CN111492979B - 一种小报春体细胞胚诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小报春体细胞胚诱导方法，包括如下步骤：1)无菌播种获得小报春无菌苗；2)将步骤1)获得的无菌苗叶片接种到胚性愈伤组织诱导培养基诱导出胚性愈伤组织；3)将步骤2)诱导的胚性愈伤组织诱导出体细胞胚；4)体细胞胚萌发生根。本发明首次建立了小报春的体细胞胚诱导方法，可以快速获得小报春体细胞苗，诱导效率高，成苗周期短。此外，与传统的叶片愈伤组织诱导不定芽和叶片直接诱导不定芽途径相比，能显著提高农杆菌介导的遗传转化效率，为小报春转基因育种奠定了基础。

Description

一种小报春体细胞胚诱导方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种小报春体细胞胚诱导方法。

背景技术

报春花科植物共74属，其中报春花属（Primula Linn.）是报春科中最大的属，在世界范围内大概有500种，大多位于北半球，该属植物主要分布在两个地区，一个是喜马拉雅山脉，另一个是我国的云南、西藏及四川地区。报春花是我国著名的观赏花卉，在国内外的栽植历史已有数百年之久[张艳丽.小报春(Primula forbesii)生物学特性初步研究[D].北京林业大学, 2003.]，其开花时间早，花期长，色彩丰富，花型各具特色，具有极高的观赏价值，与杜鹃、龙胆并称为世界三大高山花卉和中国三大天然名花[胡启明. 种子植物科属地理[M].北京:科学出版社,1999.]。中国幅员辽阔，拥有的报春花种类繁多，我国共约有300种[中国科学院中国植物志编委会. 中国植物志(第59卷第2分册)[M].北京:科学出版社,1990]，分布较为广泛，但是这些资源多位于我国西南地区的边远山区，与外界的联系不畅通，处于野生状态，采集研究的困难较大，很多种类都还有待开发利用。加之地震、泥石流等自然因素，以及旅游开发、过度放牧及挖掘等人为因素，使得野生报春花资源遭到严重破坏，尤其是一些稀有的报春花种类，其数量大大减少，生存环境也受到一定程度的破坏，急需切实有效的保护举措。在对报春花进行园林应用的过程中，国外发现了这种植物资源的巨大潜力，对其开展了大量研究，推进了园艺化应用的进程，所培育出的园艺品种繁多，在国内外广泛种植。与国外相比，中国对报春花的园林应用研究方面远远落后，很多报春花资源长期处于野生状态，未见其相关研究与报道，因此有很多资源无法得到有效利用，也无法转化为商品。特别是引种方面，还处于初步探索的阶段，还有许多野生报春花的园林应用潜力巨大，亟待开发利用，中国丰富的报春花资源优势尚未得到发挥。

为了进一步在报春花的育种工作上取得新的进展，我国丰富的种质资源应得到充分的利用，针对一些中国特有的种质资源，应该加大开发与利用力度。小报春（Primula forbesii）又名田埂报春，属于报春花科报春花属，为我国特有种，是分布于云南及四川地区的一种二年生草本花卉，具有细弱的根状茎和多数虚根。叶片基生成莲座状，通常卵圆形，多被细柔毛；花葶1至数枚，自叶丛中抽出，花序被粉，伞形花序1-2轮或多于2轮，每轮5-15朵花，花瓣5枚，花冠淡红或淡紫，裂片先端深凹陷，直径约1cm（陈封怀和胡启明，1990）。该种是报春花属植物中为数不多的具有浓郁香气的种，具有较高的观赏价值，其生命力强，播种繁殖极易成活，在野外经常成片生长，大面积的观赏效果极佳。且这两种报春花分布于较低海拔高度的地区，引种驯化相对容易，是极具园林开发潜力的盆花和香花地被植物。因此积极开展小报春的再生体系研究，加快引种驯化进度，充分利用野生资源，使其成为具有商业价值的栽培种，对创造我国自主知识产权的新品种，具有十分重要的意义。

报春花属植物主要的繁衍方式为种子繁殖，受环境条件影响较大，种子活力低，人工培育困难，加之种子细小，寿命短，要求新采收的种子及时播种，否则出苗量极低，效率低下，不利于在园林中的大范围应用。在生物技术不断发展的当下，针对植物繁殖效率低下的问题，组织培养是快速高效解决该问题的一条重要途径，在园林植物新品种选育中应用较为广泛，具有成本低，生产效率高，繁殖速度快，可生产脱毒苗等特点。金晓霞等，小报春的组织培养和植株再生，植物生理学通讯，第41 卷 第6 期，2005 年12月，公开了小报春的组织培养和植株再生，具体公开了以小报春幼嫩叶片为外植体，进行丛生芽的诱导和增殖。小报春幼嫩叶片可在不同的培养基上先诱导愈伤组织，愈伤组织再分化出不定芽，也可以不经愈伤组织过程直接从叶片上分化出不定芽。

目前我国园林中应用的报春花属植物主要有藏报春（P. sinensis）、四季报春（P. obconica）、欧报春（P. vulgaris）等园艺品种，花型多样，色泽艳丽，但普遍缺少花香性状。小报春独有的浓郁花香亦使其成为改良该属植物花香性状的理想材料。报春花种类繁多，遗传背景复杂，存在自交不亲和、异型花柱、种间染色体基数变化大等特点，且具有浓郁花香的种类不多，因此以常规育种方法培育芳香型报春花往往难以实现。随着非常规育种手段的不断更新，分子育种可以通过外源基因的导入定向修饰报春花的某个或某些目标性状，进而实现报春花分子设计精确育种。今后，利用植物遗传转化技术改良报春花花香性状将成为报春花育种的重要目标。农杆菌侵染法是植物遗传转化中常见的方法。然而，在小报春遗传转化中，发现农杆菌侵染后，无论是直接出芽途径还是愈伤不定芽途径均无法有效获得转化苗。在农杆菌侵染后，抗性愈伤组织无法分化出不定芽，也无法直接实现从叶片直接出芽，因此，亟需开发一种能有效提高转化率的小报春分化方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种小报春体细胞胚诱导方法。

1、一种小报春体细胞胚诱导方法，包括如下步骤：

1）无菌播种获得小报春无菌苗；

2）将步骤1）获得的无菌苗叶片接种到胚性愈伤组织诱导培养基诱导出胚性愈伤组织；

3）将步骤2）诱导的胚性愈伤组织诱导出体细胞胚；

4）体细胞胚萌发生根。

其中，所述的胚性愈伤组织诱导培养基为添加了0.1-0.5mg/L的2,4-D和0.5-1.0mg/L 6-BA的MS培养基，优选地，所述胚性愈伤组织诱导培养基还添加了200-400 mg/L的水解酪蛋白。

在本发明一个实施方案中，将胚性愈伤组织接种于体细胞胚分化培养基中诱导出体细胞胚，所述的体细胞胚分化培养基为添加了0.05-0.2mg/L的2,4-D和1.0-3.0mg/L 6-BA的MS培养基，优选地，所述体细胞胚分化培养基还添加了200-400 mg/L的水解酪蛋白。

在本发明另一个实施方案中，将诱导出的胚状体接种到生根培养基中进行萌发生根，其中，所述的生根培养基为添加了0.01-0.05mg/L IBA 的1/2MS培养基。

其中，无菌播种的具体步骤为：

选择当年收获的人工培养植株的种子，黑暗储藏于4℃冰箱中；接种前用75%酒精表面灭菌30S，然后用无菌水冲洗5-6次，接着用1%的次氯酸钠溶液浸泡1min，再用无菌水冲洗5-6次，然后用无菌滤纸吸干多余水分，接种于MS培养基中。

其中，叶片接种时，将叶片外沿剪去，分割成0.5-1cm²的小块，叶正面朝下接触培养基。

在本发明另一个实施方案中，所述方法还包括将胚性愈伤组织进行增殖的步骤，增殖的培养基为添加了0.1-0.3mg/L的2,4-D、0.2-0.8mg/L 6-BA、200-400 mg/L的水解酪蛋白的MS培养基。

本发明首次建立了小报春的体细胞胚诱导方法，可以快速获得小报春体细胞苗，诱导效率高，成苗周期短。此外，与传统的叶片愈伤组织不定芽和叶片直接不定芽途径相比，能显著提高农杆菌介导的遗传转化效率，为小报春转基因育种奠定了基础。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 无菌苗的制备

试验所用的小报春种子为2019年4月25日在四川农业大学温室内采摘。种子采后及时风干，用硫酸纸袋包裹并冷藏于4℃冰箱内。选取成熟饱满的种子作为外植体材料，试验于四川农业大学风景园林学院实验室进行。

将小报春种子用75%的乙醇消毒30s，无菌水清洗5～6次，再用1％次氯酸钠消毒1min，无菌水清洗5～6次后将种子接种于MS培养基中培养，每瓶接种种子2粒，培养基中加入6g•L^-1琼脂固化，并添加30g•L^-1蔗糖，pH在高压灭菌前调至5.8。种子的培养温度为（25±2）℃，光照强度1500lx～2000lx，光照时间12h/d。待幼苗长至6～8cm高，具浓绿叶片数达3～6片时，可进行叶片愈伤组织的诱导。

实施例2胚性愈伤组织的诱导

在超净台内取无菌苗的幼嫩叶片，将叶片切成0.5-1cm²的小块（带部分叶脉），将叶片背面朝上，以近轴面接触培养基，水平接种至愈伤组织的诱导培养基上。

选择细胞***素为6-BA，生长素选择了2,4-D，培养基中2,4-D分别附加0.0mg•L^-1、0.1mg•L^-1、0.3mg•L^-1、0.5mg•L^-1，6-BA分别附加0.5mg•L^-1、1.0mg•L^-1，共设计了8个处理组合。每个处理接种10瓶，每瓶3块外植体，重复3次。以MS为基本培养基，所有培养基中加入6g•L^-1琼脂固化，并添加30g•L^-1蔗糖，pH在高压灭菌前调至5.8。接种前7d进行暗培养，之后采用日光灯作培养光源，光照时间12h/d，光照强度1500lx～2000lx，培养室温度为(25±2)℃。每天观察统计愈伤组织的诱导情况。

激素配比浓度对小报春叶片外植体的胚性愈伤组织形成产生了较显著的影响。在添加不同激素的各个培养基中，培养基中的叶片均能出现愈伤组织，7~12d左右叶片外植体在主叶脉划伤处首先产生。

从表1可以看出，激素浓度对小报春叶片诱导愈伤组织有一定影响，2,4-D浓度的过高和过低都会抑制愈伤组织的产生并影响愈伤组织的形态和质地，当添加 6-BA 浓度一定时，随着添加2,4-D浓度的增加，愈伤组织诱导率呈先升高后降低的趋势。在不添加2,4-D的培养基中，愈伤组织的数量较少，且质地为致密的绿色形态。而随着2,4-D浓度的增加，愈伤组织诱导率提高，且愈伤组织变成浅绿色的疏松颗粒形态的愈伤组织，这种形态的愈伤组织为胚性愈伤组织。但当2,4-D浓度0.5mg/L，6-BA 浓度为1.0mg/L 时，愈伤组织诱导率和数量均较高，但愈伤组织的形态变成了灰白色的疏松半透明水渍状。

表1 不同激素浓度配比下小报春无菌苗叶片外植体的愈伤组织诱导率

注：小写字母表示 5%显著水平下的差异，下同。+越多代表愈伤组织数量越多，反之，则越少。

实施例3 胚状体的诱导

将诱导出的三种形态的愈伤组织，即致密绿色的愈伤组织，颗粒状疏松浅绿色愈伤组织和灰白色的疏松半透明水渍状愈伤组织接种到添加了0.05、0.1、0.15、0.2mg/L的2,4-D和1.0、2.0、3.0mg/L 6-BA的MS培养基中，培养基其它条件同前。

结果表明，致密绿色的愈伤组织和疏松半透明水渍状愈伤组织在12种培养基中均不能有效诱导出胚状体或者诱导率极低。个别致密绿色绿色的愈伤组织块诱导出不定芽。而颗粒状疏松浅绿色愈伤组织在不同培养基中可诱导出胚状体，结果见表2。

表2不同激素组合培养基对小报春胚性愈伤组织诱导胚状体的影响

由表2可知，颗粒状疏松浅绿色愈伤组织在所有培养基中均能诱导出体细胞胚，但不同培养基对于诱导率的影响比较显著。当添加 6-BA 浓度一定时，随着添加2,4-D浓度的增加，分化率呈先升高后降低的趋势。当添加2,4-D浓度一定时，体细胞胚在高浓度的6-BA下，分化率降低。从表2中可已看出，0.1mg/L的2,4-D和1-2mg/L的6-BA的培养基体细胞胚的诱导率最高。

实施例4 胚性愈伤组织的增殖

将诱导出的胚性愈伤组织接种到添加了0.1-0.3mg/L的2,4-D，0.2-0.8mg/L 6-BA的MS培养基中（表3），观察不同培养基对于胚性愈伤组织的增殖的影响。增殖系数表示愈伤组织体积增大的倍数，+表示1-2倍，++表示3-4，+++表示5倍以上，结果见表3。

表3 不同激素组合培养基对小报春胚性愈伤组织增殖的影响

从表3中可以看出，不同愈伤组织增殖培养基对于愈伤组织的增殖影响不大，各培养基均能使有效的增殖愈伤组织，且不同培养基并未改变愈伤组织的形态和质地。

实施例5 外源添加物对胚性愈伤组织和胚状体诱导的影响

在超净台内取无菌苗的幼嫩叶片，将叶片切成0.5-1cm²的小块（带部分叶脉），将叶片背面朝上，以近轴面接触培养基，水平接种至添加了不同浓度水解酪蛋白的MS+2,4-D0.3mg•L^-1+6-BA1.0mg•L^-1培养基，不同培养基的胚性愈伤组织诱导率如表4所示。

表4不同浓度水解酪蛋白对小报春胚性愈伤组织诱导率的影响

处理	水解酪蛋白浓度 （mg•L<sup>-1</sup>）	胚性愈伤组织诱导率（%）
			1	0	76.88±9.14b
2	200	80.22±9.11ab
			3	400	85.89±10.69a
4	600	72.88±6.34c
			5	800	65.59±3.64c

从表4中可以看出，添加了水解酪蛋白有助于胚性愈伤组织的诱导率的提高。然而，当水解酪蛋白的浓度超过600mg/L时，对于愈伤组织的诱导反而有一定的抑制作用。

将诱导出的胚性愈伤组织接种到添加了0、200、400、600、800mg/L水解酪蛋白的MS+2,4-D 0.1mg•L^-1+6-BA1.0mg•L^-1培养基中，诱导胚状体，也得到类似结果，即，添加了200、400mg/L的水解酪蛋白的有助于诱导出体细胞胚，然而，在高浓度的水解酪蛋白培养基中，体细胞胚诱导率反而有所下降。

实施例6 小报春不同形态建成方式对农杆菌介导的转化率的影响

取-80℃保存的pBI121农杆菌菌液于碎冰上融化，用接种针蘸取少量菌液，在添加有50mg/L Kan和80mg/L Rif的固体平板培养基上划线，于28℃恒温培养箱中倒置暗培养2d。用牙签挑取单菌落于含50mg/L Kan和80mg/L Rif 的液体LB培养基中，振摇培养16～24h至对数生长期，然后按1：100比例转接入不含抗生素的新鲜液体培养基中继续振摇培养4～6h至OD₆₀₀达0.6左右。无菌条件下取新鲜菌液于50ml离心管中于常温8000rpm离心10min，去除上清液，用1/2MS液体培养基重悬沉淀，用于侵染转化。

在超净台内取无菌苗的幼嫩叶片，将叶片切成0.5-1cm²左右的小块（带部分叶脉）置于制备好的菌液中侵染8min，期间间断地轻摇，使菌液和植物材料充分接触；将侵染完的植物材料转至无菌滤纸吸干多余菌液，转移至MS的共培养基上，25℃黑暗共培养2d。共培养后转至MS+2,4-D 0.3mg/L+6-BA1.0mg/L+卡那霉素15mg/L+羧苄青霉素300mg/L的胚性愈伤组织培养基上。

约15d 以后，在切口处能诱导出浅绿色颗粒状疏松的抗性胚性愈伤组织。1个月以后胚性愈伤组织增殖至直径0.5 cm左右，外植体未转化部位和未转化对照则褐化死亡，抗性胚性愈伤组织的诱导率为15.23±4.23%（诱导出抗性胚性愈伤组织的叶片数/总叶片数）。

将诱导出的胚性愈伤组织接种至MS+2,4-D 0.1mg/L+6-BA1.0mg/L+卡那霉素25mg/L+羧苄青霉素200mg/L培养基，1个半月后，抗性胚性愈伤组织诱导出胚状体，诱导率为68.77±3.45%（诱导出胚状体的愈伤组织团数/总团数）。将诱导出的胚状体接种于1/2MS+0.02mg/L IBA+卡那霉素25mg/L+羧苄青霉素200mg/L培养基，胚状体能正常萌发生根。

由于pBI121带有GUS报告基因，因此取抗性苗用常规的GUS组织化学染色法进行检测，试验的15个株系有11个能显蓝色斑块，表明已经成功转化GUS基因。

对比例1

菌液和小报春材料同实施例6，不同的是培养基为MS+6-BA1.0+NAA0.1（参考金晓霞等，小报春的组织培养和植株再生，植物生理学通讯，第41 卷，第6 期，2005，培养基（7）），形态建成方式为愈伤组织诱导不定芽途径。

约30天左右，在切口处能诱导出少量绿色致密的愈伤组织，抗性愈伤组织诱导率仅为2.48±1.86%。此外，愈伤组织增殖速度很慢，转接后，也不能有效增殖或者诱导出抗性芽。

对比例2

菌液和小报春材料同实施例6，不同的是培养基为MS+6-BA 1+NAA 0.05，（参考金晓霞等，小报春的组织培养和植株再生，植物生理学通讯，第41 卷，第6 期，2005，培养基（3）），形态建成方式为叶片直接诱导不定芽途径。

农杆菌侵染后的叶片，转接到上述培养基后，不能成功诱导出抗性芽，叶片均褐化死亡。

从上述对比例可以看出，不同的形态建成方式对于小报春遗传转化影响显著。胚状体途径能显著提高小报春遗传转化率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）无菌播种获得小报春无菌苗；

2）将步骤1）获得的无菌苗叶片接种到胚性愈伤组织诱导培养基诱导出胚性愈伤组织；所述胚性愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D 0.3mg•L^-1+6-BA 0.5mg•L^-1或MS+2,4-D 0.5mg•L^-1+6-BA 0.5mg•L^-1或MS+2,4-D 0.3mg•L^-1+6-BA 1.0mg•L^-1；

3）将步骤2）诱导的胚性愈伤组织接种于体细胞胚分化培养基中诱导出体细胞胚，所述的体细胞胚分化培养基为MS+2,4-D 0.1mg•L^-1+6-BA1.0mg•L^-1或MS+2,4-D 0.1mg•L^-1+6-BA2.0mg•L^-1；

4）体细胞胚萌发生根。

2.如权利要求1所述的小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织诱导培养基还添加了200-400 mg/L的水解酪蛋白。

3.如权利要求1所述的小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，所述体细胞胚分化培养基还添加了200-400 mg/L的水解酪蛋白。

4.如权利要求1所述的小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，将步骤3）诱导出的胚状体接种到生根培养基中进行萌发生根，其中，所述的生根培养基为添加了0.01-0.05mg/LIBA 的1/2MS培养基。

5.如权利要求1所述的小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，无菌播种的具体步骤为：

选择当年收获的人工培养植株的种子，黑暗储藏于4℃冰箱中；接种前用75%酒精表面灭菌30s，然后用无菌水冲洗5-6次，接着用1%的次氯酸钠溶液浸泡1min，再用无菌水冲洗5-6次，然后用无菌滤纸吸干多余水分，接种于MS培养基中。

6.如权利要求1所述的小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，叶片接种时，将叶片外沿剪去，分割成0.5-1cm²的小块，叶正面朝下接触培养基。

7.如权利要求1-6任一项所述的小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，还包括将胚性愈伤组织进行增殖的步骤，增殖的培养基为添加了0.1-0.3mg/L的2,4-D、0.2-0.8mg/L 6-BA、200-400 mg/L的水解酪蛋白的MS培养基。