CN111500598A - 一种检测欧洲型prrsv抗体效价的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种编码PRRSV N抗原的核酸分子及其应用、还提供了一种检测欧洲型PRRSV抗体效价的试剂盒及检测方法。本发明提供的检测试剂盒实用性大，可高通量操作，节约检测成本，使用方便。临床检测结果表明，本发明以N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法特异性强，为继续研究欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒打下基础。

Description

一种检测欧洲型PRRSV抗体效价的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是一种编码PRRSV N抗原的核酸分子及其应用、检测欧洲型PRRSV抗体效价的试剂盒及检测方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，其能引起母猪繁殖障碍及育肥猪呼吸***疾病，并伴有轻度神经症状，严重时可造成全身病毒血症。近年来，由于基因重组导致不断有新毒株(例如NADC30，NADC30-like)出现，使得对PRRS防控的难度增加。根据病毒基因特征和全球范围内流行状况可将PRRSV分为1型(欧洲型)和2型(美洲型)，在我国主要流行的是2型，但是近几年欧洲型在我国的流行的已有苗头，PRRSV基因组长 15.2Kb，含有10个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、 ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7，相邻开放阅读框之间存在短的重叠序列。其中由ORF7编码的核衣壳蛋白N占病毒总蛋白的20-40％，具有强免疫原性，在PRRSV 感染猪一周左右即可刺激机体产生特异性抗体，并持续数月之久。自2018年爆发非洲猪瘟后，国内大企业丛国外引进种猪较多，欧洲型蓝耳病毒有可能随之广泛传播，所以，以欧洲型蓝耳病N蛋白为基础原料，建立一种ELISA检测方法，为接下来研究欧洲型蓝耳病打下基础。
由于操作相对简便和制备成本低廉，使得大肠杆菌成为体外表达外源基因的首选***，但表达的外源蛋白大都是以非可溶性的包涵体形式存在，与天然活性蛋白差距甚远，限制了其应用。目前，GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个，一是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用；Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达***中表达效率更高； MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP 可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端；6×His是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可***在目的蛋白的 C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。His-tag有以下几个优点：标签的分子量小，只有0.84KD；His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化； His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；可应用于多种表达***，纯化的条件温和；可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。
PRRSV N蛋白是一种碱性蛋白，局部亲水性较好，通过调整表达条件和添加促溶标签等方式可以实现大肠杆菌的可溶性表达。
综上，有必要提供一种体外可溶性表达PRRSVN蛋白抗原的方法、尤其有必要提供一种检测欧洲型PRRSV抗体效价的试剂盒及检测方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种编码欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N 抗原的核酸分子、一种欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N、一种重组载体、一种用于检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的试剂盒以及一种检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的方法。
第一方面，本发明提供一种编码欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N抗原的核酸分子，其核苷酸序列包括与SEQ ID NO：1所示序列的同源性至少为70％的序列。
在本发明一实施例中，所述同源性优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％、98％或100％
在本发明一实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列还包括His标签、GST标签中的一种或多种。
第二方面，本发明提供一种欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N，其核苷酸编码序列包括如第一方面所述的核酸分子。
在本发明一实施例中，本发明提供的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N的 N端还融合有His组氨酸标签或GST标签。
可以理解的是，本领域技术人员可根据溶性表达的需要，添加其他融合标签。
可以理解的是，本领域技术人员可根据需要，添加其他常规修饰标签。
在本发明一实施例中，本发明提供的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N由如下方法制备：
1)设计PCR引物，对所述的PRRSV-N蛋白编码基因进行PCR扩增，所述引物序列如下：
上游F：CGCGGATCCATGGCCGGTAAAAA，下划线为BamH I酶切位点
下游-R：CCGGAATTCTCAATTTGCATCCT，下划线为EcoRI酶切位点；
2)PCR扩增；
3)利用BamH I和EcoRI分别双酶切PCR产物和PET-32a载体，连接、转化、筛选阳性菌；
4)将(1)中的阳性菌转入培养液中诱导表达；
5)镍树脂吸附柱纯化，获得所述带His融合标签的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N。
优选地，步骤(1)中，所述上游引物和下游引物的浓度各为20μM
优选地，步骤(4)中，所述诱导表达采用IPTG作为诱导剂。
优选地，步骤(4)中，所述诱导表达时诱导温度为23℃，诱导时间为10-12h。
优选地，步骤(5)中，用3倍树脂体积的低浓度咪唑洗涤，用500mmoL/L咪唑洗脱蛋白，用PBST置换咪唑，制得纯度较高对的蛋白。
进一步优选地，所述低浓度咪唑溶液的浓度为100mmoL/L。
本发明以His作为促溶标签，实现了PRRSV-N蛋白在大肠杆菌内的高效可溶性表达，诱导表达时采用接近常温地23℃进行，无需特意调整温度，洗涤杂蛋白使用100mmoL/L咪唑，洗脱使用500mmoL/L咪唑，两者浓度相差较大，可纯化地到纯度较高地蛋白，重组蛋白具有良好的免疫反应性，这为深入研究N蛋白功能以及开发PRRS相关诊断制剂奠定了基础。
第三方面，本发明提供了一重组载体，包含如第一方面所述的核酸分子。
优选地，所述重组载体为如第一方面所述的核酸分子***PET-32a载体的BamH I和 EcoRI克隆位点后获得的重组表达载体。
第四方面，本发明提供了如第一方面所述的核酸分子、如第二方面所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N或如第三方面所述的重组载体在检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。
第五方面，本发明提供了如第一方面所述的核酸分子、如第二方面所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N或如第三方面所述的重组载体在检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价中的应用。
第六方面，本发明提供了一种用于检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的试剂盒，其组分包括如第二方面所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N。
第七方面，本发明提供了一种用于检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的试剂盒，其组分包括：
1)固相载体：酶标板；2)抗原以及抗原缓冲液：所述抗原为如第二方面所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N；3)封闭液；4)待检测抗体以及样品稀释液；5) 酶标二抗及二抗稀释液；6)底物；7)洗液；和8)终止液。
若无特殊说明，本发明第七方面提供的用于检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的试剂盒中的固相载体、试剂以及应用浓度均为本领域常规分子生物学试剂及应用浓度。
优选地，组分2)中，所述抗原缓冲液为碳酸盐缓冲液。
进一步优选地，所述碳酸盐缓冲液的使用浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液(PH 9.6，具体地，取NaCO3 1.59g、NaHCO2.39g加去离子水1L制备所得)。
优选地，组分3)中，所述封闭液为脱脂乳。
进一步优选地，所述脱脂乳的使用浓度为5％。
优选地，组分4)中，所述稀释液为血清稀释液。
进一步优选地，所述血清稀释液的成分及使用浓度为：0.15M的PBST(PH 7.4)。
具体地，若无特殊说明，本发明采用的0.15M的PBST(PH 7.4)的制备方法为：取KH2PO4 0.2g、NaHPO4.12H2O 2.9g、NaCL 8.0g、KCL 0.2g、Tween-20 0.05％0.5mL 加去离子水1L制备所得。
优选地，组分5)中，所述酶标二抗为链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联抗IgG抗体。
进一步优选地，所述抗IgG抗体为抗猪IgG抗体。
优选地，组分5)中，所述二抗稀释液为0.15M的PBST(PH 7.4)。
进一步优选地，所述PBST的使用浓度为5％。
优选地，组分6)中，所述底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。
优选地，组分7)中，所述洗液为浓度为0.15M的PBST(PH 7.4)。
优选地，组分8)中，所述终止液为浓度为2M的硫酸。
第八方面，本发明提供了一种利用如权利要求8所述试剂盒检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的方法，包括如下步骤：
1)包被抗原：将所述抗原以抗原缓冲液稀释后加入ELISA板中，包被过夜；
2)洗涤：弃去包被液并洗3-5遍(优选为3遍)；
3)封闭：每孔加入封闭液，室温封闭1-3小时(优选为室温封闭3小时或4℃封闭过夜)，弃去封闭液并洗涤；
4)孵育一抗：将待测猪血清与样品稀释液混匀后加入，室温孵育0.5-2小时(优选为 1小时)，弃去并洗涤；
5)孵育二抗：加入二抗稀释液稀释的HRP标记的抗IgG抗体，室温孵育20-60分钟，弃去并洗涤；
6)显色与读值：加入TMB底物溶液，室温反应5-15min(优选为10分钟)后加入终止液，酶标仪读取吸收值。
优选地，所述步骤1)中，所述抗原包被浓度为5.5u g/mL。
优选地，所述步骤1)具体为：将纯化后的MHis融合N蛋白以碳酸盐缓冲液稀释至5.5μg/mL后加入ELISA板中，每孔加100μL，即每孔100ng，4℃包被过夜。
优选地，所述步骤2)具体为：弃去包被液并用PBST洗三遍，每次加入300μL/孔，吸水纸上轻轻拍干残留液体。
优选地，所述步骤3)具体为：每孔加入150μL 5％脱脂乳，37℃封闭2小时，弃去封闭液并洗涤三。
优选地，所述步骤4)中，将待测猪血清与样品稀释液混匀，其中，所述血清稀释度为1:100-800。
进一步优选地，所述步骤4)中，将待测猪血清与样品稀释液混匀，其中，所述血清稀释度为1:100-400。
进一步优选地，所述步骤4)中，将待测猪血清与样品稀释液混匀，其中，所述血清稀释度为1:200-400。
进一步优选地，所述步骤4)中，将待测猪血清与样品稀释液混匀，其中，所述血清稀释度为1:200。
优选地，所述步骤4)具体为：以一定的血清稀释度将猪血清与血清稀释液混匀，150μL/ 孔，37℃孵育1小时，弃去并洗涤三遍。
优选地，所述步骤5)具体为：加入PBST按照1:2000-1000稀释HRP标记的抗猪IgG抗体。
进一步优选地，所述步骤5)具体为：加入PBST稀释的HRP标记的抗猪IgG抗体， 100μl/孔，37℃孵育40分钟，弃去并洗涤三遍。
优选地，所述步骤6)具体为：以100μL/孔加入TMB底物溶液，室温反应10min后加入1.25M硫酸终止液，酶标仪读取OD450nm吸收值。
优选地，所述步骤6)中，OD450值大于0.237时判定为阳性，当测得的OD450值小于0.237时判定为阴性。
本发明有益效果：
本发明以带有His标签的PET-32a作为表达载体，实现了PRRSV-N蛋白在大肠杆菌地可溶性表达，融合N蛋白能被抗His的单抗和PRRSV N蛋白兔多抗特异识别。本发明以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法不与猪圆环病毒2型(PCV2)、古典猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等猪血清发生交叉反应。临床检测结果表明，本发明建立间接ELISA抗体检测方法与自建立地荧光定量RT-PCR检测方法的总符合率为100％。
附图说明
图1是本发明实施例提供的PRRSV ORF7基因的PCR扩增结果图；图中：泳道M为DL5000DNA分子质量标准；泳道1和2为PRRSV ORF7基因PCR扩增产物。
图2是本发明实施例提供的PET-32a-PRRSV-ORF7重组质粒的双酶切鉴定结果图；图中：泳道M为DL10000DNA分子质量标准；泳道1为未酶切PPET-32a-PRRSV-ORF7重组质粒；泳道2为BamH I和EcoRI双酶切PPET-32a-PRRSV-ORF7重组质粒。
图3是本发明实施例提供的PET-32a-PRRSV-ORF7重组N蛋白SDS-PAGE检测结果图；泳道M为170kDa的蛋白marker；泳道1-5分别为诱导时间4h、6h、8h、10h、12h。
图4是本发明实施例提供的PET-32a-PRRSV-ORF7重组N蛋白纯化效果SDS-PAGE 检测结果图；泳道M为170kDa的蛋白marker、泳道1为诱导纯化前上清液、泳道2为流穿液、泳道3为50mmol/L咪唑洗涤液、泳道4为100mmol/L咪唑洗涤液，泳道5为500mmol/L 咪唑洗脱液。
图5是本发明实施例提供的以抗欧洲型PRRSV-N蛋白兔血清为检测抗体进行His融合 N蛋白的Western blot分析结果图；图中：M为170kDa的蛋白marker；1为PET-32a-PRRSV-ORF7 重组N蛋白；2为阴性对照。
图6为本发明实施例提供的以抗His鼠单克隆抗体为检测抗体进行His融合N蛋白的 Western blot分析结果图；图中：M为170kDa的蛋白marker；1为PET-32a-PRRSV-ORF7重组 N蛋白，2为阴性对照。
图7-8为本发明实施例提供的PRRSV毒株与已知欧洲病毒株和美洲病毒株的序列比对结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图1-6及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1、材料
(1)PCR扩增模板和血清
含有欧洲型PRRSV-ORF7的pMD-18T-PRRSV-ORF7质粒、抗欧洲型PRRSV N蛋白兔血清、欧洲型和美洲型PRRSV阳性猪血清和PRRSV阴性猪血清、猪圆环病毒2型(PCV2) 阳性猪血清、古典猪瘟病毒(CSFV)阳性猪血清、伪狂犬病毒(PRV)阳性猪血清、猪细小病毒(PPV)阳性猪血清。
(2)试剂
PET-32a载体、抗His鼠源单克隆抗体和Factor Xa购自NEB公司；HRP标记的抗鼠IgG抗体、HRP标记的抗猪IgG抗体以及HRP标记抗兔IgG抗体购自sigma公司；BL21(DE3) 感受态细胞购自北京全式金生物公司；EX Taq DNA聚合酶和DNA限制性内切酶、质粒小提试剂盒及DNA纯化回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；镍树脂纯化柱购自武汉汇研生物科技有限公司；血清稀释液购自广州千寻生物技术公司；免疫印迹化学发光试剂(PierceECL Western Blotting Substrate)购自Thermo公司；IPTG、蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖购自 OXOID公司；氨苄霉素购自上海晶都生物技术有限公司。
PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法
(1)PCR引物设计
采用Oligo7.0软件设计引物，并引入BamH I和EcoRI酶切位点，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，上、下游引物序列如下：
上游引物为F：CGCGGATCCATGGCCGGTAAAAA，下划线为BamH I酶切位点
下游引物为R：CCGGAATTCTCAATTTGCATCCT，下划线为EcoRI酶切位点
(2)根据以下体系，扩增出欧洲型PRRSV-N序列，所述序列如SEQ ID NO.1所示
(3)欧洲型PRRSV-N蛋白编码基因ORF7的克隆
以pMD-18T-PRRSV-ORF7质粒为模板，采用50μL反应体系：按体积百分含量计， Ex-Taq预混酶25μL、上游引物和下游引物各1.5μL，其浓度均为20μM，模板1μL、补加蒸馏水至50μL，进行PCR扩增反应，反应条件为：步骤一95℃预变性8min；步骤二进行35个循环(95℃、40s；59℃、1min；72℃、30s)；步骤三72℃延伸8min；扩增结果如图1所示。对扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段测序待用。
(4)重组PET-32a-PRRSV-ORF7原核表达载体的构建及鉴定
利用BamH I和EcoRⅠ分别双酶切胶回收产物和带有His标签的PET-32a载体，反应体系为：按体积百分含量计，胶回收产物5μL，线性化后PET-32a载体20μL，1x Buffer K 4μL， BamH I 2μL，EcoRⅠ2μL，补加ddH2O至总体积为40μL，振荡混匀后37℃酶切5h，切胶纯化双酶切产物，T4DNA连接酶16℃过夜连接，连接产物转化DH5ɑ感受态细胞，然后将转化产物涂在含有X-Gal及氨苄抗性的固体LB平板上，37℃培养过夜，挑取白色单菌落至液体 LB培养基培养12h，富集菌体。扩增获得387bp的目的片段，空载体对照没有扩增出相应分子量大小的条带；进一步采用BamH I和EcoRⅠ双酶切鉴定，电泳结果显示出了5900bp左右的PET-32a载体片段外，还释放出预计片段大小的目的条带(如图2所示)。测序结果也表明我们成功制备了含有N蛋白编码基因ORF7的重组质粒，命名为PET-32a-PRRSV-ORF7。
鉴定正确的PET-32a-PRRSV-ORF7重组质粒转入BL21(DE3)感受态中，纯化单菌落，提取质粒，将阳性重组质粒测序待用。
(5)His融合N蛋白表达与纯化
将BL21(DE3)阳性重组质粒转接到400mL LB培养基中，37℃摇床振荡培养3h，培养液中加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，接近室温进行诱导培养，诱导温度优选23℃，诱导时间为10-12h，选择接近室温的诱导温度，无需加热或降温设备；4℃、6000r/min离心20min，收集菌体，再加入15mL预冷PBST重悬，冰浴超声裂解30min，条件为功率220w，工作3s，间隔5s，裂解后4℃、12000r/min离心15min，将上清液置于4℃备用；将4mL镍树脂加入到 15mL层析柱中，用3个柱体积的缓冲液即Tris-HCl、0.3mol/L NaCl、1mmol/L EDTA洗涤树脂；将20％的乙醇清洗干净，然后分次加入15mL超声裂解的上清液，轻轻混匀，4℃摇床孵育2h自然滤出并收集流穿液；加入3至5倍柱体积的100mmol/L咪唑清洗杂蛋白；最后加入500mmol/L咪唑溶液洗脱目的蛋白，使得其保证洗脱效果的前提下减少需求量，节约成本；进一步用截留量3KD的超滤膜将500mmol/L咪唑用PBST置换。纯化后的融合蛋白以BCA 法测定蛋白浓度，计算出每升菌液中融合蛋白的含量。
(6)Western blot分析
经过摸索优化表达条件后，确定在IPTG终浓度为1mmol/L、诱导温度23℃、诱导时间10-12h的条件下，重组N蛋白的表达量最高。纯化后的His融合N蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示；经SDS-PAGE电泳分析，在35kD处出现了与理论值蛋白分子量一致的蛋白。经过镍树脂亲和层析纯化后获得了较高纯度的His融合蛋白。纯化后每升菌液可得到纯度约为90％的融合蛋白22mg左右，结果如图3所示；然后进行Western blot分析，一抗分别选用抗欧洲型PRRSV-N蛋白兔血清(稀释度为1：200)和抗His鼠单克隆抗体(稀释度为 1：4000)，选择相应二抗反应后，以ECL化学发光法在暗室曝光，未诱导的重组菌作为阴性对照。
SDS-PAGE电泳分离His重组N蛋白后转印至PVDF膜，然后分别以抗N蛋白兔血清及His鼠源单克隆抗体做一抗，检测重组N蛋白的反应原性。以His鼠源单克隆抗体作为一抗时，在35kD处出现明显的特异性目的条带，而未诱导菌体的重组N蛋白条带则无。以抗N 蛋白的兔血清做一抗检测，在35KD处也出现了明显特异的目的条带，表明His标签不影响N 蛋白的反应原性。结果如图5-6所示
3、PRRSV间接ELISA抗体检测方法
包被抗原：将纯化后的MHis融合N蛋白以碳酸盐缓冲液稀释至5.5μg/mL后加入ELISA板中，每孔加100μL，即每孔100ng，4℃包被过夜；
洗涤：弃去包被液并用PBST洗三遍，每次加入300μL/孔，吸水纸上轻轻拍干残留液体；
封闭：每孔加入150μL 5％脱乳脂，37℃封闭2小时，弃去封闭液并洗涤三遍；
孵育一抗：以一定的血清稀释度将猪血清与血清稀释液混匀，150μL/孔，37℃孵育1 小时，弃去并洗涤三遍；
孵育二抗：加入PBST稀释的HRP标记的抗猪IgG抗体，100μl/孔，37℃孵育40分钟，弃去并洗涤三遍；
显色与读值：以100μL/孔加入TMB底物溶液，室温反应10min后加入1.25M硫酸终止液，酶标仪读取OD450nm吸收值。
4、确定包被抗原浓度及血清稀释度
以方阵滴定法确定包被抗原浓度和血清稀释度，将His融合N蛋白分别稀释至22、11、 5.5、2.75、1.38μg/mL，按着100ng/100μL/孔加入96孔ELISA板中，4℃过夜包被。PRRSV阴性和阳性猪血清分别按照1：50、1：100、1：200、1：400、1：800梯度稀释，37℃孵育 1h，洗涤后加入二抗，二抗暂时按推荐范围浓度1：10000使用，孵育40min后加入TMB显示读值，结果如表1所示。
表1抗原包被浓度及血清稀释度确定
表1 最佳抗原包被浓度和一抗稀释度的确定
Figure BDA0002481793550000101
P：代表PRRSV阳性猪血清(阳性血清的制备：取冻融后细胞培养物上清 (TCID50＝5.4/0.1mL)，按1:1添加弗氏佐剂和灭活后的上清，肌注8周龄SPF猪，3周后二免，再过2周采集血液，即为阳性血清。本领域技术人员可以理解的是，本发明实施例提供的 PRRSV阳性血清也可以采用其他可替代方式制备)；N:代表PRRSV阴性猪血清
由表1可知，当包被抗原浓度5.5μg/mL、血清稀释度1：200时，阳性血清(P)OD450nm吸收值为2.405，阴性血清(N)OD450nm值为0.211，P/N值为11.39，倍比最大。
5、确定抗猪IgG二抗的稀释度
按照确定的适宜抗原浓度包被ELISA板和稀释猪血清样品，抗猪IgG二抗按照1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：10000梯度稀释，洗涤5遍后加入TMB显色终止读值。以阳性血清值大于1，阴性血清值小于0.237，确定抗猪IgG二抗稀释度为1：2000，结果如表2所示。
表2抗猪IgG二抗的稀释度确定
表2 最佳酶标二抗工作浓度的确定
Figure BDA0002481793550000111
6、阴阳性临界值的确定
用建立的最佳ELISA条件对20份阴性血清(本发明实施例所述的阴性血清是指用RT-PCR法检测过其组织，确定体内没有欧洲型蓝耳病毒的血清。)进行检验，测定吸光值，结果如表3所示，算出平均值(X)为0.162，根据统计学原理算出标准方差(SD)＝0.025，临界OD450值＝0.162+0.025×3＝0.237，因此当测得OD450值大于0.237时判定为阳性，当测得的OD450值小于0.237时判定为阴性。
表3 间接ELISA血清临界值确定
Figure BDA0002481793550000112
7、间接ELISA抗体检测方法特异性分析
在确定间接ELISA抗体检测方法适宜的抗原包被浓度、猪血清稀释度和抗猪IgG二抗浓度等条件后，检测了该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、古典猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒 (PRV)、猪细小病毒(PPV)、2型PRRSV这些能够导致猪繁殖障碍性疫病的猪血清的交叉反应性，结果表明(表4所示)，结果显示其它集中病原血清检测结果皆小于0.237，阳性血清吸光度远大于0.237。表明该方法特异性良好，本发明建立的欧洲型PRRSV-N蛋白抗体间接ELISA 检测方法不与PCV2、CSFV、PRV、PPV血清发生交叉反应，与美洲型PRRSV血清发生较强反应，这表明该方法能够特异性地检测PRRSV血清抗体，但不适合区分1型和2型PRRSV 血清抗体。(本发明实施例提供的病毒(PCV2、CSFV、PRV、PPV、PRRSV)阳性血清的制备方式可采用如下方式制备：取冻融后细胞培养物上清(TCID50＝4/0.1mL)，按1:1添加弗氏佐剂和灭活后的上清，肌注8周龄SPF猪，3周后二免，再过2周采集血液，离心后制得阳性血清。本领域技术人员可以理解的是，本发明实施例提供的病毒(PCV2、CSFV、PRV、PPV、 PRRSV)阳性血清也可以采用其他常规方式制备。)
表4 异性试验结果
Figure BDA0002481793550000121
8、重复性实验
批内重复性实验：
操作均以上述最佳条件为模板，另取4份来源不同的阳性血清设立4组(样品1为本发明实施例表1部分制备猪阳性血清样本，样品2-4为临床收集市场猪阳性血清样本)，每组重复3个孔并在同一条件下进行实验。结果如表5所示。
表5 批内重复试验结果
Figure BDA0002481793550000122
批间重复性实验：
操作均以上述最佳条件为模板，另取3份不同批次的抗原(不同批次的抗原为不同时间表达、纯化后的MHis融合N蛋白)设立3组，每组重复4个孔并在同一条件下进行实验。
结果如表6所示。
表6 批间重复试验结果
Figure BDA0002481793550000131
本发明用到的PRRSV毒株暂命名为GDEU2018，为申请人课题组新发现的病毒株。本发明采用的GDEU2018与欧洲株BJEU-06-1(GU067771)、FJ0603(HM114313)、 GZ11-G1(KF001144)、HKEU16(EU076704)、LV(M96262)病毒株，以及与美洲株VR2332 (EF536003)序列比对结果显示，GDEU2018株与其他欧洲株同源性均在90％以上，与美洲株经典株比对同源性仅为65.6％。比对结果参见附图7-8。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种检测欧洲型PRRSV抗体效价的试剂盒及检测方法
<130> 2020
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccggta aaaaccagag ccagaagaaa aagaaaaatc cagctccaat ggggaatggc 60
cagccggtca atcagctgtg ccaattgctg ggtgcaatag taaaatccca gcgccagcga 120
cctagggggg gacaggccaa aaagaaaaag cctgagaagc cacatttccc tctggctgct 180
gaagatgacg ttcggcacca cctcacccaa acagagcgtt ccctctgctt gcaatcgatt 240
cagacggcct ttaaccaggg cgcaggaact gcgtcgcttt catccagtgg gaaggttagt 300
tttcaggttg agttcatgct gccggttgct catacagtgc gcctgattcg cgtgacttcc 360
gcatccgccg gtcaggatgc aaattga 387

Claims (10)

1.一种编码欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N抗原的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列包括与SEQ ID NO：1所示序列的同源性至少为70％的序列。
2.一种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸编码序列还包括His标签、GST标签中的一种或多种。
3.一种欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N，其特征在于，其核苷酸编码序列包括如权利要求1所述的核酸分子。
4.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的核酸分子。
5.如权利要求1的核酸分子、权利要求3的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N或权利要求4的重组载体在检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。
6.如权利要求1的核酸分子、权利要求3的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N或权利要求4的重组载体在检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价中的应用。
7.一种用于检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的试剂盒，其特征在于，其组分包括如权利要求3的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N。
8.一种检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的试剂盒，其特征在于，其组分包括：
1)固相载体：酶标板；
2)抗原以及抗原缓冲液：所述抗原为如权利要求3的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N；
3)封闭液；
4)待检测抗体以及样品稀释液；
5)酶标二抗及二抗稀释液；
6)底物；
7)洗液；和
8)终止液。
9.一种检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的试剂盒在检测猪血清欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。
10.一种利用如权利要求8所述试剂盒检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)包被抗原：将所述抗原以抗原缓冲液稀释后加入ELISA板中，包被过夜；
2)洗涤：弃去包被液并洗3-5遍；
3)封闭：每孔加入封闭液，室温封闭1-3小时，弃去封闭液并洗涤；
4)孵育一抗：将待测猪血清与样品稀释液混匀后加入，室温孵育0.5-2小时，弃去并洗涤；
5)孵育二抗：加入二抗稀释液稀释的HRP标记的抗IgG抗体，室温孵育20-60分钟，弃去并洗涤；
6)显色与读值：加入TMB底物溶液，室温反应5-15min后加入终止液，酶标仪读取吸收值。
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