基。杂芳基的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、***基、噁二唑基(oxadiazolyl)、噻二唑基(thiadiazolyl)、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮杂基(azepinyl)、二氮杂基、异噁唑基、苯并呋喃基、异噻唑基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、异苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并***基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉、咔唑基或吖啶基。
术语“杂环基”,单独或组合,表示4至12个环原子(尤其是4至9个环原子)的单价饱和或部分不饱和的单环或双环***,包含选自N、O和S的1、2、3或4个杂原子,剩下的环原子是碳,所述碳任选用1至3个取代基取代,所述取代基独立地选自卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲酰基。单环饱和杂环基的实例是氮杂环丁烷基(azetidinyl)、吡咯烷基(pyrrolidinyl)、四氢呋喃基(tetrahydrofuranyl)、四氢噻吩基、吡唑烷基(pyrazolidinyl)、咪唑烷基(imidazolidinyl)、噁唑烷基(oxazolidinyl)、异噁唑烷基(isoxazolidinyl)、噻唑烷基(thiazolidinyl)、哌啶基(piperidinyl)、四氢吡喃基(tetrahydropyranyl)、四氢硫代吡喃基(tetrahydrothiopyranyl)、哌嗪基(piperazinyl)、吗啉基(morpholinyl)、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、1,1-二氧-硫代吗啉-4-基(1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl),氮杂环庚基(azepanyl)、二氮杂环庚基(diazepanyl)、高哌嗪基(homopiperazinyl)或氧杂氮杂环庚基(oxazepanyl)。双环饱和杂环烷基的实例是8-氮杂-双环[3.2.1]辛基、奎宁环基、8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛基、9-氮杂-双环[3.3.1]壬基、3-氧杂-9-氮杂-双环[3.3.1]壬基或3-硫杂-9-氮杂-双环[3.3.1]壬基。部分不饱和杂环烷基的实例是二氢呋喃基、咪唑啉基、二氢-噁唑基、四氢-吡啶基或二氢吡喃基。
术语“药学上可接受的盐”是指保留游离碱或游离酸的生物学有效性和性质的那些盐,这在生物学上或其他方面都不是不希望的。盐是用无机酸(例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、特别是氢氯酸),以及有机酸(例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、N-乙酰半胱氨酸)形成的。另外,这些盐可以通过将无机碱或有机碱加到游离酸中来制备。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐,经取代的胺(包括天然存在的经取代的胺、环胺和碱性离子交换树脂,诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、多胺树脂)。本发明的寡核苷酸也可以两性离子的形式存在。本发明特别优选的药学上可接受的盐是氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和甲磺酸的盐。
术语“保护基团”,单独或组合,表示选择性地封闭多官能化合物中反应位点的基团,从而可以在另一个未保护的反应位点选择性地进行化学反应。可以除去保护基团。示例性的保护基团是氨基保护基团,羧基保护基团或羟基保护基团。
“羟基保护基团”是羟基基团的保护基团,还用于保护巯基基团。羟基保护基的例子是乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(dimethoxytrityl)(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(DMT)、三甲氧基三苯甲基(trimethoxytrityl)(或三-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(TMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMT)、对甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基或三苯甲基(Tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(tert-butyldimethylsilyl)(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)、甲基醚和乙氧基乙基醚(EE)。羟基保护基团的具体实例是DMT和TMT,特别是DMT。
如果本发明的起始材料或化合物之一含有一个或更多个在一个或更多个反应步骤的反应条件下不稳定或具有反应性的官能团,则能够在关键步骤之前应用本领域众所周知的方法引入适当的保护基团(如T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第三版,1999,Wiley,NewYork的“Protective Groups in Organic Chemistry”中所述的)。可以使用文献中描述的标准方法在合成的后期去除此类保护基团。保护基团的例子是叔丁氧基羰基(Boc),9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc),2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc),苄氧羰基(carbobenzyloxy)(Cbz)和对甲氧基苄氧基羰基(Moz)。
本文所述的化合物可以包含几个不对称中心,并且可以以光学纯的对映异构体、对映异构体的混合物(例如外消旋体)、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体或非对映异构外消旋体混合物的形式存在。
药剂(例如药物制剂)的“有效量”,是指在必要的剂量和时间段上有效实现期望治疗或预防结果的量。
寡核苷酸
如本文所用,术语“寡核苷酸”被定义为技术人员通常理解为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚体。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化来制备。当提及寡核苷酸的序列时,参考共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。寡核苷酸是人造的,并且是化学合成的,并且通常是纯化或分离的。寡核苷酸可包含一种或更多种经修饰的核苷或核苷酸。
本发明中提及的HTRA1 RNA拮抗剂可以是能够调节HTRA1靶核酸表达的寡核苷酸,例如siRNA或反义寡核苷酸。通过HTRA1 RNA拮抗剂的调节包括抑制、下调、减少、阻抑、去除、停止、阻断、预防、减轻、降低、避免或终止HTRA1的表达的能力,例如通过mRNA的降解或转录的阻断,或经由HTRA1前体-mRNA的可变剪接(HTRA1前体-mRNA的剪接调节)。
siRNA和shRNA
在一些实施方案中,HTRA1 mRNA拮抗剂是siRNA或shRNA。
siRNA是短的双链复合物,包含有义链和反义链,它们共同形成18-25个碱基对的双链体区域。靶向HTRA1的siRNA的反义链与HTRA1靶核酸(例如HTRA1 mRNA)互补。US2007185317公开了靶向HTRA1的siRNA。
短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA/发夹载体)是具有紧密发夹形转角的人造RNA分子,可用于经由RNA干扰(RNAi)沉默靶基因表达。shRNA在细胞中的表达通常由质粒的递送或通过病毒或细菌载体来完成。
反义寡核苷酸
有利地,HTRA1 mRNA拮抗剂是靶向HTRA1核酸的反义寡核苷酸。
本文所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过在表达靶核酸的细胞中与靶核酸杂交,特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的,并且因此不是siRNA或shRNAs。优选地,本发明的反义寡核苷酸是单链的。应当理解,本发明的单链寡核苷酸能够形成发夹或分子间双链体结构(相同寡核苷酸的两个分子之间的双链体),只要其内部或之间的自身互补性程度小于全长寡核苷酸的50%即可。本发明的反义寡核苷酸是人造的,并且是化学合成的,并且通常是纯化或分离的。本发明的反义寡核苷酸可包含一种或更多种经修饰的核苷或核苷酸。
连续核苷酸区域
术语“连续核苷酸序列”是指寡核苷酸与靶核酸互补的区域。该术语在本文中可以与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施方案中,寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施方案中,寡核苷酸包含连续的核苷酸序列,例如F-G-F'gapmer区域,并且可以任选地包含其他核苷酸,例如可以用于将官能团连接至连续的核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区可以与靶核酸互补或可以不互补。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元,并且出于本发明的目的,核苷酸包括天然存在和非天然存在的核苷酸。在自然界中,核苷酸,诸如DNA和RNA核苷酸包含核糖部分,核碱基部分和一个或更多个磷酸基团(在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。
经修饰的核苷
本文所用的术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比,通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或更多种修饰而被修饰的核苷。在一个优选的实施方案中,经修饰的核苷包含经修饰的糖部分。术语经修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称为DNA或RNA核苷。如果允许沃森克里克碱基配对,则在DNA或RNA核苷碱基区域中具有修饰的核苷通常仍被称为DNA或RNA。
经修饰的核苷间连接
术语“经修饰的核苷间连接”被定义为如技术人员通常所理解的,除磷酸二酯(PO)连接以外的连接,其将两个核苷共价偶联在一起。因此,本发明的寡核苷酸可包含经修饰的核苷间连接。在一些实施方案中,与磷酸二酯连接相比,经修饰的核苷间连接增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸,核苷间连接包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸基团。经修饰的核苷间连接特别可用于稳定体内使用的寡核苷酸,并可用于防止本发明寡核苷酸中DNA或RNA核苷的区域(诸如在gapmer寡核苷酸的缺口(gap)区域内,以及在经修饰的核苷的区域内,诸如区域F和F')的核酸酶切割。
在一个实施方案中,寡核苷酸包含从天然磷酸二酯修饰的一个或更多个核苷间连接,诸如例如对核酸酶攻击更具抗性的一个或更多个经修饰的核苷间连接。核酸酶抗性可以通过在血清中温育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定法(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定,两者都是本领域熟知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间连接称为核酸酶抗性核苷间连接。在一些实施方案中,寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50%的核苷间连接,是经修饰的,寡核苷酸或其连续核苷酸序列中诸如至少60%,诸如至少70%,诸如至少75%诸如至少80%或诸如至少90%的核苷间连接,是核酸酶抗体的核苷间连接。在一些实施方案中,寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的所有核苷间连接,都是核酸酶抗性的核苷间连接。应当认识到,在一些实施方案中,将本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团(诸如缀合物)连接的核苷可以是磷酸二酯。
用于本发明的寡核苷酸的优选的经修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯。
硫代磷酸酯核苷间连接由于核酸酶抗性,有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施方案中,寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50%的核苷间连接是硫代磷酸酯,寡核苷酸或其连续核苷酸序列中诸如至少60%,诸如至少70%,诸如至少75%诸如至少80%或诸如至少90%的核苷间连接,是硫代磷酸酯。在一些实施方案中,所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间连接是硫代磷酸酯。在一些实施方案中,本发明的寡核苷酸除包含二硫代磷酸酯连接外,还包含硫代磷酸酯核苷间连接和至少一个磷酸二酯连接,诸如2、3或4个磷酸二酯连接。在gapmer寡核苷酸中,磷酸二酯连接(当存在时)适当地不位于缺口区域G中连续的DNA核苷之间。
核酸酶抗性连接,诸如硫代磷酸酯连接,在与靶核酸形成双链体时能够募集核酸酶的寡核苷酸区域中特别有用,例如针对gapmer的区域G。然而,硫代磷酸酯连接也可用于非核酸酶募集区域和/或亲和力增强区域,诸如gapmer的F和F'区。在一些实施方案中,gapmer寡核苷酸可在区域F或F',或区域F和F'两者中包含一个或更多个磷酸二酯连接,其中在区域G中的所有核苷间连接可为硫代磷酸酯。
有利地,在寡核苷酸的连续核苷酸序列中的所有核苷间连接,或寡核苷酸的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯连接。
公认的是,如EP 2 742 135中所公开的,反义寡核苷酸可包含其他核苷间连接(除磷酸二酯和硫代磷酸酯之外),例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯核苷间核苷酸,根据EP 2 742135,可例如在另外的(otherwise)DNA硫代磷酸酯缺口区域被容忍。
核碱基
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(诸如尿嘧啶,胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分,其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中,术语核碱基也涵盖经修饰的核碱基,所述经修饰的核碱基可能不同于天然存在的核碱基,但是在核酸杂交期间起作用。在本文中,“核碱基”是指天然存在的核碱基,诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤,以及非天然存在的变体。这样的变体例如描述于Hirao等(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1中。
在一些实施方案中,核碱基部分通过将嘌呤或嘧啶改变为经修饰的嘌呤或嘧啶而修饰,经修饰的嘌呤或嘧啶诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶,诸如选自异胞嘧啶,假异胞嘧啶(pseudoisocytosine),5-甲基胞嘧啶,5-硫代-胞嘧啶的核碱基,5-丙炔基-胞嘧啶,5-丙炔基-尿嘧啶,5-溴尿嘧啶5-噻唑并尿嘧啶,2-硫代-尿嘧啶,2'硫代-胸腺嘧啶,肌苷,二氨基嘌呤,6-氨基嘌呤,2-氨基嘌呤,2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码表示,例如,A,T,G,C或U,其中每个字母可任选地包括具有等同功能的经修饰的核碱基。例如,在示例性的寡核苷酸中,核碱基部分选自A,T,G,C和5-甲基胞嘧啶。任选地,对于LNA gapmer,可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
经修饰的寡核苷酸
术语经修饰的寡核苷酸描述了包含一个或更多个糖修饰的核苷和/或经修饰的核苷间连接的寡核苷酸。术语“嵌合的”寡核苷酸是在文献中已用于描述具有经修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
互补性
术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的沃森-克里克碱基配对的能力。沃森-克里克碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解,寡核苷酸可包含具有经修饰的核碱基的核苷,例如通常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶,因此,术语互补性涵盖未修饰和修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对碱基配对(参见例如Hirao等(2012)Accounts of Chemical Research第45卷,第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1)。
如本文所用,术语“%互补”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的核苷酸的比率(以百分比表示),所述核酸分子跨越连续的核苷酸序列与参考序列(例如,靶序列或序列基序)互补。因此,互补性的百分比通过计数两个序列之间(当与靶序列5'-3'和3'-5'的寡核苷酸序列比对时)互补的(沃森克里克碱基对)经比对的核碱基的数目,将该数除以寡核苷酸中的核苷酸总数,然后乘以100来计算。在这种比较中,不对齐(不形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。在计算连续核苷酸序列的%互补性时,不允许***和缺失。应当理解,在确定互补性时,只要保留了形成沃森克里克碱基配对的核碱基的功能能力,就无需理会核碱基的化学修饰(例如,出于计算%同一性的目的,认为5'-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
术语“完全互补”是指100%互补性。
同一性
如本文所用,术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的核苷酸的比率(以百分比表示),所述核酸分子跨越连续的核苷酸序列与参考序列(例如,序列基序)一致。因此,同一性的百分比通过计算经比对(发明的化合物的连续的核苷酸序列中的和参考序列中的)两个序列之间一致(匹配)的碱基的数,将该数除以寡核苷酸中的核苷酸总数,然后乘以100来计算。因此,同一性的百分比=(匹配数x 100)/对齐区域的长度(例如,连续的核苷酸序列)。在计算连续核苷酸序列的同一性的百分比时,不允许***和缺失。应当理解,在确定同一性时,只要保留了形成沃森克里克碱基配对的核碱基的功能能力,就无需理会核碱基的化学修饰(例如,出于计算%同一性的目的,认为5'-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
杂交
如本文所用,术语“进行杂交”或“杂交”应理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相对链上的碱基对之间形成氢键,从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。通常用解链温度(Tm)来描述,解链温度定义为一半寡核苷酸与靶核酸双链体化的温度。在生理条件下,Tm与亲和力并不严格成比例(Mergny和Lacroix,2003,Oligonucleotides13:515–537)。标准状态吉布斯自由能ΔG°是结合亲和力的更精确表示,并且通过ΔG°=-RTln(Kd)与反应的解离常数(Kd)相关,其中R是气体常数,且T是绝对温度。因此,寡核苷酸与靶核酸之间的反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸与靶核酸之间的强杂交。ΔG°是与如下水溶液浓度为1M,pH为7,温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应,对于自发反应,ΔG°小于零。ΔG°可以通过实验来测量,例如,通过使用例如,Hansen等,1965,Chem.Comm.36–38和Holdgate等,2005,Drug Discov Today中所述的等温滴定量热法(ITC)。技术人员将知道商用设备可用于ΔG°测量。ΔG°也可以通过使用SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460–1465中描述的最近邻模型,使用Sugimoto等,1995,Biochemistry 34:11211–11216和McTigue等,2004,Biochemistry43:5388–5405中描述的适当衍生的热力学参数进行数值估计。为了具有通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性,对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸,本发明的寡核苷酸以估计的低于-10kcal的ΔG°值与靶核酸杂交。在一些实施方案中,杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能ΔG°测量。对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸,寡核苷酸可以以估计的低于-10kcal的范围(诸如低于-15kcal,诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal)的ΔG°值与靶核酸杂交。在一些实施方案中,寡核苷酸以约-10至-60kcal,诸如-12至-40,诸如从-15至-30kcal或-16至-27kcal诸如-18至-25kcal的估计ΔG°值与靶核酸杂交。
靶序列
如本文所用,术语“靶序列”是指靶核酸中存在的核苷酸序列,其包含与本发明的反义寡核苷酸互补的核碱基序列。在一些实施方案中,靶序列由靶核酸上的区域组成,所述靶核苷酸具有本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列。靶核酸的该区域可以可互换地称为靶核苷酸序列、靶序列或靶区域。在一些实施方案中,靶序列比单个寡核苷酸的连续互补序列长,并且可以例如代表可以被本发明的若干种寡核苷酸靶向的靶核酸的优选区域。
本发明的反义寡核苷酸包含与靶核酸如本文所述的靶序列互补的连续核苷酸序列。
与寡核苷酸互补的靶序列通常包含至少10个核苷酸的连续核碱基序列。连续核苷酸序列在10至50个核苷酸之间,诸如12至30个,诸如14至20个,诸如15至18个连续核苷酸
靶细胞
如本文所用,术语“靶细胞”是指表达靶核酸的细胞。在一些实施方案中,靶细胞可以在体内或体外。在一些实施方案中,靶细胞是哺乳动物细胞,例如啮齿动物细胞,例如小鼠细胞,或大鼠细胞,或灵长类动物细胞,例如猴细胞或人细胞。
高亲和力经修饰的核苷
高亲和力经修饰的核苷是一种经修饰的核苷酸,当被掺入寡核苷酸时,其可增强寡核苷酸对其互补靶标的亲和力,诸如通过解链温度(Tm)所测量的。本发明的高亲和力经修饰的核苷优选导致解链温度升高每个修饰的核苷+0.5至+12℃之间,更优选+1.5至+10℃之间,最优选在+3至+8℃。许多高亲和力经修饰的核苷在本领域中是已知的,并且包括例如许多2'取代的核苷以及锁定的核酸(locked nucleic acid,LNA)(参见例如Freier&Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann;Curr.Opinion in DrugDevelopment,2000,3(2),293-213)。
糖修饰
本发明的寡聚体可以包含一个或更多个具有经修饰的糖部分的核苷,即与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时糖部分的修饰。
已经制备了许多具有核糖糖部分修饰的核苷,主要是为了改善寡核苷酸的某些性质,诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
此类修饰包括其中核糖环结构是经修饰的(诸如通过用己糖环(HNA)或双环替代)那些,其通常在核糖环(LNA)的C2和C4碳之间具有双基桥(biradicle bridge),或通常缺乏C2和C3碳之间的键的未连接的核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括,例如,双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括以下核苷,其中例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下糖部分被非糖部分替代。
经2'修饰的核苷。
经2'糖修饰的核苷是如下的核苷,其在2'位置具有除H或–OH以外的取代基(经2'取代的核苷)或包含能够在核糖环的2'碳和第二碳之间形成桥的2'连接的双基,诸如LNA(2'-4'双基桥联)核苷。
实际上,已经将很多注意力集中在开发经2'取代的核苷上,并且已发现许多经2'取代的核苷在掺入寡核苷酸时具有有益的性质。例如,经2'修饰的糖可以为寡核苷酸提供增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。经2'取代修饰的核苷的实例是2'-O-烷基-RNA,2'-O-甲基-RNA,2'-烷氧基-RNA,2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE),2'-氨基-DNA,2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。有关其他实例,请参见例如Freier&Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213,以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937。下面是一些经2'取代修饰的核苷的图示。
关于本发明,2'取代的糖修饰的核苷不包括像LNA那样的2'桥联的核苷。
锁定的核酸(LNA)
“LNA核苷”是经2'修饰的核苷,其包含连接所述核苷的核糖糖环的C2'和C4'的双基(也称为“2'-4'桥”),其限制或锁住核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥联核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补的RNA或DNA分子的寡核苷酸中时,核糖的构象的锁定与杂交的亲和力增强(双链体稳定化)有关。这可以通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度常规确定。
没有限制,示例性LNA核苷公开于WO 99/014226,WO 00/66604,WO98/039352,WO2004/046160,WO 00/047599,WO 2007/134181,WO2010/077578,WO 2010/036698,WO 2007/090071,WO 2009/006478,WO2011/156202,WO 2008/154401,WO 2009/067647,WO 2008/150729,Morita等,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76,Seth等J.Org.Chem.2010,Vol75(5)pp.1569-81,和Mitsuoka等,Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238,以及Wan和Seth,J.Medical Chemistry 2016,59,9645-9667。
其他非限制性的示例性LNA核苷公开于方案1中。
方案1:
特定的LNA核苷是β-D-氧基-LNA,6'-甲基-β-D-氧基LNA,例如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。
如在实施例的化合物中使用的,特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。
RNA酶H的活性和募集
反义寡核苷酸的RNA酶H活性是指其与互补RNA分子形成双链体时募集RNA酶H的能力。WO01/23613提供用于测定RNA酶H活性的体外方法,其可以用于测定募集RNA酶H的能力。通常如果是以下情况则认为寡核苷酸能够募集RNA酶H:当与互补靶核酸序列一起提供时所述寡核苷酸具有使用寡核苷酸(其与被测试的经修饰的寡核苷酸具有相同碱基序列但仅含有DNA单体,寡核苷酸中所有单体之间具有硫代磷酸酯连接)以及使用WO01/23613(通过引用并入)的实施例91-95提供的方法测定的初始速率的至少5%,诸如至少10%,或者20%以上的以pmol/1/min测量的初始速率。对于确定RNA酶H活性的用途,重组人RNA酶H1可购自Lubio Science GmbH,Lucerne,Switzerland。
Gapmer
反义寡核苷酸,或其连续的核苷酸序列可以是gapmer。反义gapmer通常经由RNA酶H介导的降解抑制靶核苷酸。gapmer寡核苷酸以'5→3'方向包含至少三个不同的结构区域,5'-侧翼,缺口和3'-侧翼,F-G-F'。“缺口”区域(G)包含一段使寡核苷酸能够募集RNA酶H的连续DNA核苷酸。该缺口区域的侧翼是包含一个或更多个糖修饰的核苷,有利地是高亲和力糖修饰的核苷的5'侧翼区域(F),以及包含一个或更多个糖修饰的核苷,有利地是高亲和力的糖修饰的核苷的3'侧翼区域(F')。在区域F和F'中的一个或更多个糖修饰的核苷增强了寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即,是亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施方案中,区域F和F'中的一个或更多个糖修饰的核苷是2'糖修饰的核苷,诸如高亲和力的2'糖修饰,诸如独立地选自LNA和2'-MOE。
在gapmer设计中,缺口区域的最(most)5'和3'的核苷是DNA核苷,分别位于5'(F)或3'(F')区域的糖修饰核苷附近。侧翼还可以通过在最远离缺口区域的末端,即在5'侧翼的5'末端和3'侧翼的3'末端具有至少一个糖修饰的核苷来定义。
区域F-G-F'形成连续的核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列,可以包含式F-G-F'的gapmer区域。
gapmer设计F-G-F'的总长度可以是,例如12至32个核苷,诸如13至24个,诸如14至22个核苷,诸如14至17个,诸如16至18个核苷。
举例来说,本发明的gapmer寡核苷酸可以由下式表示:
F1-8-G5-16-F'1-8,诸如
F1-8-G7-16-F'2-8
条件是gapmer区域F-G-F'的总长度为至少12,诸如至少14个核苷酸长度。
区域F、G和F'在下面进一步定义,可以掺入到F-G-F'公式中。
Gapmer-区域G
gapmer的区域G(缺口区域)是核苷的区域,其使得寡核苷酸能够募集RNAaseH,诸如人RNase H1,通常是DNA核苷。RNaseH是一种细胞酶,其识别DNA和RNA之间的双链体,并酶促切割RNA分子。适当地,gapmer可以具有长度为至少5或6个连续的DNA核苷,诸如5-16个连续的DNA核苷,诸如6-15个连续的DNA核苷,诸如7-14个连续的DNA核苷,诸如8–12个连续的DNA核苷酸,诸如8–12个连续的DNA核苷酸的缺口区(G)。在一些实施方案中,缺口区G可以由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续的DNA核苷组成。在某些情况下,缺口区域中的胞嘧啶(C)DNA可能被甲基化,此类残基要么标注为5-甲基-胞嘧啶(meC要么用e代替c)。如果在缺口中存在cg二核苷酸以减少潜在的毒性,则在缺口中的胞嘧啶DNA的甲基化是有利的,该修饰对寡核苷酸的功效没有显著影响。
在一些实施方案中,缺口区G可以由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续的硫代磷酸酯连接的DNA核苷组成。在一些实施方案中,缺口中的所有核苷间连接是硫代磷酸酯连接。
尽管传统的gapmer具有DNA缺口区域,但是有许多经修饰核苷的实例,当它们在缺口区域内使用时,其允许RNaseH募集。已报道当被包括在缺口区域内时能够募集RNaseH的经修饰的核苷包括例如alpha-L-LNA,C4'烷基化的DNA(如PCT/EP2009/050349和Vester等,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296–2300所述,两个均通过引用并入本文),***糖衍生的的核苷,如ANA和2'F-ANA(Mangos等,2003J.AM.CHEM.SOC.125,654-661),UNA(未锁定的核酸)(如Fluiter等,Mol.Biosyst.,2009,10,1039中描述的,其通过引用并入本文)。UNA是未锁定的核酸,通常是核糖的C2和C3之间的键已被去除,形成未锁定的“糖”残基。用于这种gapmer的经修饰的核苷可以是当引入缺口区域时采用2'内切(endo)(DNA样)结构的核苷,即允许RNaseH募集的修饰)。在一些实施方案中,本文所述的DNA缺口区域(G)可任选地包含1至3个糖修饰的核苷,所述糖修饰的核苷在被引入缺口区域中时采用2'内切(DNA样)结构。
G区域-“缺口-破坏子”
备选地,有许多关于***经修饰的核苷的报道,该修饰的核苷赋予3'内切构象到gapmer的缺口区域中,同时保留了一些RNaseH活性。具有包括一个或更多个3'内切修饰的核苷的缺口区域的这种gapmer被称为“缺口破坏子(gap-breaker)”或“缺口破坏的”gapmer,参见例如WO2013/022984。缺口破坏子寡核苷酸在缺口区域内保留了足够的DNA核苷区域,以允许RNaseH募集。缺口破坏子寡核苷酸设计募集RNaseH的能力通常是序列或甚至是化合物特异性的–参见Rukov等2015Nucl.Acids Res.Vol.43pp.8476-8487,其公开了募集某些情况下提供靶RNA的更特异性切割的RNaseH的“缺口破坏子”寡核苷酸。在缺口破坏子寡核苷酸的缺口区域内使用的经修饰的核苷可以是例如赋予3'内切构象(confirmation)的经修饰的核苷,例如2'-O-甲基(OMe)或2'-O-MOE(MOE)核苷或β-D LNA核苷(核苷的核糖糖环的C2'和C4'之间的桥处于β构象),例如β-D-氧基LNA或ScET核苷。
如上述含有区域G的gapmer一样,缺口破坏子或缺口破坏的gapmer的缺口区域在缺口的5'端(与区域F的3'核苷相邻)具有DNA核苷,而在缺口的3'末端具有DNA核苷(与区域F'的5'核苷相邻)。包含破坏的缺口的gapmer通常在缺口区域的5'端或3'端保留至少3或4个连续DNA核苷的区域。
缺口破坏子寡核苷酸的示例性设计包括
F1-8-[D3-4-E1-D3-4]-F'1-8
F1-8-[D1-4-E1-D3-4]-F'1-8
F1-8-[D3-4-E1-D1-4]-F'1-8
其中区域G在方括号[Dn-Er-Dm]之内,D是DNA核苷的连续序列,E是经修饰的核苷(缺口破坏子或破坏缺口的核苷),F和F'是本文所定义的侧翼区域,条件是gapmer区域F-G-F'的总长度为至少12个,诸如为至少14个核苷酸长度。
在一些实施方案中,缺口破坏的gapmer的区域G包含至少6个DNA核苷,诸如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个DNA核苷。如上所述,DNA核苷可以是连续的或可以任选地散布有(be interspersed with)一个或更多个经修饰的核苷,条件是缺口区域G能够介导RNaseH募集。
Gapmer-的侧翼区域,F和F'
区域F紧邻区域G的5'DNA核苷。区域F的最3'的核苷是糖修饰的核苷,诸如高亲和力的糖修饰的核苷,例如2'取代的核苷,诸如MOE核苷或LNA核苷。
区域F'紧邻区域G的3'DNA核苷。区域F’的最5'的核苷是糖修饰的核苷,诸如高亲和力的糖修饰的核苷,例如2'取代的核苷,诸如MOE核苷或LNA核苷。
区域F的长度为1-8个连续核苷酸,诸如2-6个,诸如3-4个连续核苷酸。有利的是,区域F的最5'的核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中,区域F的两个最5'核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中,区域F的最5'核苷是LNA核苷。在一些实施方案中,区域F的两个最5'核苷是LNA核苷。在一些实施方案中,区域F的两个最5'的核苷是2'取代的核苷核苷(nucleoside nucleosides),诸如两个3'MOE核苷。在一些实施方案中,区域F的最5'核苷是2'取代的核苷,例如MOE核苷。
区域F'的长度是2-8个连续核苷酸,诸如3-6个,例如长度为4-5个连续核苷酸。有利地,在实施方案中,区域F'的最3'的核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中,区域F'的两个最3'的核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中,区域F'的两个最3'核苷是LNA核苷。在一些实施方案中,区域F'的最3'的核苷是LNA核苷。在一些实施方案中,区域F'的两个最3'的核苷是2'取代的核苷核苷(nucleoside nucleosides),诸如两个3'MOE核苷。在一些实施方案中,区域F'的最3'核苷是2'取代的核苷,例如MOE核苷。
应当注意,当区域F或F'的长度为1时,它有利地是LNA核苷。
在一些实施方案中,区域F和F'独立地由糖修饰的核苷的连续序列组成或包括其。在一些实施方案中,区域F的糖修饰的核苷可独立地选自2'-O-烷基-RNA单元,2'-O-甲基-RNA,2'-氨基-DNA单元,2'-氟-DNA单元,2'-烷氧基-RNA,MOE单元,LNA单元,***核酸(ANA)单元和2'-氟-ANA单元。
在一些实施方案中,区域F和F'独立地包含LNA和2'取代的经修饰的核苷二者(混合翼设计)。
在一些实施方案中,区域F和F'仅由一种类型的糖修饰的核苷组成,诸如仅MOE或仅β-D-氧基LNA或仅ScET。这样的设计也被称为统一侧翼或统一gapmer设计。
在一些实施方案中,区域F或F',或F和F'的所有核苷均为LNA核苷,诸如独立地选自β-D-氧基LNA,ENA或ScET核苷。在一些实施方案中,区域F由1-5个,诸如2-4个,诸如3-4个,诸如1、2、3、4或5个连续的LNA核苷组成。在一些实施方案中,区域F和F'的所有核苷都是β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施方案中,区域F或F',或F和F'的所有核苷都是2'取代的核苷,诸如例如OMe或MOE核苷。在一些实施方案中,区域F由1、2、3、4、5、6、7或8个连续的OMe或MOE核苷组成。在一些实施方案中,仅侧翼区域之一能够由2'取代的核苷,诸如OMe或MOE核苷组成。在一些实施方案中,是5'(F)侧翼区域由2'取代的核苷,例如OMe或MOE核苷组成,而3'(F')侧翼区域包含至少一个LNA核苷,诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些实施方案中,是3'(F')侧翼区域由2'取代的核苷,例如OMe或MOE核苷组成,而5'(F)侧翼区域包含至少一个LNA核苷,诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
在一些实施方案中,区域F和F'的所有修饰的核苷是LNA核苷,诸如独立地选自β-D-氧基LNA,ENA或ScET核苷,其中区域F或F',或F和F'可以任选地包含DNA核苷(交替(alternating)侧翼,更多细节请参见这些的定义)。在一些实施方案中,区域F和F'的所有修饰的核苷是β-D-氧基LNA,其中区域F或F',或F和F'可以任选地包含DNA核苷(交替侧翼,更多细节请参见这些的定义)。
在一些实施方案中,区域F和F'的最5'和最3'核苷是LNA核苷,例如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。
在一些实施方案中,区域F和区域G之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。在一些实施方案中,区域F'和区域G之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。在一些实施方案中,区域F或F',F和F'的核苷之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
另外的gapmer设计公开于WO 2004/046160、WO 2007/146511和WO2008/113832,通过引用并入。
LNA Gapmer
LNA gapmer是其中区域F和F'之一或两者包含LNA核苷或由LNA核苷组成的gapmer。β-D-氧基gapmer是其中区域F和F'之一或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的gapmer。
在一些实施方案中,LNA gapmer具有式:[LNA]1-5-[区域G]-[LNA]1-5,其中区域G如在gapmer区域G的定义中所定义。
MOE Gapmer
MOE gapmer是其中区域F和F'由MOE核苷组成的gapmer。在一些实施方案中,MOEgapmer是设计[MOE]1-8-[区域G]-[MOE]1-8,诸如[MOE]2-7-[区域G]5-16-[MOE]2-7,诸如[MOE]3-6-[区域G]-[MOE]3-6,其中区域G是如Gapmer定义所定义的。具有5-10-5设计的MOEgapmer(MOE-DNA-MOE)已在本领域中广泛使用。
混合翼Gapmer
混合翼gapmer是LNA gapmer,其中区域F和F'之一或两者包含2'取代的核苷,诸如独立地选自由以下组成的组的2'取代的核苷:2'-O-烷基-RNA单元,2'-O-甲基-RNA,2'-氨基-DNA单元,2'-氟-DNA单元,2'-烷氧基-RNA,MOE单元,***核酸(ANA)单元和2'-氟-ANA单元,诸如MOE核苷。在一些实施方案中,其中区域F和F'中的至少一个,或区域F和F'两者包含至少一个LNA核苷,区域F和F'的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在一些实施方案中,其中区域F和F'中的至少一个,或区域F和F'两者包含至少两个LNA核苷,区域F和F'的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在一些混合翼的实施方案中,区域F和F'之一或两者可进一步包含一个或更多个DNA核苷。
混合翼gapmer设计公开于WO 2008/049085和WO 2012/109395,其特此通过引用并入。
交替侧翼Gapmer
侧翼区域可包含LNA和DNA核苷两者,并被称为“交替侧翼”,因为它们包含LNA-DNA-LNA核苷的交替基序。包括这样的交替侧翼的gapmer被称为“交替侧翼gapmer”。因此,“交替侧翼gapmer”是其中除LNA核苷外,至少一个侧翼(F或F')还包含DNA的LNA gapmer寡核苷酸。在一些实施方案中,区域F或F'中的至少一个,或区域F和F'两者,包含LNA核苷和DNA核苷两者。在这样的实施方案中,侧翼区F或F',或F和F'两者都包含至少三个核苷,其中F和/或F'区域的最5'和3'核苷是LNA核苷。
在WO 2016/127002中公开了交替侧翼LNA gapmer。
具有交替侧翼的寡核苷酸是LNA gapmer寡核苷酸,其中至少一个侧翼(F或F')除LNA核苷外还包含DNA。在一些实施方案中,区域F或F'中的至少一个,或区域F和F'两者,包含LNA核苷和DNA核苷两者。在这样的实施方案中,侧翼区F或F',或F和F'两者都包含至少三个核苷,其中F和/或F'区域的最5'和3'核苷是LNA核苷。
在一些实施方案中,区域F或F'中的至少一个,或区域F和F'两者,包含LNA核苷和DNA核苷两者。在这样的实施方案中,侧翼区F或F',或F和F'两者都包含至少三个核苷,其中F或F'区域的最5'和3'核苷是LNA核苷。包含LNA和DNA核苷两者的侧翼区域,被称为交替侧翼,因为它们包含LNA-DNA-LNA核苷的交替基序。在WO2016/127002中公开了交替侧翼LNAgapmer。
交替侧翼区域可包含多达3个连续的DNA核苷,诸如1至2或1或2或3个连续的DNA核苷。
交替侧翼可以注释为一系列整数,代表LNA核苷(L)的个数,然后是DNA核苷(D)的个数,例如
[L]1-3-[D]1-4-[L]1-3
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2
在寡核苷酸设计中,这些通常会以数字表示,使得2-2-1代表5'[[L]2-[D]2-[L]3',而1-1-1-1-1代表5'[L]-[D]-[L]-[D]-[L]3'。具有交替侧翼的寡核苷酸中的侧翼长度(区域F和F')可以独立地为3至10个核苷,诸如4至8个,诸如5至6个核苷,诸如4、5、6或7个经修饰的核苷。在一些实施方案中,gapmer寡核苷酸中仅一个侧翼是交替的,而另一个由LNA核苷酸组成。在3'侧翼(F')的3'末端具有至少两个LNA核苷,以赋予额外的核酸外切酶抗性可能是有利的。具有交替侧翼的寡核苷酸的一些实例是:
[L]1-5-[D]1-4-[L]1-3-[G]5-16-[L]2-6
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[G]5-16-[L]1-2-[D]1-3-[L]2-4
[L]1-5-[G]5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2
条件是gapmer的总长度为至少12个,诸如长度为至少14个核苷酸。
寡核苷酸中的区域D'或D”
在一些实施方案中,本发明的寡核苷酸可以包含与靶核酸互补的寡核苷酸的连续核苷酸序列,例如gapmer F-G-F'以及另外的5'和/或3'核苷,或由其组成。另外的5'和/或3'核苷可以或可以不与靶核酸完全互补。这种另外的5'和/或3'核苷在本文中可以被称为区域D'和D”。
可以使用区域D'或D”的添加用于将诸如gapmer的连续核苷酸序列与缀合物部分或另一个官能团连接。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分连接时,其可以用作可生物切割的接头。备选地,它可用于提供核酸外切酶保护或易于合成或制造。
区域D'和D”可以分别连接到区域F的5'端或区域F'的3'端,以生成下式的设计D'-F-G-F',F-G-F'-D”或
D'-F-G-F'-D”。在这种情况下,F-G-F'是寡核苷酸的gapmer部分,而区域D'或D”构成寡核苷酸的单独部分。
区域D'或D”可以独立地包含1、2、3、4或5个额外的核苷酸或由其组成,所述额外的核苷酸可以与靶核酸互补或不互补。与F或F'区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸,诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D'或D'区域可以用作核酸酶敏感的可生物切割的接头(参见接头的定义)。在一些实施方案中,所述额外的5'和/或3'末端核苷酸与磷酸二酯连接连接,并且是DNA或RNA。适合用作区域D'或D”的基于核苷酸的可生物切割的接头公开于WO2014/076195,其例如包括磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。聚寡核苷酸构建体中可生物切割的接头的用途公开于WO2015/113922,其中它们被用于在单个寡核苷酸内连接多个反义构建体(例如gapmer区域)。
在一个实施方案中,本发明的寡核苷酸除了构成gapmer的连续核苷酸序列之外还包含区域D'和/或D”。
在一些实施方案中,本发明的寡核苷酸可以由下式表示:
F-G-F';特别是F1-8-G5-16-F'2-8
D'-F-G-F',特别是D'1-3-F1-8-G5-16-F'2-8
F-G-F'-D”,特别是F1-8-G5-16-F'2-8-D”1-3
D'-F-G-F'-D”,特别是D'1-3-F1-8-G5-16-F'2-8-D”1-3
在一些实施方案中,位于区域D'和区域F之间的核苷间连接是磷酸二酯连接。在一些实施方案中,位于区域F'和区域D”之间的核苷间连接是磷酸二酯连接。
缀合物
如本文所用,术语缀合物是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸与一个或更多个非核苷酸部分的缀合可以改善寡核苷酸的药理学,例如通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞摄取或稳定性。在一些实施方案中,缀合物部分通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢,***、通透性和/或细胞摄取来改变或增强寡核苷酸的药代动力学性质。特别地,缀合物可以将寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型,从而增强寡核苷酸在该器官、组织或细胞类型中的有效性。同时,缀合物可用于减少寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性,例如在非靶细胞类型、组织或器官中的脱靶活性或活性。WO 93/07883和WO2013/033230提供合适的缀合物部分,其特此通过引用并入。其他合适的缀合物部分是能够结合至去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)的那些。特别地,三价N-乙酰基半乳糖胺缀合物部分适合于结合至ASGPr,参见例如WO2014/076196、WO 2014/207232和WO 2014/179620(特此通过引用并入,特别是WO2014/076196的图13或WO2014/179620的权利要求158-164)。
寡核苷酸缀合物及其合成已经报道于Manoharan的综述Antisense DrugTechnology,Principles,Strategies,and Applications中,S.T.Crooke,编,Ch.16,Marcel Dekker,Inc.,2001和Manoharan,Antisense and Nucleic Acid DrugDevelopment,2002,12,103,其每一个均通过引用以其整体并入本文。
在一个实施方案中,非核苷酸部分(缀合物部分)选自由以下各项组成的组:碳水化合物、细胞表面受体配体、药物物质、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或其组合。
接头
连接或接头是两个原子之间的连接,其通过一个或更多个共价键将一个化学基团或目标片段连接到另一个化学基团或目标片段。缀合部分可直接或通过连接部分(例如接头或系链)连接至寡核苷酸。接头用于将第三区域例如缀合部分(区域C)共价连接至第一区域例如与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A),从而将区域A的末端之一连接至C。
在本发明的一些实施方案中,本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可任选地包含位于与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A或第一区域)和缀合部分(区域C或第三区域)之间的接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。
区域B是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物切割的接头,该接头在哺乳动物体内通常遇到的条件或与之相似的条件下可被切割。生理上不稳定的接头经历化学转化(诸如切割)的条件包括化学条件,诸如pH,温度,氧化或还原条件或试剂,以及在哺乳动物细胞中发现的盐浓度或在哺乳动物细胞中遇到的那些相似的盐浓度。哺乳动物细胞内状况还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性的存在,所述酶活性诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施方案中,生物可切割的接头对S1核酸酶切割敏感。在一个优选的实施方案中,核酸酶敏感性接头包含1至10个核苷,诸如1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷,更优选2至6个核苷,最优选2和4个之间的连接的核苷,其包含至少两个连续的磷酸二酯连接,例如至少3或4或5个连续的磷酸二酯连接。优选地,核苷是DNA或RNA。含有生物可切割的接头的磷酸二酯在WO2014/076195(特此通过引用并入)中有更详细的描述。
缀合物也可以通过非生物可切割的接头与寡核苷酸连接,或者在一些实施方案中,缀合物可以包含与生物可切割的接头共价连接的不可切割的接头(区域Y)。接头不一定是生物可切割的,但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)共价连接至寡核苷酸(区域A或第一区域),可包含链结构或重复单元(例如乙二醇,氨基酸单元或氨基烷基)的寡聚体。本发明的寡核苷酸缀合物能够由以下区域要素构建:A-C,A-B-C,A-B-Y-C,A-Y-B-C或A-Y-C。在一些实施方案中,不可切割的接头(区域Y)是氨基烷基,诸如C2-C36氨基烷基,包括诸如C6至C12氨基烷基。在优选的实施方案中,接头(区域Y)是C6氨基烷基。缀合物接头基团可以通过使用经氨基修饰的寡核苷酸和缀合物基团上的活化酯基团常规附接到寡核苷酸上。
HTRA1
如本文所用,术语“HTRA1”是指任何天然的,指来自任何哺乳动物诸如来自任何哺乳动物来源(包括灵长类(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠))的灵长类或人类高温需求A1蛋白,除非另有说明。该术语涵盖“全长”,未处理的HTRA1以及在细胞中进行处理而产生的任何形式的HTRA1。该术语还涵盖HTRA1的天然存在的变体,例如剪接变体或等位基因变体。人类HTRA1的UniProt登记号为Q92743。示例性人HTRA1的氨基酸序列示于SEQ IDNO:1。
SEQ ID NO 1:
示例性的灵长类HTRA1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2(食蟹猴(Macacafascicularis))。Uniprot登录号H9FX91中公开了猕猴(Macaca mulatta)HTRA1氨基酸序列。
SEQ ID NO 2
HTRA1在本领域中也称为蛋白酶、丝氨酸、11(IGF结合)(PRSS11)、ARMD7、HtrA和IGFBP5-蛋白酶。术语“HTRA1”还涵盖“HTRA1变体”,这是指与天然序列HtrA1多肽具有至少约90%氨基酸序列同一性的活性HtrA1多肽,例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO 2。通常,HTRA1变体会与天然HTRA1序列(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO 2)具有至少约95%的氨基酸序列同一性,或至少约98%的氨基酸序列同一性,或至少约99%的氨基酸序列同一性。
术语“HTRA1 mRNA拮抗剂”用于指靶向HTRA1核酸(诸如mRNA,包括HTRA1 mRNA或前体-mRNA)的HTRA1拮抗剂。在一些实施方案中,HTRA1 mRNA拮抗剂是反义寡核苷酸或siRNA和shRNA或核酶。
HTRA1 mRNA拮抗剂能够在抑制HTRA1靶核酸在表达HTRA1靶核酸的细胞中的表达。有利的是,HTRA1 mRNA拮抗剂是寡核苷酸或包含寡核苷酸,其中该寡核苷酸的核碱基的连续序列与HTRA1靶核酸互补,诸如完全互补,如跨越寡核苷酸或其连续核苷酸序列的长度所测量的。在一些实施方案中,HTRA1靶核酸可以是RNA或DNA,诸如信使RNA,诸如成熟的mRNA或前体mRNA。在一些实施方案中,靶核酸是编码哺乳动物HTRA1蛋白(诸如人HTRA1)的RNA,例如人HTRA1 mRNA序列,诸如SEQ ID NO 3或4所公开的。表1和表2提供了有关示例性靶核酸的更多信息。
表1.人和食蟹猴HTRA1的基因组和装配信息。
Fwd=正向链。基因组坐标提供前体-mRNA序列(基因组序列)。NCBI参考提供了mRNA序列(cDNA序列)。
*国家生物技术信息中心(The National Center for BiotechnologyInformation)参考序列数据库是一套综合的,完整的,无冗余的,注释充分的参考序列,包括基因组,转录本和蛋白质。它位于www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq。
**在NCBI参考序列中,存在着从位置126到位置227共100个核苷酸的一段,其身份未知。在SEQ ID NO 5&6中,此段已被该区域的人和猕猴(Macaca mulatta)HTRA1前体mRNA序列中出现的核苷酸所替代。
表2.人和食蟹猴HTRA1的序列详细信息。
HTRA1的寡核苷酸拮抗剂
通过引用以其整体并入本文的PCT/EP2017/065937和EP17173964.2公开了许多是HTRA1 mRNA的有效体内抑制剂的反义寡核苷酸及其治疗用途,包括用于治疗黄斑变性,其在本发明中可以使用。
HTRA1 mRNA拮抗剂可以是反义寡核苷酸或siRNA,其包含与哺乳动物HTRA1核酸具有至少90%互补性的(诸如完全互补的)长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列,诸如SEQID NO 3,SEQ ID NO 4,SEQ ID NO5或SEQ ID NO 6。
有利地,HTRA1 mRNA拮抗剂是LNA反义寡核苷酸,诸如LNA gapmer寡核苷酸。
在一些实施方案中,HTRA1 mRNA拮抗剂,诸如反义寡核苷酸,包括LNA反义寡核苷酸或gapmer寡核苷酸,包含与SEQ ID NO 7至少有90%,例如100%互补性的10-22个核苷酸的连续核苷酸区域:
SEQ ID NO 7:5'CCAACAACCAGGTAAATATTTG 3'
在一些实施方案中,HTRA1 mRNA拮抗剂,诸如反义寡核苷酸或siRNA;诸如LNA反义寡核苷酸或gapmer寡核苷酸,包含在选自由以下组成的组的序列中存在的长度为至少12个连续核苷酸的连续核苷酸区域:
SEQ ID NO 8:CAAATATTTACCTGGTTG
SEQ ID NO 9:TTTACCTGGTTGTTGG
SEQ ID NO 10:CCAAATATTTACCTGGTT
SEQ ID NO 11:CCAAATATTTACCTGGTTGT
SEQ ID NO 12:ATATTTACCTGGTTGTTG
SEQ ID NO 13:TATTTACCTGGTTGTT
SEQ ID NO 14:ATATTTACCTGGTTGT,和
SEQ ID NO 15:ATATTTACCTGGTTGTT。
在一些实施方案中,HTRA1 mRNA拮抗剂(反义寡核苷酸)是或包含选自以下的组的寡核苷酸:
CsAsAsAstsastststsascscstsgsGsTsTsG(SEQ ID NO 8,化合物#8,1)
TsTstsascscstsgsgststsgstsTsGsG(SEQ ID NO 9,化合物#9,1)
CsCsAsAsastsastststsascscstsgsGsTsT(SEQ ID NO 10,化合物#10,1)
CsCsAsasastsastststsascscstsgsgststsGsT(SEQ ID NO 11,化合物#11,1)
AsTsAstststsascscstsgsgststsgsTsTsG(SEQ ID NO 12,化合物#12,1)
TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT(SEQ ID NO 13,化合物#13,1)
TsAstststsascscstsgsGstsTsgsTsT(SEQ ID NO 13,化合物#13,2)
TsAsTststsascscstsgsgsTsTsgsTsT(SEQ ID NO 13,化合物#13,3)
AsTsAsTststsascscstsgsgsTsTsGsT(SEQ ID NO 14,化合物#14,1)
AstsAsTsTstsascscstsgsgstsTsGsT(SEQ ID NO 14,化合物#14,2)
AstsAsTststsascscstsgsGsTsTsgsTsT(SEQ ID NO 15,化合物#15,1)
AsTsAstststsascscstsgsGstsTsgsTsT(SEQ ID NO 15,化合物#15,2)
AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT(SEQ ID NO 15,化合物#15,3)
其中大写字母代表β-D氧基LNA核苷单元,小写字母代表DNA核苷单元,下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接,其中所有LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶。
在一些实施方案中,HTRA1 mRNA拮抗剂是或包含式5’TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3’(SEQ ID NO 13)或5’AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT3’(SEQ ID NO 15)的LNA反义寡核苷酸,其中大写字母代表β-D氧基LNA核苷单元,小写字母代表DNA核苷单元,下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接,其中所有LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中,反义寡核苷酸的长度为10-30个核苷酸,其中所述反义寡核苷酸靶向HTRA1核酸,并包含10-22个核苷酸的连续核苷酸区域,所述连续核苷酸区域与SEQID NO 16至少有90%(诸如100%)的互补性。
SEQ ID NO 16:
在一些实施方案中,反义寡核苷酸是或包含选自SEQ ID NO 17、18和19中的任一个的连续核苷酸区域,或其至少12个连续核苷酸:
CTTCTTCTATCTACGCAT(SEQ ID NO 17)
TACTTTAATAGCTCAA(SEQ ID NO 18)
TTCTATCTACGCATTG(SEQ ID NO 19)
在一些实施方案中,反义寡核苷酸是或包含选自以下的连续核苷酸区域:
CTTCttctatctacgcAT(SEQ ID NO 17),
TACTttaatagcTCAA(SEQ ID NO 18),和
TTCtatctacgcaTTG(SEQ ID NO 19);
其中大写字母是LNA核苷酸,小写字母是DNA核苷,并且胞嘧啶残基任选地是5-甲基胞嘧啶。
在一些实施方案中,反义寡核苷酸是或包含选自以下的连续核苷酸区域:
mCsTsTs mCststscstsastscstsas mcsgscsAsT(SEQ ID NO 17,C ID#17),
TsAs mCsTststsasastsasgscsTs mCsAsA(SEQ ID NO 18,C ID#18),
TsTs mCstsastscstsas mcsgscsasTsTsG(SEQ ID NO 19,C ID#19),
其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷,小写字母代表DNA核苷,下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接,且mC代表5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷,且mc代表5甲基胞嘧啶DNA核苷。
示例性的LNA反义寡核苷酸化合物参见图1、2、3、4和5,其是根据本发明或根据本发明的方法使用的HTRA1 mRNA拮抗剂。
眼部和HTRA1相关病症
如本文所用,术语“HtrA1相关病症”在广义上是指与HtrA1表达或活性,包括异常的HTRA1表达或活性相关的任何病症或病况。在一些实施方案中,HTRA1相关病症与过量的HTRA1水平或活性相关,其中由于局部(例如,在眼睛中)和/或体内全身的HTRA1的水平或活性而可能显现出出非典型症状。示例性HTRA1相关病症包括HTRA1相关眼部病症,其包括但不限于例如年龄相关性黄斑变性(AMD),包括湿性(渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性(非渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如地图状萎缩(GA))。
如本文所用,术语“眼部病症”包括但不限于眼的病症,包括黄斑变性疾病,例如年龄相关性黄斑变性(AMD),包括湿性(渗出性)AMD(包括早期,中期和晚期湿性AMD)和干性(非渗出性)AMD(包括早期,中期和晚期干性AMD(例如地图状萎缩(GA);糖尿病性视网膜病(DR))和其它缺血相关的视网膜病;眼内炎;葡萄膜炎;脉络膜新生血管形成(CNV);早产儿视网膜病(ROP);息肉样脉络膜血管病变(PCV);糖尿病性黄斑水肿;病理性近视;冯·希佩尔·林道病;眼组织胞浆病;中央视网膜静脉阻塞(CRVO);角膜新血管形成和视网膜新血管形成。在一些实施方案中,眼部病症是AMD(例如,GA)。
受试者
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括灵长类(例如,人和非人灵长类如猴)和啮齿类(例如,小鼠和大鼠)。在某些实施方案中,个体或受试者是人。“受试者”可以是“患者”–患者是需要治疗的人类受试者,可以是患有HTRA1相关病症如眼部病症的个体,处于发生HTRA1相关病症如眼部病症的风险的受试者。
在一些实施方案中,患者是已经被诊断患有眼部病症的人,所述眼部病症例如本文列出的那些,例如选自AMD、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病或息肉样脉络膜血管病变的眼部病症。在一些实施方案中,所述眼部病症选自早期干性AMD、中期干性AMD或晚期干性AMD。在一些实施方案中,所述眼部病症是地图状萎缩。
在一些实施方案中,患者是已经被鉴定为处于发生眼部病症的风险的人,所述眼部病症例如本文列出的那些,例如选自AMD、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病或息肉样脉络膜血管病变的眼部病症。在一些实施方案中,所述眼部病症选自早期干性AMD、中期干性AMD或晚期干性AMD。在一些实施方案中,所述眼部病症是地图状萎缩。
在一些实施方案中,患者是在其房水或玻璃体液中具有升高的HTRA1水平的人。在一些实施方案中,患者是已经诊断患有HTRA1相关病症的人或已经鉴定处于发生HTRA1相关病症风险的人。因此,患者可以是在其房水或玻璃体液中具有升高的HTRA1水平(任选可以是无症状的)的受试者。
在一些实施方案中,患者可以是在HTRA1基因或HTRA1控制序列中具有一种或更多种疾病相关多态性的受试者,所述多态性例如HTRA1启动子多态性rs11200638(G/A)(参见例如DeWan等,Science 314:989-992,2006,其通过引用以其全文并入本文)。因此,患者可以是在其HTRA1基因或HTRA1控制序列中具有与疾病相关的多态性的受试者,并且任选地可以是无症状的。
药用盐
为了用作治疗剂,根据本发明的方法或用途使用的HTRA1 mRNA拮抗剂,诸如靶向HTRA1的寡核苷酸,可以作为合适的药物盐诸如钠盐或钾盐提供。在一些实施方案中,本发明的寡核苷酸是钠盐。
药物组合物
在另一方面,本发明提供药物组合物,所述药物组合物包含任何上述寡核苷酸和/或寡核苷酸缀合物以及药学上可接受的稀释剂,载体,盐和/或佐剂。药学上可接受的稀释剂包括磷酸缓冲盐水(PBS),药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施方案中,药学上可接受的稀释剂是无菌磷酸缓冲盐水。在一些实施方案中,寡核苷酸以50-300μM溶液的浓度在药学上可接受的稀释剂中使用。在一些实施方案中,本发明的寡核苷酸以10-1000μg的剂量施用。
WO 2007/031091提供药学上可接受的稀释剂,载体和佐剂的合适的和优选的实例(特此通过引用并入)。WO2007/031091中也提供合适的剂量,制剂,施用途径,组合物,剂型,与其他治疗剂的组合,前药制剂。
可以将本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物与药学上可接受的活性或惰性物质混合用于制备药物组合物或制剂。用于配置药物组合物的组合物和方法取决于许多标准,包括但不限于给药途径,疾病程度或施用剂量。
在一些实施方案中,本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物是前药。特别是对于寡核苷酸缀合物,一旦将前药递送至作用位点例如靶细胞,缀合物部分就被从寡核苷酸切割。
施用
HTRA1 mRNA拮抗剂可局部施用(诸如至皮肤,吸入,经眼或经耳)或肠内(诸如口服或通过胃肠道)或肠胃外(诸如静脉内,皮下,肌肉内,脑内,脑室内或鞘内)。
在一些实施方案中,HTRA1 mRNA拮抗剂通过通过肠胃外途径施用,包括静脉内,动脉内,皮下,腹膜内或肌内注射或输注,鞘内或颅内,例如脑内或脑室内(intraventricular)施用。在一些实施方案中,活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物静脉内施用。在另一个实施方案中,活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物皮下施用。
针对治疗眼部病症中的用途,HTRA1 mRNA拮抗剂,例如本文所述的LNA寡核苷酸诸,可使用眼内注射。
在一些实施方案中,本发明的化合物或其药学上可接受的盐通过眼内注射施用,剂量为每眼约10μg至约200μg,诸如每眼约50μg至约150μg,诸如每眼约100μg。在一些实施方案中,剂量间隔,即连续给药之间的时间段是至少每月,诸如至少每两个月或至少每三个月一次。
测定样品中HTRA1的水平
玻璃体或房水的样品,有利地是房水的样品,从受试者获得。样品中存在的HTRA1的水平可以通过本领域中任何已知的方法来确定,适当地经由在免疫测定中使用抗HTRA1抗体或经由使用质谱法确定。
在一些实施方案中,HTRA1蛋白水平使用质谱确定。
在一些实施方案中,HTRA1蛋白的水平使用免疫测定法,诸如使用HTRA1特异性抗体,确定。
在一些实施方案中,HTRA1蛋白水平使用HTRA1抗体捕获然后通过LC-MS确定。
在一些实施方案中,HTRA1蛋白水平是经由蛋白酶的LC-MS确定的,蛋白酶例如胰蛋白酶,其从来自受试者的玻璃体或房水的样品中获得的免疫捕获的HTRA1的经消化的蛋白质样品。可以用于消化免疫捕获的HTRA1的其他蛋白酶包括LysC、AspN、GluC。
在一些实施方案中,使用HTRA1抗体从样品中免疫捕获HTRA1蛋白,例如经由免疫捕获酶联免疫吸附测定(ELISA)或经由蛋白质印迹。
将HTRA1的水平与一个或更多个参考样品进行比较
如上所述,HTRA1过度表达与许多眼部疾病有关,包括AMD如早期干性AMD、中期干性AMD或晚期干性AMD如地图状萎缩。因此,步骤ii)中本发明的方法可包括将步骤i)中获得的HTRA1水平(例如HTRA1蛋白水平)与健康受试者(阴性对照受试者)中HTRA1水平的一个或更多个参考值,或从这样的健康受试者(阴性对照受试者)的群体获得的平均或均值参考值进行比较,所述健康受试者未患有眼部疾病或在HTRA1基因(包括HTRA对照区域)中不具有疾病相关多态性。备选地或另外,步骤ii)可以包括将步骤ii)中获得的HTRA1水平(例如HTRA1蛋白水平)与受试者中HTRA1水平的一个或多个参考值进行比较,所述受试者已被诊断患有HTRA1相关眼部疾病,或已被表征为过表达HTRA1,和/或已被表征为在HTRA1基因(包括HTRA控制区)中具有疾病相关多态性-即阳性对照。与阴性对照受试者相比升高和/或与阳性对照值相似或相等的HTRA1水平是受试者可能或适合用HTRA1 mRNA拮抗剂治疗的指示。
在另一个实施方案中,除了阳性和/或阴性对照值之外,还可以使用先前从同一个体受试者获得的值。因此,该参考样品可以包括先前从同一受试者获得的一个或更多个历史值。通过将步骤i)中获得的HTRA1水平与来自同一受试者的历史值进行比较,可以监测HTRA1 mRNA拮抗剂治疗的疗效,因此可用于确定HTRA1 mRNA拮抗剂的可能有效剂量。就这一点而言,在一些实施方案中,HTRA1 mRNA拮抗剂治疗的目的是实质上使HTRA1水平正常化而不是实现完全抑制。因此,本发明的方法或用途可以用于在HTRA1治疗之前,期间或之后用于HTRA1水平的患者监测,并且例如可以在HTRA1 mRNA拮抗剂的施用剂量之间使用,例如允许用于调节用量以优化治疗效果。
本发明的其他实施方案
1.确定受试者对施用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗的合适性的方法,所述方法包括步骤:
i)确定从所述受试者获得的房水或玻璃体液的样品中HTRA1的水平
ii)将步骤i)获得的HTRA1的水平与一个或更多个参考样品或参考值比较;
以确定所述受试者是否可能或适于用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗,
其中所述受试者患有或处于发生眼部病症诸如黄斑变性的风险。
2.根据实施方案1的方法,其中所述房水或玻璃体液的样品中的HTRA1水平通过定量样品中HTRA1蛋白的水平来确定。
3.根据实施方案2的方法,其中所述HTRA1蛋白的水平是使用免疫测定法诸如使用HTRA1特异性抗体确定的。
4.根据实施方案3的方法,其中所述HTRA1蛋白的水平使用质谱确定,例如经由HTRA1抗体捕获,然后通过LC-MS。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法,其中所述参考样品或参考值中的至少一个是从患有黄斑变性的对照受试者获得的。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法,其中所述参考样品或参考值中的至少一个是从患有黄斑变性的对照受试者获得的。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法,其中所述参考样品中的至少一个是先前从正在评估其治疗的合适性的同一受试者中获得的值。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法,其中所述参考值来源于对视网膜中的HTRA1浓度与房水或玻璃体液中的HTRA1浓度之间的相关性进行建模的数据集。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中,所述HTRA1 mRNA拮抗剂选自由以下各项组成的组:靶向HTRA1 mRNA或前体-mRNA的反义寡核苷酸、靶向HTRA1 mRNA的siRNA、靶向HTRA1 mRNA或前体-mRNA的核酶。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法,其中所述方法用于确定所述受试者在诸如视网膜上皮细胞的视网膜中是否具有增强的HTRA1mRNA或HTRA1蛋白表达。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法,其中所述受试者患有眼部病症或处于发生眼部病症的风险,所述眼部病症选自由以下各项组成的组:黄斑变性疾病,例如年龄相关性黄斑变性(AMD),包括湿性(渗出性)AMD(包括早期,中期和晚期湿性AMD)和干性(非渗出性)AMD(包括早期,中期和晚期干性AMD(例如地图状萎缩(GA));糖尿病性视网膜病(DR)和其它缺血相关的视网膜病;眼内炎;葡萄膜炎;脉络膜新生血管形成(CNV);早产儿视网膜病(ROP);息肉样脉络膜血管病变(PCV);糖尿病性黄斑水肿;病理性近视;冯·希佩尔·林道病;眼组织胞浆病;中央视网膜静脉阻塞(CRVO);角膜新血管形成和视网膜新血管形成。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法,其中所述受试者患有年龄相关性黄斑变性(AMD)或处于发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的风险,诸如所述AMD选自由以下各项组成的组:湿性(渗出性)AMD(包括早期,中期和晚期湿性AMD),干性(非渗出性)AMD(包括早期,中期和晚期干性AMD(例如,地图状萎缩(GA));有利的是干性AMD。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法,其中该方法用于确定用于施用HTRA1mRNA拮抗剂的合适剂量方案。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法,其中所述HTRA1mRNA拮抗剂是寡核苷酸,所述寡核苷酸包含与HTRA1靶核酸序列诸如SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2完全互补的10-30个核苷酸的连续核苷酸区域。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法,其中所述HTRA1mRNA拮抗剂是或包含寡核苷酸,所述寡核苷酸包含长度为至少12个核苷酸的连续的核苷酸序列,所述连续的核苷酸序列与SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 16至少90%互补,诸如完全互补。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法,其中所述HTRA1mRNA拮抗剂是或包含反义寡核苷酸,诸如LNA gapmer寡核苷酸。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法,其中所述HTRA1mRNA拮抗剂选自由以下各项组成的组:
5’TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3’(SEQ ID NO 13,#13,1)
5’AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3’(SEQ ID NO 15,#15,3)
5’CsTsTsCststscstsastscstsas mcsgscsAsT 3’(SEQ ID NO 17,#17),
5’TsAsCsTststsasastsasgscsTsCsAsA 3’(SEQ ID NO 18,#18);和
5’TsTsCstsastscstsas mcsgscsasTsTsG 3’(SEQ ID NO 19,#19),
其中大写字母代表β-D氧基LNA核苷单元,小写字母代表DNA核苷单元,下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接,mc代表5甲基胞嘧啶核苷,所有LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶;或其药学上可接受的盐。
18.用于治疗患有黄斑变性或处于发生黄斑变性的风险的受试者的方法,所述方法包括进行根据实施方案1-17中任一项所述的方法,以及向所述受试者施用有效量的HTRA1 mRNA拮抗剂。
19.根据实施方案1-17中任一项所述的方法,其中所述HTRA1mRNA拮抗剂用于经由玻璃体内施用来施用。
20.HTRA1抗体作为用于HTRA1 RNA拮抗剂治疗的伴随诊断的用途。
21.HTRA1抗体作为用于HTRA1 RNA拮抗剂治疗功效的生物标记的用途,所述HTRA1RNA拮抗剂为例如HTRA1 mRNA拮抗剂,诸如根据前述实施方案中的任一项的HTRA1 mRNA拮抗剂。
22.HTRA1抗体在检测从受试者获得的房水或玻璃体液的样品中HTRA1水平中的用途,所述受试者正在经历用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗,或正在被评价用HTRA1 mRNA拮抗剂,诸如根据前述实施方案中的任一项的HTRA1 mRNA拮抗剂治疗的合适性。
22.生物标记用于确定受试者对包含诸如根据前述实施方案中任一项的HTRA1mRNA拮抗剂的治疗剂的可能应答的用途,其中所述生物标记与从健康受试者的参考样品中获得的HTRA1水平相比,在从来自所述受试者的房水或玻璃体液获得的生物样品中包含升高水平的HTRA1。
实施例
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成是本领域公知的。以下可以应用的方案。本发明的寡核苷酸可以通过在所用的装置,支持物和浓度方面略有变化的方法来制备。
寡核苷酸使用亚磷酰胺方法以1μmol规模在Oligomaker 48上在尿苷通用支持物上合成。合成结束时,使用氨水在60℃下将寡核苷酸从固相支持物中切割5-16小时。通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相提取纯化寡核苷酸,并通过UPLC进行表征,并通过ESI-MS进一步确认分子量。
寡核苷酸的延伸:
β-氰基乙基亚磷酰胺(DNA-A(Bz),DNA-G(ibu),DNA-C(Bz),DNA-T,LNA-5-甲基-C(Bz),LNA-A(Bz),LNA-G(dmf),LNA-T)的偶联通过使用0.1M的5'-O-DMT保护的亚酰胺在乙腈中的溶液和DCI(4,5-二氰基咪唑)在乙腈(0.25M)中的溶液作为激活剂进行。对于最后的循环,可以使用具有期望修饰(例如,用于附接缀合物基团或像这样的缀合物基团的C6接头)的亚磷酰胺。用于硫代磷酸酯连接的引入的硫醇化通过使用氢化黄原素(xanthanehydride)(在乙腈/吡啶9:1中,0.01M)进行。磷酸二酯连接可以在THF/吡啶/水7:2:1中使用0.02M碘引入。其余的试剂是通常用于寡核苷酸合成的试剂。
对于固相合成后的缀合,可以在固相合成的最后一个循环中使用市售的C 6氨基接头磷酰胺,并且在从固体载体上去保护和切割后,分离出氨基连接的脱保护的寡核苷酸。通过使用标准合成方法激活官能团来引入缀合物。
通过RP-HPLC纯化:
通过制备型RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10μ150x10 mm层析柱上纯化粗化合物。使用0.1M醋酸铵pH 8和乙腈作为缓冲液,流速为5mL/min。将收集的级分冻干,得到纯化的化合物,通常为白色固体。
实施例1.食蟹猴(非人灵长类动物,NHP)体内药代动力学和药效学(PK/PD)研究,治疗21天,玻璃体内(IVT)注射,单剂量。
对于靶向人HTRA1前体mRNA(位置33042-33064之间)中“热点”的1个所选的HTRA1LNA寡核苷酸,15.3,在视网膜的mRNA以及视网膜和玻璃体内的蛋白水平上均观察到了敲低(见图6)
动物
所有实验均在食蟹猴(Cynomolgus monkeys)(Macaca fascicularis)上进行。
化合物和给药程序
在测试化合物注射之前和之后两天施用丁丙诺啡镇痛。用***和甲苯噻嗪肌内注射麻醉动物。在研究第1天在局部施用丁卡因(tetracaine)麻醉剂后,在麻醉动物的双眼玻璃体内施用(每次施用50μL)测试物品和阴性对照(PBS)。
安乐死
在生命阶段结束时(第22天),通过腹膜内过量注射戊巴比妥将所有猴子安乐死。
通过qPCR测量寡核苷酸含量并定量Htra1 RNA表达
在安乐死后立即将眼组织迅速且小心地在冰上切片,并在-80℃下保存直至装运。视网膜样品在700μL MagNa Pure 96LC RNA分离组织缓冲液中裂解,并通过使用precellys渐进匀浆器(precellys evolution homogenizer)每2ml管加入1个不锈钢珠进行匀浆2x1,5min,然后在室温下温育30分钟。将样品以13000rpm离心5min。留出一半用于生物分析,另一半直接进行RNA提取。
对于进行生物分析,将样品稀释10至50倍,用杂交ELISA方法测量寡核苷酸含量。将生物素化的LNA捕获探针和地高辛缀合的LNA检测探针(在5xSSCT中均为35nM,各自与待检测的LNA寡核苷酸的一端互补)与稀释的匀浆或相关标准品混合,在室温下温育30分钟然后添加到链霉亲和素包被的ELISA板中(Nunc目录号436014)。
将板在室温温育1小时,在2×SSCT(300mM氯化钠,30mM柠檬酸钠和0.05%v/vTween-20,pH 7.0)中洗涤。使用缀合有碱性磷酸酶(Roche Applied Sciencecat.No.11093274910)和碱性磷酸酶底物***(Blue Phos substrate,KPL product code50-88-00)的抗-DIG的抗体检测捕获的LNA双链体。寡聚复合物的量在Biotek读数器上测量为在615nm处的吸光度。
对于RNA提取,细胞RNA大容量试剂盒(05467535001,Roche)用于MagNA Pure 96***,程序如下:组织FF标准LV3.1根据制造商的说明,包括DNAse处理。用Eon读数(Biotek)测量RNA质量控制和浓度。将RNA浓度在样品间标准化,随后使用qScript XLT one-step RT-qPCR ToughMix Low ROX,95134-100(Quanta Biosciences)在一步反应中进行cDNA合成和qPCR。以下TaqMan引物测定法用于单链体反应中:来自Life Technologies的Htra1,Mf01016150_,Mf01016152_m1和Rh02799527_m1和管家基因,ARFGAP2,Mf01058488_g1和Rh01058485_m1,和ARL1,Mf02795431_m1。qPCR分析在ViiA7机器(Life Technologies)上进行。眼睛/组:n=3只眼睛。将每只眼睛视为个体样品。该表中相对的Htra1 mRNA表达水平显示为对照(PBS)的%。
组织学
取出眼球并在10%中性***缓冲液中固定24小时,修剪并包埋在石蜡中。
对于ISH分析,使用全自动的Ventana Dicovery ULTRA染色模块(程序:mRNADiscovery Ultra Red 4.0–v0.00.0152),使用RNAscope 2.5VS Probe-mMu-HTRA1,REF486979,Advanced Cell Diagnostics,Inc.处理***固定的,石蜡包埋的视网膜组织切片,厚度为4μm。使用的色原是Fastred,苏木精II复染剂。
使用基于板的免疫沉淀质谱(IP-MS)方法对HTRA1蛋白进行定量
样品制备,视网膜
将视网膜在4倍体积(w/v)的具有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA,Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,0.25%脱氧胆酸,1%NP-40,1mM EDTA,Millipore)使用Precellys 24进行匀浆(5500,15s,2个循环)。将匀浆物离心(13,000rpm,3min)并测定上清液的蛋白质含量(Pierce BCA蛋白质测定)
样品制备,玻璃体
将玻璃体液(300μl)用5x具有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA,Roche)的RIPA缓冲液(终浓度:50mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,0.25%脱氧胆酸,1%NP-40,1mM EDTA)稀释,并使用Precellys 25匀浆(5500,15s,2个循环)。将匀浆物离心(13,000rpm,3min)并测定上清液的蛋白质含量(Pierce BCA蛋白质测定)
基于板的HTRA1免疫沉淀和胰蛋白酶消化
用抗HTRA1小鼠单克隆抗体(R&D MAB2916,在50μl PBS中500ng/孔)包被96孔板(Nunc MaxiSorp),并在4℃下温育过夜。将该板用PBS(200μl)洗涤两次,并用PBS中的3%(w/v)BSA于20℃封闭30分钟,然后两次PBS洗涤。将样品(在50μl PBS中的75μg视网膜,100μg玻璃体)随机化并加入板中,然后在4℃在摇床(150rpm)上温育过夜。然后将板用PBS洗涤两次,并用水洗涤一次。然后将50mM TEAB(30μl)中的10mM DTT加入每个孔中,然后在20℃下孵育1h以还原半胱氨酸巯基。然后将50mM TEAB(5μl)中的150mM碘乙酰胺添加到每个孔中,然后在黑暗中于20℃温育30分钟,以阻断半胱氨酸巯基。向每个孔中加入10μl消化溶液(终浓度:1.24ng/μl胰蛋白酶,20fmol/μl BSA肽,26fmol/μl同位素标记的HTRA1肽,1fmol/μl iRT肽,Biognosys),然后在20℃温育过夜。
通过靶向质谱法的HTRA1肽定量(选择性反应监测,SRM)
在与TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪(Thermo Scientific)偶联的UltimateRSLCnano LC上进行质谱分析。样品(20μL)直接从用于IP的96孔板注射,并在上样缓冲液(0.5%v/v甲酸,2%v/v ACN)中以5μL/min加载到Acclaim Pepmap 100捕获柱(100μm x2cm,C18,5μm,Thermo Scientific)上,持续6min。然后将肽在具有加热至40℃的集成电喷雾发射器的PepMap Easy-SPRAY分析柱(75μm x 15cm,3μm,ThermoScientific)上使用以下梯度以250nL/min的流速分离:6min,98%缓冲液A(2%ACN,0.1%甲酸),2%缓冲液B(ACN+0.1%甲酸);36min,30%缓冲液B;41min,60%缓冲液B;43min,80%缓冲液B;49min,80%缓冲液B;50min,2%缓冲液B。TSQ Quantiva在SRM模式下运行,其具有以下参数:循环时间,1.5s;喷雾电压,1800V;碰撞气压,2mTorr;Q1和Q3分辨率,0.7FWHM;离子传输管温度300℃。获得HTRA1肽"LHRPPVIVLQR"和同位素标记的(L-[U-13C,U-15N]R)合成形式(其用作内标)的SRM转换。使用Skyline 3.6版进行数据分析。
实施例2食蟹猴体内药代动力学和药效学研究,治疗21天,玻璃体内(IVT)注射,单剂量。
针对人HTRA1前体mRNA(位置53113-53384之间)中“热点”的3个HTRA1 LNA寡核苷酸,在视网膜的mRNA以及视网膜和玻璃体内的蛋白水平上均观察到了敲低。
动物
所有实验均在食蟹猴(Cynomolgus monkeys)(Macaca fascicularis)上进行。
每组研究中包括四只动物,总共20只。
化合物和给药程序
在测试化合物注射之前和之后两天施用丁丙诺啡镇痛。用***和甲苯噻嗪肌内注射麻醉动物。在研究第1天在局部施用丁卡因(tetracaine)麻醉剂后,在麻醉动物的双眼玻璃体内施用(每次施用50μL)测试物品和阴性对照(PBS)。
安乐死
在生命阶段结束时(第22天),通过腹膜内过量注射戊巴比妥将所有猴子安乐死。
通过qPCR测量寡核苷酸含量并定量Htra1 RNA表达
在安乐死后立即将眼组织迅速且小心地在冰上切片,并在-80℃下保存直至装运。视网膜样品在700μL MagNa Pure 96LC RNA分离组织缓冲液中裂解,并通过使用precellys渐进匀浆器(precellys evolution homogenizer)每2ml管加入1个不锈钢珠进行匀浆2x1,5min,然后在室温下温育30分钟。将样品以13000rpm离心5min。留出一半用于生物分析,另一半直接进行RNA提取。
对于进行生物分析,将样品稀释10至50倍,用杂交ELISA方法测量寡核苷酸含量。将生物素化的LNA捕获探针和地高辛缀合的LNA检测探针(在5xSSCT中均为35nM,各自与待检测的LNA寡核苷酸的一端互补)与稀释的匀浆或相关标准品混合,在室温下温育30分钟然后添加到链霉亲和素包被的ELISA板中(Nunc目录号436014)。
将板在室温温育1小时,在2×SSCT(300mM氯化钠,30mM柠檬酸钠和0.05%v/vTween-20,pH 7.0)中洗涤。使用缀合有碱性磷酸酶(Roche Applied Sciencecat.No.11093274910)和碱性磷酸酶底物***(Blue Phos substrate,KPL product code50-88-00)的抗-DIG的抗体检测捕获的LNA双链体。寡聚复合物的量在Biotek读数器上测量为在615nm处的吸光度。
对于RNA提取,细胞RNA大容量试剂盒(05467535001,Roche)用于MagNA Pure 96***,程序如下:组织FF标准LV3.1根据制造商的说明,包括DNAse处理。用Eon读数(Biotek)测量RNA质量控制和浓度。将RNA浓度在样品间标准化,随后使用qScript XLT one-step RT-qPCR ToughMix Low ROX,95134-100(Quanta Biosciences)在一步反应中进行cDNA合成和qPCR。以下TaqMan引物测定法用于单链体反应中:来自Life Technologies的Htra1,Mf01016150_,Mf01016152_m1和Rh02799527_m1和管家基因,ARFGAP2,Mf01058488_g1和Rh01058485_m1,和ARL1,Mf02795431_m1。qPCR分析在ViiA7机器(Life Technologies)上进行。眼睛/组:n=3只眼睛。将每只眼睛视为个体样品。该表中相对的Htra1 mRNA表达水平显示为对照(PBS)的%。
组织学
取出眼球并在10%中性***缓冲液中固定24小时,修剪并包埋在石蜡中。
对于ISH分析,使用全自动的Ventana Dicovery ULTRA染色模块(程序:mRNADiscovery Ultra Red 4.0–v0.00.0152),使用RNAscope 2.5VS Probe-mMu-HTRA1,REF486979,Advanced Cell Diagnostics,Inc.处理***固定的,石蜡包埋的猕猴视网膜组织切片,厚度为4μm。使用的色原是Fastred,苏木精II复染剂。
使用基于板的免疫沉淀质谱(IP-MS)方法对HTRA1蛋白进行定量
样品制备,视网膜
将视网膜在4倍体积(w/v)的具有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA,Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,0.25%脱氧胆酸,1%NP-40,1mM EDTA,Millipore)使用Precellys 24匀浆(5500,15s,2个循环)。将匀浆物离心(13,000rpm,3min)并测定上清液的蛋白质含量(Pierce BCA蛋白质测定)
样品制备,玻璃体
将玻璃体液(300μl)用5x具有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA,Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,0.25%脱氧胆酸,1%NP-40,1mM EDTA)稀释,并使用Precellys 25匀浆(5500,15s,2个循环)。将匀浆物离心(13,000rpm,3min)并测定上清液的蛋白质含量(Pierce BCA蛋白质测定)
基于板的HTRA1免疫沉淀和胰蛋白酶消化
用抗HTRA1小鼠单克隆抗体(R&D MAB2916,在50μl PBS中500ng/孔)包被96孔板(Nunc MaxiSorp),并在4℃下温育过夜。将该板用PBS(200μl)洗涤两次,并用PBS中的3%(w/v)BSA于20℃封闭30分钟,然后两次PBS洗涤。将样品(在50μl PBS中的75μg视网膜,100μg玻璃体)随机化并加入板中,然后在4℃在摇床(150rpm)上温育过夜。然后将板用PBS洗涤两次,并用水洗涤一次。然后将50mM TEAB(30μl)中的10mM DTT加入每个孔中,然后在20℃下孵育1h以还原半胱氨酸巯基。然后将50mM TEAB(5μl)中的150mM碘乙酰胺添加到每个孔中,然后在黑暗中于20℃温育30分钟,以阻断半胱氨酸巯基。向每个孔中加入10μl消化溶液(终浓度:1.24ng/μl胰蛋白酶,20fmol/μl BSA肽,26fmol/μl同位素标记的HTRA1肽,1fmol/μl iRT肽,Biognosys),然后在20℃温育过夜。
通过靶向质谱法的HTRA1肽定量(选择性反应监测,SRM)
在与TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪(Thermo Scientific)偶联的UltimateRSLCnano LC上进行质谱分析。样品(20μL)直接从用于IP的96孔板注射,并在上样缓冲液(0.5%v/v甲酸,2%v/v ACN)中以5μL/min加载到Acclaim Pepmap 100捕获柱(100μm x2cm,C18,5μm,Thermo Scientific)上,持续6min。然后将肽在具有加热至40℃的集成电喷雾发射器的PepMap Easy-SPRAY分析柱(75μm x 15cm,3μm,ThermoScientific)上使用以下梯度以250nL/min的流速分离:6min,98%缓冲液A(2%ACN,0.1%甲酸),2%缓冲液B(ACN+0.1%甲酸);36min,30%缓冲液B;41min,60%缓冲液B;43min,80%缓冲液B;49min,80%缓冲液B;50min,2%缓冲液B。TSQ Quantiva在SRM模式下运行,其具有以下参数:循环时间,1.5s;喷雾电压,1800V;碰撞气压,2mTorr;Q1和Q3分辨率,0.7FWHM;离子传输管温度300℃。获得HTRA1肽"LHRPPVIVLQR"和同位素标记的(L-[U-13C,U-15N]R)合成形式(其用作内标)的SRM转换。
使用Skyline 3.6版进行数据分析。
蛋白质印迹
0.5Precellyses管(CK14_0.5ml,Bertin Technologies)中经切片的视网膜样品在带有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA的蛋白酶-抑制剂mini,11 836170 001,Roche)的RIPA裂解缓冲液(20-188,Milipore)中裂解并匀浆。
将玻璃体样品加入0.5Precellyses管(CK14_0.5ml,Bertin Technologies)中,并在带有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA的蛋白酶-抑制剂mini,11 836170 001,Roche)的1/4xRIPA裂解缓冲液(20-188,Milipore)中裂解并匀浆。
在还原条件下,以4-15%梯度凝胶(#567-8084Bio-Rad)分析样品(视网膜20μg蛋白,玻璃体40μg蛋白),并使用使用来自Bio-Rad的Trans-Blot Turbo装置转移至硝酸纤维素(#170-4159Bio-Rad)上。
一抗:兔抗人HTRA1(SF1)是Sascha Fauser(科隆大学)的友好馈赠,小鼠抗人Gapdh(#98795Sigma-Aldrich)。二抗:山羊抗兔800CW和山羊抗小鼠680RD来自Li-Cor
在来自Li-Cor的Odyssee CLX上对印迹进行成像和分析。
实施例3–食蟹猴体内评估:房水中的HTRA1蛋白测定以及与视网膜中的HTRA1mRNA和蛋白抑制的比较。
实验方法:请参见实施例2。采集房水样品并按照实施例2的玻璃体液样品制备样品。食蟹猴水样房水样品(AH)通过基于大小的测定法在Analytical Methodology:Capillary Electrophoresis System(Peggy SueTM,Proteinsimple)上进行了分析。
将样品在冰上解冻,不稀释使用。对于定量,重组HTRA1-S328A突变体(Origene#TP700208)。如提供者所述进行制备。
第一兔抗人HTRA抗体SF1由Sascha Fauser博士教授提供,并以1:300的比例稀释使用。所有其他试剂均来自Proteinsimple。
样品在技术上一式三份处理,使用12-230kDa分离模块,一式两份校准曲线。使用Xlfit(IDBS软件)计算并分析峰下面积。
结果
图9A显示了施用化合物#15,3和#17的猴子的房水中HTRA1蛋白水平的可视化,样品在注射后第3,8,15和22天采集。图9B提供用于计算HTRA1蛋白水平的校准曲线。图9C提供来自个体动物的房水的计算出的HTRA1水平针对注射后的时间作图。
图10示出了房水中的HTRA1蛋白水平与视网膜中的HTRA1 mRNA水平之间的直接相关性。因此,房水HTRA1蛋白水平可用作HTRA1视网膜mRNA水平或HTRA1视网膜mRNA抑制的生物标记。
图11说明了视网膜中HTRA1蛋白水平与房水中HTRA1蛋白水平之间也存在相关性,尽管在本实验中,该相关性不如视网膜中HTRA1 mRNA抑制与房水中的HTRA1蛋白水平之间的相关性强,其指示房水HTRA1蛋白水平特别适合作为HTRA1 mRNA拮抗剂的生物标记。
实施例4:食蟹猴体内药代动力学和药效学研究,治疗36天,玻璃体内(IVT)注射,单剂量。
在36天内调查了暴露于HTRA1 LNA的动物的房水中HTRA1蛋白的动态,并在尸检后在不同眼组织区室(玻璃体,神经视网膜,视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜)中检查了残留的HTRA1蛋白的含量。在终端样品中评估了HTRA1 mRNA抑制。
动物
所有实验都是在加拿大森Sennville的Charles Rivers Laboratories MontrealULC的设施中对雄性食蟹猴(Macaca fascicularis)进行的。
化合物和给药程序
在每次注射前一天两次和注射后一天两次将局部抗生素(妥布霉素)施用于双眼。在给药前,禁食动物接受肌内注射***(5mg/kg)和右美度胺(dexmetedomidine)(0.01mg/kg)的镇静剂混合物,然后通过面罩混合异氟烷/氧气。在双侧玻璃体内注射50μl中的100μg测试物质或赋形剂(磷酸盐缓冲盐水)之前,将局部麻醉剂(0.5%丙美卡因)徐徐滴入每只眼中。根据需要将瞳孔放大滴剂(1%托品酰胺)滴到每只眼中。在完成给药程序后,动物接受了0.1mg/kg的阿替美唑的肌内注射,阿替美唑是右美托咪定(dexmetedomidine)的逆转剂
在该程序的第0天,向4只动物双侧注射50μl中的100μg HTRA1 LNA#18,并向4只动物注射相同体积的赋形剂。
房水取样
将动物分成两组,每组包括两个对照和两个经处理的猴。在基线(所有动物)收集房水样品;第3天和第18天(1组);第11天、第25天、(2组)第32天(所有动物)和安乐死后第36天。根据与化合物应用相同的程序麻醉动物,在瞳孔放大后取样30-40μl房水,并冷冻储存在-80℃。
安乐死
在第36天,禁食动物用***和异氟烷麻醉,夹住主动脉和腔静脉,用磷酸盐缓冲盐水进行上身的经心灌注。从粘附组织上取出并清理冲洗的眼球,并取样200μl房水。左眼进一步处理用于RNA制备,右眼用于蛋白质分析。尸检时从左眼和右眼测量房水中的HTRA1蛋白。
HTRA1蛋白分析的样品处理
为了最终收集,用带有30G,1/2”针的超细胰岛素注射器收获高达0.2ml的房水,从粘附的肌肉中清理眼球并通过角膜缘后3mM的圆周切口正面打开。取出玻璃体,通过迫使组织(3次通过)通过3cc无针注射器进行匀浆,离心(3min 16,000xg,4℃)并冷冻保存。从下面的RPE中小心地将神经视网膜剥离并在干冰上快速冷冻。然后将打开的杯保持正面朝上,用含有蛋白酶抑制剂(cOmpleteTM无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物,mini,Roche,1个片剂/10ml)的1ml RIPA缓冲液(Millipore,50mM Tris-HCl,pH7.4,150mM NaCl,0.25%脱氧胆酸,1%NP-40,1mM EDTA)填充,在旋转平台上震荡(200rpm)5分钟。通过离心(3分钟,在4℃下16,000xg)使所得的RPE裂解物干净,并冷冻保存。剩余的眼后杯用磷酸盐缓冲盐水冲洗掉,制作四个切口以允许组织平放,并且剥离布鲁赫膜和粘附的脉络膜。使用Geno研磨机(1500rpm,2分钟)将脉络膜在4ml每克含蛋白酶抑制剂的组织RIPA缓冲液中匀浆3次,其间在冰上冷却。通过离心除去碎片,并储存提取物(在4℃下3分钟,16,000xg)。
将玻璃体液用5x具有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA,Roche)的RIPA缓冲液(终浓度:50mM TrisHCl,pH 7.4,150mM NaCl,0.25%脱氧胆酸,1%NP-40,1mM EDTA)稀释,并使用Precellys 25匀浆(5500rpm,15s,2个循环)。离心匀浆(16,000xg,3min)。使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)法和来自Pierce(Rockford USA)的试剂,以血清白蛋白为标准,测量神经视网膜和脉络膜提取物的蛋白质含量。
用于RNA制备的样品处理
对于RNA制备,初始解剖步骤与蛋白质步骤相似。
将剥离的视网膜转移到匀浆容器中,加入10μl/mg组织匀浆缓冲液(Maxwell RNA分离试剂盒,Promega)。在Geno研磨机中以1500rpm处理该材料三个2分钟的循环。将所得裂解物储存在-80℃下直至进一步处理。
去除神经视网膜后,将打开的杯子装满RNA保护细胞试剂(Qiagen),在4℃的旋转平台(400rpm)上摇动。10分钟后收集所得的RPE细胞悬液,离心700g 5分钟并在200μlMaxwell匀浆缓冲液中裂解。将裂解物储存在-80℃直至进一步处理。
将新鲜的RNA保护液加入到眼杯中,再震荡10分钟以除去剩余的RPE细胞并丢弃。进行四个切口,以允许组织平放,并且剥离布鲁赫膜和粘附的脉络膜,并冷冻保存直至进一步处理。为了匀浆,将冷冻的脉络膜不解冻地加入Promega匀浆缓冲液(10μl/mg组织)中,并在组织溶解液II(Retsch)中在20Hz下处理3个2分钟的循环。
根据供应商的说明,使用Maxwell RNA分离机器人和相应的试剂(Promega)从裂解物中纯化RNA。
在Experion装置(BioRad)上通过毛细管电泳评估RNA质量并测量数量。
使用RNA测序对HTRA1 mRNA进行定量
使用TruSeqTM链式mRNA文库制备试剂盒(lllumina 20020594),将400ng总RNA用于制备mRNA测序文库。在Illumina HiSeq 4000测序仪(2x 50bp)上对文库进行测序。使用BCL对Illumina(https://support.illumina.com/downloads.html)的FASTQ文件转换器bcl2fastq v2.17.1.14执行碱基识别(Base calling)。为了估计基因表达水平,使用默认的作图参数,用STAR aligner版本2.5.2a将配对末端的RNASeq读数映射到Macacafascicularis基因组(来自WashU的macFas5)(Dobin等2013)。通过使用SAMTOOLS软件(Li等2009)将基因的所有RefSeq转录本变体的映射的读数的数目(计数)组合成单个值,并标准化为rpkms(每百万测序读数的每千碱基转录本的映射的读数的数目,Mortazavi等2008)。
使用基于毛细管电泳的方法定量HTRA1蛋白质
如供应商所述,使用Peggy Sue装置(Protein Simple,San Jose,California,USA)上的12-230kDa分离基质,通过毛细管电泳分析来自不同眼区室的蛋白质。将人重组6His标记的HTRA1 S328A(RD Biotech,法国)样品(62.5-.0.12ng/ml)平行分析定量。HTRA1蛋白通过使用Dr.Sascha Fauser教授提供的兔抗人HTRA1抗血清SF1(稀释度1:300)检测。含5.5ng/ml HTRA1s的食蟹猴RPE裂解物用于评估测定的重复性。
由于初步实验(未显示)排除了基质效应,因此以最高可能浓度分析样品,从而能够最佳定量HTRA1抑制。房水样品未经稀释即使用;同时将澄清的经匀浆的玻璃体样品在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中稀释80%。将神经视网膜、RPE和脉络膜裂解物的浓度调整为0.5mg总蛋白/ml。
在整个研究中,测定内变化是9.1%,测定间变化是21%。为了提高可比性,在单次运行中分析来自每种组织的所有样品。除了在不同于最终样品的运行中分析的不同时间点收集的房水样品。
结果1:LNA应用后32天,在尸检后,不同组织区室中的HTRA1蛋白抑制:
在脉络膜裂解物中发现了最高HTRA1浓度(PBS组:28ng/mg总蛋白sd=2.2),LNA处理仅在该解剖区域内引起轻微抑制(LNA组中16%的降低:24ng/mg总蛋白sd=3.5)。
测得的最低HTRA1浓度是在RPE裂解物中(PBS组:5.2ng/mg总蛋白sd=0.4),具有显著的l的干预效果(降低55%,LNA组:2.4ng/mg总蛋白sd=0.2)。
在神经视网膜、玻璃体液和房水(AH)中观察到干预的最大影响,平均HTRA1水平分别比用赋形剂处理的动物低为76;84;和74%。图12A中显示了不同区室中的组平均抑制。
尽管在对照组中确定HTRA1值的分散,但在玻璃体、视网膜和RPE中测量的Htra1浓度通常与在房水中测量的水平一致;说明作为靶接合生物标记的潜在有效性。组织HTRA1水平和房水水平之间的相关性示于图12B
结果2:房水中HTRA1蛋白浓度的动态
由于样品的可获得性不足,不能测量一个基线样品,并且将动物(赋形剂处理,组1)从当前分析中排除。
房水中基线HTRA1蛋白浓度是不均匀的(4.32ng/ml标准偏差(sd)0.98ng/ml),在治疗组中具有较高的值。(活性处理3.65ng/ml sd 0.18ng/ml,赋形剂5.23ng/ml sd0.82ng/ml)。IVT后第3天两组中HTRA1浓度均有增加的趋势(活性处理:n=2,+51%和+54%;赋形剂n=1,+42%)。因此,在标准化至个体基线值和与时间匹配的赋形剂组之后,分析了干预的效果。该处理在第3天没有影响,但房水HTRA1浓度从第11天起减少(52%),在第36天效果达到了66%抑制。数据如图13所示。
结果3:LNA应用后32天,在尸检后,不同组织区室中的HTRA1mRNA抑制:
HTRA1 mRNA水平通过来自八只动物(赋形剂组中4只动物和LNA处理组中4只动物)的左眼解剖的视网膜、RPE和脉络膜中RNA测序来测量。每个样本平均产生129,876,690个读数,每个样本平均产生122,038,760个映射读数。由于不能通过质量控制测量,一个视网膜样品被排除在赋形剂和LNA组之外,一个RPE样品被排除在赋形剂组之外。在其余样品中,经LNA治疗后,视网膜中HTRA1 mRNA的水平显著而有力地降低(与赋形剂组相比,LNA组降低了80%)。在LNA处理后,在RPE中观察到略低(60%)但显著的降低。脉络膜中未见明显减少(见图14)。
结论
食蟹猴中单次玻璃体内注射100μg HTRA1 LNA导致在暴露后36天,神经视网膜中HTRA1 mRNA表达降低80%,视网膜色素上皮细胞减少60%。相应地,在神经视网膜和RPE中HTRA1蛋白减少分别为76%和55%,指示药物在所研究的不同眼区室中的持续的药物活性和广泛的分布和功效。如所预期的,由于血-视网膜屏障脉络膜仅被寡核苷酸最小程度地到达。因此,在该组织中未观察到HTRA1 mRNA的显著减少。重要的是,这些数据表明,对RPE层具有重大而长期的影响,所述RPE层在AMD发病机理中起着举足轻重的作用。mRNA中的HTRA1抑制与蛋白质水平之间的强相关性指示局部HTRA1合成是眼部蛋白质池的主要来源,且血液来源的HTRA1的比例可忽略不计。
基本上无细胞的玻璃体和房水中的HTRA1蛋白水平减少的程度与神经视网膜相似(分别为r84%和74%),指示这些生物流体中的蛋白浓度能够用于评估眼后干预的有效性。在第11天之前无法检测到房水的降低,这说明该区室中的动作的起始延迟和/或HTRA1蛋白周转低。
参考文献
Dobin等人2013,Bioinformatics 29:“STAR:ultrafast universal RNA-seqaligner”
Li等人2009,Bioinformatics 25:“The Sequence Alignment/Map format andSAMtools”
Mortazavi等人2008.Nature Methods 5:“Mapping and quantifying mammaliantranscriptomes by RNA-Seq”
Claims (23)
1.确定受试者对施用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗的合适性的方法,所述方法包括步骤:
i)确定从所述受试者获得的房水或玻璃体液的样品中HTRA1的水平
ii)将步骤i)获得的HTRA1的水平与一个或更多个参考样品或参考值比较;
以确定所述受试者是否可能或适于用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗,
其中所述受试者患有或处于发生眼部病症诸如黄斑变性的风险。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述房水或玻璃体液的样品中的HTRA1水平通过定量所述样品中HTRA1蛋白的水平来确定。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述HTRA1蛋白的水平是使用免疫测定法诸如使用HTRA1特异性抗体确定的。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述HTRA1蛋白的水平使用质谱确定。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述参考样品或参考值中的至少一个是从患有黄斑变性的对照受试者获得的。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述参考样品或参考值中的至少一个是从没有患有黄斑变性的对照受试者获得的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述参考样品中的至少一个是先前从正在评估其治疗的合适性的同一受试者中获得的值。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述参考值来源于对所述视网膜中的HTRA1浓度与所述房水或玻璃体液中的HTRA1浓度之间的相关性进行建模的数据集。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述HTRA1 mRNA拮抗剂选自由以下各项组成的组:靶向HTRA1 mRNA或前体-mRNA的反义寡核苷酸、靶向HTRA1 mRNA的siRNA、靶向HTRA1 mRNA或前体-mRNA的核酶。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述方法用于确定所述受试者在视网膜中是否具有增强的HTRA1表达。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述受试者患有眼部病症或处于发生眼部病症的风险,所述眼部病症选自由以下各项组成的组:黄斑变性疾病,例如年龄相关性黄斑变性(AMD),包括湿性(渗出性)AMD(包括早期,中期和晚期湿性AMD)和干性(非渗出性)AMD(包括早期,中期和晚期干性AMD(例如地图状萎缩(GA));糖尿病性视网膜病(DR)和其它缺血相关的视网膜病;眼内炎;葡萄膜炎;脉络膜新生血管形成(CNV);早产儿视网膜病(ROP);息肉样脉络膜血管病变(PCV);糖尿病性黄斑水肿;病理性近视;冯·希佩尔·林道病;眼组织胞浆病;中央视网膜静脉阻塞(CRVO);角膜新血管形成和视网膜新血管形成。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述受试者患有年龄相关性黄斑变性(AMD)或处于发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的风险,诸如所述AMD选自由以下各项组成的组:湿性(渗出性)AMD(包括早期,中期和晚期湿性AMD),干性(非渗出性)AMD(包括早期,中期和晚期干性AMD(例如,地图状萎缩(GA))。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中该方法用于确定用于施用HTRA1mRNA拮抗剂的合适剂量方案。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法,其中所述HTRA1 mRNA拮抗剂是寡核苷酸,所述寡核苷酸包含与HTRA1靶核酸序列诸如SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2完全互补的10-30个核苷酸的连续核苷酸区域。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述HTRA1 mRNA拮抗剂是或包含寡核苷酸,所述寡核苷酸包含长度为至少12个核苷酸的连续的核苷酸序列,所述连续的核苷酸序列与SEQ ID NO 7或SEQ ID NO16至少90%互补,诸如完全互补。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述HTRA1 mRNA拮抗剂是或包含反义寡核苷酸,诸如LNA gapmer寡核苷酸。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述HTRA1 mRNA拮抗剂选自由以下各项组成的组:
5’TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3’(SEQ ID NO 13,#13,1)
5’AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3’(SEQ ID NO 15,#15,3)
5’CsTsTsCststscstsastscstsas mcsgscsAsT 3’(SEQ ID NO 17,#17),
5’TsAsCsTststsasastsasgscsTsCsAsA 3’(SEQ ID NO 18,#18);和
5’TsTsCstsastscstsas mcsgscsasTsTsG 3’(SEQ ID NO 19,#19),
其中大写字母代表β-D氧基LNA核苷单元,小写字母代表DNA核苷单元,下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接,mc代表5甲基胞嘧啶DNA核苷,所有LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶;或其药学上可接受的盐。
18.用于治疗患有黄斑变性或处于发生黄斑变性的风险的受试者的方法,所述方法包括进行根据权利要求1-17中任一项所述的方法,以及向所述受试者施用有效量的HTRA1mRNA拮抗剂。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述HTRA1 mRNA拮抗剂用于经由玻璃体内施用来施用。
20.HTRA1抗体作为用于HTRA1 RNA拮抗剂治疗的伴随诊断的用途。
21.HTRA1抗体作为用于HTRA1 RNA拮抗剂治疗功效的生物标记的用途,所述HTRA1 RNA拮抗剂为例如HTRA1 mRNA拮抗剂,诸如根据前述权利要求中的任一项的HTRA1 mRNA拮抗剂。
22.HTRA1抗体在检测从受试者获得的房水或玻璃体液样品中HTRA1水平中的用途,所述受试者正在经历用HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗,或正在被评价用HTRA1 mRNA拮抗剂,诸如根据前述权利要求中的任一项的HTRA1 mRNA拮抗剂治疗的合适性。
23.生物标记用于确定受试者对包含诸如根据前述权利要求中任一项的HTRA1 mRNA拮抗剂的治疗剂的可能应答的用途,其中所述生物标记与从健康受试者的参考样品中获得的HTRA1水平相比,在从来自所述受试者的房水或玻璃体液获得的生物样品中包含升高水平的HTRA1。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17209535.8 | 2017-12-21 | ||
EP17209535 | 2017-12-21 | ||
EP18209473.0 | 2018-11-30 | ||
EP18209473 | 2018-11-30 | ||
PCT/EP2018/085721 WO2019121838A1 (en) | 2017-12-21 | 2018-12-19 | Companion diagnostic for htra1 rna antagonists |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111512160A true CN111512160A (zh) | 2020-08-07 |
CN111512160B CN111512160B (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=64902064
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201880082677.0A Active CN111512160B (zh) | 2017-12-21 | 2018-12-19 | Htra1 rna拮抗剂的伴随诊断 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20200378970A1 (zh) |
EP (1) | EP3729095A1 (zh) |
JP (1) | JP2021507253A (zh) |
KR (1) | KR20200104339A (zh) |
CN (1) | CN111512160B (zh) |
AU (1) | AU2018390167A1 (zh) |
BR (1) | BR112020012523A2 (zh) |
CA (1) | CA3085211A1 (zh) |
IL (1) | IL275470A (zh) |
MX (1) | MX2020005872A (zh) |
WO (1) | WO2019121838A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020109343A1 (en) * | 2018-11-29 | 2020-06-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy for treatment of macular degeneration |
Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000008134A2 (en) * | 1998-08-03 | 2000-02-17 | Novartis Ag | HUMAN HtrA SERINE PROTEASE |
WO2006127913A2 (en) * | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of lmw-ptpase expression |
WO2007024752A2 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Methods and compositions for the treatment and diagnosis of endothelial cell disorders and angiogenic disorders |
WO2008094370A2 (en) * | 2006-12-22 | 2008-08-07 | University Of Utah Research Foundation | Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same |
WO2009000520A1 (en) * | 2007-06-25 | 2008-12-31 | Universität Duisburg-Essen | Screening-method for polymorphic markers in htra1 gene in neurodegenerative disorders |
WO2009006460A1 (en) * | 2007-07-02 | 2009-01-08 | Alcon Research, Ltd. | Rnai-mediated inhibition of htra1 for treatment of macular degeneration |
CN101550451A (zh) * | 2008-03-04 | 2009-10-07 | 四川省医学科学院(四川省人民医院) | 检测老年黄斑变性疾病的试剂盒 |
CN102171235A (zh) * | 2008-08-08 | 2011-08-31 | 艾德拉药物股份有限公司 | 通过反义寡核苷酸来调制髓样分化初级应答基因88(MyD88)表达 |
WO2012038668A1 (fr) * | 2010-09-23 | 2012-03-29 | Universite De Caen Basse Normandie | Procédé d'obtention in vitro ou ex vivo de chondrocytes articulaires différenciés et leurs utilisations |
WO2013055998A1 (en) * | 2011-10-14 | 2013-04-18 | Genentech, Inc. | ANTI-HtrA1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE |
CN104884049A (zh) * | 2012-11-08 | 2015-09-02 | 克莱尔塞德生物医学股份有限公司 | 用于在人类受试者中治疗眼部疾病的方法和装置 |
WO2017004243A1 (en) * | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Caris Science, Inc. | Therapeutic oligonucleotides |
Family Cites Families (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE239484T1 (de) | 1991-10-24 | 2003-05-15 | Isis Pharmaceuticals Inc | Derivatisierte oligonukleotide mit verbessertem aufnahmevermögen |
JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
CN1273476C (zh) | 1997-09-12 | 2006-09-06 | 埃克西康有限公司 | 寡核苷酸类似物 |
ES2234563T5 (es) | 1999-02-12 | 2018-01-17 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Nuevos análogos de nucleósidos y oligonucleótidos |
NZ514348A (en) | 1999-05-04 | 2004-05-28 | Exiqon As | L-ribo-LNA analogues |
US6617442B1 (en) | 1999-09-30 | 2003-09-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof |
WO2006006948A2 (en) | 2002-11-14 | 2006-01-19 | Dharmacon, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY |
EP1569661B1 (en) | 2002-11-18 | 2009-09-09 | Santaris Pharma A/S | Antisense design |
WO2007031091A2 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-22 | Santaris Pharma A/S | Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression |
PL2314594T3 (pl) | 2006-01-27 | 2014-12-31 | Isis Pharmaceuticals Inc | Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych |
WO2007134014A2 (en) | 2006-05-05 | 2007-11-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating expression of gcgr |
DK2066684T3 (da) | 2006-05-11 | 2012-10-22 | Isis Pharmaceuticals Inc | 5´-Modificerede bicycliske nukleinsyreanaloge |
US7666854B2 (en) | 2006-05-11 | 2010-02-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs |
CA2658853A1 (en) | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Yale University | Diagnosis and treatment of age related macular degeneration |
US20100166743A1 (en) * | 2006-10-06 | 2010-07-01 | University Of Utah Research Foundation | Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same |
ES2620472T5 (es) | 2006-10-18 | 2020-07-09 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compuestos antisentido |
US7972787B2 (en) * | 2007-02-16 | 2011-07-05 | Massachusetts Eye And Ear Infirmary | Methods for detecting age-related macular degeneration |
DK2149605T3 (da) | 2007-03-22 | 2013-09-30 | Santaris Pharma As | Korte RNA antagonist forbindelser til modulering af det ønskede mRNA |
ES2388590T3 (es) | 2007-05-30 | 2012-10-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos con puente aminometileno N-sustituido. |
ES2386492T3 (es) | 2007-06-08 | 2012-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos carbocíclicos |
ES2376507T5 (es) | 2007-07-05 | 2015-08-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos 6-disustituidos |
US8546556B2 (en) | 2007-11-21 | 2013-10-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs |
US9261508B2 (en) * | 2008-04-25 | 2016-02-16 | Istituto Superiore Di Sanita | Antisense RNA for treating cancer and inhibition of metastasis and vectors for antisense sequestration |
EP2356129B1 (en) | 2008-09-24 | 2013-04-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides |
US9012421B2 (en) | 2009-08-06 | 2015-04-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs |
WO2011156202A1 (en) | 2010-06-08 | 2011-12-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted 2 '-amino and 2 '-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom |
EP2673361B1 (en) | 2011-02-08 | 2016-04-13 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof |
US20140303013A1 (en) * | 2011-03-15 | 2014-10-09 | University Of Utah Research Foundation | Methods of diagnosing and treating vascular associated maculopathy and symptoms thereof |
WO2013022967A1 (en) | 2011-08-11 | 2013-02-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligomeric compounds comprising 5'-modified deoxyribonucleosides in the gap and uses thereof |
EP3453761A1 (en) | 2011-08-29 | 2019-03-13 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomer-conjugate complexes and their use |
WO2013154798A1 (en) | 2012-04-09 | 2013-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Tricyclic nucleic acid analogs |
MY173826A (en) | 2012-11-15 | 2020-02-24 | Roche Innovation Ct Copenhagen As | Oligonucleotide conjugates |
IL284593B2 (en) | 2013-05-01 | 2023-02-01 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compositions and methods for modulation of hbv and ttr expression |
CN112263682A (zh) | 2013-06-27 | 2021-01-26 | 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 | 靶向pcsk9的反义寡聚体和缀合物 |
WO2015113922A1 (en) | 2014-01-30 | 2015-08-06 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Poly oligomer compound with biocleavable conjugates |
WO2016127002A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Bristol-Myers Squibb Company | Lna oligonucleotides with alternating flanks |
EP3368578B1 (en) | 2015-10-30 | 2021-03-17 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof |
-
2018
- 2018-12-19 AU AU2018390167A patent/AU2018390167A1/en active Pending
- 2018-12-19 US US16/766,497 patent/US20200378970A1/en active Pending
- 2018-12-19 MX MX2020005872A patent/MX2020005872A/es unknown
- 2018-12-19 BR BR112020012523-7A patent/BR112020012523A2/pt unknown
- 2018-12-19 JP JP2020534464A patent/JP2021507253A/ja active Pending
- 2018-12-19 KR KR1020207021012A patent/KR20200104339A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-12-19 CA CA3085211A patent/CA3085211A1/en active Pending
- 2018-12-19 WO PCT/EP2018/085721 patent/WO2019121838A1/en unknown
- 2018-12-19 EP EP18829338.5A patent/EP3729095A1/en active Pending
- 2018-12-19 CN CN201880082677.0A patent/CN111512160B/zh active Active
-
2020
- 2020-06-17 IL IL275470A patent/IL275470A/en unknown
Patent Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000008134A2 (en) * | 1998-08-03 | 2000-02-17 | Novartis Ag | HUMAN HtrA SERINE PROTEASE |
WO2006127913A2 (en) * | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of lmw-ptpase expression |
WO2007024752A2 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Methods and compositions for the treatment and diagnosis of endothelial cell disorders and angiogenic disorders |
WO2008094370A2 (en) * | 2006-12-22 | 2008-08-07 | University Of Utah Research Foundation | Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same |
US20110212075A1 (en) * | 2007-06-25 | 2011-09-01 | Siemens Aktiengesellschaft | Screening method for polymorphic markers in htra1 gene in neurodegenerative disorders |
WO2009000520A1 (en) * | 2007-06-25 | 2008-12-31 | Universität Duisburg-Essen | Screening-method for polymorphic markers in htra1 gene in neurodegenerative disorders |
WO2009006460A1 (en) * | 2007-07-02 | 2009-01-08 | Alcon Research, Ltd. | Rnai-mediated inhibition of htra1 for treatment of macular degeneration |
CN101550451A (zh) * | 2008-03-04 | 2009-10-07 | 四川省医学科学院(四川省人民医院) | 检测老年黄斑变性疾病的试剂盒 |
CN102171235A (zh) * | 2008-08-08 | 2011-08-31 | 艾德拉药物股份有限公司 | 通过反义寡核苷酸来调制髓样分化初级应答基因88(MyD88)表达 |
WO2012038668A1 (fr) * | 2010-09-23 | 2012-03-29 | Universite De Caen Basse Normandie | Procédé d'obtention in vitro ou ex vivo de chondrocytes articulaires différenciés et leurs utilisations |
WO2013055998A1 (en) * | 2011-10-14 | 2013-04-18 | Genentech, Inc. | ANTI-HtrA1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE |
US20130129743A1 (en) * | 2011-10-14 | 2013-05-23 | Genentech, Inc. | ANTI-HtrA1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE |
CN103917556A (zh) * | 2011-10-14 | 2014-07-09 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 抗HtrA1抗体及使用方法 |
CN104884049A (zh) * | 2012-11-08 | 2015-09-02 | 克莱尔塞德生物医学股份有限公司 | 用于在人类受试者中治疗眼部疾病的方法和装置 |
WO2017004243A1 (en) * | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Caris Science, Inc. | Therapeutic oligonucleotides |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
GIAN MARCO TOSI 等: "HTRA1 and TGF-β1 Concentrations in the Aqueous Humor of Patients With Neovascular Age-Related Macular Degeneration", INVEST OPHTHALMOL VIS SCI, vol. 58, no. 1, XP055570741, DOI: 10.1167/iovs.16-20922 * |
TIAN YU 等: "Inhibition of cell proliferation, migration and apoptosis in blue-light illuminated human retinal pigment epithelium cells by down-regulation of HtrA1", INT J OPHTHALMOL, vol. 10, no. 4 * |
TSZ KIN NG 等: "Interactive Expressions of HtrA1 and VEGF in Human Vitreous Humors and Fetal RPE Cells", INVEST OPHTHALMOL VIS SCI, vol. 52, no. 6, XP055571156, DOI: 10.1167/iovs.10-6773 * |
冯宇梁;李杰;刘巾男;张军军;: "视网膜脉络膜新生血管性疾病机制及治疗研究进展", 西部医学, no. 09 * |
朱妍;宋愈;黄黎黎;: "房水中血管内皮生长因子表达水平与黄斑水肿程度的相关性研究", 临床眼科杂志, no. 02 * |
李雨心;南新帅;聂闯;胡莲娜;罗灵;: "玻璃体腔注射雷珠单抗治疗非AMD脉络膜新生血管", 国际眼科杂志, no. 05 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MX2020005872A (es) | 2020-08-13 |
BR112020012523A2 (pt) | 2020-11-24 |
JP2021507253A (ja) | 2021-02-22 |
AU2018390167A1 (en) | 2020-06-11 |
CA3085211A1 (en) | 2019-06-27 |
CN111512160B (zh) | 2024-04-09 |
US20200378970A1 (en) | 2020-12-03 |
WO2019121838A1 (en) | 2019-06-27 |
IL275470A (en) | 2020-08-31 |
EP3729095A1 (en) | 2020-10-28 |
KR20200104339A (ko) | 2020-09-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6959293B2 (ja) | B型肝炎ウイルスの遺伝子発現を阻害するための組成物および方法 | |
CN109414448B (zh) | 用于减少PAPD5或PAPD7 mRNA治疗乙型肝炎感染的核酸分子 | |
JP7416852B2 (ja) | Htra1の発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド | |
JP2022078069A (ja) | 二本鎖RNAによるα-1アンチトリプシンの特異的阻害のための方法及び組成物 | |
CN113444725A (zh) | 用于抑制α-1抗胰蛋白酶基因表达的组合物及方法 | |
KR20220024153A (ko) | 안지오포이에틴 유사 7(angptl7) 관련 질환의 치료 | |
US20220042022A1 (en) | Antisense oligonucleotides for modulating htra1 expression | |
TW201143780A (en) | Treatment of Colony-stimulating factor 3 (CSF3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to CSF3 | |
US20230357774A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of angiopoietin like 7 (angptl7) related diseases | |
JP2009516710A (ja) | eIF4E−BP2の発現のモジュレート | |
CN111512160B (zh) | Htra1 rna拮抗剂的伴随诊断 | |
WO2023192828A2 (en) | Compositions and methods for the treatment of angiopoietin like 7 (angptl7) related diseases | |
NZ749395A (en) | Antisense oligonucleotides for modulating htra1 expression |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40031713 Country of ref document: HK |
|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |