CN111485002A - 一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法及其应用，包括通过CRISPR/CAS9技术敲除小鼠染色体中编码白介素‑2受体的gamma链的基因的步骤，选择白介素‑2受体的gamma链的基因的外显子1和2作为敲除位点，Cas9信使RNA和引导RNA被共同通过显微注射进小鼠的受精卵内。本发明的重度免疫缺陷小鼠，不能产生T，B及NK免疫细胞，从而为人源造血干细胞的移植创造最大的便利条件。
Description
技术领域
本发明涉及一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
人类的免疫应答需要在体内进行，由于受到伦理限制，不能够直接以人为实验对象。啮齿类动物是广泛应用于实验研究的小动物模型，目前免疫***发育分化及功能研究大多来源于这些模型，但是因为种属特异性的存在，啮齿类动物模型得到的结论并不能直接推导于人类免疫***。人类的造血免疫功能研究、感染类疾病、自身免疫病以及肿瘤研究都难以实现体内动态观察。一些研究人员则以灵长类动物为替代对象，试图弥补人类与啮齿类动物之间巨大的种属差异，但是因实验对象操作复杂，经济成本高，并不利于推广。黑猩猩、长臂猿等灵长类动物虽然能感染HIV，但是感染后并不发病，而且属濒危动物，逐渐被禁止使用。因此，亟需一种能够应用于人类免疫应答的小动物模型，免疫***人源化小鼠便应运而生。免疫***人源化小鼠是指在免疫缺陷小鼠植入人的造血细胞、淋巴细胞或组织而具有人的免疫功能的小鼠模型，为了解人类免疫***及其免疫应答的重要工具。
由于普通小鼠中存在的免疫细胞会排斥外来移植的人源造血干细胞或淋巴细胞，为了制作免疫***人源化的小鼠，需要拥有有足够免疫缺陷程度的小鼠。早在1988年，Mccune等发现在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中植入人胎肝干细胞、胎胸腺和胎***可以支撑人源T细胞和B细胞的重建。但是由于SCID小鼠较强的NK细胞功能对外源细胞的排斥作用，及随年龄增长出现小鼠T、B细胞，即发生“渗漏现象”等因素，均极大程度的限制了重建。随后通过SCID缺陷小鼠与NOD背景小鼠回交，产生了NOD/SCID小鼠，该小鼠NK细胞活性及天然免疫细胞的功能更低，可以更好地支持重建，所以在接下来的很长一段时间里，NOD/SCID小鼠被认为是用于人源化重建的最理想受者小鼠。然而，当研究者用造血干细胞进行免疫重建时，残存的NK细胞和天然免疫细胞活性，仍然成为了难以跨越的障碍。因此，为了制作更加完善的人源化免疫***小鼠，需要克服目前免疫缺陷动物中过强的NK细胞功能。而NK细胞发育成熟过程中，IL-2是起到主要作用的细胞因子。对NOD/SCID小鼠的IL-2受体的gamma亚基进行敲除，其体内的T，B和NK细胞基本完全缺失或失去功能，巨噬细胞及DC细胞及补体***的功能也大幅减弱，且成年后不再会发生免疫渗漏问题，使其成为目前免疫缺陷程度最高的小鼠。且此重度免疫缺陷小鼠寿命比普通NOD/SCID小鼠长30-50％，达1.5-2年，极大的延长了实验的观察期。以上优点，使得此重度免疫缺陷小鼠对人源组织几乎没有排斥反应，使其成为目前最适合作为人源组织/细胞移植的实验动物，包括人源化动物模型(CD34+，BLT及PBLS人源化小鼠)，肿瘤移植及肿瘤干细胞研究(CDX，PDX)，人造血和免疫***研究和人类感染性疾病(HIV，HBV)的动物模型首选。
如果通过基因敲入的方法，采用人的NGF基因在小鼠基因组中定位替换鼠的NGF基因，可以使人NGF基因在小鼠内源性NGF的表达调控序列控制下表达，在纯化时也不会有鼠源NGF的污染。但是利用常规基因敲入技术获得NGF基因敲入的小鼠存在很多的困难或风险，例如，在基因敲入的过程中需要在ES内发生2次同源重组，经过2次筛选，一次正的筛选，一次负的筛选，才能获得阳性克隆。同源重组载体进入ES细胞内后，可以随机***小鼠基因组的任何序列，造成假阳性结果，导致小鼠内源性NGF基因不能正确的删除。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，
本发明提供一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于：
包括通过CRISPR/CAS9技术敲除小鼠染色体中编码白介素-2受体的gamma链的基因的步骤，
选择白介素-2受体的gamma链的基因的外显子1和2作为敲除位点，
Cas9信使RNA和引导RNA被共同通过显微注射进小鼠的受精卵内。
进一步，本发明的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，还具有这样的特征：基因敲除小鼠使用PCR及基因测序进行基因型分析，筛选出目标小鼠。
进一步，本发明的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，还具有这样的特征：与正链基因相匹配的引导RNA1序列为:CGGCTCTCACTAGGGTCAACAGG，
与反链基因相匹配的引导RNA2序列为:AGCTGGCTACCCACTTGATTGGG。
进一步，本发明的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，还具有这样的特征：
显微注射流程：
6-1，第一天，选取3-4周龄NOD/SCID雌性小鼠，作为供体，每只小鼠腹腔注射5IUPMSG；47～48小时后，每只小鼠腹腔注射5IU HCG，并与性成熟的正常公鼠合笼交配；
6-2，第二天进行***栓检查，并将供体雌鼠拿出用于受精卵采集，同天准备好适龄的***母鼠；
6-3，第四天，安乐死供体雌鼠，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶～0.3mg/M2液中，显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，洗涤和采集受精卵，最终将受精卵放在5％CO2，37℃培养箱培养待用；
6-4，第四天，在显微镜下观察，挑选形态正常，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵用于显微注射；
6-5，通过加样器，将混合的Cas9和引导RNA加入到注射针内；安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵；
6-6，200-400倍镜下进行显微注射，将混合的Cas9和引导RNA注射到受精***质中；注射400枚左右受精卵，注射完毕后，放入5％CO2，37℃培养箱培/0.5-1h，筛选掉即时死亡的受精卵；
6-7，将受体***鼠麻醉，手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口，将注射后的受精卵移植到***鼠输卵管内，每只母鼠移植20-30枚注射后受精卵；
6-8，移植完毕后，将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤，将小鼠放到干净的笼盒内，待苏醒后，转移到动物饲养间饲养；
6-9，定期观察手术后***鼠的健康和怀孕情况；手术后19～21天母鼠分娩，待幼崽出生2-3周后，剪耳、编号，剪尾，进行PCR和测序鉴定；
6-10，F0小鼠出生后，进行同胞交配，将新生的F1代小鼠剪鼠尾进行裂解后，用引物序列1和引物序列2进行PCR检测。
进一步，本发明的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，还具有这样的特征，还包括：
基因鉴定的步骤：
1.样品处理：
1)剪下2-5mm长的鼠尾后保存于离心管中，3000rmp(900g)离心1min，使鼠尾离到管底，
2)每管加入98μLTriton裂解液+2μL的20mg/mL蛋白酶K共100μL的混合物，
3)检查每管内裂解液的量并确保样品淹没在裂解液中，放入烘箱，56℃裂解过夜，
4)98℃加热13min，灭活蛋白酶K，
5)轻弹管底混匀，13000rmp等效16200g离心3min，
6)取2.5μL上清做为模板进行PCR鉴定，
2.PCR产物判断：
1)在PCR产物的电泳条带中，小鼠产物中有680bp片段的，为IL-Rg敲除成功的小鼠，
2)在敲除成功的小鼠中，还同时有引物序列2的191bp产物片段的，为杂合子小鼠，则剩余小鼠为纯合子。
进一步，本发明的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，还具有这样的特征：PCR鉴定的过程如下：
小鼠白介素2受体gamma链基因座的目标区域通过特定的引物进行PCR扩增，并对扩增产物测序进行验证，保证敲除位置正确，
PCR扩增所用引物如下：
引物序列1：
小鼠白介素2受体gamma链引物-正向:5’-GACCAGTTTGTGGGTTACGGG-3’
小鼠白介素2受体gamma链引物-反向:5’-CTGGACAACAAATGTCTGGTAGAG-3’
引物序列2：
小鼠白介素2受体gamma链引物-正向:5’-GAGGAAGGCTATGGGGAAAG-3’
小鼠白介素2受体gamma链引物-反向:5’-GGTGTTCAGGGGCTGTAGAA-3’。
进一步，本发明的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，还具有这样的特征，还具有：
突变型基因片段的测序引物：
R1:5’-CTGGACAACAAATGTCTGGTAGAG-3’。
进一步，本发明的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，还具有这样的特征，在PCR产物判断步骤后，还包括步骤：
通过流式细胞术检测基因敲除纯合子小鼠外周血中淋巴细胞，包括T细胞、B细胞和NK细胞的数量和占比。
本发明还提供一种人源化免疫***小鼠的制备方法，使用上述任意一项所述的方法所制备的重度免疫缺陷的转基因小鼠，其特征在于，还包括步骤：
使用重度免疫缺陷小鼠制作，需选用新生小鼠，或年龄为1至5周龄的NPLG小鼠，小鼠进行全身辐照清髓，放射源是X射线、或者Co60/Cs137来源的Gamma射线，射线的剂量为0.5-3Gy每只小鼠，或者通过给予化疗药物来代替辐照，
经辐照或化疗药物处理后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞，注射剂量为1*104～1*106每只小鼠，根据前处理情况，包括辐照剂量及周龄进行调整，
干细胞接种16周后，对该人源化免疫***小鼠的外周血中，人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25％，则说明造模成功。
本发明还提供上述方法制备的人源化免疫***小鼠在肿瘤免疫治疗单抗的药效评价中的应用。
发明的有益效果：本发明的重度免疫缺陷小鼠，不能产生T，B及NK免疫细胞，从而为人源造血干细胞的移植创造最大的便利条件。同时在该小鼠上进行人源造血干细胞的移植测试，观察人源免疫细胞的发育。最终利用发育好的人源化免疫***小鼠进行肿瘤免疫治疗药物的药效测试。
附图说明
图1是白介素2受体gamma链基因座在基因组上的位置。
图2A和图2B是PCR鉴定的产物。
图3是流式细胞术检测此基因敲除纯合子小鼠外周血中淋巴细胞，包括T细胞，B细胞和NK细胞的数量和占比。
图4A、图4B、和图4C是人源化免疫***小鼠造模成功后，流式检测的数据。
图5是人源化免疫***小鼠用于肿瘤免疫治疗单抗的药效评价的结果曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施方式来对本发明的技术方案做进一步的说明。
本实施方式通过CRISPR/CAS9技术，生产一种基于NOD/SCID小鼠的重度免疫缺陷的转基因小鼠，小鼠染色体中编码白介素-2受体的gamma链的基因被敲除，而导致该链功能丧失。该重度免疫缺陷小鼠，不能产生T,B及NK免疫细胞，从而为人源造血干细胞的移植创造最大的便利条件。同时在该小鼠上进行人源造血干细胞的移植，使人源免疫细胞在免疫缺陷的小鼠体内发育。最终利用发育好的人源化免疫***小鼠进行肿瘤免疫治疗药物的药效测试。
一、基因敲除的位点和引导RNA
1.敲除位点
1.1小鼠白介素2受体gamma链基因(基因库登记号:NM_013563.3；Ensembl数据库编号:ENSMUSG00000031304)位于小鼠X染色体上。
1.2该基因共有8个外显子，起始密码子ATG位于外显子1，终止密码子TGA位于外显子8。
1.3本次敲除将选择外显子1和2作为敲除位点。
1.4本次敲除将会构建1对引导RNA并通过测序验证序列正确。
1.5在体外转录出的Cas9信使RNA和引导RNA将被共同注射进小鼠的受精卵内。
1.6得到的基因敲除小鼠将使用PCR及基因测序进行基因型分析，以筛选出目标小鼠。
2.基因敲除
2.1原理图
白介素2受体gamma链基因座在基因组上的位置如图1所示，基因从左到右排列，总尺寸约3.88kb。图1中实心条表示开放阅读框架ORF。
2.2引导RNA目标序列
引导RNA1(与正链基因相匹配):CGGCTCTCACTAGGGTCAACAGG
引导RNA2(与反链基因相匹配):AGCTGGCTACCCACTTGATTGGG
二、显微注射流程：
1、Day 1，选取3-4周龄NOD/SCID雌性小鼠，作为供体，每只小鼠腹腔注射5IUPMSG；47～48小时后，每只小鼠腹腔注射5IU HCG，并与性成熟的正常公鼠合笼交配；
2、Day 3,第二天上午9:00前进行***栓检查，并将供体雌鼠拿出用于受精卵采集；同天准备好适龄的***母鼠。
3、Day 4，检栓当天早上，安乐死供体雌鼠，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶～0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，洗涤和采集受精卵，最终将受精卵放在5％CO2，37℃培养箱培养待用。
4、Day 4,在显微镜下观察，挑选形态正常，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵用于显微注射。
5、通过加样器，将混合的Cas9和引导RNA加入到注射针内；安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
6、200-400倍镜下进行显微注射，将混合RNA样品注射到受精***质中；注射400枚左右受精卵，注射完毕后，放入5％CO2，37℃培养箱培/0.5-1h，筛选掉即时死亡的受精卵。
7、将受体***鼠用Avertin麻醉，手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。将注射后的受精卵移植到***鼠输卵管内，每只母鼠移植20-30枚注射后受精卵。
8、移植完毕后，将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤，将小鼠放到干净的笼盒内，待苏醒后，转移到动物饲养间饲养。
9、定期观察手术后***鼠的健康和怀孕情况；手术后19～21天母鼠分娩，待幼崽出生2-3周后，剪耳、编号，剪尾，进行PCR和测序鉴定。
等F0小鼠出生后，进行同胞交配，将新生的F1代小鼠剪鼠尾进行裂解后，用引物序列1和2进行PCR，可能出现两条带，并将短片段PCR产物送测序，读取峰图，判断缺失的碱基数。
三、基因鉴定：
1.样品处理：
1)从动物房拿到剪下2-5mm长的鼠尾后保存于离心管中，3000rmp(900g)离心1min，使鼠尾离到管底。
2)每管加入100μL裂解液(98μL Triton裂解液+2μL蛋白酶K(20mg/mL))。
3)检查每管内裂解液的量并确保样品淹没在裂解液中。放入烘箱，56℃裂解过夜。
4)98℃加热13min，灭活蛋白酶K。
5)轻弹管底混匀，13000rmp(16200g)离心3min。
6)取2.5μL上清做为模板进行PCR鉴定。
2.CRISPR引起的突变测定
小鼠白介素2受体gamma链基因座的目标区域将通过特定的引物进行聚合酶链式反应PCR扩增，并对扩增产物测序进行验证，保证敲除位置正确。
引物序列1:
小鼠白介素2受体gamma链引物-正向:5’-GACCAGTTTGTGGGTTACGGG-3’
小鼠白介素2受体gamma链引物-反向:5’-CTGGACAACAAATGTCTGGTAGAG-3’
引物序列2:
小鼠白介素2受体gamma链引物-正向:5’-GAGGAAGGCTATGGGGAAAG-3’
小鼠白介素2受体gamma链引物-反向:5’-GGTGTTCAGGGGCTGTAGAA-3’
预期的PCR扩增产物尺寸：
引物：
野生型基因使用:引物序列2，产物长度为191碱基对。
杂合型基因使用:引物序列2，产物长度为191碱基对；以及及引物序列1，产物长度为680碱基对。
突变型基因使用:引物序列1，产物长度为680碱基对。
突变型基因的680碱基对片段的测序引物:
R1:5’-CTGGACAACAAATGTCTGGTAGAG-3’
PCR产物,如图2A和图2B所示。
从图2A的PCR产物的电泳条带可见，第3,5,7,8,10,13,15,16和18号小鼠产物中有680bp片段，证明这些小鼠的IL-Rg敲除成功。
如图2B，其中13,15和16号同时有Primer 2的191bp产物片段，证明这些小鼠为杂合子。
则，第3,5,7,8,10和18号小鼠为纯合子。
四、表型鉴定
通过流式细胞术检测此基因敲除纯合子小鼠外周血中淋巴细胞，包括T细胞，B细胞和NK细胞的数量和占比，其代表性结果如图3所示，可见外周血中基本没有小鼠的上述免疫细胞。相比于普通的NOD/SCID小鼠，其外周仅有部分T,B淋巴细胞缺陷。故此基因敲除小鼠免疫缺陷程度更高，非常适合于人的造血干细胞免疫重建，或用于人源移植瘤模型的构建等等。
五、人源化免疫***小鼠的制作
使用该重度免疫缺陷小鼠制作人源化免疫***小鼠，需选用新生小鼠，或年龄为1至5周龄的NPLG小鼠。为了更好的实现人源造血干细胞移植，该小鼠需要进行全身辐照清髓，其放射源可以是X射线，或Co60/Cs137来源的Gamma射线。射线的剂量为0.5-3Gy每只小鼠，根据其周龄而变化。如若没有全身辐照的条件，亦可通过给予白消安(Busulfan)0.5-10mg/kg来代替。其剂量根据周龄而调整。
经辐照或化疗药物处理后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞，注射剂量为1*104–1*106每只小鼠，根据前处理情况，包括辐照剂量及周龄进行调整。
干细胞接种16周后，对该人源化免疫***小鼠的外周血中，人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25％，则认为造模成功。其流式检测数据如图4A、图4B和图4C所示。
可见经过16周的发育，该人源化免疫***小鼠的外周血中，73％的免疫细胞已经为人源免疫细胞，其中T细胞占比17.7％，B细胞占比61％。T细胞中，CD4阳性T细胞占比53.8，CD8阳性T细胞占比38.2％，和正常人群中CD4/CD8比值接近。
六、人源化免疫***小鼠用于肿瘤免疫治疗单抗的药效评价
PD-1抗体是近年来最重要的肿瘤免疫治疗药物，其在美国及欧洲已被批准用于非小细胞肺癌的一线治疗。目前已经上市的PD-1抗体包括MSD的Keytruda及BMS的Opdivo.其两者在临床试验中均显示出了良好的针对非小细胞肺癌及黑色素瘤的疗效。
故本实验通过PD-L1高表达的人肺癌HCC827细胞系，及经过FDA及NMPA批准的抗人PD-1抗体Keytruda，来验证该人源化免疫***小鼠，对肿瘤免疫治疗抗体的药效评价。Keytruada仅能和人类的PD-1分子结合，和啮齿类动物，包括大小鼠的PD-1均没有亲和能力。
在本实验中，HCC827细胞系以RPMI-1640培养基添加10％FBS培养于含5％CO2的37℃培养箱。细胞连续培养十代之前通过皮下注射接种于hCD45>25％的CD34+人源化小鼠皮下。每只小鼠接种约1-5×106HCC-827细胞，接种体积为100μL左右。经过4周的给药治疗后，其药效如图5所示。
可见，Keytruda可以在该人源化免疫***小鼠中显著抑制肿瘤生长。
序列表
<110> 澎立生物医药（技术）上海有限公司
<120> 一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法及其应用
<130> JSP12000006
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
Claims (10)
1.一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于：
包括通过CRISPR/CAS9技术敲除小鼠染色体中编码白介素-2受体的gamma链的基因的步骤，
选择白介素-2受体的gamma链的基因的外显子1和2作为敲除位点，
Cas9信使RNA和引导RNA被共同通过显微注射进小鼠的受精卵内。
2.如权利要求1所述的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于：
基因敲除小鼠使用PCR及基因测序进行基因型分析，筛选出目标小鼠。
3.如权利要求3所述的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于：
与正链基因相匹配的引导RNA1序列为:
CGGCTCTCACTAGGGTCAACAGG，
与反链基因相匹配的引导RNA2序列为:
AGCTGGCTACCCACTTGATTGGG。
4.如权利要求1所述的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于：
显微注射流程：
6-1，第一天，选取3-4周龄NOD/SCID雌性小鼠，作为供体，每只小鼠腹腔注射5IU PMSG；47～48小时后，每只小鼠腹腔注射5IU HCG，并与性成熟的正常公鼠合笼交配；
6-2，第二天进行***栓检查，并将供体雌鼠拿出用于受精卵采集，同天准备好适龄的***母鼠；
6-3，第四天，安乐死供体雌鼠，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶～0.3mg/M2液中，显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，洗涤和采集受精卵，最终将受精卵放在5％CO2，37℃培养箱培养待用；
6-4，第四天，在显微镜下观察，挑选形态正常，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵用于显微注射；
6-5，通过加样器，将混合的Cas9和引导RNA加入到注射针内；安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵；
6-6，200-400倍镜下进行显微注射，将混合的Cas9和引导RNA注射到受精***质中；注射400枚左右受精卵，注射完毕后，放入5％CO2，37℃培养箱培/0.5-1h，筛选掉即时死亡的受精卵；
6-7，将受体***鼠麻醉，手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口，将注射后的受精卵移植到***鼠输卵管内，每只母鼠移植20-30枚注射后受精卵；
6-8，移植完毕后，将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤，将小鼠放到干净的笼盒内，待苏醒后，转移到动物饲养间饲养；
6-9，定期观察手术后***鼠的健康和怀孕情况；手术后19～21天母鼠分娩，待幼崽出生2-3周后，剪耳、编号，剪尾，进行PCR和测序鉴定；
6-10，F0小鼠出生后，进行同胞交配，将新生的F1代小鼠剪鼠尾进行裂解后，用引物序列1和引物序列2进行PCR检测。
5.如权利要求4所述的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于，还包括：
基因鉴定的步骤：
1.样品处理：
1)剪下2-5mm长的鼠尾后保存于离心管中，3000rmp(900g)离心1min，使鼠尾离到管底，
2)每管加入98μLTriton裂解液+2μL的20mg/mL蛋白酶K共100μL的混合物，
3)检查每管内裂解液的量并确保样品淹没在裂解液中，放入烘箱，56℃裂解过夜，
4)98℃加热13min，灭活蛋白酶K，
5)轻弹管底混匀，13000rmp等效16200g离心3min，
6)取2.5μL上清做为模板进行PCR鉴定，
2.PCR产物判断：
1)在PCR产物的电泳条带中，小鼠产物中有680bp片段的，
为IL-Rg敲除成功的小鼠，
2)在敲除成功的小鼠中，还同时有引物序列2的191bp产物片段的，为杂合子小鼠，则剩余小鼠为纯合子。
6.如权利要求5所述的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于，PCR鉴定的过程如下：
小鼠白介素2受体gamma链基因座的目标区域通过特定的引物进行PCR扩增，并对扩增产物测序进行验证，保证敲除位置正确，
PCR扩增所用引物如下：
引物序列1：
小鼠白介素2受体gamma链引物-正向:5’-GACCAGTTTGTGGGTTACGGG-3’
小鼠白介素2受体gamma链引物-反向:5’-CTGGACAACAAATGTCTGGTAGAG-3’
引物序列2：
小鼠白介素2受体gamma链引物-正向:5’-GAGGAAGGCTATGGGGAAAG-3’
小鼠白介素2受体gamma链引物-反向:5’-GGTGTTCAGGGGCTGTAGAA-3’。
7.如权利要求6所述的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于，还具有：
突变型基因片段的测序引物：
R1:5’-CTGGACAACAAATGTCTGGTAGAG-3’。
8.如权利要求7所述的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于，在PCR产物判断步骤后，还包括步骤：
通过流式细胞术检测基因敲除纯合子小鼠外周血中淋巴细胞，包括T细胞、B细胞和NK细胞的数量和占比。
9.一种人源化免疫***小鼠的制备方法，使用如权利要求1-8中任意一项所述的方法所制备的重度免疫缺陷的转基因小鼠，其特征在于，还包括步骤：
使用重度免疫缺陷小鼠制作，需选用新生小鼠，或年龄为1至5周龄的NPLG小鼠，小鼠进行全身辐照清髓，放射源是X射线、或者Co60/Cs137来源的Gamma射线，射线的剂量为0.5-3Gy每只小鼠，或者通过给予化疗药物来代替辐照，
经辐照或化疗药物处理后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞，注射剂量为1*104～1*106每只小鼠，根据前处理情况，包括辐照剂量及周龄进行调整，
干细胞接种16周后，对该人源化免疫***小鼠的外周血中，人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25％，则说明造模成功。
10.如权利要求9的方法制备的人源化免疫***小鼠在肿瘤免疫治疗单抗的药效评价中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202010373356.5A CN111485002A (zh) | 2020-05-06 | 2020-05-06 | 一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法及其应用 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010373356.5A CN111485002A (zh) | 2020-05-06 | 2020-05-06 | 一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法及其应用 |
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