CN111492225A - 无酚抗酸染色组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及不含酚的抗酸染色组合物。本公开内容也涉及检测生物样品中的抗酸性生物的方法，其包括：（a）将抗酸染色组合物应用于所述生物样品，所述抗酸染色溶液包含品红、碱、表面活性剂和醇，且其中所述抗酸染色组合物不含酚；和（b）将所述生物样品与所述抗酸染色组合物于预定温度温育预定的时间量。

Description

无酚抗酸染色组合物及其用途
与相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月24日提交的美国临时专利申请No. 62/610,215的申请日的利益，其公开内容特此整体引入本文作为参考。
公开内容的背景
分枝杆菌（例如结核分枝杆菌（M. tuberculosis））的含脂质细胞壁具有如此紧密地结合石炭酸品红染色剂以致于它们耐得住用强脱色剂如醇和强酸脱色的独特特征。因此，术语“抗酸”已被用于描述某些类型的杆菌如耐得住用酸或醇脱色的分枝杆菌的石炭酸品红染色反应。分枝杆菌的抗酸染色反应以及其独特的串珠状和略微弯曲的形状对于早期检测感染和监测治疗是有价值的帮助。在痰或其他分枝杆菌学标本中发现抗酸性杆菌被认为是活动性结核的可据以推定的证据，且足以启动治疗。
在结核的疑似病例中，使用抗酸染色技术，这是因为分枝杆菌和其他抗酸性生物不能被革兰氏染色剂染色。于是通过萋-尼（Ziehl-Neelsen）方法处理含有生物样品（例如涂片）的载玻片。在萋-尼方法中，首先制备了石炭酸品红染色剂。石炭酸品红染色剂包含0.3克碱性品红、10.0毫升乙醇和90毫升5％酚水溶液。将石炭酸品红染色剂应用于载玻片涂片达5分钟，应用足够的热用于温和蒸汽加工。不允许染色剂蒸发，且在需要的情况下添加更多的染色剂。然后将载玻片冷却并在水中漂洗。然后将载玻片在含有3体积％浓盐酸的95％乙醇溶液中脱色。添加脱色溶液，直到不再能除去石炭酸品红染色剂为止。将载玻片在自来水中洗涤，且然后用亚甲蓝溶液复染1-2分钟。亚甲蓝溶液含有0.3克亚甲蓝（90％染料含量）和100毫升蒸馏水。然后将载玻片洗涤、干燥并由病理学家检查。
用于染色抗酸性生物的传统制剂（例如，萋-尼方法中使用的那些）包括品红和酚。酚的使用带来若干健康危害。例如，酚是有毒的，通常在暴露时引起蛋白质降解作用。暴露于少量的症状从皮肤灼伤和肺水肿一直到节律障碍、癫痫发作和昏迷。已知长期暴露引起肝和肾损害。除其毒性外，酚是腐蚀性的，并被怀疑是致癌的。因此，在制备和使用含酚的染色溶液过程中必须采取相当大的安全预防措施。此外，酚具有令人不愉快的气味，所述气味通常在终产物中仍存在，并容易黏附在手和衣服上。
公开内容概述
申请人已经开发了无酚的抗酸染色组合物，所述组合物实现的染色性能至少等于那些包含酚的传统制剂（例如萋-尼染色剂）。实际上，在没有伴随的酚暴露危险的情况下，与含酚的制剂相比，本文所述的无酚组合物至少达到了相同的染色频率（即在组织的确定区域内染色的微生物总数目）和/或染色剂强度（即染色剂的暗度）。
此外，申请人已经发现，从染色组合物中除去酚并将其用碱和表面活性剂替代允许品红染料在染色溶液中增加的溶解度。增加的品红溶解度允许在任何染色溶液中使用较低的品红浓度，且这对于自动染色仪器中使用的那些染色溶液特别重要，在自动染色仪器的场合，高浓度的品红可能在仪器中沉淀。最后，据信除去具有较高蒸气压的酚减少或消除自动染色仪器中交叉污染的危险。
鉴于前述内容，本公开内容的一个方面是包含品红、碱、表面活性剂和醇的抗酸染色组合物，其中所述抗酸染色组合物不含酚。在一些实施方案中，组合物中的品红（例如可溶性品红）的量按组合物总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75 w/v％。
在一些实施方案中，碱是氢氧化物（例如KOH、NaOH、Mg(OH)2等）。在一些实施方案中，碱是非亲核碱。在一些实施方案中，碱是弱碱。在一些实施方案中，弱碱具有从约8一直到约20的pKa。在一些实施方案中，碱是三(羟甲基)氨基甲烷。在一些实施方案中，组合物中碱的量按组合物总体积计从约0.05 w/v％一直到约0.5 w/v％。
在一些实施方案中，表面活性剂是非离子型表面活性剂。在一些实施方案中，非离子型表面活性剂是脂肪醇乙氧基化物。在一些实施方案中，非离子型表面活性剂是C8-C18脂肪醇乙氧基化物。在一些实施方案中，C8-C18脂肪醇乙氧基化物包含小于12摩尔的环氧乙烷。在一些实施方案中，组合物中表面活性剂的量按组合物的总体积计从约0.5 w/v％一直到约4 w/v％。
在一些实施方案中，抗酸染色组合物的10％水溶液具有从约2一直到约6的pH。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少120天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少240天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少360天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少420天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少500天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少540天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少600天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少620天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物进一步包含至少一种添加剂。
在一些实施方案中，抗酸染色组合物基本上由下述组成：（a）可溶性品红，其量按组合物总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75 w/v％；（b）弱碱，其量按组合物总体积计从约0.05 w/v％一直到约0.5 w/v％；和（c）非离子型表面活性剂，其量按组合物总体积计从约0.5 w/v％一直到约4w/v％。在一些实施方案中，表面活性剂是C8-C18脂肪醇乙氧基化物，并且碱是三(羟甲基)氨基甲烷，并且品红是可溶性品红。
本公开内容的另一个方面是已经用不含酚的抗酸染色组合物染色的生物样品，所述抗酸染色组合物包含品红、碱、表面活性剂和醇。在一些实施方案中，生物样品是已经用基本上由下述组成的抗酸染色组合物染色的生物样品：（a）可溶性品红，其量按组合物总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75 w/v％；（b）弱碱，其量按组合物总体积计从约0.05 w/v％一直到约0.5 w/v％；和（c）非离子型表面活性剂，其量按组合物总体积计从约0.5 w/v％一直到约4w/v％。
本公开内容的另一个方面是试剂盒，其包括（a）抗酸染色组合物，其包含品红、碱、表面活性剂和醇，其中所述抗酸染色组合物不含酚；和（b）第二组合物，其选自（i）脱蜡溶液；（ii）包括去污剂的洗涤溶液；（iii）包括低级醇和酸的脱色溶液；和（iv）包含染料和弱酸的第二染料溶液。在一些实施方案中，试剂盒包括（a）抗酸染色组合物，其包含品红、碱、表面活性剂和醇，其中所述抗酸组合物不含酚；和至少两种额外的组合物，其选自（i）脱蜡溶液；（ii）包括去污剂的洗涤溶液；（iii）包括低级醇和酸的脱色溶液；和（iv）包含染料和弱酸的第二染料溶液。在一些实施方案中，试剂盒包括具有不含酚的抗酸染色组分的第一容器；具有脱色溶液的第二容器；和具有第二染料溶液的第三容器。
本公开内容的另一个方面是对生物样品（例如组织学样品、细胞学样品等）中的抗酸性生物进行染色的体外方法，所述方法包括以下步骤：（a）提供来自患有或怀疑患有抗酸性生物感染的主体的生物样品；（b）将抗酸染色组合物应用于所述生物样品；和（c）将抗酸染色组合物或生物样品中的至少一种加热至从约30℃一直到约45℃的温度。在一些实施方案中，将样品与抗酸染色组合物温育从约12分钟一直到约24分钟的时间段。在一些实施方案中，将约100微升至约500微升的抗酸染色组合物应用于生物样品。在一些实施方案中，将约200微升的抗酸染色组合物应用于生物样品。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在应用抗酸染色组合物之前对生物样品进行脱蜡。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：（d）将包括醇和酸的脱色溶液应用于生物样品；和（e）将包含染料和弱酸的第二染色剂应用于生物样品。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对生物样品进行成像的步骤。在一些实施方案中，用自动染色***应用抗酸染色组合物。
本公开内容的另一个方面是检测生物样品（例如组织学样品，细胞学样品等）中的抗酸性生物的方法，其包括：（a）将抗酸染色溶液应用于所述生物样品，所述抗酸染色溶液包含品红、碱、表面活性剂和醇，其中组合物中品红的量从约0.75 w/v％一直到约2.75 w/v％；和（b）将染色溶液或生物样品中的至少一种加热到从约30℃一直到约45℃的温度。在一些实施方案中，染色溶液具有从约8一直到约20的pH。在一些实施方案中，将样品与染色溶液一起温育从约10分钟一直到约40分钟的时间段。在一些实施方案中，将样品与染色溶液一起温育从约12分钟一直到约24分钟的时间段。在一些实施方案中，将约100微升至约500微升的染色溶液应用于生物样品。在一些实施方案中，将约200微升的染色溶液应用于生物样品。
在一些实施方案中，碱以按组合物总体积计从约0.05 w/v％一直到约0.5 w/v％的量存在于染色溶液中；且表面活性剂以按组合物总体积计从约0.5 w/v％一直到约4 w/v％的量存在于染色溶液中。在一些实施方案中，碱是具有从约8一直到约20的pKa的弱碱。在一些实施方案中，碱是三(羟甲基)氨基甲烷。在一些实施方案中，表面活性剂是非离子型表面活性剂。在一些实施方案中，非离子型表面活性剂是脂肪醇乙氧基化物。在一些实施方案中，非离子型表面活性剂是C8-C18脂肪醇乙氧基化物。在一些实施方案中，C8-C18脂肪醇乙氧基化物包含小于12摩尔的环氧乙烷。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在应用染色溶液之前对生物样品进行脱蜡的步骤。在一些实施方案中，所述方法在用抗酸染色溶液染色后进一步包括以下步骤：（i）将包括醇和酸的脱色溶液应用于样品；和（ii）将包含染料和弱酸的第二染色剂应用于样品。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对生物样品进行成像的步骤。在一些实施方案中，用自动标本加工仪器将抗酸染色溶液应用于生物样品。
本公开内容的另一个方面是用自动染色装置对置于载玻片上的生物样品中的抗酸性生物进行染色的方法，其包括：（a）将生物样品装载到自动染色装置中，（b）将抗酸染色组合物分配到生物样品上；和（c）从载玻片上除去抗酸染色组合物。在一些实施方案中，生物样品来自患有或怀疑患有抗酸性生物感染的主体。在一些实施方案中，将约100微升至约500微升的抗酸染色组合物应用于生物样品。在一些实施方案中，将生物样品与抗酸染色组合物一起温育从约10分钟一直到约30分钟的时间段。在一些实施方案中，生物样品于从约30℃一直到约45℃的温度温育。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将包括醇和酸的脱色溶液分配到样品上。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将包含染料和弱酸的第二染色剂组合物分配到样品上。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在应用抗酸染色组合物之前对样品进行脱蜡。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将盖玻片应用于置于载玻片上的样品。
本公开内容的另一个方面是一种装置，其包括至少一个被进行配置以分配抗酸染色组合物的分配器。在一些实施方案中，所述装置进一步包括至少一个适合于加热显微镜载玻片的组件。
本公开内容的另一方面是用自动染色装置对置于显微镜载玻片上的样品进行染色的方法，其包括：（i）将无酚的抗酸染色溶液分配到载玻片上，所述染色溶液包含（a）以按组合物总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75 w/v％的量存在的品红；（b）以按组合物总体积计从约0.05 w/v％一直到约0.5 w/v％的量存在的碱；和（c）以按组合物总体积计从约0.5 w/v％一直到约4w/v％的量存在的表面活性剂；和（ii）在预定量的时间后从载玻片上除去抗酸染色溶液。在一些实施方案中，将约100微升至约500微升的染色溶液应用于生物样品。在一些实施方案中，将约200微升的染色溶液应用于生物样品。在一些实施方案中，将标本与染色溶液一起温育从约10分钟一直到约40分钟的时间段；且其中将所述标本或染色溶液中的至少一种加热至从约30℃一直到约45℃的温度。在一些实施方案中，将标本加热至从约30℃一直到约45℃的温度。在一些实施方案中，将样品加热至从约30℃一直到约45℃的温度。在一些实施方案中，将样品和标本两者都加热至从约30℃一直到约45℃的温度。在一些实施方案中，所述方法进一步包括（例如用显微镜或用扫描设备）对标本成像。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将第一漂洗液、洗涤液和/或缓冲液分配到载玻片上。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将包括醇和酸的脱色溶液分配到载玻片上；以及从载玻片除去脱色溶液的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将第二漂洗液或缓冲液分配到载玻片上。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：将包含染料和弱酸的第二染色剂组合物分配到载玻片上；并除去第二染色剂组合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将第三漂洗液或缓冲液分配至载玻片。
在一些实施方案中，所述方法包括在用抗酸染色溶液染色之前将样品进行脱蜡。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在样品上应用盖玻片。在一些实施方案中，所述方法进一步包括分析用无酚的抗酸染色溶液染色的样品，以确定其中是否存在抗酸细菌。
本公开内容的另一个方面是一种装置，其包括至少一个分配器，该分配器被进行配置以将包含品红、碱、表面活性剂和醇的抗酸染色溶液分配到生物标本上，其中所述抗酸染色组合物不含酚；且其中所述装置进一步包括适合于将所述生物标本或所述抗酸染色溶液中的至少一种加热至至少30℃的温度的组件。在一些实施方案中，碱是三(羟甲基)氨基甲烷。在一些实施方案中，表面活性剂是非离子型表面活性剂。
附图简述
为了总的理解本公开内容的特征，提供附图以进行介绍。在附图中，相似的参考数字自始至终用于标记相同的元件。
图1提供了使用第一仪器用不含酚的抗酸染色组合物染色的载玻片的载玻片读出的图形概略。
图2提供了使用第一仪器用不含酚的抗酸染色组合物染色的载玻片的载玻片读出的图形概略。
图3提供了使用两种不同仪器染色的载玻片的载玻片读出的图形概略，其中，用不含酚的抗酸染色组合物或传统的含酚染色组合物对载玻片进行染色。
图4提供了在每个测试时间点的每个设计批次/条件的pH图。贮藏条件通过着色点显示。失败的上限和下限显示为通过第0天测量结果确立的红色梯度条。
图5显示了每个时间点的设计批次1 HPLC测量结果的图。温度条件由着色点表示。失败下限由红线显示。所有时间点都高于失败极限。
图6显示了每个时间点的设计批次2 HPLC测量结果的图。温度条件由着色点表示。失败下限由红线显示。所有时间点都高于失败极限。
图7显示了每个时间点的设计批次2 3 HPLC测量结果的图。温度条件由着色点表示。失败下限由红线显示。所有时间点都高于失败极限。
图8提供了在每个时间点所有DL的UV-Vis测量结果的图。温度条件由着色点表示。失败的上限和下限显示为红色梯度条。所有时间点都通过。
详述
还应该理解的是，除非清楚地有相反指示，否则在本文请求保护的包括不止一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不必定限于叙述所述方法的步骤或动作的顺序。
如本文所用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数术语“一个（a）”、“一种（an）”和“该（the）”包括复数对象。类似地，除非上下文另外清楚地指出，否则单词“或”意图包括“和”。术语“包括”内含地进行定义，以致于“包括A或B”表示包括A、B或A和B。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应被理解为具有与上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当将表中的项目分开时，“或”或“和/或”应解释为内含的，即包含多个要素或要素表中的至少一个，但也包括不止一个，以及任选地额外的未列举的项目。仅清楚地有相反指示的术语，例如“仅一个或“恰好一个”，或当在权利要求书中使用时，“由……组成”将指包括多个要素或要素表中的恰好一个要素。通常，如本文中所使用的术语“或”当前面是排他性术语（例如“任何一个”、“一个”、“仅一个”或“恰好一个”）时仅应被解释为表示排他性的选择对象（即，“一个或另一个但不是两者”）。当在权利要求书中使用时，“基本上由……组成”应具有其如在专利法领域中所使用的普通含义。
术语“包含”、“包括”、“具有”等可互换使用并且具有相同的含义。类似地，“包含”、“包括”、“具有”等可互换使用并且具有相同的含义。具体而言，每个术语均与美国专利法中通常的“包含”定义一致地进行定义，且因此被解释为表示“至少以下内容”的开放术语，并且也被解释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如，“具有部件a、b和c的设备”指所述设备包括至少部件a、b和c。类似地，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”指所述方法包括至少步骤a、b和c。此外，尽管这里可以以特定顺序概述步骤和过程，但是本领域技术人员将认识到步骤和过程的次序关系可以变化。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个要素的表的短语“至少一个”应理解为指从该要素表中的任何一个或多个要素中选择的至少一个要素，但不必定包括要素表中具体列举的每个要素中的至少一个，并且不排除要素表中要素的任何组合。这个定义还允许除了短语“至少一个”所指的要素表中明确确定的要素以外的要素可以任选地存在，无论与那些明确确定的要素有关还是无关。因此，作为非限制性示例，“A和B的至少一个”（或等价地，“A或B的至少一个”，或等价地“A和/或B的至少一个”） 可以在一个实施方案中，指在没有B的情况下的至少一个，任选地包括不止一个A（并且任选地包括除B以外的要素）；在另一个实施方案中，指在没有A的情况下的至少一个，任选地包括不止一个B（并且任选地包括除A以外的要素）；在又另一实施方案中，指至少一个，任选地包括不止一个A，以及至少一个，任选地包括不止一个B（并且任选地包括其他要素）；等等。
如本文所用的，术语“抗酸”或“抗酸度（acid-fastness）”是指某些细菌和真核细胞以及一些亚细胞结构的物理性质，特别是它们在实验室染色程序过程中对用酸脱色的抗性。一旦作为样品的一部分被染色，这些生物便可以耐得住许多染色规程中常见的基于酸和/或乙醇的脱色程序。
如本文所用的，术语“抗酸细菌”或“AFB”是指在酸洗涤后保留染色剂的细菌。本文使用的术语“AFB”是指抗酸细菌，并且可以包括具有抗酸特性的任何细菌。如本发明中所使用的AFB可以是分枝杆菌属（Mycobacterium）的属。AFB可以是除分枝杆菌属以外的属。因此，本发明可以应用于不是分枝杆菌属的AFB。更具体地，举一些例子，本发明可以应用于是棒杆菌属（Corynebacterium）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、冢村氏菌属（Tsukamurella）或放线菌属（Actinomyces）、诺卡氏菌属（Norcardium）的AFB。
如本文所用的，术语“生物样品”或“组织样品”是指包括从任何生物包括病毒获得的生物分子（例如蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其组合）的任何样品。生物的其他实例包括哺乳动物（例如人；兽医动物，例如猫、狗、马、牛和猪；和实验室动物，例如小鼠、大鼠和灵长类动物）、昆虫、环节动物、蜘蛛、有袋类、爬行类、两栖类、细菌和真菌。生物样品包括组织样品（例如组织切片和组织的针吸活组织检查），细胞样品（例如细胞学涂片如巴氏涂片（Pap smears）或血涂片或通过显微解剖获得的细胞样品），或细胞级分，碎片或细胞器（例如通过裂解细胞并通过离心或其他方法分离其组分而获得的）。生物样品的其他实例包括血液、血清、尿、***、粪便物质、脑脊液、组织液、黏液、眼泪、汗、脓、活组织检查的组织（例如，通过手术活组织检查或针吸活组织检查获得的）、***抽吸物、耵聍、乳、***液（vaginal fluid）、唾液、拭子（例如颊拭子）或任何包含衍生自第一生物样品的生物分子的材料。在某些实施方案中，如本文所用的术语“生物样品”是指从获得自主体的肿瘤或其一部分制备的样品（例如均化或液化的样品）。
如本文所用的，其中“a”和“b”是整数的“Ca至Cb”是指烷基、链烯基或炔基中的碳原子数，或环烷基、环烯基、环炔基或芳基的环中的碳原子数，或杂烷基、杂环基、杂芳基或杂脂环基中的碳原子和杂原子的总数。也就是说，烷基、链烯基、炔基、环烷基的环、环烯基的环、环炔基的环、芳基的环、杂芳基的环或杂脂环基的环可以含有“a”至“b”（a和b也包括在内）的碳原子。因此，例如，“C1至C4烷基”是指具有1-4个碳的所有烷基，即CH3—、CH3CH2—、CH3CH2CH2—、(CH3)2CH—、CH3CH2CH2CH2—、CH3CH2CH(CH3)—和(CH3)3C—。如果关于烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基或杂脂环基未标明“a”和“b”，则假定在这些定义中描述的最宽范围。
如本文所用的，术语“流体”是指任何液体，包括水、溶剂、溶液（例如缓冲液）等。术语“流体”还指任何混合物、胶体、悬浮液等。术语“流体”还包括可以应用于显微镜载玻片和/或标本的试剂、染色剂和其他标本加工剂（例如胶水、固定剂等）。流体可以是水性的或非水性的。进一步的实例包括抗体的溶液或悬浮液、核酸探针的溶液或悬浮液以及染料或染色剂分子的溶液或悬浮液（例如，H＆E染色溶液、Pap染色溶液等）。流体的再进一步的实例包括用于使石蜡包埋的生物标本脱蜡的溶剂和/或溶液、水性去污剂溶液和烃（例如，烷、异烷烃和芳族化合物，例如二甲苯）。流体的再进一步的实例包括用于使生物标本脱水或再水化的溶剂（及其混合物）。
如本文所用的，术语“低级醇”是指C1-C6醇，其可以是直链或支链的。低级醇的实例包括甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，及其异构体。
如本文所用的，术语“分枝杆菌”意图是包含任何已知的分枝杆菌，包括，但不限于，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）、田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti）、非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum）、Mycobacterium canetti、鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium）、胞内分枝杆菌（Mycobacterium intracellulare）、瘰疬分枝杆菌（Mycobacterium scrofulaceum）、堪萨斯分枝杆菌（Mycobacterium kansasii）、玛尔摩分枝杆菌（Mycobacterium malmoense）、蟾分枝杆菌（Mycobacterium xenopi）、海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）、猿分枝杆菌（Mycobacterium simiae）、土分枝杆菌（Mycobacterium terrae）、溃疡分枝杆菌（Mycobacterium ulcerans）、脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）、偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）、龟分枝杆菌（Mycobacterium chelonae）和戈登分枝杆菌（Mycobacterium gordonae）。
如本文所用的，术语“试剂”可以指沉积在组织切片或细胞学样品上的任何流体，其用于形态学（例如苏木精和伊红）、免疫组织化学或特殊染色剂的背景中。这包括，但不限于，用于去除蜡（即脱蜡）的油、有机物和桥联试剂（bridging reagents）；用于设立反应条件、将试剂稀释至适当的浓度、猝灭反应或洗掉过量的反应物的洗涤物（washes）、漂洗物（rinses）、稀释剂或缓冲液；用于形态学染色的小分子染料和特殊染色剂；用于IHC或ICC染色的抗体、抗体缀合物、酶、多聚体、增强剂（amplifiers）、显色底物、荧光检测化学成分（chemistries）、化学发光底物和酶反应辅因子。
如本文所用的，术语“载玻片”是指其上放置生物标本用于分析的任何合适尺寸的任何基底（例如，全部或部分由玻璃、石英、塑料、硅等制成的基底），且更特别地是指“显微镜载玻片”，例如标准的3英寸×1英寸的显微镜载玻片或标准的75 mm×25 mm的显微镜载玻片。可以放置在载玻片上的生物标本的例子包括但不限于细胞学涂片，薄组织切片（例如来自活组织检查）和生物标本阵列，例如组织阵列，细胞阵列，DNA阵列，RNA阵列，蛋白质阵列，或其任何组合。因此，在一个实施方案中，将组织切片、DNA样品、RNA样品和/或蛋白质于特定位置放置在载玻片上。在一些实施方案中，术语载玻片可以指SELDI和MALDI芯片以及硅片。
如本文所用的，“表面活性剂”取决于其化学作用方式而分类为阴离子型、阳离子型或非离子型。通常，表面活性剂降低两种液体之间的界面张力。表面活性剂分子一般具有极性或离子“头”和非极性烃“尾”。在溶解于水中时，表面活性剂分子聚集并形成微团，其中非极性尾向内取向，而极性或离子头朝水性环境向外取向。非极性尾在微团内产生非极性“口袋”。溶液中的非极性化合物被隔绝在由表面活性剂分子形成的口袋中，从而允许非极性化合物在水溶液中保持混合。在一些实施方案中，表面活性剂可用于产生试剂从组织切片的这头到那头的均匀涂布以及减少背景染色。
如本文所用的，如本文所用的术语“染色（stain）”、“染色（staining）”等通常是指检测和/或区分生物标本中的特定分子（例如脂质、蛋白质或核酸）或特定结构（例如正常或恶性细胞、细胞溶胶、核、高尔基体或细胞骨架）的存在、位置和/或量（例如浓度）的生物标本的任何处理。例如，染色可以提供生物标本的特定分子或特定细胞结构与周围部分之间的对比，并且染色的强度可以提供标本中特定分子的量的量度。染色可以用于帮助不仅用明视场显微镜而且用其他观察工具如相差显微镜、电子显微镜和荧光显微镜来观察分子、细胞结构和生物。***2执行的一些染色可用于显示细胞的轮廓。***2执行的其他染色可以取决于在没有或有相对少的其他细胞组分染色的情况下被染色的某些细胞组分（例如分子或结构）。***2执行的染色方法的类型的实例包括，但不限于，组织化学方法、免疫组织化学方法和其他基于分子之间的反应（包括非共价结合相互作用）的方法，例如核酸分子之间的杂交反应。特定的染色方法包括，但不限于，初级染色方法（例如，H＆E染色、Pap染色等）、酶联免疫组织化学方法以及原位RNA和DNA杂交方法，例如荧光原位杂交（FISH）。
如本文所用的，“萋-尼染色剂”是指用于显示属于分枝杆菌属的属的抗酸细菌的染色剂，其包括结核的病原体。
总览
本公开内容涉及不含酚的抗酸染色组合物。本公开内容还提供了将那些组合物应用于生物样品以使得能够检测其中存在的抗酸细菌的方法。
抗酸染色组合物
本公开内容的一个方面是抗酸染色组合物，其包含品红、碱、表面活性剂和醇，其中所述组合物不含酚。
在一些实施方案中，单一品红包含在任何抗酸染色组合物中。品红化合物的实例包括可溶性品红、酸性品红、碱性品红及其衍生物或类似物。在一些实施方案中，品红是可溶性品红。
在一些实施方案中，品红在组合物中的量按组合物总体积计从约0.5w/v％一直到约5/v％。在其他实施方案中，品红在组合物中的量按组合物总体积计从0.5 w/v％一直到约4 w/v％。在一些实施方案中，品红在组合物中的量按组合物总体积计从0.5w/v％一直到约3.5 w/v％。在再其他的实施方案中，品红在组合物中的量按组合物总体积计从3 w/v％一直到约4 w/v％。在进一步的实施方案中，品红在组合物中的量按组合物总体积计从0.75w/v％一直到约2.75 w/v％。在进一步的实施方案中，品红在组合物中的量按组合物总体积计从0.75 w/v％一直到约2.5 w/v％。在甚至进一步的实施方案中，品红在组合物中的量按组合物总体积计从1 w/v％一直到约2.5 w/v％。在甚至进一步的实施方案中，品红在组合物中的量按组合物总体积计从1.25 w/v％一直到约2.5 w/v％。在再甚至进一步的实施方案中，品红在组合物中的量按组合物总体积计从1 w/v％一直到约2.25 w/v％。
在一些实施方案中，抗酸染色组合物包含碱。在一些实施方案中，碱是氢氧化物，例如KOH、NaOH。在一些实施方案中，碱是非亲核碱。在一些实施方案中，碱具有从约9一直到约11的pH。在其他实施方案中，碱是弱碱。在一些实施方案中，弱碱具有从约8一直到约20的pKa。合适的弱碱包括三(羟甲基)氨基甲烷（“TRIS”）、氨、吡啶、有机胺（例如三甲胺）、羧酸盐、碳酸盐。在其他实施方案中，碱是TRIS。在一些实施方案中，碱选自不与品红反应以形成乙氧基化品红衍生物的碱。
在一些实施方案中，抗酸染色组合物中碱的量按组合物的总体积计从约0.05 w/v％一直到约0.5 w/v％。在一些实施方案中，碱的量按组合物的总体积计从约0.075 w/v％一直到约0.45 w/v％。在其他实施方案中，碱的量按组合物的总体积计从约0.1 w/v％一直到约0.4 w/v％。在其他实施方案中，碱的量按组合物的总体积计从约0.1 w/v％一直到约0.35 w/v％。在再其他实施方案中，碱的量按组合物的总体积计从约0.125 w/v％一直到约0.3 w/v％。在再其他实施方案中，碱的量按组合物的总体积计从约0.1 w/v％一直到约0.2w/v％。在再其他实施方案中，碱的量按组合物的总体积计从约0.2 w/v％一直到约0.45 w/v％。
在一些实施方案中，抗酸染色组合物进一步包含表面活性剂。表面活性剂可以是阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂或其混合物中的一种。在一些实施方案中，表面活性剂是非离子型表面活性剂。属于合适的非离子型表面活性剂之列的是C8-C30醇与糖或淀粉聚合物的缩合产物。这些化合物可以由式(S)n —O—R表示，其中S是糖部分，例如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖；n为约1至约1000的整数，并且R为C8-C30烷基。可以衍生R基团的合适的C8-C30醇的实例包括癸醇、鲸蜡醇、十八烷醇、月桂醇、肉豆蔻醇、油醇等。这些表面活性剂的具体实例包括癸基聚葡糖苷和月桂基聚葡糖苷。
其他合适的非离子型表面活性剂包括烯化氧与脂肪酸的缩合产物（即，脂肪酸的烯化氧酯）。这些材料具有通式RCO(X)n OH，其中R为C10–C30烷基，X为—OCH2CH2—（衍生自环氧乙烷）或—OCH2CHCH3—（衍生自氧化丙烯），并且n为约1至约200的整数。
再其他合适的非离子型表面活性剂是具有分子式RCO(X)nOOCR的烯化氧与脂肪酸的缩合产物（即，脂肪酸的烯化氧二酯），其中R为C10–C30烷基，X为—OCH2CH2—（衍生自环氧乙烷）或—OCH2CHCH3—（衍生自氧化丙烯），并且n为约1至约200的整数。再其他的非离子型表面活性剂是具有通式R(X)nOR'的烯化氧与脂肪醇的缩合产物（即，脂肪醇的烯化氧醚），其中R为C10–C30烷基，n为约1至约200的整数，并且R'是H或C10–C30烷基。
再其他的非离子型表面活性剂是具有分子式RCO(X)nOR'的化合物，其中R和R'为C10–C30烷基，X为—OCH2CH2—（衍生自环氧乙烷）或—OCH2CHCH3—（衍生自氧化丙烯），并且n为约1至约200的整数。烯化氧衍生的非离子型表面活性剂的实例包括十六烷基聚氧乙烯醚（ceteth）-1、十六烷基聚氧乙烯醚-2、十六烷基聚氧乙烯醚-6、十六烷基聚氧乙烯醚-10、十六烷基聚氧乙烯醚-12、鲸蜡硬脂醇聚醚（ceteraeth）-2、鲸蜡硬脂醇聚醚（ceteareth）6、鲸蜡硬脂醇聚醚-10、鲸蜡硬脂醇聚醚-12、十八烷基聚氧乙烯醚（steareth）-1、十八烷基聚氧乙烯醚-2、十八烷基聚氧乙烯醚（stearteth）-6、十八烷基聚氧乙烯醚-10、十八烷基聚氧乙烯醚-12、PEG-2硬脂酸酯、PEG4硬脂酸酯、PEG6硬脂酸酯、PEG-10硬脂酸酯、PEG-12硬脂酸酯、PEG-20甘油硬脂酸酯、PEG-80甘油牛油酸酯（glyceryl tallowate）、PPG-10甘油硬脂酸酯、PEG-30甘油椰油酸酯（glyceryl cocoate）、PEG-80甘油椰油酸酯、PEG-200甘油牛油酸酯、PEG-8二月桂酸酯、PEG-10二硬脂酸酯及其混合物。再其他有用的非离子型表面活性剂包括例如在引入本文作为参考的美国专利Nos. 2,965,576、2,703,798和1,985,424中公开的多羟基脂肪酸酰胺。
本领域和文献中通常已知的非离子型表面活性剂的实例包括各种直链乙氧基化物，例如伯或仲脂肪醇乙氧基化物、其他醇烷氧基化物（alcohol alkoxylates）、芳族乙氧基化物、改性乙氧基化物及其掺合物。实例包括但不限于，C8-C18脂肪醇乙氧基化物，包括具有小于12摩尔环氧乙烷（EO）的那些C8-C18脂肪醇乙氧基化物。示例性的表面活性剂包括Tomadol 1200（Air Products）、Tomadol 900（Air Products）、Tomadol 91-8（AirProducts）、Tomadol 1-9（Air Products）、Tergitol 15-S-9（Sigma）、Tergitol 15-S-12（Sigma）、Masurf NRW-N（Pilot Chemical）、Bio-Soft N91-6（Stepan）和Brij-35（聚乙二醇十二烷基醚）（Sigma）。如本文所用的，“Tergitol”表面活性剂由以下分子式定义，其中n、n1和n2独立地为5-30。例如，对于Tergitol 15-S-5，n + n1 = 12，n2 = 4；对于Tergitol 15-S-7，n + n1 = 12且n2 = 6；且对于Tergitol 15-S-9，n + n1 = 12且n2 = 8。聚氧乙烯的进一步实例包括Nonoxynol-9、Nonidet P-40和Igepal系列表面活性剂，尽管许多其他是已知的。
其他非离子型表面活性剂的实例包括聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的共聚物（例如，泊洛沙姆，例如BASF PLURONIC®产品）。非离子型表面活性剂的进一步实例包括，但不限于，8-甲基-1-壬醇丙氧基化物-嵌段-乙氧基化物、ALKANOL® 6112、烯丙醇1,2-丁氧基化物（butoxylate）-嵌段-乙氧基化物、Brij® 30、Brij® 52、Brij® 72、Brij® 78、Brij®92V、Brij® 93、Brij® 97、Brij® 98、Brij® 010、Brij® 5100、Brij® 510、Brij®58、IGEPAL® CA-210、IGEPAL® CA-520、IGEPAL® CA-720、IGEPAL® CO-210、IGEPAL®CO-520、IGEPAL® CO-630、IGEPAL® CO-720、IGEPAL® CO-890、IGEPAL® DM-970、MERPOL® A、MERPOL® DA、MERPOL® HCS、MERPOL® OJ、MERPOL® SE、MERPOL® SH、聚乙烯-嵌段-聚乙二醇、聚氧乙烯十三烷基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐四油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇六油酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、TWEEN® 20、TWEEN® 40、TWEEN® 60、TWEEN® 85。
阴离子型表面活性剂通常基于硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐或羧酸盐，且含有水溶性阳离子。磺酸盐的代表性分子式为R—SO3M，其中R为约5至22个碳原子的烃基，其可通过烷氧基或氧化烷氧基（oxyalkoxy）连接至磺酸盐官能团（functionality），并且M为水溶性阳离子，例如碱金属。阴离子表面活性剂包括烷基醚硫酸盐，烷基硫酸盐和磺酸盐，烷基羧酸盐，烷基苯基醚硫酸盐，烷基聚氧乙烯磺酸盐的钠盐，烷基苄基磺酸盐的钠盐，例如十二烷基苄基磺酸盐的钠盐和月桂基***硫酸钠。阴离子表面活性剂还包括阴离子磷酸酯。
在本公开内容的组合物中有用的阳离子表面活性剂包含氨基或季铵部分。在以下文件中公开了属于本文中有用的那些之列的阳离子表面活性剂：M.C. Publishing Co.,McCutcheon's, Detergents & Emulsifiers, (North American edition 1979)；Schwartz等人; Surface Active Agents, Their Chemistry and Technology, NewYork: Interscience Publishers, 1949；美国专利No. 3,155,591, Hilfer, 1964年11月3日授权；美国专利No. 3,929,678, Laughlin等人, 1975年12月30日授权；美国专利No.3,959,461, Bailey等人, 1976年5月25日授权；和美国专利No. 4,387,090, Bolich,Jr., 1983年6月7日授权。
在一些实施方案中，组合物中表面活性剂的量按组合物的总体积计从约0.5 w/v％一直到约4 w/v％。在其他实施方案中，组合物中表面活性剂的量按组合物的总体积计从约0.75 w/v％一直到约3.5 w/v％。在再其他实施方案中，组合物中表面活性剂的量按组合物的总体积计从约1 w/v％一直到约3 w/v％。在进一步的实施方案中，组合物中表面活性剂的量按组合物的总体积计从约1.5 w/v％一直到约2.5 w/v％。
在一些实施方案中，醇是低级醇，其可以是支链或直链的。在一些实施方案中，醇是乙醇、正丙醇、异丙醇或它们的混合物。
在一些实施方案中，抗酸染色组合物包含可溶性品红、非离子型表面活性剂和TRIS，其中（a）可溶性品红以按组合物的总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75w/v％的量存在；（b）TRIS以按组合物的总体积计从约0.1 w/v％一直到约0.5 w/v％的量存在；且（c）非离子型表面活性剂以按组合物的总体积计从约0.5w/v％一直到约4w/v％的量存在。
在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少120天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少180天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少240天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少300天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少360天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少420天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少450天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少500天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少520天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少540天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少580天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少600天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少620天。在一些实施方案中，抗酸染色组合物稳定至少630天。
抗酸染色组合物的非限制性实例在表1中陈述：
Figure 392758DEST_PATH_IMAGE001
方法
本公开内容的另一个方面是对生物样品（例如组织学样品、细胞学样品等）中的抗酸性生物（例如分枝杆菌属）进行染色的体外方法，所述方法包括提供来自患有或怀疑患有抗酸性生物感染的主体的生物样品，并且将根据本公开内容的抗酸染色组合物应用于所述生物样品。
本公开内容的另一个方面是检测生物样品中的抗酸性生物（例如分枝杆菌属）的方法，其包括从患有或怀疑患有抗酸细菌感染的主体（例如，患者）接收生物样品；并将包含品红、碱、表面活性剂和醇的抗酸染色组合物应用于所述生物样品，其中所述组合物不含酚。在一些实施方案中，抗酸染色组合物包含可溶性品红、非离子型表面活性剂和TRIS。
在其他实施方案中，抗酸染色组合物包含可溶性品红、非离子型表面活性剂和TRIS，其中（a）可溶性品红以按组合物的总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75w/v％的量存在；（b）TRIS以按组合物的总体积计从约0.1 w/v％一直到约0.5 w/v％的量存在；且（c）非离子型表面活性剂以按组合物的总体积计从约0.5w/v％一直到约4w/v％的量存在。当然，本文所指出的任何抗酸染色组合物，包括在表1中鉴定的那些，都可以应用于生物样品，以实现样品中抗酸性生物的检测。如本文所指出的，将抗酸染色组合物应用于生物样品的步骤可以手动进行或用标本加工装置进行。
在一些实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热至高于室温的温度，例如从约30℃一直到约80℃的温度。在一些实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热至高于室温的温度，例如从约30℃一直到约60℃的温度。在一些实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热至高于室温的温度，例如从约30℃一直到约50℃的温度。在其他实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热至从约35℃一直到约40℃的温度。在一些实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热至约37℃的温度。
在一些实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热从约10分钟一直到约40分钟的时间段。在其他实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热从约15分钟一直到约40分钟的时间段。在再其他实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热从约15分钟一直到约30分钟的时间段。在进一步的实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热从约12分钟一直到约24分钟的时间段。在再进一步的实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热从约16分钟一直到约36分钟的时间段。在一个实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热约12分钟。在一个实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热约16分钟。在一个实施方案中，将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热约20分钟。
在一些实施方案中，将生物样品与抗酸染色组合物在加热后温育额外的时间段，例如允许生物样品冷却的时间段。在一些实施方案中，这个额外的时间段从约1分钟一直到约15分钟。在其他实施方案中，这个额外的时间段从约5分钟一直到约10分钟。在一些实施方案中，组合物保持与样品接触的总时间从约5分钟一直到约80分钟。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使生物样品与其他流体和/或试剂接触。例如，在一些实施方案中，可以将包括复染剂的额外的染色剂应用于生物样品。在其他实施方案中，可以在沉积抗酸染色组合物之前或之后应用洗涤试剂、检测试剂、脱蜡试剂、缓冲液等。
自动标本加工***
在一些实施方案中，可以使用标本加工***来沉积本公开内容的抗酸染色组合物。在一些实施方案中，标本加工装置是自动装置，例如由Ventana Medical Systems, Inc.销售的BENCHMARK XT仪器、BenchMark专用染色剂（Special Stains）仪器、NexES专用染色器（Special Stainer）仪器、SYMPHONY仪器或BENCHMARK ULTRA仪器。Ventana MedicalSystems, Inc.是许多美国专利的受让人，所述美国专利公开了用于执行自动分析的***和方法，包括美国专利Nos. 5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029以及美国公开专利申请Nos. 2003/0211630和2004/0052685，其各自整体引入本文作为参考。另一方面，可以手动加工标本。
可通过其应用抗酸染色组合物的其他可商购获得的标本加工***的实例包括VENTANA SYMPHONY（单独载玻片染色器）和VENTANA HE 600（单独载玻片染色器）系列；来自Agilent Technologies的Dako CoverStainer（分批染色器）；来自Leica BiosystemsNussloch GmbH的Leica ST4020小线性染色器（Small Linear Stainer）（分批染色器）、Leica ST5020 Multistainer（分批染色器）和Leica ST5010 Autostainer XL系列（分批染色器）H＆E染色器。
在一些实施方案中，本公开内容的染色***可以适合于执行对基底（例如，载玻片）封固的标本进行加工、染色和盖片的所有或一些步骤。在一些实施方案中，将带有生物标本的载玻片放置在载玻片盘上，并将带有样品载玻片的载玻片盘装载到***中，在那里，通过一系列步骤处理载玻片，其中载玻片被烘烤、去蜡、染色且最后盖片。在一些实施方案中，本文公开的方法涉及在显微镜载玻片（或其他基底）上自动制备组织样品用于病理分析的方法，其包括通过使仪器向组织施加足以将其黏附到载玻片的热来将组织样品烘烤到载玻片上；通过在高于石蜡熔点的温度使组织样品与脱蜡流体接触并接着将液化的石蜡漂洗掉来使其脱蜡；通过使组织样品与染色试剂接触来对其进行染色；和通过使载玻片上的染色的组织样品与预先用胶水粘合的盖玻片和黏合剂活化流体接触来将载玻片盖片。在一些实施方案中，本文公开的方法仅利用前述步骤中的一些。
标本加工装置可以包括用于固定许多基底（例如显微镜载玻片）的圆盘传送带，其中每个基底包括要染色的生物样品。自动染色设备还可包括用于以预定速度旋转圆盘传送带的设备以及用于在圆盘传送带旋转期间指导和控制试剂（包括抗酸染色组合物）应用到基底和样品上的机构。一旦将载玻片装载到仪器中，测试规程就将规定在特定时间将哪些试剂分配到基底上。在适当的时间，分配器支架将旋转以在基底上排列正确的试剂，并且仪器将在基底上分配预定量的试剂或流体（例如不含酚的抗酸染色组合物）。
在一些实施方案中，***是自动载玻片加工***，其包括以基本水平的位置（例如，在两行中，在那里载玻片以与水平线成约0.2度至约1.2度的角度固定）固定许多载玻片的载玻片盘和一个或多个容纳载玻片盘并在载玻片盘中的载玻片上执行一种或多种载玻片加工操作的工作站（例如，以垂直堆积排列的）。在一些实施方案中，工作站可以在载玻片盘中的一个或多个个别的载玻片上执行载玻片加工操作，例如，载玻片盘中的至少两个或四个载玻片，或者它可以同时在载玻片盘中的所有载玻片上执行载玻片加工操作。在一些实施方案中，一个或多个工作站在没有相当大量的接触第一载玻片的试剂和第二载玻片接触的情况下将试剂分配到载玻片盘中的载玻片，从而将载玻片之间的交叉污染减至最小。这种工作站可以包括将试剂分配到载玻片上的一个或多个定向喷嘴，例如，一个或多个定向喷嘴可以包括在穿过载玻片的表面以相反的方向分配试剂的一对定向喷嘴。在更特定的实施方案中，一个或多个定向喷嘴可以进一步包括将试剂朝向载玻片的底表面分配的定向喷嘴。在其他特定实施方案中，一个或多个工作站可以同时将试剂（例如，相同的试剂）分配到给定工作站内固定于载玻片盘中的至少两个载玻片，或者一个或多个工作站可以同时将试剂（例如相同的试剂）分配到给定工作站内固定于载玻片盘中的所有载玻片。在美国专利Nos. 8,663,991、7,468,161和9,528,918中描述了额外的***部件和盘配置（以及控制***），其公开内容特此整体引入本文作为参考。
在一些实施方案中，标本加工装置被进行配置以将预定量的抗酸染色组合物分配至生物样品。在一些实施方案中，标本加工装置被进行配置以将至少约100微升的抗酸染色组合物分配至生物样品。在其他实施方案中，将至少约150微升的抗酸染色组合物分配至生物样品。在再其他实施方案中，将至少约200微升的抗酸染色组合物分配至生物样品。在进一步的实施方案中，将约200微升至约500微升的抗酸染色组合物分配至生物样品。
在一些实施方案中，自动标本加工装置包括加热或冷却设备（例如传导加热器或珀尔帖（Peltier）设备），从而使得将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热至预定温度和/或达预定的时间量。载玻片加热设备的合适的例子在美国专利Nos. 7,425,306和6,582,962中描述，其公开内容特此整体引入本文作为参考。在一些实施方案中，将样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热至从约30℃一直到约45℃的温度。在其他实施方案中，标本加工装置将生物样品或抗酸染色组合物中的至少一种加热至从约35℃一直到约40℃的温度。在一些实施方案中，标本加工装置可将样品或染色组合物加热如本文所指出的时间段，例如10分钟至40分钟。在一个实施方案中，标本加工装置将生物样品或抗酸染色组合物温育约12分钟。在另一个实施方案中，标本加工装置将生物样品或抗酸染色组合物温育约16分钟。在再另一个实施方案中，标本加工装置将生物样品或抗酸染色组合物温育约20分钟。
在一些实施方案中，接着在进一步加工如从载玻片除去或洗涤抗酸染色组合物之前，允许标本冷却。在一些实施方案中，载玻片加工装置可提供从约1分钟一直到约20分钟的“冷却”时间。在一些实施方案中，冷却时间持续时间为约8分钟。
标本加工装置还可被进行配置以在将抗酸染色组合物分配至生物样品之前和之后都应用其他流体和/或试剂。实际上，标本加工装置可以向标本应用各式各样的物质，包括，但不限于，染色剂、探针、试剂、漂洗物和/或调节剂，或本文所述的任何其他流体和/或试剂。探针可以是附着至可检测标记的分离的核酸或分离的合成寡核苷酸。标记可以包括放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。在一些实施方案中，标本加工装置例如通过与特异性于特定靶细菌的一种或多种抗体一起温育并使用标记（例如抗体上的标记或通过使用标记的第二抗体）进行检测来促进进行免疫测定。示例性可检测标记包括荧光团、半抗原、酶、放射性标记和本领域已知的其他标记。
标本加工装置可以进一步适合于将脱色溶液第二染色剂应用于生物样品。在一些实施方案中，脱色溶液可包含醇和酸。在美国专利No. 9,023,615中公开了合适的脱色组合物及其应用方法（手动和通过使用自动标本加工装置两者），其公开内容特此整体引入本文作为参考。在一些实施方案中，标本加工装置可以应用包含染料和弱酸的第二染色剂。在一些实施方案中，将约200微升至约500微升的脱色溶液和/或第二染色剂分配至生物样品。
在一些实施方案中，标本加工装置促进其他微生物学测定。例如，样品可以接触一种或多种其他染料，例如一种或多种以下染色剂：爱茜蓝（Alcian Blue）、用于过碘酸希夫（PAS）的爱茜蓝、爱茜黄（Alcian Yellow）、刚果红（Congo Red）、淀粉酶（Diastase）、弹性（Elastic）、吉姆萨、Grocott氏六亚甲基四胺银染色剂（Grocott's Methenamine Silverstain）（GMS）II、铁、Jones亮绿（Jones Light Green）、Jones、用于PAS的亮绿、黏蛋白胭脂红（Mucicamine）PAS、网状组织（Reticulum）、Steiner II、三色蓝（Trichrome Blue）和三色绿（Trichrome Green）。
在一些实施方案中，如果标本是石蜡中包埋的样品，则可以使用一种或多种适当的脱蜡流体用标本加工装置将样品脱蜡。在一些实施方案中，并且在标本加工装置的废物去除器设备去除一种或多种任何脱蜡流体之后，可以接连地将任意数目的物质应用于标本。所述物质可以用于预处理（例如，蛋白质交联、暴露核酸等）、变性、杂交、洗涤（例如，严格洗涤）、检测（例如，将肉眼可见的或标记分子与探针连接）、扩增（例如，扩增蛋白质、基因等）、复染、盖片等。
根据本文描述的程序染色的生物标本的分析可以是自动的，并且可以通过计算机分析和/或图像分析***来促进。在一些实施方案中，光学显微镜术用于图像分析。某些公开的实施方案涉及获得数字图像。这可以通过将数码相机偶联到显微镜（例如明视场显微镜）来完成。使用图像分析软件分析染色的样品获得的数字图像。还可以定性和半定量评价样品。定性评估包括评估染色强度、鉴定染色中涉及的阳性染色的细胞和胞内区室以及评价总的样品或载玻片质量。对测试样品进行单独评价，且这种分析可以包括与已知平均值的比较，以确定样品是否代表异常状态。
试剂盒
本公开内容还提供了包括抗酸染色组合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括抗酸染色组合物和额外的组分。在其他实施方案中，试剂盒包括抗酸染色组合物和脱色溶液（例如，可从Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ获得的AFB脱色剂II）或第二染料溶液（例如，可从Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ获得AFB III蓝（Blue））中的至少一种。在再其他实施方案中，试剂盒包括抗酸染色组合物、脱色溶液和第二染料溶液。在一些实施方案中，试剂盒的每个组分都被保持在单独的容器中。在实施方案中，试剂盒包括本文公开的抗酸染色组合物作为第一组合物，并且进一步包括脱色溶液和第二染料溶液，各自在单独的容器中。
在一些实施方案中，抗酸染色组合物被提供在容器中。在一些实施方案中，容器被进行配置以由标本加工装置使用。例如，容器可以是适合于供Ventana Medical Systems,Inc.设备如NexES专用染色器（“NesES SS”）或BenchMark专用染色器（“BKMKSS”）使用的容器。在一些实施方案中，将抗酸染色组合物提供在供标本加工装置里使用的分配器中。
在一些实施方案中，试剂盒还可包括一个或多个显微镜载玻片，例如适合于封固并在一些实例中固定样品的载玻片，以及盖玻片、移液管或其组合。在一些实施方案中，试剂盒可任选地进一步包括用于进行额外测定的额外试剂。例如，该试剂盒可以包括一个或多个装有其他染料、染色剂或复染剂的贮器或容器，例如包括以下染色剂中的一种或多种的容器：爱茜蓝（Alcian Blue）、用于过碘酸希夫（PAS）的爱茜蓝、爱茜黄（Alcian Yellow）、刚果红（Congo Red）、淀粉酶（Diastase）、弹性（Elastic）、吉姆萨、Grocott氏六亚甲基四胺银染色剂（Grocott's Methenamine Silver stain）（GMS）II、铁、Jones亮绿（Jones LightGreen）、Jones、用于PAS的亮绿、黏蛋白胭脂红（Mucicamine）PAS、网状组织（Reticulum）、Steiner II、三色蓝（Trichrome Blue）和三色绿（Trichrome Green）。在一个实例中，试剂盒可包括含有细菌特异性抗体的贮器或容器。在一些实例中，试剂盒包括装有标记的第二抗体（例如，用荧光团标记）的贮器或容器。在一些实施方案中，试剂盒包括用于检测生物样品中的抗酸细菌的说明书。在其他实施方案中，试剂盒包括用于与标本加工装置一起使用抗酸染色组合物的说明书。
实施例
实施例1-染色组合物比较研究
设计了研究以与传统的含酚的抗酸染色组合物对比测试现在公开的抗酸染色组合物。这个研究被设计用来证明在一定范围的TRIS碱浓度（包括0.22 w/v％（“低TRIS”）、0.32％w/v％（“标称TRIS”）和0.43 w/v％（“高TRIS”））内制备的抗酸染色组合物导致的功能性染色至少与使用含酚的抗酸染色组合物（例如Ventana AFB III，可从Ventana MedicalSystems, Inc., Tucson, Arizona, USA获得）（在下文中“AFB III”）的染色类似。
对于这个研究选择了三个表现出不同程度的AFB微生物感染的组织病例。对于每个病例，使用三组邻近切割的（near-cut）载玻片（每个病例6张载玻片=每次运行总计18张载玻片）来评估病理学家对于盲法对（blinded pairs）中一张载玻片对另一张载玻片的偏爱。将载玻片用AFB III或组合物之一染色。将染色的载玻片通过两次各自为95％试剂醇、100％试剂醇和100％二甲苯的漂洗进行脱水。将载玻片盖片。所有载玻片都成对显示，例如具有被“低TRIS”和“标称TRIS”染色的载玻片的载玻片对，或具有被“标称TRIS”和“高TRIS”染色的载玻片的载玻片对。通过在不同标本加工***即Benchmark专用染色剂（SpecialStains）自动染色器（BMKSS）和NexES专用染色器（Special Stainer）（可从VentanaMedical Systems, Inc. Tucson, AZ获得）上每次运行内通过/失败的载玻片总数目计数确定“通过”/“失败”的判定，通过判断载玻片对中的一张载玻片相对于所述对中的另一张载玻片是优选的还是不是优选的来确定的通过/失败。
对于BMKSS，每个病理学家每个高TRIS-标称TRIS（即 0.32w/v％）对通过18/18张载玻片，而对于低TRIS-标称TRIS对则各通过17/18张载玻片（参见图1）。根据病理学家的评论，单张失败的载玻片似乎是脱色剂未与针吸活组织检查大小的组织接触的结果，而不是由于无酚染色剂组合物本身的失败。对于NexES SS，所有载玻片均通过（参见图2）。病理学家还评价了用“标称TRIS”染色的载玻片和用AFB III染色的那些载玻片。如图3中所举例说明的，病理学家更喜欢用“标称TRIS”染色的载玻片。
实施例2-加速稳定性研究
设计了研究以使用三种用每种可用的供应商批次原成分制备的DLs确立在60℃的加速条件下的新抗酸染色组合物的原始产品测年（initial product dating）（IPD）。所述研究没有改变个别抗酸染色组合物组分浓度。
材料
组织要求：这个研究中使用的每个组织块对于AFB-阳性率（positivity）均合格，同时从每个块总计切割54-100张载玻片（数目取决于特定块，包括多余的切片）。总计183张载玻片被染色，包括重新运行。
组织切片分类：将每个块的第一张和每第25张载玻片用在销售的AFB染色试剂盒进行染色，以确定在即将到来的时间点登记参加（enrollment）的适当性。所有载玻片均显示AFB-阳性微生物的存在并通过。然后将第0天的载玻片染色并评价。阅读第0天的载玻片后，由于染色不一致和组织质量问题，决定从研究中去除第3块。将第3块用第5块代替，其被打算万一在最初块（1-4）中发现了这种不一致时作为备用。
对照：在研究的第0天制备用于在每个指定的每周时间点的成对比较的基线对照。这需要将总计45张载玻片染色作为对照。然而，在第0天之后，必须对9张额外的第0天载玻片进行染色，这是因为后面发现由于贴标签问题，它们已接受了错误的设计批次。将适当的参考用正确的设计批次染色并如所预期的那样使用。使用新的参考载玻片是合适的，这是因为使用在环境条件下贮藏的溶液进行的分析测试和功能性染色显示，在研究过程中，一直到发现错误时（1月），AFB染色剂的性能或组成均未发生变化。
统装（Bulk）试剂：使用了以下统装试剂材料。对这些试剂没有批次限制。
BenchMark专用染色剂液体盖玻片（Special Stains Liquid Coverslip），P/N860-034
BenchMark专用染色剂两部分洗涤试剂盒（Special Stains Two Part Wash Kit），P/N860-040
BenchMark专用染色剂脱蜡溶液（Special Stains Deparaffinization Solution）（10X），P/N 860-036
设备
硬件/软件：在这项研究中，使用单个正确维护的BMKSS仪器进行所有功能性染色。
环境室温度：在测试期间使用在校准范围以内的适当的传感器来跟踪和记录实际温度。所有温度条件均保持在5℃的变化范围内。于在这项研究过程中保持的最大温度条件60℃贮藏的AFB染色剂设计批次用于确立原始产品测年。在这项研究中包括其他温度条件以确保在各式各样的条件内正确的性能，但不是用于确立产品测年。
加速稳定性设计
当使用Arrhenius模型时，假定试剂降解是一个简单的过程，其基本上取决于所考虑的温度范围内的一级动力学。同样，Q规则对于鉴定用于加速稳定性研究的合适温度是有用的（参见Anderson & Scott, Clin. Chem. 1991, 37, 398）。Q规则指出，当贮藏温度改变10℃时，产品降解速率以恒定的倍数改变（对于每10 C的温度升高，反应速率大约加倍）。Q的值一般设置为2、3或4。2的Q值是最保守的模型，其用于这项研究（参见表3）。
“测试条件”定义为在特定应激条件下的特定设计批次溶液（例如：在第3周测试的于60℃的设计批次2是特定的“测试条件”）。根据接受标准，测试条件被认为通过或失败。为了使稳定性规程得以失败，两个连续的测试条件必须已经失败。除非特定测试条件在两个连续时间点对于任何一个参数均失败，否则加速稳定性测试继续，直到达到规程中指定的终点为止。
对于每种测试条件，评价了三个设计批次的试剂。将每个设计批次等分到单独的仪器试剂瓶中，且每个设计批次的12个瓶在每种温度条件下贮藏。温度条件是-20℃、环境、40℃和60℃。这允许总计9个瓶用于测试（第0天的瓶和8个额外的瓶，每个后面的星期一瓶），从而留下三个额外的瓶用于任何预料之外的情况。每个瓶都标示有试剂信息和贮藏温度。在每个时间点从瓶中取出样品用于分析测试，并然后给瓶配备塞子和管供功能性染色之用。如果在8-周的时间点确定每个关键参数于60℃在可接受的范围内，则Arrhenius模型将预测91-周的实时稳定性。
在测试每个关键参数的情况下在第0天开始对每个设计批次的加速测试。在第0天之后，测试频率取决于被测试的参数（参见表4）。染色的每个时间点具有3个重复的载玻片。由合格的读出器检查在第0天染色的载玻片，以确定染色是否可接受。在每个时间点都进行了分析测试。
如果可将失败归因于除测试中试剂以外的任何事物，则认为运行无效（而不是失败）。实例包括但不限于：载玻片干燥、盖片失败、组织问题（降解、切片）、仪器或试剂瓶故障、规程程序设计错误或载玻片贴标签/问题。没有记录每张载玻片的有效性信息。
结果与讨论
使用加速稳定性测试来确立所公开的无酚AFB染色剂的原始产品测年，所述无酚AFB染色剂含有弱碱（例如TRIS碱）和表面活性剂作为亲脂剂且意图是取代在销售的含有酚且获得自外部供应商的AFB染色剂。在整个8-周加速稳定性研究的过程中（相当于91周），在从-20℃一直到+60℃的每个温度条件下贮藏的设计批次AFB染色剂溶液的性能都相当，如由病理学办公室（Pathology Office）和AFB的合格读出器所独立评价的。除这些结果以外，在这项研究期间进行的分析测试（关于每种方法，参见表2）证明，在任何温度条件下，没有参数接近预定的失败极限。对于pH，从第0天起，所有测量结果都在一个pH单位内（图4）。类似地，HPLC和UV-Vis数据证明可溶性品红染料浓度没有显著变化（图5-8）。最后，在这项研究中评价的任何条件下，均未观察到染料降解（氧化）的迹象，这对于含有KOH碱而不是TRIS碱的AFB染色剂制剂的以前重复已经观察到。
结论
在这项研究过程期间对于四种测试的条件（AFB染色剂设计批次溶液达8周的-20℃、环境、+40℃和+60℃贮藏）中的任何一种进行的任何分析测试或功能性染色中均未接近失败极限。使用对于条件60℃的Arrhenius模型，生成的数据支持最多到91周的原始产品测年。总的说来，在使处于物理失败或化学失败应激状态的任何条件下，对于所公开的AFB溶液都没有观察到降解的迹象。这项研究通过显示所公开的AFB染色剂制剂的适当功能确立了原始产品测年。
表2：测试的加速稳定性参数
参数 方法 描述
1 染料浓度/降解产物 HPLC、MS、UV/vis 测量溶液中NF浓度的可能变化。检测NF的已知降解产物
2 pH pH 跟踪指示化学或物理变化的可能pH变化
3 功能性染色 BMKSS 染色组织以评价性能
表3：加速稳定性Q ＝ 2（活化能＝ 12kcal/mol或50kJ/mol）。实时稳定性测年由60℃条件确定。其他温度供参考。
Figure 372215DEST_PATH_IMAGE002
表4：总测试时间表。在每个时间点都发生分析测试。对于所有条件，染色均在时间点零发生，然后如表中所示。所述时间表适用于三个设计批次中的每一个。
Figure 542165DEST_PATH_IMAGE003
额外的实施方案
在一些实施方案中，染色***包括除本文所述的那些以外的部件。可以并入本***和方法中的额外的实施方案、特征、***、设备、材料、方法和技术在美国专利Nos. 8,911,815；9,498,791；9,618,430；7,468,161；和6,352,861中描述，其公开内容特此整体引入本文作为参考。染色***的再额外的部件在美国专利Nos. 7,303,725、8,048,373、9,528,918和9,192,935中描述，其公开内容特此整体引入作为参考。
在一些实施方案中，染色***包括统装流体容器（例如，以在分配或应用于样品之前容纳本文所述的任何溶液）。在一些实施方案中，载玻片加工装置在一些实施方案中进一步包括许多额外的染色构件和被进行配置以独立地控制每个染色构件的控制器。
在一些实施方案中，染色***可以包括支撑许多工作站的框架，所述工作站包括例如排列在塔中的一个或多个干燥或烘烤操作台或构件、去蜡或脱蜡操作台或构件、一个或多个染色操作台或构件以及盖片操作台或构件。在一些实施方案中，靠近塔设置有运输和升降机机构，用于将设计为携带许多个别的带有标本的载玻片的载玻片盘从盘贮藏操作台运输通过干燥/烘烤、去蜡、染色和盖片工序。
在一些实施方案中，盘贮藏车库（garage）或操作台包括一对支柱，其带有许多用于容纳载玻片盘的彼此垂直隔开的架子或滑轨。在一些实施方案中，贮藏操作台或车库包括枢轴安装的门，从而提供到第一架子位置的通路（为清楚起见，已省略了车库的外部壳或盖）。通常表示为包括由一对由驱动马达和传动装置驱动的可旋转安装的主动轮的盘驱动组件设置在第一架子位置的下面，用于将盘移入和移出入口。
在一些实施方案中，载玻片盘包括具有大概矩形样式的盘状物或载玻片盘，包括底壁、相对的侧壁和相对的端壁。载玻片盘一般通过常规的注射模塑法使用打算供这种用途使用的合成聚合物形成，这在本领域中是众所周知的。
在一些实施方案中，盘包括标本载玻片支撑支架，用于将标本载玻片固定在同一平面中的基本水平位置。如将在下文所述的，将所有载玻片固定在同一平面上便于烘烤和干燥，并且如将在下文所述的还防止在脱蜡和染色过程中载玻片的交叉污染。在一些实施方案中，支架包括许多载玻片弹簧支撑物，其一旦放置在载玻片盘上，就限制了标本载玻片的轴向、横向和垂直运动。在一些实施方案中，支架以足够的高度被支撑在盘底部上面，以阻止或防止在标本载玻片底部与盘底部之间形成的膜或气泡的形成。在一些实施方案中，载玻片弹簧支撑物通过在标本载玻片的相对边缘上施加力来将各个标本载玻片固定就位。载玻片盘的底部朝着中部倾斜，以便于排放到中央位置用于排空去蜡流体和染色剂，如将在下文中详细描述的。在一些实施方案中，盘允许通过干燥/烘烤、脱蜡、染色和盖片的步骤自动处理许多标本载玻片。在一些实施方案中，盘包括防溅围栏，并且被布置成容纳布置在大概水平的两个载玻片宽且八个载玻片高的格子中的16个标本载玻片。
染色构件可以包括至少一个加热元件，其被进行定位以传导地加热第一侧壁、第二侧壁或两者。载玻片夹具可用于在横过标本操纵液体带的同时加热载玻片、标本和/或液体。
在一些实施方案中，控制器包括一个或多个存储器和可编程序的处理器。存储器存储第一程序指令序列和第二程序指令序列。可编程序的处理器被进行配置以执行第一程序指令序列，以使用第一液体处理载玻片上的标本，并且被进行配置以执行第二程序指令序列，以使用与第一液体不同的第二液体处理标本。在一些实施方案中，可编程序的处理器被进行配置以执行第一程序指令序列以加热载玻片，并且控制器被进行配置以执行第二程序指令序列以将载玻片加热至第二温度，所述第二温度与所述第一温度不同。
在一些实施方案中，控制器被进行配置以执行第一程序指令序列，以操作分配设备以第一速率将第一液体递送至载玻片。控制器被进一步进行配置以执行第二程序指令序列，以操作分配设备以不同于第一速率的第二速率将第二液体递送至载玻片。
这个说明书中提及的和/或申请数据表中列举的所有美国专利、美国专利申请公开物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开物均整体引入本文作为参考。如果需要，则可以修改实施方案的各方面，以采用各专利、申请和公开物的概念以提供再进一步的实施方案。
尽管已经参考许多举例说明性实施方案描述了本公开内容，但是应当理解，本领域技术人员可以设计出许多其他修改和实施方案，它们将落入本公开内容原理的精神和范围内。更特别地，在不背离本公开内容的精神的情况下，在前述公开内容、附图和所附权利要求的范围内，主题组合布置的组成部分和/或布置中的合理变化和修改是可能的。除了组成部分和/或布置的变化和修改之外，备择用途对本领域技术人员而言也是明显的。

Claims (75)

1.包含品红、碱、表面活性剂和醇的抗酸染色组合物，其中所述组合物中的品红的量按组合物总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75 w/v％，且其中所述抗酸染色组合物不含酚。
2.权利要求1的抗酸染色组合物，其中所述组合物中碱的量按组合物总体积计从约0.05 w/v％一直到约0.5 w/v％。
3.权利要求1或2的抗酸染色组合物，其中所述碱是氢氧化物。
4.权利要求1或2的抗酸染色组合物，其中所述碱是弱碱。
5.权利要求4的抗酸染色组合物，其中所述弱碱具有从约8一直到约20的pKa。
6.权利要求5的抗酸染色组合物，其中所述碱是三(羟甲基)氨基甲烷。
7.前述权利要求任一项的抗酸染色组合物，其中所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
8.权利要求7的抗酸染色组合物，其中所述非离子型表面活性剂是脂肪醇乙氧基化物。
9.权利要求8的抗酸染色组合物，其中所述非离子型表面活性剂是C8-C18脂肪醇乙氧基化物。
10.权利要求9的抗酸染色组合物，其中所述C8-C18脂肪醇乙氧基化物包含小于12摩尔的环氧乙烷。
11.前述权利要求任一项的抗酸染色组合物，其中所述组合物中表面活性剂的量按组合物的总体积计从约0.5 w/v％一直到约4 w/v％。
12.前述权利要求任一项的抗酸染色组合物，其中所述品红是可溶性品红。
13.前述权利要求任一项的抗酸染色组合物，其中所述抗酸染色组合物的10％水溶液具有从约4一直到约6的pH。
14.前述权利要求任一项的抗酸染色组合物，其中所述酸染色组合物稳定至少420天。
15.前述权利要求任一项的抗酸染色组合物，其进一步包含至少一种添加剂。
16.前述权利要求任一项的抗酸染色组合物，其中所述碱选自不与品红反应的碱。
17.前述权利要求任一项的抗酸染色组合物，其中所述抗酸染色组合物基本上由下述组成：（a）品红，其量按组合物总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75 w/v％；（b）碱，其量按组合物总体积计从约0.05 w/v％一直到约0.5 w/v％；和（c）表面活性剂，其量按组合物总体积计从约0.5 w/v％一直到约4w/v％。
18.权利要求17的抗酸染色组合物，其中所述表面活性剂是C8-C18脂肪醇乙氧基化物。
19.权利要求17的抗酸染色组合物，其中所述碱是三(羟甲基)氨基甲烷。
20.权利要求19的抗酸染色组合物，其中所述碱的量按组合物总体积计从约0.15 w/v％一直到约0.4 w/v％。
21.用权利要求1-20任一项的抗酸染色组合物染色的生物样品。
22.权利要求21的生物样品，其中所述样品不含酚。
23.包含权利要求1-20任一项的抗酸染色组合物的容器。
24.***，其包括适合于将权利要求1-20任一项的抗酸染色组合物应用到置于基底上的生物样品的分配器。
25.试剂盒，其包括（a）包含权利要求1-20任一项的抗酸染色组合物的第一组合物；和（b）第二组合物，其选自（i）脱蜡溶液；（ii）包括去污剂的洗涤溶液；（iii）包括低级醇和酸的脱色溶液；和（iv）包含染料和弱酸的第二染料溶液。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述第二组合物是脱色溶液。
27.权利要求25或26的试剂盒，其中所述第一组合物、所述第二组合物和所述第二染料各自在单独的容器中。
28.对生物样品中的抗酸性生物进行染色的体外方法，所述方法包括以下步骤：
（a）提供来自患有或怀疑患有抗酸性生物感染的主体的生物样品；
（b）将权利要求1-20任一项的抗酸染色组合物应用于所述生物样品；和
（c）将所述抗酸染色组合物或所述生物样品中的至少一种加热至从约30℃一直到约45℃的温度。
29.权利要求28的方法，其中将所述生物样品与所述抗酸染色组合物温育从约10分钟一直到约40分钟的时间段。
30.权利要求29的方法，其中将所述生物样品与所述抗酸染色组合物温育从约12分钟一直到约24分钟的时间段。
31.权利要求28-30任一项的方法，其中将约100微升至约500微升的所述抗酸染色组合物应用于所述生物样品。
32.权利要求28-31任一项的方法，其中将约200微升的所述抗酸染色组合物应用于所述生物样品。
33.权利要求28-32任一项的方法，其进一步包括在应用所述抗酸染色组合物之前对所述生物样品进行脱蜡的步骤。
34.权利要求28-33任一项的方法，其进一步包括以下步骤：
（d）将包括醇和酸的脱色溶液应用于所述生物样品；和
（e）将包含染料和弱酸的第二染色剂应用于所述生物样品。
35.权利要求28-34任一项的方法，其进一步包括对所述生物样品进行成像的步骤。
36.权利要求28-35任一项的方法，其中所述抗酸染色组合物用自动染色***应用。
37.用自动染色装置对置于载玻片上的生物样品中的抗酸性生物进行染色的方法，其包括：
（a）将所述生物样品装载到所述自动染色装置中，
（b）将权利要求1-20任一项的抗酸染色组合物分配到所述生物样品上；和
（c）从载玻片上除去所述抗酸染色组合物。
38.权利要求37的方法，其中所述生物样品来自患有或怀疑患有抗酸性生物感染的主体。
39.权利要求37或38的方法，其中将约100微升至约500微升的所述抗酸染色组合物应用于所述生物样品。
40.权利要求37-39任一项的方法，其中将所述生物样品与所述抗酸染色组合物一起温育从约10分钟一直到约30分钟的时间段。
41.权利要求40的方法，其中所述生物样品于从约30℃一直到约45℃的温度温育。
42.权利要求37-41任一项的方法，其中所述方法进一步包括将包括醇和酸的脱色溶液分配到所述生物样品上。
43.权利要求37-42任一项的方法，其中所述方法进一步包括将包含染料和弱酸的第二染色剂组合物分配到所述生物样品上。
44.权利要求37-43任一项的方法，其中所述方法进一步包括在应用所述抗酸染色组合物之前对所述样品进行脱蜡。
45.权利要求37-44任一项的方法，其中所述方法进一步包括将盖玻片应用于置于载玻片上的所述生物样品。
46.装置，其包括至少一个被进行配置以分配权利要求1-20任一项的抗酸染色组合物的分配器。
47.权利要求46的装置，其进一步包括至少一个适合于加热显微镜载玻片的组件。
48.检测生物样品中的抗酸性生物的方法，其包括：
（a）将抗酸染色溶液应用于所述生物样品，所述抗酸染色溶液包含品红、碱、表面活性剂和醇，其中组合物中品红的量按组合物总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75 w/v％，且其中所述抗酸染色组合物不含酚；和
（b）将所述染色溶液或所述生物样品中的至少一种加热到从约30℃一直到约45℃的温度。
49.权利要求48的方法，其中将所述生物样品与所述抗酸染色溶液一起温育从约10分钟一直到约40分钟的时间段。
50.权利要求49的方法，其中将所述生物样品与所述抗酸染色溶液一起温育从约12分钟一直到约24分钟的时间段。
51.权利要求48-50任一项的方法，其中将约100微升至约500微升的所述抗酸染色溶液应用于所述生物样品。
52.权利要求48-51任一项的方法，其中将约200微升的所述抗酸染色溶液应用于所述生物样品。
53.权利要求48-52任一项的方法，其中所述抗酸染色溶液的10％水溶液具有从约4一直到约6的pH。
54.权利要求48-53任一项的方法，其中所述品红以按组合物的总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75w/v％的量存在；所述碱以按组合物总体积计从约0.05 w/v％一直到约0.5 w/v％的量存在；且所述表面活性剂以按组合物总体积计从约0.5 w/v％一直到约4 w/v％的量存在。
55.权利要求54的方法，其中所述碱是三(羟甲基)氨基甲烷。
56.权利要求54的方法，其中所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
57.权利要求56的方法，其中所述非离子型表面活性剂是脂肪醇乙氧基化物。
58.权利要求57的方法，其中所述非离子型表面活性剂是C8-C18脂肪醇乙氧基化物。
59.权利要求58方法，其中所述C8-C18脂肪醇乙氧基化物包含小于12摩尔的环氧乙烷。
60.权利要求48-59任一项的方法，其进一步包括在应用所述抗酸染色溶液之前对所述生物样品进行脱蜡。
61.权利要求48-60任一项的方法，其进一步包括以下步骤：（i）将包括醇和酸的脱色溶液应用于所述生物样品；和（ii）将包含染料和弱酸的第二染色剂应用于所述生物样品。
62.权利要求61的方法，其进一步包括对所述生物样品进行成像的步骤。
63.权利要求48-62任一项的方法，其中所述染色溶液用自动染色***应用。
64.用自动染色装置对置于载玻片上的样品进行染色的方法，其包括：
（a）将抗酸染色溶液分配到所述样品上，所述染色溶液包含（i）以按组合物总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75 w/v％的量存在的品红；（ii）以按组合物总体积计从约0.05w/v％一直到约0.5 w/v％的量存在的碱；和（iii）以按组合物总体积计从约0.5 w/v％一直到约4w/v％的量存在的表面活性剂，且其中所述抗酸染色溶液不含酚；和
（b）从载玻片上除去所述抗酸染色溶液。
65.权利要求64的方法，其中将约100微升至约500微升的所述抗酸染色溶液应用于所述生物样品。
66.权利要求64或65的方法，其中将所述样品与所述抗酸染色溶液一起温育从约10分钟一直到约30分钟的时间段。
67.权利要求66的方法，其中所述样品于从约30℃一直到约45℃的温度温育。
68.权利要求64-67任一项的方法，其中所述方法进一步包括将包括醇和酸的脱色溶液分配到所述样品上。
69.权利要求64-68任一项的方法，其中所述进一步包括将包含染料和弱酸的第二染色剂组合物分配到所述样品上。
70.权利要求64-69任一项的方法，其中所述方法进一步包括在应用所述抗酸染色组合物之前将所述样品进行脱蜡。
71.权利要求64-70任一项的方法，其中所述方法进一步包括将盖玻片应用于置于载玻片上的所述样品。
72.装置，其包括至少一个分配器，所述分配器被进行配置以将不含酚的抗酸染色溶液分配到显微镜载玻片上，其中所述抗酸染色溶液包含（a）品红，其量按组合物总体积计从约0.75 w/v％一直到约2.75 w/v％；（b）碱，其量按组合物总体积计从约0.05 w/v％一直到约0.5 w/v％；和（c）表面活性剂，其量按组合物总体积计从约0.5 w/v％一直到约4w/v％。
73.权利要求72的装置，其进一步包括至少一种适合于加热所述显微镜载玻片的组件。
74.权利要求72或73的装置，其中所述碱是三(羟甲基)氨基甲烷。
75.权利要求72-74任一项的装置，其中所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
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