CN111500739B - 一种用于检测鼻咽癌预后的生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种用于检测鼻咽癌预后的生物标志物及其应用。本发明提出的生物标记物由miR‑106a‑5p、BTG3和SOX9中的一种或三种组成。当生物标记物由miR‑106a‑5p、BTG3和SOX9组成时，可根据三种生物标志物的定量表达量评分可以迅速和精确地预测鼻咽癌预后。若将这组生物标志物组合应用于制备检测鼻咽癌预后的试剂或工具中，将会显著提高鼻咽癌患者预后的预测准确性，进而在大量的鼻咽癌患者中筛选出预后差的群体，在确保这批患者得到合理治疗的同时，也避免了预后较好的患者的过度治疗，缓解了患者及社会的经济压力和医疗资源压力，有利于减少治疗费用并改善鼻咽癌患者的预后。

Description

一种用于检测鼻咽癌预后的生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种用于检测鼻咽癌预后的生物标志物及其应用。
背景技术
鼻咽癌(NPC)是头颈癌最常见的恶性肿瘤，在中国发病率居世界之冠，约占全世界的80％，发病率为15-30人/10万人。目前鼻咽癌的治疗有放疗、化疗和放化疗相结合、靶向药物等多种方法，需要通过病人的实际情况合理选择。每个鼻咽癌患者的预后如何，如何根据他们可能的不同预后情况制定不同的诊疗计划从而得到更好的治疗效果是临床上最为关心的问题之一。目前临床上主要通过病人确诊时的临床病理分期来判断其大致预后、制定治疗策略，然而处于同一临床病理分期的病人时常预后差异较大，因此临床上急需一个更为准确地预测鼻咽癌预后的方法。针对鼻咽癌患者新的预后标志物的发现，能够较准确预测患者的预后情况，为患者的进一步诊治提供依据，对鼻咽癌的诊断和治疗的有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种用于检测鼻咽癌预后的生物标志物及其应用，该生物标志物能够准确地判断鼻咽癌患者的预后。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测鼻咽癌预后的生物标志物，所述生物标志物由miR-106a-5p、miR-106a-5p靶基因BTG3和miR-106a-5p上游转录因子SOX9中的一种或三种组成，所述的miR-106a-5p序列为SEQ ID NO.1，所述的BTG3序列为SEQ IDNO.2，所述的SOX9序列为SEQ ID NO.3。
优选的，所述用于检测鼻咽癌预后的生物标志物为miR-106a-5p，若miR-106a-5p的表达量判定为高表达，则表示鼻咽癌预后差。
优选的，所述用于检测鼻咽癌预后的生物标志物为miR-106a-5p靶基因BTG3，若BTG3的表达量判定为低表达时，则表示鼻咽癌预后差。
优选的，所述用于检测鼻咽癌预后的生物标志物为miR-106a-5p上游转录因子SOX9，若SOX9的表达量判定为高表达时，则表示鼻咽癌预后差。
优选的，所述用于检测鼻咽癌预后的生物标志物由miR-106a-5p、miR-106a-5p下游靶分子BTG3和miR-106a-5p上游转录因子SOX9组成；
所述鼻咽癌的预后检测模型如下式所示：
S＝x1+x2+x3
若A≥9，则x1＝1；若A＜9，则x1＝0；
若B≤7，则x2＝1；若B＞7，则x2＝0；
若C≥8，则x3＝1；若C＜8，则x3＝0；
其中，S表示鼻咽癌的预后评分，S＝3表示预后差，S＝2表示预后中等，S＝1表示预后较好，S＝0表示预后最佳；A表示miR-106a-5p的定量表达量；B表示BTG3的定量表达量；C表示SOX9的定量表达量，x1表示miR-106a-5p对应的预后评分，x2表示BTG3对应的预后评分，x3表示SOX9对应的预后评分。
本发明还提供了上述的用于检测鼻咽癌预后的生物标志物在制备检测鼻咽癌预后的试剂或工具中的应用。
与现有技术相比，本发明提出一种用于检测鼻咽癌预后的生物标志物，生物标记物由miR-106a-5p、BTG3和SOX9中的一种或三种组成。当生物标记物由miR-106a-5p、BTG3和SOX9组成时，可根据三种生物标志物的定量表达量评分可以迅速和精确地预测鼻咽癌预后。若将这组生物标志物组合应用于制备检测鼻咽癌预后的试剂或工具中，将会显著提高鼻咽癌患者预后的预测准确性，进而在大量的鼻咽癌患者中筛选出预后差的群体，在确保这批患者得到合理治疗的同时，也避免了预后较好的患者的过度治疗，缓解了患者及社会的经济压力和医疗资源压力，有利于减少治疗费用并改善鼻咽癌患者的预后。
附图说明
图1为不同miR-106a-5p表达量的鼻咽癌患者生存折线图；
图2为双荧光素酶报告基因检测荧光值对比图；
图3为鼻咽癌组织芯片BTG3、miR-106a-5p染色评分的相关性分析图；
图4为不同BTG3表达量的鼻咽癌患者生存折线图；
图5为双荧光素酶报告基因检测荧光值对比图；
图6为染色质免疫沉淀(Chip)实验超声电泳图；
图7为鼻咽癌组织芯片SOX9、miR-106a-5p染色评分的相关性分析图；
图8为不同SOX9表达量的鼻咽癌患者生存折线图；
图9为TCGA数据库中miR-106a-5p的生存分析折线图；
图10为TCGA数据库中BTG3的生存分析折线图；
图11为TCGA数据库中SOX9的生存分析折线图；
图12为判断鼻咽癌患者预后的不同方法的ROC曲线图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种预测鼻咽癌患者预后的生物标志物组合及其应用进行详细描述。
样本准备
123例鼻咽癌组织样本芯片为上海芯超(OUTDO BIOTECH)所制备。样本的病理诊断及分期依据2018年常见肿瘤AJCC分期手册(第八版)，组织芯片信息见表1。
表1鼻咽癌组织样本芯片信息
Figure BDA0002540188560000021
实施例1(探究生物标志物miR-106a-5p与鼻咽癌患者的预后关系)
为了探究生物标志物miR-106a-5p在鼻咽癌进展中发挥的作用，我们对上述123例组织样本芯片进行了原位杂交(ISH)实验，包括以下步骤：
步骤一：对组织样本芯片进行脱蜡、水化(此步骤需要在通风橱中进行)
利用二甲苯浸泡组织样本芯片30min，每隔10min更换一次二甲苯；然后将二甲苯浸泡后的组织样本芯片利用100％乙醇充分浸洗，100％乙醇中浸泡5分钟，96％乙醇中充分浸洗，96％乙醇中浸泡5分钟，70％乙醇中充分浸洗，70％乙醇中浸泡5分钟，PBS中浸泡5分钟。
步骤二：利用蛋白酶消化组织样本芯片
将脱蜡后的组织样本芯片浸没于37℃的蛋白酶K(15μg/mL)中孵育40分钟，然后在PBS中充分浸洗，70％乙醇中充分浸洗，70％乙醇中浸泡2分钟，96％乙醇中充分浸洗，96％乙醇中浸泡2分钟，100％乙醇中充分浸洗，100％乙醇中浸泡2分钟，最后取出组织样本芯片置于洁净处空气干燥15分钟。
步骤三：杂交(杂交温度为50℃)
将蛋白酶消化处理后的组织样本芯片置于载玻片上并滴加80μL的杂交液，盖上盖玻片，胶水封片以防止样品干片，然后置于50℃杂交仪中1小时。
步骤四：洗片
杂交结束后，祛除载玻片上的封片胶，然后置入5×SSC缓冲液中孵育5分钟(室温)，1×SSC缓冲液中孵育5分钟(50℃)，0.2×SSC缓冲液中孵育5分钟(50℃)，0.2×SSC缓冲液中孵育5分钟(室温)，PBS中浸泡5分钟(室温)。
步骤五：颜色反应
将洗片后的载玻片甩干，置于1mL封闭液(1mL封闭液中包括100μL的10×Roche封闭液加900μL的1×顺丁烯二酸缓冲液)中封闭15分钟(室温)，用吸水纸吸干封闭液后，置于湿盒中用1:800的anti-DIG-AP Fab fragments孵育(4℃过夜)，然后在室温下置于PBST中浸泡15分钟，每5分钟更换一次PBST；然后在室温、避光条件下，使用400μL/slide的NBT/BCIP缓冲液(每毫升NBT/BCIP缓冲液中含有20μL的Roche试剂缓冲液和1mL的NBT/BCIP稀释液)孵育载玻片24h。
实验结果：
上述miR-106a-5p原位杂交实验结果判定由两个病理师在不了解切片资料的情况下进行评判，判定标准见表2。最终染色评分定义为染色强度与染色面积的乘积：将0-8的染色评分定义为miR-106a-5p低表达，将9-16的染色评分定义为miR-106a-5p高表达。
表2原位杂交结果判定标准
染色强度 阴性 弱阳性 中度阳性 强阳性
得分 1 2 3 4
染色面积 0-25％ 26-50％ 51-75％ >75％
得分 1 2 3 4
进一步，以原位杂交结果判定标准对123例鼻咽癌组织样本芯片进行评分，并统计鼻咽癌患者的预后情况和生物标志物miR-106a-5p在鼻咽癌患者不同临床分期中的表达情况，结果如表3所示。
表3组织样本芯片miR-106a-5p评分结果及预后情况统计
Figure BDA0002540188560000031
由表3可知，miR-106a-5p的表达含量在IV临床阶段患者中比在I～III临床阶段的患者更高，说明miR-106a-5p的失调可能与鼻咽癌的终末期恶性进展相关。
进一步，基于Kaplan-Meier法分析miR-106a-5p表达与鼻咽癌患者预后情况之间的关联，并作出图1，图1为不同miR-106a-5p表达量的鼻咽癌患者生存折线图，图1表明具有高miR-106a-5p表达的患者的预后情况比具有低miR-106a-5p表达的患者更差。
实施例2(证明生物标志物BTG3是miR-106a-5p的直接靶标)
通过荧光素酶报告基因实验证实了miR-106a-5p和BTG3的生物学有效相互作用，荧光素酶报告基因实验的具体操作步骤如下：
步骤一：质粒转染鼻咽癌CNE2细胞
1、实验分组：
A组：质粒为106NC和PGL3-Mut
B组：质粒为106NC和PGL3-WT
C组：质粒为106Mimics和PGL3-Mut
D组：质粒为106Mimics和PGL3-WT
2、接种CNE2细胞至六孔板内，每组设置3个重复，然后在六孔板内注入培养基进行细胞培养，当细胞密度达到40％-50％时，按照分组加入转染试剂和对应的质粒进行共转染。
共转染过程：1mL基础培养基中加入5μL的Lip3000转染试剂，混匀后室温孵育5分钟，按照分组加入1μg相应质粒和200ng海肾荧光素质粒混匀后，室温孵育10分钟。
步骤二：荧光素酶报告基因检测
1、共转染结束48小时后，移除六孔板内细胞基础培养基，采用PBS清洗六孔板内细胞，然后在六孔板的每个孔中加入100μL的1×Passive Lysis Buffer(1×Passive LysisBuffer由5×Passive Lysis Buffer用水稀释得到)裂解细胞，移至1.5mL离心管中离心，取上层细胞裂解液，得到对应的A、B、C、D共四组细胞裂解液。
2、96孔板中每孔先加入100μL的LARⅡ溶液(LARⅡ溶液由10mL的Luciferas AssayBuffer稀释冻干Luciferas Assay Substrate配制而成)，再分别加入20μL制得的不同组别的细胞裂解液，每组3个重复孔，然后立即放入荧光酶标仪中读取数值a，然后加入100μL预混合的Stop&GLO溶液(Stop&GLO溶液由Stop&GLO Substrate与Stop&GLO Buffer以1:50的比例混合配置)，立即放入荧光酶标仪中进行二次读数，读取数值b，实验所得的荧光值为两次读数之比即a/b，然后根据得到的荧光值做出图2，图2为双荧光素酶报告基因检测荧光值对比图。
实验结果：
由图2可知，106Mimics显著降低了转染入野生型BTG3(PGL3-WT)质粒的CNE2细胞中的荧光素酶活性，但转染入突变体BTG3(PGL3-Mut)质粒的CNE2细胞中的荧光素酶活性未有显著改变。根据图2可知，BTG3是鼻咽癌细胞中miR-106a-5p的真正靶标。
实施例3(生物标志物BTG3与鼻咽癌患者的预后关系)
实验方法：
为了探究生物标志物BTG3(即miR-106a-5p靶基因)在鼻咽癌进展中发挥的作用，同样地针对BTG3对123例组织样本芯片进行免疫组化实验，包括以下步骤：
步骤一：对组织样本芯片进行脱蜡、水化(此步骤需要在通风橱中进行)
利用二甲苯浸泡组织样本芯片30min，每隔10min更换一次二甲苯；然后将二甲苯浸泡后的组织样本芯片利用100％乙醇充分浸洗，100％乙醇中浸泡5分钟，96％乙醇中充分浸洗，96％乙醇中浸泡5分钟，70％乙醇中充分浸洗，70％乙醇中浸泡5分钟，PBS中浸泡5分钟。
步骤二：抗原修复、淬灭、封闭
1、水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液至沸腾，放入组织芯片加热20分钟。取出，待其温度降至室温，PBS溶液冲洗，5分钟×3次。
2、3％H2O2室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS溶液冲洗，3分钟×3次。
3、一抗封闭液室温孵育30分钟。
步骤三：抗体结合
1、滴加使用一抗稀释液1:50稀释BTG3抗体配置而成的一抗工作液。4℃孵育过夜。
2、PBS溶液冲洗，3分钟×3次。滴加生物素标记二抗，室温孵育1小时。PBS溶液冲洗，3分钟×3次。
步骤四：颜色反应
1、DAB染色剂显色，在显微镜下掌握染色程度。流动自来水冲洗10分钟。
2、苏木精染核两分钟，盐酸酒精分化。流动自来水冲洗15分钟。
3、脱水、封片、染色评分。
生物标志物BTG3的组织芯片免疫组化结果判定由两个病理师在不了解切片资料的情况下进行评判，判定标准与表2一致。最终染色评分定义为染色强度与染色面积的乘积。将0-7的染色评分定义为BTG3低表达，将8-16的染色评分定义为BTG3高表达。
进一步，以生物标志物BTG3的免疫组化判定标准对123例鼻咽癌组织样本芯片进行评分，并统计鼻咽癌患者的预后情况和生物标志物BTG3在鼻咽癌患者不同临床分期中的表达情况，结果如表5所示。
表5
Figure BDA0002540188560000041
Figure BDA0002540188560000051
对miR-106a-5p及BTG3的染色评分进行相关性分析，分析结果见图3，由图3可知，BTG3的表达含量与miR-106a-5p的表达呈负相关，说明BTG3的异常表达可能与鼻咽癌的终末期恶性进展相关。
进一步，基于Kaplan-Meier法分析BTG3表达与鼻咽癌患者预后情况之间的关联，结果如图4所示，图4表明具有低BTG3表达的患者的预后情况比具有高BTG3表达的患者更差，与生物标志物miR-106a-5p对鼻咽癌患者预后的作用相反。
实施例4(证明生物标志物SOX9是miR-106a-5p的上游基因)
实验方法：
为确定调控miR-106a-5p的上游转录因子，我们应用转录因子结合位点的分析网站JASPAR(http://jaspar.jenereg.net)对miR-106a-5p的启动子序列进行分析，确定了SRY-box转录因子9(SOX9)可与之结合于-1472，表明SOX9调节miR-106a-5p的转录。
进一步，通过荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀(ChIP)证明二者间的相互作用，荧光素酶报告基因实验步骤如下：
步骤一：质粒转染鼻咽癌CNE2细胞
1、实验分组：
A组：质粒为TF-NC和MIR106A promoter-NC
B组：质粒为SOX9和MIR106A promoter-NC
C组：质粒为TF-NC
D组：质粒为TF-NC和MIR106A promoter
E组：质粒为SOX9和MIR106A promoter
2、接种CNE2细胞至六孔板内，每组设置3个重复，然后在六孔板内注入培养基进行细胞培养，当细胞密度达到40％-50％时，按照分组加入转染试剂和对应的质粒进行共转染。
共转染过程：1mL基础培养基中加入5μL的Lip3000转染试剂，混匀后室温孵育5分钟，按照分组加入1μg相应质粒和200ng海肾荧光素质粒混匀后，室温孵育10分钟。
步骤二：荧光素酶报告基因检测
1、共转染结束48小时后，移除六孔板内细胞基础培养基，采用PBS清洗六孔板内细胞，然后在六孔板的每个孔中加入100μL的1×Passive Lysis Buffer(1×Passive LysisBuffer由5×Passive Lysis Buffer用水稀释得到)裂解细胞，移至1.5mL离心管中离心，取上层细胞裂解液，得到对应的A、B、C、D、E共五组细胞裂解液。
2、96孔板中每孔先加入100μL的LARⅡ溶液(LARⅡ溶液由10mL的Luciferas AssayBuffer稀释冻干Luciferas Assay Substrate配制而成)，再分别加入20μL制得的不同组别的细胞裂解液，每组3个重复孔，然后立即放入荧光酶标仪中读取数值a，然后加入100μL预混合的Stop&GLO溶液(Stop&GLO溶液由Stop&GLO Substrate与Stop&GLO Buffer以1:50的比例混合配置)，立即放入荧光酶标仪中进行二次读数，读取数值b，实验所得的荧光值为两次读数之比即a/b，然后根据得到的荧光值做出图5，图5为双荧光素酶报告基因检测荧光值对比图。
染色质免疫沉淀实验使用默克密理博公司chip试剂盒，具体操作步骤如下：
步骤一：将CNE2及5-8F细胞(1×107)与1％甲醛交联10min并经超声波处理产生200至1000bp的DNA片段。
步骤二：交联的DNA-protein进行染色质免疫沉淀，除常规的input、阴性对照、阳性对照，目的蛋白中加入SOX9抗体以完成染色质免疫沉淀。将交联的DNA-protein与抗体混合后缓慢旋转4℃孵育过夜。
步骤三：加入60μLProteinA+GAAgarose/Salmon sperm DNA，4℃缓慢旋转混匀60分钟，以沉淀一抗识别的相应复合物。
步骤四：按照制造商的说明书步骤完成所有洗涤步骤，所得沉淀用于后续凝胶电泳分析。
步骤五：用miR-106a-5p启动子结合位点的引物对步骤三所得沉淀进行PCR扩增，以从总核提取物中提取的DNA作为PCR阳性对照，用2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，分析结果如图6所示。
实验结果：
由图5和图6可知，SOX9直接结合到miR-106a-5p启动子的预测结合位点并且反式激活miR-106a-5p，可进一步确定生物标志物SOX9是miR-106a-5p的上游基因。
实施例5(生物标志物SOX9与鼻咽癌患者的预后关系)
实验方法：
为了探究生物标志物miR-106a-5p上游基因SOX9在鼻咽癌进展中发挥的作用，同样地针对SOX9对123例组织样本芯片进行免疫组化实验，包括以下步骤：
步骤一：对组织样本芯片进行脱蜡、水化(此步骤需要在通风橱中进行)
利用二甲苯浸泡组织样本芯片30min，每隔10min更换一次二甲苯；然后将二甲苯浸泡后的组织样本芯片利用100％乙醇充分浸洗，100％乙醇中浸泡5分钟，96％乙醇中充分浸洗，96％乙醇中浸泡5分钟，70％乙醇中充分浸洗，70％乙醇中浸泡5分钟，PBS中浸泡5分钟。
步骤二：抗原修复、淬灭、封闭
1、水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液至沸腾，放入组织芯片加热20分钟。取出，待其温度降至室温，PBS溶液冲洗，5分钟×3次。
2、3％H2O2室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS溶液冲洗，3分钟×3次。
3、一抗封闭液室温孵育30分钟。
步骤三：抗体结合
1、滴加使用一抗稀释液1:50稀释SOX9抗体配置而成的一抗工作液。4℃孵育过夜。
2、PBS溶液冲洗，3分钟×3次。滴加生物素标记二抗，室温孵育1小时。PBS溶液冲洗，3分钟×3次。
步骤四：颜色反应
1、DAB染色剂显色，在显微镜下掌握染色程度。流动自来水冲洗10分钟。
2、苏木精染核两分钟，盐酸酒精分化。流动自来水冲洗15分钟。
3、脱水、封片、染色评分。
实验结果：
生物标志物SOX9的组织芯片免疫组化结果判定由两个病理师在不了解切片资料的情况下进行评判，判定标准与表2一致。最终染色评分定义为染色强度与染色面积的乘积：将0-7的得分定义为SOX9低表达，将8-16的得分定义为SOX9高表达。
进一步，以生物标志物SOX9的免疫组化判定标准对123例鼻咽癌组织样本芯片进行评分，并统计鼻咽癌患者的预后情况和生物标志物SOX9在鼻咽癌患者不同临床分期中表达的情况，结果如表6所示。
表6
Figure BDA0002540188560000061
对miR-106a-5p及SOX9的染色评分进行相关性分析，由图7可知，SOX9的表达含量与MIR106A-5p水平呈正相关，说明SOX9的失调可能与鼻咽癌的终末期恶性进展相关。
进一步，基于Kaplan-Meier法分析SOX9表达与鼻咽癌患者预后情况之间的关联，分析结果如图8所示，由图8可知具有低SOX9表达的患者的临床结果比具有高SOX9表达的患者更差，与生物标志物miR-106a-5p对鼻咽癌患者预后的影响呈正相关。
实施例6(TCGA验证实验结果)
为了验证生物标志物miR-106a-5p、BTG3、SOX9的表达对鼻咽癌患者预后影响结果的可靠性，借助癌症基因组图谱(TCGA；http://www.cbioportal.org)数据库对525名头颈癌患者进行Kaplan-Meier分析评估生物标志物miR-106a-5p、BTG3、SOX9的预后意义。TCGA数据库结果分别如图9、图10、图11所示，由图9可知，miR-106a-5p表达越高鼻咽癌患者预后越差；由图10可知，BTG3表达越低鼻咽癌患者预后越差；由图11可知，SOX9表达越高鼻咽癌患者预后越差。综合图9-11可知，miR-106a-5p与其靶基因BTG3对鼻咽癌患者预后的影响呈负相关；miR-106a-5p与其上游转录因子SOX9对鼻咽癌患者预后的影响呈正相关。评估结果验证了实验结果，说明采用生物标志物miR-106a-5p、BTG3和SOX9对鼻咽癌患者预后预测的可靠性、准确性高。
实施例7(生物标志物组合与鼻咽癌患者的预后关系)
序列为SEQ ID NO.1的miR-106a-5p、序列为SEQ ID NO.2的miR-106a-5p的下游靶基因BTG3和序列为SEQ ID NO.3的miR-106a-5p的上游转录因子SOX9组成的鼻咽癌的预后生物标志物组合。
采用该预后生物标志物组合进行鼻咽癌的预后检测模型如下式所示：
S＝x1+x2+x3
若A≥9，则x1＝1；若A＜9，则x1＝0；
若B≤7，则x2＝1；若B＞7，则x2＝0；
若C≥8，则x3＝1；若C＜8，则x3＝0；
其中，S表示鼻咽癌的预后风险值，S＝3表示预后差，S＝2表示预后中等，S＝1表示预后较好，S＝0表示预后最佳；A表示miR-106a-5p的定量表达量；B表示BTG3的定量表达量；C表示SOX9的定量表达量。x1表示miR-106a-5p对应的预后评分，x2表示BTG3对应的预后评分，x3表示SOX9对应的预后评分。
具体的，本申请运用患者活检后组织病理切片，通过原位杂交、免疫组化技术对病理切片进行染色及评分。根据实例1、3、5，我们采用以上预后标志物组合，将miR-106a-5p的病理切片染色评分(定量表达量)定为A，miR-106a-5p的下游靶基因BTG3的病理切片染色评分(定量表达量)定为B，miR-106a-5p的上游转录因子SOX9的病理切片染色评分(定量表达量)定为C。在每个病人的病理切片中，若A≥9则评1分，若A≤8则评0分；若B≤7则评1分，若B≥8则评0分；若C≥8则评1分，若C≤7则评0分；三项分数相加即为每个病人的总得分，每个病人的得分可为0、1、2、3分四种。得分为3分时，认为该病人预后差，在我们已有的114名病人中，属于此组的有17人，五年生存率为64.7％；得分为2分时，认为该病人预后中等，在我们已有的114名病人中，属于此组的有32人，五年生存率为81.25％；得分为1分时，认为该病人预后较好，在我们已有的114名病人中，属于此组的有27人，五年生存率为85.2％；得分为0分时，认为该病人预后最佳，在我们已有的114名病人中，属于此组的有38人，五年生存率为94.7％。
应用ROC曲线图评价本实施例预测模型的临床准确性，ROC曲线图见图12，横坐标是假阳性率(1-特异度)，纵坐标是真阳性率(灵敏度)，计算ROC曲线下的面积值(AUC值)在1.0和0.5之间，在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。若单独使用A、B、C三个数值根据实例1、3、5的描述将病人分为高表达、低表达两组来判断其预后，则其AUC值分别为0.605、0.618、0.645。若使用实施例7上述分组来判断预后，AUC值为0.693，较前更优，说明综合考虑A、B、C三个数值预测病人预后准确性较高。
综上可知，本发明生物标志物组合miR-106a-5p、BTG3、SOX9和鼻咽癌的发展及预后密切相关，可用于辅助预测鼻咽癌患者的生存及预后情况，而且证明了生物标志物miR-106a-5p为高表达时，鼻咽癌患者判定为预后差，生物标志物BTG3为低表达时，鼻咽癌患者判定为预后差，生物标志物SOX9为高表达时，鼻咽癌患者判定为预后差。还通过荧光素酶报告基因实验证实了生物标志物BTG3是miR-106a-5p的直接靶标，通过荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀(ChIP)实验证了生物标志物SOX9是miR-106a-5p的上游基因，进一步证明了利用本发明生物标志物组合能够准确判定鼻咽癌患者预后。在此基础上，同时综合考量同一个病人的miR-106a-5p、BTG3、SOX9生物标志物组合表达水平判断其预后，临床准确性高于单独通过三者表达判断预后。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 南通大学附属医院
<120> 一种用于检测鼻咽癌预后的生物标志物及其应用
<130> 2020.06.15
<141> 2020-06-15
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aaaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 2
<211> 1542
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
actcgtgtgc gcgctcgtcc gcccgccagt cctctcaacg cgcgcttggc cgcccgacga 60
cgcgggagcc gcacgcgccg gacgaggctc gctgcgctcc ctgttgccca gcgcgggccc 120
gttgaggcgg agccctcagt tcccggccag gacacggtct gggccgccga atctccggcc 180
gaagagcggc ggcggcagcg gcgggaaaaa aatgaagaat gaaattgctg ccgttgtctt 240
ctttttcaca aggctagttc gaaaacatga taagttgaaa aaagaggcag ttgagaggtt 300
tgctgagaaa ttgaccctaa tacttcaaga aaaatataaa aatcactggt atccagaaaa 360
accatcgaaa ggacaggcct acagatgtat tcgtgtcaat aaatttcaga gagttgatcc 420
tgatgtcctg aaagcctgtg aaaacagctg catcttgtat agtgacctgg gcttgccaaa 480
ggagctcact ctctgggtgg acccatgtga ggtgtgctgt cgtagagatg gggtttcacc 540
atgttggcca gactgctctc aaactcctga cctcgtgatc cgcccgcctt ggcctcccaa 600
agcgctggat tacaggcgtg agccactgcg cccggcctcc tcctttttga ttatgtatgg 660
agagaaaaac aatgcattca ttgttgccag ctttgaaaat aaagatgaga acaaggatga 720
gatctccagg aaagttacca gggcccttga taaggttacc tctgattatc attcaggatc 780
ctcttcttca gatgaagaaa caagtaagga aatggaagtg aaacccagtt cggtgactgc 840
agccgcaagt cctgtgtacc agatttcaga acttatattt ccacctcttc caatgtggca 900
ccctttgccc agaaaaaagc caggaatgta tcgagggaat ggccatcaga atcactatcc 960
tcctcctgtt ccatttggtt atccaaatca gggaagaaaa aataaaccat atcgcccaat 1020
tccagtgaca tgggtacctc ctcctggaat gcattgtgac cggaatcact ggattaatcc 1080
tcacatgtta gcacctcact aacttcgttt ttgattgtgt tggtgtcatg ttgagaaaaa 1140
ggtagaataa accttactac acattaaaag ttaaaagttc ttactaatag tagtgaagtt 1200
agatgggcca aaccatcaaa cttattttta tagaagttat tgagaataat ctttcttaaa 1260
aaatatatgc actttagata ttgatatagt ttgagaaatt ttattaaagt tagtcaagtg 1320
cctaagtttt taatattgga cttgagtatt tatatattgt gcatcaactc tgttggatac 1380
gagaacactg tagaagtgga cgatttgttc tagcaccttt gagaatttac tttatggagc 1440
gtatgtaagt tatttatata caaggaaatc tattttatgt cgttgtttaa gagaattgtg 1500
tgaaatcatg tagttgcaaa taaaaaatag tttgaggcat ga 1542
<210> 3
<211> 12401
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cagtcgaccc agcccccgag actccctcac gccgctccaa aaccaaaacg gagcccaaca 60
cgaagctggg tgaagccgta gcttgcagga gccagggaga tgcgctctgc ccgggacttc 120
ccgggtcctg ttgagacgga aaggatcgca gggaagacag gataattggt ctttaactct 180
gaccgttacc ttcgaaattg caccttacaa gcatgtcctc tatttccgtg gcttgatggg 240
gacactttct ctgattaaga tccggaataa tcacccaccc aatgggatct cttagaggga 300
agcgctggtt agaatccctc caggctgaga tgcaatcatc gccattgagc ctgccctccc 360
ctagggaaac cccacaaaac catcctgaga atctcagccc tctttggtcg gtacctgaga 420
ctgcatagac ctaaactgaa aggtgatcga aggggaggag cagttgctcg tgcggaggaa 480
gctcttgggg ccgaagtggc cccggccgag tatgtcgcaa aggaggcacc actgcgttga 540
gcgcttactg tatctttact tttaaatcac caaggcaaaa tcaccttcag ctaaaaatgc 600
ctgaaagact ttttaaaata gtgggagtgg gcgttagggg gaagagatgg cctaggaaat 660
tttccgcagg gcgttctagg gatgagttga gggaagccgc atgacgcgcg gctccccggt 720
gccacagcta aggacagata ttttcgcaaa acccagaatg aaaaaagagc acgctccctt 780
tgggagcgct gtccctttgg gactggggcc ttccactccc acccctcctt tttccctgat 840
cggctccgca gctccacgac aagccagctg gtctggtctc tgacttgggc tccggtccgt 900
acccccgggg cgccctgctg tgttacagcc gcccgacgcc cccagacccg gccaggtcac 960
cagggcagat tggaggttcg cgccccctca cccgacacct cccgtccacc tcatctttct 1020
ttttttcgaa aacaggaaag ggaagaaaac tgaaacgggc ctcttggtct gcagttttag 1080
cggagtcggg attccacagc cctgagtggc acatgccggt caacttccca aagtcgggct 1140
cccgtgtggg gagaaataca cacgcaggaa tgcacaagca tcgcgtgttc gcaactgtcg 1200
ctgggaggtc tggcggctgt gatgggacat gcactcactc gggcaacacg tccacaggtg 1260
acatctattc gatcagtcaa cagatattta ttgcgcacct acgacgctat ctggtacttt 1320
ccttttcccc ttagctgttg ctgtccagcc cagcgccagt ccagagacgg gcttaccggc 1380
cgctcccttc cacaagaaac tcgtgtccgg cgtgaagagc ggacgataaa cactctccaa 1440
gcccagcgaa atgtactaat tacaggagcg gctgggagcc cgcgacacgg ggacctgtcc 1500
ctccagggat aggagtcttc tacctgcaag ggacccggcc tggggaactg gaatagacaa 1560
ggggtaaccc cttctcccat cacctctaat gagaacattg tccggggctg agatatttgg 1620
gggacgccgc tgctcacccc accaaacttt ccctagggac agaaaagcgt ccctaccgaa 1680
aacggattta aacaccgtcc ccacttttgc taaggaagtt tggataggga ggttgtggtc 1740
cttaattcgc caggtaaaag gaaccccatc agctcgcatc cctcaccccc atcctgagca 1800
ctgagtgttt gcgagaaact cgccctgcgc cagcaactct gggctccggt ctcagctccc 1860
gcgtagacgc ggaggagaga ttggcggccc ccgctgggga aattgagccc ggcgccggtc 1920
cgggacgtgc aagaggggga aagggggaga tcccagacct cggtttcccg agggcttccc 1980
tggggagcca ctcgcacctc tgtgtctccg ctcccggcgg cagacctcgc ggcgcttgct 2040
caagagcggg tatccgaaag cacgtcccga acacggagaa gcgccctccg tctcctgcct 2100
cgtgacctgc gccctttccc tccctcaccg catcagatgg aggaccctgg ctcctttcgc 2160
ccctggcaaa atgctctagc caacactggg tcaacagcct tagtttccag atctgtaacc 2220
tgaacatcag gagcgggttc ctttccttct acctgtgtct gaggtcctct ggtcggggac 2280
tgcgcgcgtc ttcccaggtc agggaggagg ggtcggggcg acctgagaaa gacacaacga 2340
agcgaatgga gcccctgaat ggggaaaggg gagtggacac caggaggccc ctgcagaaat 2400
gcaggaccga tccactcgcg agctgacaat gccacgcgct agacttggcc tgacggtggc 2460
aacgcttggc acctggggga taggggcctt ctcctggcct cagtccccaa attctgcgca 2520
gaatagaacg gctggcatct caagtgctct tttttcaccc ggatctctac agacacaagt 2580
tccctcactg agctgcgcag aggtggatcc gcacaggagg gaatatcgcg taggaattcc 2640
tgcaaatata aatctcagca gcaaagcagt ccagattgac tggaacacac cacccccagc 2700
caccaccatc caagttttcc ctggttctcg gagttggaaa cagtttctgg gcttttggcg 2760
ccccctctgg atacagatga aaactgcagt ccatttttaa gtcgcctgtt cataagtttt 2820
caggaagatg taaaattcaa aaatgcttgc atcaaatcaa cgggaaatgt ataaatcccc 2880
gtcgtttatg atgtaaaact ctacatatta gtatcttatt gcataattgc attaaaagta 2940
tatttataca tatacgtata tatcttgaca tatatttagt gaaatattcc aaaatatctt 3000
aaagtcatag ccctcttcac tgactttatt ccagcaaaca tggtaattac aatatcatac 3060
aactaagtac agacgacctg gctaaaatgt ctgcccgatg gtctccgagt ctcctgaatc 3120
aggtgtctga gaattacaca gttatactgt acacacaatg cccttctacc cgggacacag 3180
aaataggtcc acactacgcg gacttttttc tcctaggaaa ggacgatgct gttcttacac 3240
tttctgaaag taatcacaga gccctggata cgaagctatt gtatgcaaat ctcttaaatt 3300
tgtaaacgag ctatagggca ccagaaacat cccatttgaa gaagttacat tcgttaaaaa 3360
aaaaatgctg ttgaacaagg ctgtaactta ctaccttatg aagagttcca tttcctataa 3420
gaaatgtcgg gcttcttccg aagacaacga gagaaaacaa gattttaaga aattctcccg 3480
gaaggacatt gatttggatc ttgtgatagt gtcctcactt cgcaaattag aaagggaaaa 3540
aaaaactagt ttttattatg atgtgggccg attcaccaca acaataattt aattgaggcg 3600
aatttttgca agagcccaaa agggtggggg ggggggggga gtttaaaatt aagagtttcc 3660
caatgctgtg cgtttatttg ggattctgaa agcacagaac ccgcaagcga ccaagacttt 3720
tcttctatcc cagagcagat agctccgcac ttacccaacc tggctctaag catttcgtgt 3780
aaacacaaag gttgtgctca aatcacactt gaaatacatg agagacacca ccaatgcctc 3840
ccccagaact cccaactaca tgcaggtctg aaccgaccgg actagagtca gaagcaccgg 3900
cgcttcaccc cttcaggtgt ttcgtaaatg ccagcaaaag caggcaagca gcatgactcc 3960
gccagagtgg agcgttttgt ctgcggtggt gcccatttgt ttggtctttt acaaaccaag 4020
tgaccggcct gggcctcgcg gcccgggaca gccgcattgg caaacttcta tctctcaaag 4080
ccagagcagt tagcaaactc tcccccagac agggcgactc ggctgacgtt tttgacccgg 4140
ccaggaggca aagaccaaaa cgtcagagca gtagccctgt tactgaggag cgtcggcagg 4200
gtcgcgggta gagggggctg gagaatgact tgtcagagct caaggtcgat gtggcgcggg 4260
gcggcctcga gagcgccggg ctcctgcgtg gccacggccg ccgctgccaa ccttcgcggg 4320
gacttagctt tgctttccat tgactccctt tgcaaaagcg cagcagaatc ctgaccagcc 4380
gcaccagccc cggcgaaccc gagcatgtta atctatttat atggattatt acggaggaac 4440
agcgggcgtt gagtcaccaa aacatttgct tcaaaagact atttctaagc acttttgcag 4500
gcaggcaggc tcgctccagg cgcgtaaact cggctacgca ttaagaagcg gctgcttttc 4560
gaatactgca aactccagct aagtccccgg tgccgcggag agagcagtga aaagaaatgt 4620
cggaggtggg ggtagatcct agtctagaca cacacacttg cgcgcacaca cacacacaca 4680
cacacaagat tcgcgcggag aaggcactaa aattctggca ttccgagagt acgacaaact 4740
tacacacttg gaagtcccgg gtcccccgcc ttccccgcag caccccccgc ccccccaccc 4800
taccgtccgc cctttggctg cgatcccctc ccctctcctc ccctcccgcc tcgtcaccca 4860
gcccagtgcc acaatcctcc tccctcccca aaatcgggtc caatcagctg cctgccaacc 4920
ctgggactgc tgtgctgtga ttggcgggtg gctctaaggt gaggcggagt atttattaaa 4980
gagaccctgg gctgggagtt ggagagccga aagcggagct cgaaactgac tggaaacttc 5040
agtggcgcgg agactcgcca gtttcaaccc cggaaacttt tctttgcagg aggagaagag 5100
aaggggtgca agcgccccca cttttgctct ttttcctccc ctcctcctcc tctccaattc 5160
gcctcccccc acttggagcg ggcagctgtg aactggccac cccgcgcctt cctaagtgct 5220
cgccgcggta gccggccgac gcgccagctt ccccgggagc cgcttgctcc gcatccgggc 5280
agccgagggg agaggagccc gcgcctcgag tccccgagcc gccgcggctt ctcgcctttc 5340
ccggccacca gccccctgcc ccgggcccgc gtatgaatct cctggacccc ttcatgaaga 5400
tgaccgacga gcaggagaag ggcctgtccg gcgcccccag ccccaccatg tccgaggact 5460
ccgcgggctc gccctgcccg tcgggctccg gctcggacac cgagaacacg cggccccagg 5520
agaacacgtt ccccaagggc gagcccgatc tgaagaagga gagcgaggag gacaagttcc 5580
ccgtgtgcat ccgcgaggcg gtcagccagg tgctcaaagg ctacgactgg acgctggtgc 5640
ccatgccggt gcgcgtcaac ggctccagca agaacaagcc gcacgtcaag cggcccatga 5700
acgccttcat ggtgtgggcg caggcggcgc gcaggaagct cgcggaccag tacccgcact 5760
tgcacaacgc cgagctcagc aagacgctgg gcaagctctg gaggtaggac ccggcggggg 5820
cggcgcggca gggtgggcat cgcggcggct gggggcgctg gtcagggctg atttgccccg 5880
ccccgcctcc catcgcccgg gagttgccgt tccgggagcc ggcgggatgg ggttgggagt 5940
gggaatgggg tgtaactgtg gctcagagtt tgacaaagtt cttgggctgc tcgcggggac 6000
gcggaggagg ggggtggtaa gtggaagagg tgagggaggt agctggagga tggacgaaga 6060
ctggtgggag acggaaggag ggggctgcca gcctgctctc cagtcgcctg gaagctcaat 6120
cggggcgggg aagtgaaact tgcctccctc ctacccggcc tcttaaaact gcactctctc 6180
gtgcagcccc actgtccacg gagatggggc aagggagaaa ccgaggttgg aggagaccct 6240
tggcaggaac tgggaggcgg gaggagggag gctactggaa ataggtggga gtgtatggtg 6300
gggggtgaga attggggacc ttcttgcagc ttaagtaatt tgggggaaag ttttcaaagg 6360
gggttggggt tgggggcggt aagtcgagca gcaaaggcgt ttagggggca gcaccgggag 6420
tcgttttcat ctccagcgtt tccaaaatag aaatagaagg ggaggggagg gagggggcgg 6480
ggagtgaccg ctcaggtcag actgcaataa cttatttatt tatttatttt taagaaaagt 6540
tatgagctgt ggttgcaggc aggagggaag atggagttgt gtgcagagga agccgagtgg 6600
tctgggtcgc cgcctcctcc ccgccgacct gacagtttgg cggatttcac tgacccctct 6660
ccctcttttt ctctgtgccc cccgccccgc cccgagcaga cttctgaacg agagcgagaa 6720
gcggcccttc gtggaggagg cggagcggct gcgcgtgcag cacaagaagg accacccgga 6780
ttacaagtac cagccgcggc ggaggaagtc ggtgaagaac gggcaggcgg aggcagagga 6840
ggccacggag cagacgcaca tctcccccaa cgccatcttc aaggcgctgc aggccgactc 6900
gccacactcc tcctccggca tgagcgaggt gcactccccc ggcgagcact cgggtgagtc 6960
gcccctcgac cccaccggac aagctatctc cgtcccgcct ggcacacccc ctgccctccg 7020
cctgggagat tcttcgtggg gactttatgc ttcccgggag ggacacactg ccctttgcgc 7080
ccgtcccgct cccctctcta cccagagcct aagaggcatc caaacaacac acacacaaac 7140
acacacaccc caactcaatc ccagcatccg aagagattaa cttttttatt gggaggtaaa 7200
atgcccttaa cagccttaca agacctctcc cttcttctct gctcccccac cccaaaagca 7260
cacacagggc tcttacacaa gtagcaatta ggtcttccgg accctccggg ccccagaccc 7320
tcccctgata aaagggggct gtccagtgtg taccggcggg ttaatcattg ggcgacttat 7380
ctccggtgca gcgcgcctct tgcgcgggtg cgggccctta ttacacttta gcagcgaggg 7440
agggtccccg gagggtgcct aagactaggg cgtctgcaca gcccttgttg attttctcgt 7500
gcttgttctt ttattgtcca cagggcaatc ccagggccca ccgaccccac ccaccacccc 7560
caaaaccgac gtgcagccgg gcaaggctga cctgaagcga gaggggcgcc ccttgccaga 7620
ggggggcaga cagcccccta tcgacttccg cgacgtggac atcggcgagc tgagcagcga 7680
cgtcatctcc aacatcgaga ccttcgatgt caacgagttt gaccagtacc tgccgcccaa 7740
cggccacccg ggggtgccgg ccacgcacgg ccaggtcacc tacacgggca gctacggcat 7800
cagcagcacc gcggccaccc cggcgagcgc gggccacgtg tggatgtcca agcagcaggc 7860
gccgccgcca cccccgcagc agcccccaca ggccccgccg gccccgcagg cgcccccgca 7920
gccgcaggcg gcgcccccac agcagccggc ggcacccccg cagcagccac aggcgcacac 7980
gctgaccacg ctgagcagcg agccgggcca gtcccagcga acgcacatca agacggagca 8040
gctgagcccc agccactaca gcgagcagca gcagcactcg ccccaacaga tcgcctacag 8100
ccccttcaac ctcccacact acagcccctc ctacccgccc atcacccgct cacagtacga 8160
ctacaccgac caccagaact ccagctccta ctacagccac gcggcaggcc agggcaccgg 8220
cctctactcc accttcacct acatgaaccc cgctcagcgc cccatgtaca cccccatcgc 8280
cgacacctct ggggtccctt ccatcccgca gacccacagc ccccagcact gggaacaacc 8340
cgtctacaca cagctcactc gaccttgagg aggcctccca cgaagggcga agatggccga 8400
gatgatccta aaaataaccg aagaaagaga ggaccaacca gaattccctt tggacatttg 8460
tgtttttttg tttttttatt ttgttttgtt ttttcttctt cttcttcttc cttaaagaca 8520
tttaagctaa aggcaactcg tacccaaatt tccaagacac aaacatgacc tatccaagcg 8580
cattacccac ttgtggccaa tcagtggcca ggccaacctt ggctaaatgg agcagcgaaa 8640
tcaacgagaa actggacttt ttaaaccctc ttcagagcaa gcgtggagga tgatggagaa 8700
tcgtgtgatc agtgtgctaa atctctctgc ctgtttggac tttgtaatta tttttttagc 8760
agtaattaaa gaaaaaagtc ctctgtgagg aatattctct attttaaata tttttagtat 8820
gtactgtgta tgattcatta ccattttgag gggatttata catattttta gataaaatta 8880
aatgctctta tttttccaac agctaaacta ctcttagttg aacagtgtgc cctagctttt 8940
cttgcaacca gagtattttt gtacagattt gctttctctt acaaaaagaa aaaaaaaatc 9000
ctgttgtatt aacatttaaa aacagaattg tgttatgtga tcagttttgg gggttaactt 9060
tgcttaattc ctcaggcttt gcgatttaag gaggagctgc cttaaaaaaa aataaaggcc 9120
ttattttgca attatgggag taaacaatag tctagagaag catttggtaa gctttatcat 9180
atatatattt tttaaagaag agaaaaacac cttgagcctt aaaacggtgc tgctgggaaa 9240
catttgcact cttttagtgc atttcctcct gcctttgctt gttcactgca gtcttaagaa 9300
agaggtaaaa ggcaagcaaa ggagatgaaa tctgttctgg gaatgtttca gcagccaata 9360
agtgcccgag cacactgccc ccggttgcct gcctgggccc catgtggaag gcagatgcct 9420
gctcgctctg tcacctgtgc ctctcagaac accagcagtt aaccttcaag acattccact 9480
tgctaaaatt atttattttg taaggagagg ttttaattaa aacaaaaaaa aattcttttt 9540
tttttttttt tccaatttta ccttctttaa aataggttgt tggagctttc ctcaaagggt 9600
atggtcatct gttgttaaat tatgttctta actgtaacca gttttttttt atttatctct 9660
ttaatctttt tttattatta aaagcaagtt tctttgtatt cctcacccta gatttgtata 9720
aatgcctttt tgtccatccc ttttttcttt gttgtttttg ttgaaaacaa actggaaact 9780
tgtttctttt tttgtataaa tgagagattg caaatgtagt gtatcactga gtcatttgca 9840
gtgttttctg ccacagacct ttgggctgcc ttatattgtg tgtgtgtgtg ggtgtgtgtg 9900
tgttttgaca caaaaacaat gcaagcatgt gtcatccata tttctctgca tcttctcttg 9960
gagtgaggga ggctacctgg aggggatcag cccactgaca gaccttaatc ttaattactg 10020
ctgtggctag agagtttgag gattgctttt taaaaaagac agcaaacttt tttttttatt 10080
taaaaaaaga tatattaaca gttttagaag tcagtagaat aaaatcttaa agcactcata 10140
atatggcatc cttcaatttc tgtataaaag cagatctttt taaaaagata cttctgtaac 10200
ttaagaaacc tggcatttaa atcatatttt gtctttaggt aaaagctttg gtttgtgttc 10260
gtgttttgtt tgtttcactt gtttccctcc cagccccaaa ccttttgttc tctccgtgaa 10320
acttaccttt ccctttttct ttctcttttt tttttttgta tattattgtt tacaataaat 10380
atacattgca ttaaaaagaa agtggccctg tggatttatt cacccagttc tcctgttgga 10440
tgatttggca aatttgagca caaaagacat tgtggagtgc tgattgctgt gatgtttttg 10500
ttttttatca gcacctttgg caatcctaga aaacaagctg aggaaaagac tgtatctcca 10560
aaaatctagg cagaaaaatc ttgaaaagtg ccactccaat agatcacaca gaaaattaca 10620
tgtcagtagt tgctcactct ggcaaaaatg tttgttgtgg ttttcatgac ctcatgcttc 10680
agggcaaaag ctgtcccttg tggaggtcac agggaatatt agacctgaaa tcaggagctt 10740
gtcagtagac agaatgccag aggggtgact tgcttatctg gttttaatat ggcaaacttt 10800
ccgttcctat gaacacatac ccaagaaatg gagtatccac ttaaaaagca aaggaagcca 10860
gagaaaatca gtgtctacag ggaaccagag agaagcctgt cgtattaacc cattaaatga 10920
ttcagagcct tccagatttc tctgtagaga caatgaaagg ggatgatttt tctgctccct 10980
ccagtttaac tcattctaag cagacgcaaa gccattgtag aagaaacaag acctaatcct 11040
gttttccttg gccccagtta gatggggagt ttccaggttc agagaaacgt tcaggtcatt 11100
tttcattaaa tagatgaaat cactccttcc ctcacatggg cacacctccc catccccact 11160
cccacacccc agatgattgg agaagtgtct ctaaagagtc agtcaccttc accctctcag 11220
gctagtttta ctactgggcc tgtgtctctg gcagtcttaa ccagagtcca acctctctgg 11280
cattacctca cattgtctgt ttctgcttat tggattcctg gctgacatcc cacaccagga 11340
acatggcaac caggaaaatg gtagttatca aatcgaggca acattagtac tcggcctcct 11400
ttgcaaattc cttcgacaaa cattgattga gggcctgtga tctgcggggg actgtgcaaa 11460
tccttcccta ccccttcaga catcaaattc tgttccttgt ttgtgacata gccttccatg 11520
cgctgaggcc ctcccttctt acaaaatctc tatttttttt ttctcttgcc aacactcaca 11580
aagtcctttt taaaagtctc tgtggtgttc actaattctt gcctacctta ttcgttctaa 11640
tccctttgtc tattaaaatc aacacacacc attccactgc gactaccccc ttccctagca 11700
aatctgtatg tttgctagac tgttctccct tccagaaata tgctcttttt cccagtatgt 11760
ggcctttgcc aggacttctt gaagccaaaa tattctgttc ggacataaac ttgtgaaggg 11820
aactgaagca agttgttttg ctttcccgtg cctcactttc cccttttgct gagtatgttt 11880
ataattcctc ctacatagag cagggttgtt aatagaggag attttagcca gagcaatctg 11940
ggagttgact gcattggagt ctcctggtct gtacagcagt ccccctgcat tagaattcct 12000
gggagtaata gccaggaaaa agagtttcat aagctcccca agtggctctg atacacagta 12060
aaatgcaaga gacacaggag tgctgggaga gaattcctca gaatcccgct cacccccata 12120
tctatcagat ctagtcaaag cccaatatca ccagattata aaatattttg gaggaatttt 12180
tagtctaaca ccagaagcac agagcttatc accctggcaa cagcaacaca ttgactggaa 12240
acctaggaga gtcctccaca ccggaaagag tttgtatgta gatccagggt tatttgtttg 12300
tttgcactta aaataaaacc ttttcttttc taaccatttt aacaaaactg aaatttttag 12360
caaaagggaa taaaaataaa ctcatttaag aatcggtctt t 12401

Claims (3)

1.一种用于检测鼻咽癌预后的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物由miR-106a-5p、miR-106a-5p靶基因BTG3和miR-106a-5p上游转录因子SOX9组成，所述的miR-106a-5p序列为SEQ ID NO.1，所述的BTG3序列为SEQ ID NO.2，所述的SOX9序列为SEQ ID NO.3。
2.权利要求1所述的用于检测鼻咽癌预后的生物标志物在制备检测鼻咽癌预后的试剂或工具中的应用。
3.一种用于检测鼻咽癌预后的生物标志物在制备检测鼻咽癌预后的试剂或工具中的应用，所述生物标志物为BTG3，序列为SEQ ID NO.2。
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Tumor-derived exosomes promote tumor progression and T-cell dysfunction through the regulation of enriched exosomal microRNAs in human nasopharyngeal carcinoma;Shu-biao Ye等;《Oncotarget》;20140619;第5卷(第14期);摘要、第5446页左栏第2段至第5447页右栏第2段、表1 *

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