CN111512152B - 改善单克隆抗体的检测结果的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种样品中的单克隆抗体的检测方法，所述方法包括以下的步骤：(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤；(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤；及(c)通过液相色谱质谱分析(LC‑MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，在步骤(a)之后，还包括(a’)进行在酸性条件下的还原反应的步骤。根据本发明，可以期待使用了质谱分析的单克隆抗体的检测方法的进一步的应用。

Description

改善单克隆抗体的检测结果的方法
技术领域
本发明涉及改善利用质谱分析进行单克隆抗体定量时的检测结果的方法。更具体而言，本发明涉及为了定量单克隆抗体而已确立的方案的改良。
背景技术
近些年，作为替代ELISA法的定量法，积极进行了使用LC-MS/MS法的抗体药物的生物催化剂的开发。
本发明人等小组发现：通过将测定对象的单克隆抗体及能将其作为底物消化的蛋白酶这两者固定化于固相，从而能够通过区域选择性的固相-固相反应而实现单克隆抗体的蛋白酶解，成功地获得了各个单克隆抗体特有的肽(专利文献1～6和非专利文献1～8)。该方法是使将单克隆抗体固定化于细孔内的多孔体、与固定化有蛋白酶的纳米颗粒在液体中接触来进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的质谱分析的前处理方法，是能够通过液相色谱质谱分析(LC-MS)对得到的肽片段进行有效地检测和定量的突破性技术。本发明人等将本方法命名为“纳米表面和分子取向限制蛋白质水解(nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis)方法(nSMOL法)”。
基于nSMOL法进行的血中抗体药物的定量是如下方法：能够仅对具有抗体药物的特异性序列的Fab域限定性胰蛋白酶解、抑制在LC-MS/MS分析中视为最棘手问题的离子抑制效果，从而提供更稳定的可靠性高的定量值。本发明人等已经确认了：在15种以上的抗体药物的血药浓度测定中，组合nSMOL法和LC-MS/MS法而使用的单克隆抗体的检测方法符合日本、美国和欧洲的用于验证生物学分析方法的准则的基准。
另一方面，已知作为生物高分子的蛋白质中存在具有非常特征性的坚硬的(刚性)结构的蛋白质。例如，β淀粉样蛋白、转铁蛋白、多个跨膜型蛋白质(视紫红质、转运蛋白等)中，尽管机理不同，但已知通过采用刚性结构其作用分别得到了控制。
作为使蛋白质结构保持刚性的结构之一，有通过SS键而产生如结扣状那样的结构的半胱氨酸结结构。作为具有半胱氨酸结结构、有助于特异性信号传递的分子，可列举出血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素等细胞因子类。
抗体分子是由2根重链和2根轻链组成的4聚体高分子量蛋白质，在各自链中存在：具有抗体特异性氨基酸序列而定义抗体结构的多样性、功能的可变区；和、分子结构相同的恒定区。在可变区中，突变的频率也特别高且决定与抗原的结合性的区域是互补决定区(CDR)；另外，在重链恒定区的CH1结构域与CH2结构域之间存在被称为铰链的灵活性非常高的结构。
由于抗体分子中存在铰链，因此使抗体结合部位(抗原结合片段：Fab,fragmentantigen binding)的立体结构学的波动得以确保，利用NMR分析等进行分子动力学解析时，尽管Fc位点几乎被三维地固定，但已知Fab位点大幅波动以至无法三维地分配。在抗原发生结合时该波动收敛而变为刚性结构。
另外，在抗体分子中，在分子内和分子间存在大量SS键，具有保持各自的区域的作用。可认为：根据抗体分子本身、周围的微细结构环境，涉及SS键的硫原子的氧化还原电位不同，SS键强度也存在差异。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2015/033479号
专利文献2：国际公开WO2016/194114号
专利文献3：国际公开WO2016/143224号
专利文献4：国际公开WO2016/143223号
专利文献5：国际公开WO2016/143226号
专利文献6：国际公开WO2016/143227号
非专利文献
非专利文献1：Analyst.2014Feb 7；139(3):576-80.doi:10.1039/c3an02104a
非专利文献2：Anal.Methods,2015；21:9177-9183.doi:10.1039/c5ay01588j
非专利文献3：Drug Metabolism and Pharmacokinetics,2016；31:46-50.doi:10.1016/j.dmpk.2015.11.004
非专利文献4：Bioanalysis.2016；8(10):1009-20.doi:10.4155.bio-2016-0018
非专利文献5：Biol Pharm Bull,2016；39(7):1187-94.doi:10.1248/bpb.b16-00230
非专利文献6：J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci；2016；1023-1024:9-16.doi:10.1016/j.jchromb.2016.04.038
非专利文献7：Clin Pharmacol Biopharm 2016；5:164.doi:10.4172/2167-065X.1000164
非专利文献8：J.Pharm Biomed Anal；2017；145:33-39.doi:10.1016/j.jpba.2017.06.032
发明内容
发明要解决的问题
nSMOL法中具有如下反应机制：通过使固定在直径约200nm的纳米颗粒表面的蛋白酶与固定在细孔直径约100nm的多孔体的免疫球蛋白分子接触，从而在被限制的反应场中选择性切断免疫球蛋白分子的Fab。nSMOL法的精度/灵敏度/再现性优异，为了实施nSMOL法，LC/MS/MS用前处理试剂盒“nSMOL Antibody BA Kit”(岛津制作所)已经有所市售，还提供与试剂盒组合的方案。但本发明人等为了使nSMOL法的通用性进一步扩大，而进行了方案改良等的研究。
其中，本发明人等确认了：在作为抗体药物使用的单克隆抗体中，存在与其它单克隆抗体相比检测结果极低的分子。若从nSMOL法的精度和灵敏度方面考虑，可认为在临床使用中没有问题，但为了以更高的可靠性检测微量的抗体浓度，考虑有能进一步改良步骤的可能性。
用于解决问题的方案
本发明人等预料出：检测结果变低的情况可能是由测定对象的抗体分子的硬度引起的蛋白酶耐性所导致的，但不受理论约束。即，在这样的抗体分子中，由于某种机制例如由于SS键所致的半胱氨酸结结构的存在，而存在非常刚性的区域并发生针对蛋白酶的耐性，其结果，有可能未进行在nSMOL法中所预测的蛋白酶解。
从原理上，nSMOL法由于在立体结构上控制蛋白酶与底物的接触部位，因此假设对全部抗体的Fab域选择性地进行蛋白酶反应。也已证实了确实进行了不依赖于抗体的多样性反应。然而，抗体分子其本身为非常刚性的情况下，即使与底物接触，也可能对能抗体定量的部位不进行基于蛋白酶的的水解。
为了使nSMOL法适用于所有的单克隆抗体药物，而进行了各种针对上述那样的刚性单克隆抗体的分析条件的研究，结果本发明人等发现：在从样品中分离出抗体分子后，通过酸性还原条件而使SS键快速裂解，由此能够使其具有空间上的波动，显著改善利用nSMOL法的检测结果。由于蛋白A与Fc的键在酸性还原条件下不会解离，因此认为能够在将抗体分子保持于多孔体上情况下将半胱氨酸结结构拆解。
即，本发明提供以下方案。
1.一种样品中的单克隆抗体的检测方法，其包括以下的步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、
(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和
(c)通过液相色谱质谱分析(LC-MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，
在步骤(a)之后，还包括(a’)进行在酸性条件下的还原反应的步骤。
2.根据上述1所述的方法，其中，通过在有机磷系还原剂的存在下的孵育来实施步骤(a’)。
3.根据上述2所述的方法，其中，有机磷系还原剂为三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)或其盐酸盐。
4.根据上述3所述的方法，其中，TCEP的浓度为100～500mM。
5.根据上述1～4中任一项所述的方法，其中，在pH2.5以下的强酸性条件下实施步骤(a’)。
6.根据上述1～5中任一项所述的方法，其中，步骤(a’)的还原反应的时间为10～60分钟。
7.根据上述1～6中任一项所述的方法，其中，通过LC-MS检测的肽片段源自重链。
发明的效果
根据本发明，对于预测在结构化学上为刚性(rigid)的单克隆抗体例如托珠单抗与莫加木珠单抗(Mogamulizumab)，确立了能进行分析验证的定量方法，nSMOL法能够用于比现有更广泛范围的抗体。
附图说明
图1示出通过添加TCEP而改善源自托珠单抗的多个肽的基于nSMOL法的检测结果。
图2示出不会由在TCEP存在下的反应而发生抗体从多孔体中的脱离。
图3示出在250mM TCEP的存在下(pH1.5和pH7)或没有250mM TCEP的存在下的VTMLR(序列号1)的检测结果。
图4示出由于TCEP添加而使源自托珠单抗的肽的检测量依赖于还原反应时间而增大。
图5示出利用本发明的方法中的托珠单抗的检测所制作的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供一种样品中的单克隆抗体的检测方法：其包括以下的步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、
(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和
(c)通过液相色谱质谱分析(LC-MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，
在步骤(a)之后，还包括(a’)进行在酸性条件下的还原反应的步骤。
＜步骤(a)＞
本发明的方法的步骤(a)相当于捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤。
本说明书中，“样品”是要检测单克隆抗体存在的液体样品，没有特别限定，通常为小鼠、大鼠、猴、山羊、牛、人等哺乳动物、特别是人被检者、主要是人患者来源的生物学样品，优选为血浆或血清或者组织均质器提取液。或者，样品可以是例如为了证实发明的效果而包含人为添加的单克隆抗体和血浆的液体样品。为了检测本发明的方法中的单克隆抗体，样品中的单克隆抗体的浓度在0.05～300μg/ml的范围内即可。
作为能成为测定对象的单克隆抗体，没有特别限定，例如可列举出帕尼单抗(Panitumumab)、奥法木单抗(offatumumab)、戈利木单抗(golimumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、纳武单抗(Nivolumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、阿达木单抗(Adalimumab)等人抗体；托珠单抗(Tocilizumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、曲妥珠单抗-DM1、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、吉妥单抗(Gemtuzumab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、赛妥珠单抗(Certolizumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、莫加木珠单抗(Mogamulizumab)、艾库组单抗(Eculizumab)、托珠单抗(Atlizumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)等人源化抗体；利妥昔单抗(Rituximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、巴利昔单抗(Basiliximab)等嵌合抗体等。
另外，维持单克隆抗体的特异性且附加有进一步的功能的复合体、例如Fc融合蛋白质(依那西普、阿巴西普等)、抗体-药物复合体(例如本妥昔单抗、吉妥珠单抗·奥佐米星(gemtuzumab-ozogamicin)、曲妥单抗-艾玛坦星(trastuzumab-emtansine)等)也为测定对象的单克隆抗体。可以在测定之前使复合体的结合裂解仅将抗体部分供于分析，但也可以以复合体的形态直接供于分析。
单克隆抗体的氨基酸序列的信息等可以从例如京都基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)获得。
作为用于本发明的方法的多孔体，可以使用具有多个细孔且能够使抗体部位特异性地结合的物质。多孔体的平均细孔直径在10nm～200nm左右的范围内且在小于纳米颗粒的平均粒径的范围内适宜设定。
本发明的步骤(a)中，将测定对象的单克隆抗体固定化于多孔体的细孔内。出于该目的，优选使用多孔体的细孔内固定化有与抗体部位特异性地相互作用的连接体分子的物质。
作为连接体分子，优选使用与抗体的Fc结构域部位特异性结合的蛋白A、蛋白G等。通过使用细孔内固定化有这些连接体分子的多孔体，抗体的Fc结构域被固定化于细孔内，Fab结构域位于细孔的表层附近，因此基于蛋白酶的Fab结构域的区域选择性消化成为可能。
作为本发明中可以适合使用的多孔体，没有特别限定，例如可以举出蛋白GUltralink树脂(Pierce公司制)、Toyopearl TSKgel(Tosoh Corporation制)、蛋白ASepharose(GE Healthcare)、KanCapA(KANEKA)等。
使抗体固定化于多孔体的细孔内的方法没有特别限定，例如，使抗体固定化于细孔内固定化有蛋白A、蛋白G的多孔体时，通过将多孔体的悬浮液与包含抗体的溶液混合，可以使抗体容易地固定化于细孔内。多孔体与抗体的量比可以根据目的而适当设定。
＜步骤(a’)＞
本发明的方法中，在上述的步骤(a)之后实施步骤(a’)进行在酸性条件下的还原反应的步骤。
在酸性条件下的还原反应例如可以通过在有机磷系还原剂的存在下的孵育来实施。作为有机磷系还原剂，例如可列举出三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)或其盐酸盐、三丁基膦等，这些还原剂可以从Sigma-Aldrich Co.LLC、NACALAI TESQUE,INC.、Funakoshi Co.,Ltd.等获得。可适宜使用的TCEP的浓度优选在反应液中为100～500mM的范围。
步骤(a’)的还原反应优选在pH2.5以下的强酸性条件下例如以pH1.5、pH2.0、pH2.5等来实施。另外，还原反应的时间没有特别限定，只要为10～60分钟的范围就是充分的，例如可以为20分钟、30分钟、40分钟、45分钟、50分钟。还可以超过60分钟地进行还原反应，但在此情况下，用于测定的作业时间会变长，因此并不现实。反应温度没有特别限定，例如为15～30℃的范围即可，可以在室温下实施反应。适宜地，反应温度为约25℃。
需要说明的是，以本发明的方法的理解为目的，本说明书中，记载了在步骤(a)之后进行步骤(a’)，但如本领域技术人员所理解的那样，通常在各步骤中包括用于对试剂进行添加和去除、清洗等的各种操作，记载为步骤(a’)的在酸性条件下的还原反应根据情况可以在作为步骤(a)的一部分而说明的操作之前来实施。然而，可理解为：在记载为步骤(a)的“捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤”之后、且记载为步骤(b)的“使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤”之前，实施记载为步骤(a’)的“进行在酸性条件下的还原反应的步骤”。
＜步骤(b)＞
本发明的方法的步骤(b)相当于如下步骤：使固定化有上述步骤(a)中得到的单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触来进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解。
固定化于纳米颗粒的蛋白酶的种类根据成为基于质谱分析的定量或鉴定的对象的单克隆抗体的种类来适宜选择即可，没有限定，例如可以单独或组合使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、V8蛋白酶、AspN蛋白酶(Asp-N)、ArgC蛋白酶(Arg-C)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、二肽基肽酶。作为蛋白酶，可特别优选使用胰蛋白酶。作为能适宜用于本发明的方法的蛋白酶，例如可列举出Trypsin Gold(Promega Corporation制)、TrypsinTPCK-treated(Sigma公司制)等。
纳米颗粒的平均粒径大于多孔体的平均细孔直径，形状没有特别限定，从蛋白酶向多孔体的细孔的接近的均匀化的观点出发，优选球状的纳米颗粒。另外，纳米颗粒优选分散性高、平均粒径均匀。
作为纳米颗粒的种类，优选可以分散或悬浮于水性介质且可以通过磁性分离或磁性沉淀分离从分散液或悬浮液容易地回收的磁纳米颗粒。另外，在不易引起聚集的方面，更优选用有机聚合物覆盖其表面而成的磁纳米颗粒。作为用有机聚合物覆盖的磁性纳米珠的具体例，可以举出FG珠、SG珠、Adembeads、nanomag等。作为市售品，例如适合使用TamagawaSeiki Co.,Ltd.制的FG beads(将铁氧体颗粒用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(聚GMA)覆盖而成的粒径约200nm的聚合物磁性纳米颗粒)。
对于上述纳米颗粒，为了非特异性的蛋白质的吸附抑制、和蛋白酶的选择性的固定化，优选用能够与蛋白酶结合的间隔物分子修饰。通过借助间隔物分子使蛋白酶固定化，蛋白酶从纳米颗粒表面的脱离被抑制，可以提高蛋白酶解的区域选择性。另外，通过调整间隔物的分子尺寸，可以使蛋白酶选择性地接近抗体的期望位置，也可以提高区域选择性。
用这样的间隔物分子进行了表面修饰的纳米颗粒还可以被市售，例如，利用具有用N-羟基丁二酰亚胺活化的酯基(活性酯基)的间隔物分子修饰过的纳米颗粒以商品名“FGbeads NHS”(Tamagawa Seiki Co.,Ltd.)被市售。
将蛋白酶固定化于纳米颗粒的表面的方法没有特别限定，可以根据蛋白酶与纳米颗粒(或修饰纳米颗粒表面的间隔物分子)的特性等而采用适宜的方法。需要说明的是，上述的LC/MS/MS用前处理试剂盒“nSMOL Antibody BA Kit”(岛津制作所)中包含固定化有作为蛋白酶的胰蛋白酶的纳米颗粒即FG beads Trypsin DART(注册商标)，可以适宜用于本发明的方法。
通过使固定化有上述单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触，从而使单克隆抗体被选择性蛋白酶解而产生肽片段。
蛋白酶解例如在调整至蛋白酶的最佳pH附近的缓冲溶液中实施。用于蛋白酶解的反应温度可以为37℃左右，在饱和蒸气压下以约50℃进行是适宜的。反应时间可以是30分钟～20小时、例如1小时～8小时、3～5小时的范围。没有特别限定，为了防止反应液的蒸发，优选在饱和蒸气压下维持反应。
步骤(b)通过对反应液进行搅拌而能够促进多孔体与纳米颗粒的接触，可以在整个反应时间进行搅拌，或仅在反应时间的一部分例如仅在反应初期进行搅拌，没有特别限定。
被蛋白酶酶解的肽溶解于反应液中并被释放。因此，为了将目标肽片段供于质谱分析，需要去除多孔体和纳米颗粒。这可以通过对蛋白酶解后的样品进行过滤、离心分离、磁性分离、透析等操作来实现。
例如通过使用聚偏氟乙烯(PVDF)制的过滤膜(Low-binding hydrophilic PVDF(低结合亲水性PVDF)、孔径0.2μm、Millipore公司制)、聚四氟乙烯(PTFE)制的过滤膜(Low-binding hydrophilic PTFE(低结合亲水性PTFE)、孔径0.2μm、Millipore公司制)等进行过滤，可以将多孔体和纳米颗粒简便地去除。过滤设为离心过滤时，可以进行迅速且简便的过滤。
＜步骤(c)＞
本发明的方法的步骤(c)相当于通过液相色谱质谱分析(LC-MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤。
质谱分析中的离子化法和经离子化的试样的分析方法没有特别限定。另外，可以使用三重四极型质谱分析装置等来进行MS/MS分析、或MS3以上的多个阶段质谱分析、多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)。
本发明的方法中特别适合的装置没有特别限定，例如可以列举出LCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050、LCMS-8060(均为岛津制作所)、LCMS-IT-TOF(岛津制作所)。
通过质谱分析等来检测包含对于目标单克隆抗体特异性的Fab域例如重链和/或轻链的CDR1区域、CDR2区域、CDR3区域的氨基酸序列的肽片段，从而能够进行目标单克隆抗体的鉴定/定量。
有意作为抗体药物使用的单克隆抗体的氨基酸序列信息等已被公开，可以获得重链和轻链的氨基酸序列、Fab和Fc结构域、互补决定区(CDR)、二硫键等信息。因此，基于nSMOL法通过蛋白酶解而可以得到多个肽，只要可以获得针对每个肽的氨基酸序列信息，就能够容易地理解该肽存在于单克隆抗体中任意的位置。因此，源自Fab域的多个肽中，可以选择特别适合的肽作为分析对象。如此选择的肽被称为“信号肽”。
虽然没有特别限定，但本发明的方法中，优选通过LC-MS检测的肽片段为源自重链的肽片段。
nSMOL法的详细情况公开于如下文献：例如WO2015/033479号；WO2016/143223号；WO2016/143224号；WO2016/143226号；WO2016/143227号；WO2016/194114号；Analyst.2014Feb 7；139(3):576-80.doi:10.1039/c3an02104a；Anal.Methods,2015；21:9177-9183.doi:10.1039/c5ay01588j；Drug Metabolism and Pharmacokinetics,2016；31:46-50.doi:10.1016/j.dmpk.2015.11.004；Bioanalysis.2016；8(10):1009-20.doi:10.4155.bio-2016-0018；Biol Pharm Bull,2016；39(7):1187-94.doi:10.1248/bpb.b16-00230；J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci；2016；1023-1024:9-16.doi:10.1016/j.jchromb.2016.04.038；Clin Pharmacol Biopharm2016；5:164.doi:10.4172/2167-065X.1000164；和J.Pharm Biomed Anal；2017；145:33-39.doi:10.1016/j.jpba.2017.06.032等。这些文献的公开内容通过参照而引入本说明书中。
由岛津制作所以“nSMOL Antibody BA Kit”市售的nSMOL(注册商标)Antibody BAKit中与操作说明书一同包含以下的试剂。
免疫球蛋白收集树脂(本发明中的多孔体的悬浮液)
清洗液1(清洗溶液)
清洗液2(清洗溶液)
反应介质(反应溶液)
增强反应介质(反应促进溶液)
反应停止液(反应停止溶液)
FG Beads Trypsin DART(注册商标、固定有蛋白酶的纳米颗粒(粒径200nm)的悬浮液)
现有的nSMOL法的方案的例子如下。
＜步骤(a)＞
1.将包含单克隆抗体的生物学样品5-10μL用约10-20倍量的PBS+0.1％正辛基硫代糖苷(OTG)稀释。
2.加入免疫球蛋白收集树脂(TOYOPEARL AF-r蛋白A HC-650F,50％研磨液)25μL。
3.平缓地涡漩搅拌5分钟左右。
4.回收全部超自由低蛋白结合Durapore PFDF(0.22μm)。
5.离心去除上清液(10000g×1分钟)。
6.加入PBS+0.1％OTG 300μL，离心去除上清液(10000g×1分钟)。
7.重复步骤6。
8.为了去除表面活性剂，加入PBS 300μL，离心去除上清液(10000g×1分钟)。
9.重复步骤8。
10.加入反应介质或增强反应介质75-100μL。在该溶液中预先添加10fmol/μL的P14R合成肽。
＜步骤(b)＞
11.加入固定化有化学修饰胰蛋白酶的FG beads(0.5mg/ml FG beads悬浮液)5-10μL。
12.在饱和蒸气压下50℃下边平缓地搅拌边进行4-6小时反应。
13.通过在反应液中加入10％甲酸10μL而使反应停止。
14.进行离心过滤(10000g×1分钟)，回收溶液。
15.置于磁力架上，静置约1-2分钟，去除残余的树脂。
＜步骤(c)＞
16.供于LCMS分析。
本发明的方法中的步骤(a’)可以在上述的步骤(a)之后实施。更严格地，对于用于实施步骤(a’)的还原剂的添加，在上述的步骤(a)中，可以在认为生物学样品中的单克隆抗体固定化在多孔体(免疫球蛋白收集树脂)的细孔内得以实现的上述“4.”之后“8.”的操作前的期间的任意时间点进行。由此，固定化于多孔体的细孔内的单克隆抗体因还原剂而发生反应、且在步骤(b)的蛋白酶解之前还原剂被去除。根据需要，可以包括进一步的清洗工序等追加的工序。
作为具有刚性结构的单克隆抗体的一个例子而记载于本说明书中的托珠单抗是能与白细胞介素-6特异性结合的人源化单克隆抗体，可以以Actemra的商品名获得。
同样假设具有刚性结构的莫加木珠单抗是能与CC趋化因子受体4特异性结合的人源化单克隆抗体，可以以Poterijio的商品名获得。
同样地假设具有刚性结构的美泊利单抗是能与白细胞介素-5特异性结合的人源化单克隆抗体，可以以Nucala的商品名获得。
如上所述，本发明的方法对于基于nSMOL法检测具有刚性结构的单克隆抗体是特别有利的，但可以对所有单克隆抗体进行实施。然而，由于在现有的方法中组入追加的步骤，因而使测定时间变长，而且也会使用多余的试剂，因此例如在利用现有的nSMOL法的检测结果显著低于所预料的结果的情况下，或者在预料到预先在单克隆抗体的Fab域包含刚性结构的情况下，推荐选择本发明的方法。
本发明的方法没有特别限定，例如在使用现有的nSMOL法的情况下，难以以0.5μg/mL以下、1μg/mL以下、5μg/mL以下或10μg/mL以下的浓度进行检测，可以适宜地用于无法检测比由药代动力学试验的结果所预料的定量范围还低很多的浓度范围的单克隆抗体、或能够检测的单克隆抗体中的任意种。
作为能够适宜使用本发明的方法的具体的单克隆抗体，没有特别限定，例如可列举出也记载于以下的实施例中的上述的托珠单抗、莫加木珠单抗、和美泊利单抗。
实施例
根据以下的实施例，对本发明进一步进行具体说明，但本发明不受实施例的限定。
[实施例1]
作为测定对象而使用托珠单抗，使用“nSMOL Antibody BA Kit”(岛津制作所)，研究了用于样品中的托珠单抗的检测方法的方案。
在试剂盒中包含的免疫球蛋白收集树脂悬浮液12.5μL中加入清洗液190μL，在其中加入将托珠单抗(中外制药)以100μg/mL添加至人血浆(Kohjin Bio Co.,Ltd.制、用5μm的过滤器过滤后，用0.8μm的过滤器过滤而成)中而得到的样品5μL，轻轻搅拌5分钟左右(步骤(a))。
将得到的悬浮液移至滤杯中，进行离心分离(10000g×1分钟)而去除上清液。
在其中加入5mM、50mM、100mM、250mM或500mM TCEP-HCL(Sigma-Aldrich)水溶液或者不加入而在室温下静置30分钟(pH1.5～2.5、步骤(a’))。
进行离心分离(10000g×1分钟)而去除上清液后，重复3次加入清洗液1300μL并进行离心分离的操作。
重复3次加入清洗液2 300μL并进行离心分离的操作。
加入反应介质80μL，进而加入FG beads Trypsin DART 5μL，在饱和蒸气压下以50℃进行5小时反应(步骤(b))。
加入反应停止液5μL，进行离心过滤，通过磁性分离回收了溶液。
使用NexeraX2***(岛津制作所)和LCMS-8050/8060(岛津制作所)进行LCMS分析(步骤(c))。
基于托珠单抗的重链和轻链的氨基酸序列，选择以下的表1所示的5种肽作为存在于Fab域的指示肽，分别实施了测定。
[表1]
序列位点 氨基酸序列 序列号 MRM瞬态
重链，68-72 VTMLR 1 310.20＞520.20
重链，77-82 NQFSLR 2 382.70＞522.30
轻链，46-53 LLIYYTSR 3 514.80＞227.20
轻链，35-42 ASQDISSYLNWYQQKPGK 4 705.00＞799.90
重链，103-123 TTAMDYVVGQGSLVTVSSASTK 5 730.70＞780.40
图1示出结果，任意的肽的检测结果与未添加TCEP的情况相比，均依赖于所添加的TCEP浓度地改善，添加了250mM TCEP的样品中可以得到最高的相对峰强度。
[实施例2]
为了确认有无由于TCEP的添加而使抗体分子(托珠单抗)从多孔体脱离，在保持有抗体分子的免疫球蛋白收集树脂悬浮液中添加250mM TCEP(pH1.5或pH7.0)并在室温下静置30分钟后，通过SDS-PAGE将溶液(流经(follow-through))和蛋白A珠上的蛋白质分离。作为对照，对添加25mM Tris-HCl(pH8.0)并同样静置后进行电泳。将结果示于图2。
由图2的(A)所示的重链和轻链的条带，重链在任意条件下均未观察到自多孔体的分离(图2的(B))。轻链中，虽然确认了在pH1.5的条件下与250mM TCEP共存的情况下有少许脱离，但在pH7.0下几乎未发生脱离(图2的(C))。由该结果示出，在强酸性条件下，通过SS键而与重链结合的轻链有约30％左右发生脱离的可能性。
[实施例3]
实施例1中提供良好的检测结果，选择作为源自重链的肽的VTMLR(序列号2)作为信号肽，在与实施例1同样的条件下，用添加了250mM TCEP(pH1.5或pH7.0)的样品进行测定。
其结果，如图3所示，证实了：与未添加TCEP的情况相比，pH7.0的中性条件下时检测结果未得到较大的差异，在pH1.5的强酸性条件下，检测结果得以大幅改善。
[实施例4]
用添加了250mM TCEP(pH1.5)的样品，改变在室温下静置的时间(还原反应时间)，对检测结果进行比较。将VTMLR(序列号2)作为信号肽与实施例1同样地进行测定。
其结果，如图4所示，在10分钟的还原反应中，与未添加TCEP的情况相比，可确认检测结果大幅的增大，进而通过使反应时间变长，确认了在直至60分钟为止的范围内依赖于反应时间地得到了更高的检测值。
[实施例5]
变更在血浆中添加托珠单抗的添加量，确认了250mM TCEP(pH1.5)的添加在低抗体浓度下也改善检测结果。将VTMLR(序列号2)作为信号肽与实施例1同样地进行测定。
如表2所示，在加入代替250mM TCEP(pH1.5)而添加反应促进溶液(试剂盒中的增强反应介质)并静置30分钟的步骤的情况下，样品在直至1μg/mL的低浓度下未能进行基于nSMOL法的检测。相对于此，在加入添加250mM TCEP(pH1.5)并静置30分钟的步骤(本发明的步骤(a’))的情况下，显示出能够进行0.25μg/mL以上的浓度的托珠单抗的检测定量。
[表2]
[实施例6]
包括添加250mM TCEP(pH1.5)并静置30分钟的步骤，除此以外在与实施例1同样的条件下对含有0.25～300μg/mL的浓度范围的托珠单抗的样品进行了分析。将VTMLR(序列号2)作为信号肽与实施例1同样地进行了测定。
其结果，如图5所示，得到了与浓度成比例的几乎直线状的定量结果(r＝0.99)，且实现了分析准则基准。证实了本发明的方法是可靠性高的分析方法。
[实施例7]
使用各种抗体，且包括添加250mM TCEP(pH1.5)并静置30分钟的步骤，除此以外在与实施例1同样的条件下进行测定。对于西妥昔单抗(Bristol-Myers Squibb Company)、利妥昔单抗(全药工业株式会社)、本妥昔单抗(武田药品工业株式会社)、伊匹单抗(小野药品工业株式会社)、纳武单抗(小野药品工业株式会社)、贝伐珠单抗(中外制药株式会社)、阿达木单抗(AbbVie GK公司)、曲妥珠单抗(中外制药株式会社)、雷莫芦单抗(Eli LillyJapan K.K.)、英夫利昔单抗(Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation)、美泊利单抗(GlaxoSmithKline K.K.)、莫加木珠单抗(Kyowa Hakko Kirin Co.,Ltd.)，基于氨基酸序列信息等选择表3所示的信号肽，对是否添加250mM TCEP(pH1.5)时的检测结果进行比较。
表3的结果显示出：针对各自的抗体，将未添加250mM TCEP(pH1.5)时(对照)的检测结果作为1的、添加了250mM TCEP(pH1.5)时的相对结果。
如由表3可知，对于托珠单抗、美泊利单抗和莫加木珠单抗(Mogamulizumab)，通过添加250mM TCEP(pH1.5)所致的在酸性条件下的还原反应，使检测结果增大数十倍。该结果显示出，具有比较刚性的结构且在nSMOL法中对蛋白酶解显示出耐性的这些分子由于在强酸性下TCEP的存在而成为容易被酶解的状态，显示出检测结果大幅的改善。相对于此，其它抗体中，虽然也存在显示出少许改善检测结果的情况，但未显示出显著的效果。然而，利用现有的nSMOL法这些抗体可以得到可靠性足够高的检测，且已经确认符合用于验证生物学分析方法的准则的基准。需要说明的是，与对照相比可得到较低值的阿达木单抗和雷莫芦单抗的信号肽源自轻链，因此还启示出由于在强酸性下的TCEP的存在而在蛋白酶解之前轻链从多孔体脱离的可能性。
[表3]
产业上的可利用性
根据本发明，使nSMOL法的方案得到改良，可以期待使用了质谱分析的单克隆抗体的检测方法的进一步的应用。特别是能够广泛地应用在药代动力学试验、治疗药物监测试验中。
本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请直接通过引用并入本说明书。
序列表
<110> 株式会社岛津制作所（Shimadzu Corporation）
<120> 改善单克隆抗体的检测结果的方法
<130> PH-7225-PCT
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 托珠单抗指示肽（Tocilizumab monitor peptide）
<400> 1
Val Thr Met Leu Arg
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 托珠单抗指示肽（Tocilizumab monitor peptide）
<400> 2
Asn Gln Phe Ser Leu Arg
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 托珠单抗指示肽（Tocilizumab monitor peptide）
<400> 3
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg
1 5
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 托珠单抗指示肽（Tocilizumab monitor peptide）
<400> 4
Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
1 5 10 15
Gly Lys
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 托珠单抗指示肽（Tocilizumab monitor peptide）
<400> 5
Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Lys
20
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 西妥昔单抗特征肽（Cetuximab signature peptide）
<400> 6
Ser Gln Val Phe Phe Lys
1 5
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 利妥昔单抗特征肽（Rituximab signature peptide）
<400> 7
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser
1 5 10 15
Tyr Asn Gln Lys
20
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 布伦妥昔单抗特征肽（Brentuximab signature peptide）
<400> 8
Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg
1 5 10 15
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 伊匹单抗特征肽（Ipilimumab signature peptide）
<400> 9
Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser Thr Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
1 5 10 15
Gly Gln Ala Pro Arg
20
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 纳武单抗特征肽（Nivolumab signature peptide）
<400> 10
Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg
1 5 10 15
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 贝伐珠单抗特征肽（Bevacizumab signature peptide）
<400> 11
Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 阿达木单抗特征肽（Adalimumab signature peptide）
<400> 12
Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
1 5 10
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 曲妥珠单抗特征肽（Trastuzumab signature peptide）
<400> 13
Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg
1 5
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 雷米单抗特征肽（Ramcirumab signature peptide）
<400> 14
Ala Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 英夫利昔单抗特征肽（Infliximab signature peptide）
<400> 15
Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1 5 10
<210> 16
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 美泊利单抗特征肽（Mepolizumab signature peptide）
<400> 16
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr
1 5 10 15
Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg
20
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 莫加木珠单抗特征肽（Mogamulizumab signature peptide）
<400> 17
Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Gly Arg
1 5 10

Claims (7)

1.一种样品中的单克隆抗体的检测方法，其包括以下的步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、
(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和
(c)通过液相色谱质谱分析即LC-MS来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，
在步骤(a)之后，还包括以下的步骤：
(a’)追加还原剂而进行在酸性条件下的还原反应的步骤、和
(a”)在进行还原反应之后且进行选择性蛋白酶解之前去除还原剂的步骤，
其中，在pH2.5以下的强酸性条件下实施步骤(a’)；
所述蛋白酶为胰蛋白酶，所述单克隆抗体选自由利妥昔单抗、本妥昔单抗、纳武单抗、曲妥珠单抗、英夫利昔单抗、美泊利单抗、莫加木珠单抗和托珠单抗组成的组中的任一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过在有机磷系还原剂的存在下的孵育来实施步骤(a’)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，有机磷系还原剂为三(2-羧乙基)膦即TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)或其盐酸盐。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，TCEP的浓度为100～500mM。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，步骤(a’)的还原反应的时间为10～60分钟。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，通过LC-MS检测的肽片段源自重链。
7.一种样品中的单克隆抗体的检测方法，其包括以下的步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、
(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和
(c)通过液相色谱质谱分析即LC-MS来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，
在步骤(a)之后，还包括(a’)进行在酸性条件下的还原反应的步骤，
其中，在pH2.5以下的强酸性条件下实施步骤(a’)；
所述蛋白酶为胰蛋白酶，所述单克隆抗体选自由利妥昔单抗、本妥昔单抗、纳武单抗、曲妥珠单抗、英夫利昔单抗、美泊利单抗、莫加木珠单抗和托珠单抗组成的组中的任一种。
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