CN111484991A - 用于病毒核酸高通量全自动化提取的试剂盒及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于病毒核酸高通量全自动化提取的试剂盒及提取方法,具体地,本发明提供了一种高效、快速的病毒核酸提取试剂盒,在裂解液中强有力的蛋白质变性剂的作用下,病毒衣壳蛋白被迅速破坏,使核酸释放出来;在高盐条件下,释放出来的核酸被吸附到磁珠上;随后通过洗涤液的作用,将蛋白质、无机盐离子和许多有机杂质去除。富集的核酸与磁珠一起加入到PCR体系中扩增检测。可用于临床多种病毒血清,血浆样本类型核酸的提取。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断领域,具体地说,本发明涉及一种用于病毒核酸高通量全自动化提取的试剂盒及提取方法。
背景技术
核酸提取是核酸检测中必不可少的环节,核酸提取质量的好坏直接关系到检测结果的成败。因此,要确保核酸检测结果的准确性,重复性和稳定性,首先要确保得到高质量的核酸。核酸提取的方法有很多,不同病原体的不同样本类型或同一病原体的不同样本类型之间核酸提取方法也不完全相同。
目前临床检测上,主要使用的核酸提取方法有煮沸法,柱提法以及磁珠法等。煮沸法操作简单,成本低,但存在检测灵敏度低,易污染,重复性差,无法自动化的缺点,渐渐不能满足临床检测发展的需求。柱提法提取的核酸纯度高,处理样本体积范围宽,与煮沸法相比,柱提法的重复性会好很多,但也存在人为因素对检测结果影响较大,通量低,无法自动化的缺点,需要专业人员才能操作。
综上所述,目前临床上病毒检测使用的核酸提取方法,煮沸法和柱提法存在以下缺点:
(1)耗时长,过程繁复,需要洗涤多遍;
(2)洗脱过程需加热,增加了气溶胶污染的风险;
(3)灵敏度不足;
(4)手动提取,人工成本高;
(5)对试验人员有一定的专业技能要求,检测结果的好坏与试验人员的操作过程有很大关系。
因此,本领域技术人员致力于开发简单方便、适用于自动化操作的核酸高通量提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种病毒核酸高通量全自动化提取的试剂盒及提取方法。
在本发明的第一方面,提供了病毒核酸提取试剂盒,所述试剂盒包括裂解液,所述裂解液包括:离液盐、硫酸铵、聚乙二醇、表面活性剂、EDTA、和异丙醇。
在另一优选例中,使用pH缓冲液配制所述裂解液。
在另一优选例中,所述裂解液中离液盐的浓度为2-5mol/L,优选为4mol/L;优选地,所述离液盐选自下组的一种或多种:硫氰酸胍、盐酸胍、和硫氰酸钾;更优选地,所述离液盐为硫氰酸胍。
在另一优选例中,所述裂解液中硫酸铵的浓度为20-200mmol/L,优选为100mmol/L。
在另一优选例中,所述裂解液中所含的聚乙二醇为平均分子量200-20000的聚乙二醇;优选为平均分子量为6000的聚乙二醇;较佳地所述裂解液中聚乙二醇的浓度为1%-10%(w/v),优选为5%(w/v)。
在另一优选例中,所述裂解液中表面活性剂的浓度为1%-20%(w/v),优选为15%(w/v);更优选地,所述表面活性剂选自下组的一种或多种:曲拉通(Triton)、十二烷基磺酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、聚醚醇、和Brij58。
在另一优选例中,所述裂解液中EDTA浓度为1mmol/L-20mmol/L,优选为15mmol/L。
在另一优选例中,所述裂解液中异丙醇的浓度为30%-50%(v/v),优选为35%(v/v)。
在另一优选例中,所述裂解液的pH为3.5-7.0,优选为4.4。
在另一优选例中,所述pH缓冲液选自下组:Tris-HCl缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、和磷酸钠缓冲液;较佳地,pH缓冲液浓度为1mmol/L-30mmol/L,优选为10mmol/L。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括洗涤液A和洗涤液B,其中,所述洗涤液A包括:表面活性剂、和氯化钠;所述洗涤液B为石蜡油。
在另一优选例中,使用Tris-HCl缓冲液配制所述洗涤液A。
在另一优选例中,所述洗涤液A中的表面活性剂选自下组的一种或多种:曲拉通(Triton)、十二烷基磺酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、聚醚醇、和Brij58(优选为曲拉通(Triton));优选地,所述表面活性剂浓度为0.1%-5%(w/v),更优选为0.5%(w/v)。
在另一优选例中,所述洗涤液A中氯化钠浓度为0.1-0.2mol/L优选为0.14mol/L。
在另一优选例中,所述洗涤液A和所述洗涤液B的体积比为3:1。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括纳米磁珠。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括蛋白酶K。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括洗脱液;优选地,所述洗脱液为pH8.0的缓冲液(优选为10mmol/L)或无核酸酶纯化水。
本发明的第二方面,提供了一种病毒核酸提取方法,所述方法包括步骤:
(1)磁珠分离病毒核酸
在生物样品中加入所述裂解液和所述磁珠,破坏病毒的结构,释放病毒颗粒中的核酸,使病毒核酸结合到磁珠上,并在外加磁场的作用下,分离结合有病毒核酸的磁珠;
(2)核酸的纯化
将步骤(1)分离出来的结合有病毒核酸的磁珠转移到所述洗涤液中,用洗涤液洗涤结合有病毒核酸的磁珠;
(3)扩增检测
将步骤(2)获得的经洗涤液洗涤的结合有病毒核酸的磁珠直接加入到PCR反应体系中扩增检测。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了样品梯度稀释的病毒核酸提取后的扩增效果。
图2显示了提取10IU/mL的HBV-DNA灵敏度结果图。
图3显示了提取1E3IU/mL和1E5IU/mL浓度的精密度结果图。
图4显示了10例临床样本的检测结果。
图5显示了对照提取试剂灵敏度检测结果。
图6显示了对照提取试剂精密度检测结果。
图7显示了针对同一例样本的检测结果对比。
图8显示了另一对照提取试剂灵敏度检测结果。
图9显示了另一对照提取试剂精密度检测结果。
图10显示了另一对照提取试剂针对同一例样本的检测结果对比。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,获得了一种病毒核酸高通量提取试剂盒并开发了提取方法。具体地,本发明提供了一种高效,快速的病毒核酸DNA/RNA提取方法,具体涉及一种利用磁珠法从血清、血浆中分离病毒核酸DNA/RNA的提取方法。在裂解液中强有力的蛋白质变性剂的作用下,病毒衣壳蛋白被迅速破坏,使核酸释放出来;在高盐条件下,释放出来的核酸被吸附到磁珠上;随后通过洗涤液A、洗涤液B的作用,将蛋白质、无机盐离子和许多有机杂质去除。富集的核酸与磁珠一起加入到PCR体系中扩增检测。可用于临床多种病毒血清,血浆样本类型核酸的提取。
本发明的试剂盒优化了样本裂解液配方,将样本裂解与核酸结合统一成一步,在样本裂解的同时促进核酸与磁珠的结合,简化了样本处理步骤;本发明的试剂盒及配套方法灵敏度高、耗时短、适用性强。
在描述本发明之前,应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件,因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案,并且不意图是限制性的,本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料,本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明提供了一种高灵敏度、快速,适用于病毒核酸DNA自动化提取方法,包括步骤:
(1)磁珠分离病毒核酸:在生物样品中加入裂解液和磁珠,在室温条件下破坏病毒的结构,释放病毒颗粒中的核酸,在裂解液特定的盐溶液和pH值环境下,病毒核酸结合到磁珠上,在外加磁场的作用下,结合有病毒核酸的磁珠被分离出来;
(2)核酸的纯化:分离出来的结合有病毒核酸的磁珠转移到洗涤液中,用洗涤液洗涤结合有病毒核酸的磁珠,转移洗涤后的结合有病毒核酸的磁珠即可得到高纯度的核酸;
(3)核酸的扩增检测:纯化后的结合有病毒核酸的磁珠直接加入到PCR反应体系中扩增检测。
本发明快速磁珠法病毒核酸提取试剂包含独立包装的裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液、磁珠和蛋白酶K,其中:
裂解液包含离液盐、硫酸铵、聚乙二醇、表面活性剂、EDTA、异丙醇、和Tris-HCl;
洗涤液A包含Tris-HCl、表面活性剂、和氯化钠;
洗涤液B包含石蜡油;
磁珠为纳米级的四氧化三铁微球,并修饰了官能团以加强对核酸的吸附能力;
蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶,具有很高的比活性,可直接使用商品化蛋白酶K。
根据本发明优选地实施方案,裂解液中离液盐的浓度为2-5mol/L,优选为4mol/L,离液盐包括但不限于硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钾。
根据本发明优选地实施方案,裂解液中硫酸铵的浓度为20-200mmol/L,优选为100mmol/L。
根据本发明优选地实施方案,裂解液中含有聚乙二醇-n,其中n=200-20000,优选n=6000,使用浓度为1%-10%(w/v),优选为5%(w/v)。
根据本发明优选地实施方案,表面活性剂使用浓度为1%-20%,优选为15%,所述表面活性剂包括但不限于曲拉通(Triton),十二烷基磺酸钠(SDS),十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),聚醚醇,Brij58。
根据本发明优选地实施方案,异丙醇作为磁珠与病毒核酸的结合增强剂,使用浓度为30%-50%,优选为35%。
根据本发明优选地实施方案,调节pH范围在3.5-7.0的缓冲液,优选为pH4.4,使用浓度为1mmol/L-30mmol/L,优选为10mmol/L,所述调节溶液pH值的缓冲液,包括但不限于Tris-HCl缓冲液,柠檬酸钠缓冲液,磷酸钠缓冲液。
根据本发明优选地实施方案,使用EDTA作为螯合剂,螯合样本中镁离子、钙离子等的干扰,使用浓度为1mmol/L-20mmol/L,优选为15mmol/L。
根据本发明优选地实施方案,所述洗涤液使用的表面活性剂浓度为0.1%-5%,优选为0.5%,所述表面活性剂包括但不限于曲拉通(Triton),十二烷基磺酸钠(SDS),十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),聚醚醇,Brij58。
根据本发明优选地实施方案,洗涤液中使用的氯化钠浓度为0.14mol/L。
根据本发明优选地实施方案,洗涤液中使用的石蜡油浓度为25%。
根据本发明优选地实施方案,使用过程中磁珠:蛋白酶k:样本:裂解液的体积比为1:2:10:20。
根据本发明优选地实施方案,磁珠可以为商品化磁珠(纳米磁珠),也可自行加工修饰官能团。
根据本发明优选地实施方案,蛋白酶K为商品化蛋白酶K。
根据本发明优选地实施方案,洗脱液内包含Tris-HCl,使用浓度为1-100mmol/L,优选为10mmol/L,调节pH范围在7.0-9.0,优选为8.0。也可用无核酸酶水替代,或直接用PCR反应体系洗脱。
根据本发明优选地实施方案,本发明试剂盒可用于手提,其步骤包括:
步骤一:往无菌EP管中加入适量样本,裂解液,磁珠,蛋白酶k,混匀,56摄氏度温育10分钟;
步骤二:短暂离心后,将EP管置于磁力架上,吸磁3分钟,弃上清;
步骤三:往EP管中加入适量洗涤液,洗涤1分钟;
步骤四:短暂离心后,将EP管置于磁力架上,吸磁3分钟,弃上清;
步骤五:将PCR反应体系加入EP管,混匀,将磁珠与PCR反应体系一起转移至PCR管中,上PCR扩增仪扩增。
根据本发明优选地实施方案,本发明试剂盒可用于Smart 32或同等类型的仪器上进行自动化提取,其步骤包括:
①根据提取样本的数量,在96深孔板的第3、9列中加入600μL的洗涤液A;
②根据提取样本的数量,在96深孔板的第3、9列中加入200μL的洗涤液B;
③根据提取样本的数量,在96深孔板的第6、12列中加入45μL的洗脱液;
④根据提取样本的数量,在96深孔板的第1、7列中按顺序加入20μL蛋白酶K、10μL磁珠、200μL的样本、400μL裂解液。
注:1.添加磁珠前需充分混匀磁珠,如提取的样本数量较多,建议每添加完8个样品孔重悬一次磁珠;
2.第2、4、5、8、10、11列空置,不添加试剂,不参与提取。
程序设置:
本发明中,所述结合病毒核酸的磁性纳米粒子(纳米磁珠)可购买商品化的成品,也可利用文献公开报道的方法直接合成。
所述裂解液在加热条件下能够充分的破坏病毒颗粒的结构,同时能够促进释放出来的病毒核酸结合到磁珠上。破坏病毒颗粒结构的物质为1-4mol/L的离液盐和表面活性剂,促进病毒核酸与磁珠结合的物质为20-200mmol/L的硫酸铵,1%-5%(w/v)聚乙二醇,pH3.5-7.0的Tris-HCl缓冲液。
所述离液盐包括但不限于硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钾。
所述表面活性剂包括但不限于曲拉通(Triton),十二烷基磺酸钠(SDS),十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),聚醚醇,聚氧乙烯醚(Brij58)。
所述调节溶液pH值的缓冲液,包括但不限于Tris-HCl缓冲液,柠檬酸钠缓冲液,磷酸钠缓冲液。
根据本发明优选地实施方案洗脱液可以是10mmol/L,pH8.0的缓冲液,也可以是无核酸酶纯化水或者PCR反应体系洗脱。
本发明的主要优点在于:
(1)优化样本裂解液配方,将样本裂解与核酸结合统一成一步,在样本裂解的同时促进核酸与磁珠的结合,简化了样本处理步骤;
(2)简化了洗脱过程,无需加热洗脱,只需把洗涤后的磁珠转移到PCR反应体系中即可上机进行PCR扩增检测;
(3)灵敏度高,样本中的核酸全部加入到PCR反应体系中,提高了试剂的灵敏度;
(4)样本处理时间短,由于优化了磁珠提取试剂配方,简化了操作步骤,30分钟内即可完成样本的处理,得到高质量的核酸;
(5)适用强,本磁珠提取试剂所需设备简单,既可用于手动提取,又可用于自动化提取。
下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译,北京:科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1试剂盒及使用方法
本实施例提供的试剂盒用于核酸的提取、富集、纯化等步骤。其处理后的产物用于临床体外检测使用。
为了实现上述目的,本发明人对核酸提取试剂盒进行了大量优化工作,比如对试剂盒中裂解液和洗涤液的各组分构成和含量进行了大量的优化,最终优化后的试剂盒,其各组分构成如下表1所示:
表1用于病毒核酸高通量全自动化提取的试剂盒
裂解液中含强有力的蛋白质变性剂,能迅速溶解蛋白质,使核酸解离出来;在其存在下,释放出来的核酸成分可以结合在磁珠上;随后通过洗涤液A、洗涤液B的作用,将蛋白质、无机盐离子和许多有机杂质去除。最终磁珠在PCR体系中洗脱并扩增。
本试剂盒适用标本类型:血液样本、分泌物样本、脱落细胞样本、骨髓样本、尿液样本、粪便样本等。
标本采集
1、血液样本:
血清——用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升,注入无菌收集管,室温(22~25℃)放置30~60分钟,血标本可自发完全凝集析出血清,或直接使用水平离心机,1500rpm离心5分钟;吸取上层血清,转移至1.5mL灭菌离心管中备用。
血浆——用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升,注入含EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的无菌收集管,立即轻轻颠倒混合5~10次,使抗凝剂与静脉血充分混匀,5~10分钟后即可分离出血浆,转移至1.5mL灭菌离心管中备用。
全血——用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升,注入含EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的无菌收集管,立即轻轻颠倒玻璃管混合5~10次,使抗凝剂与静脉血充分混匀,密闭送检。
2、分泌物样本:
口咽/口腔分泌物——用拭子取口咽部分泌物,将拭子置于灭菌试管,密封送检。
鼻腔/鼻咽分泌物——负压下吸取鼻咽分泌物,或用灭菌拭子取鼻腔或咽部分泌物,将分泌物或拭子置于灭菌试管,密闭送检。
泌尿道分泌物——男性尿道:用细小拭子伸入尿道约2-4厘米,捻动拭子采集分泌物,将拭子置入无菌收集管,密闭送检(采集分泌物前2小时禁小便)。女性尿道:用无菌生理盐水棉球洗净尿道口,再用无菌棉拭子***尿道约2厘米,捻动拭子采集分泌物,将棉拭子置入无菌收集管,密闭送检。
生殖道分泌物——女性宫颈:用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物,再用无菌拭子***宫颈内,停5秒钟后旋动拭子采集宫颈分泌物,将拭子置入无菌收集管,密闭送检。女性***:先拭去***过多的分泌物,采用无菌拭子******至内1/3处,沿***壁轻旋沾取分泌物,将采集的拭子置于无菌收集管,密闭送检。
3、脱落细胞样本:
宫颈脱落细胞——标本的采集需医护人员先用窥阴器或***张开器暴露宫颈,用宫颈刷置于宫颈口,顺时针旋转4-6周以获取足量的上皮细胞,然后取出宫颈刷置于盛有2mL生理盐水的无菌试管中备用。
口腔/口咽脱落细胞——取出采样管,轻甩一下,使管中的细胞保存液沉积在管底,拧开管盖,使管口朝上立于桌上备用。从袋内抽出采样棒,以其绒毛头部分别刮取左边口腔和右边口腔内侧黏膜细胞(即脸颊内侧的部位),上下刮取约15下,且刮取的同时要转动采样棒的头部,以使绒毛头上各处都沾有黏膜细胞。采样完成后,将采样棒绒毛头一端伸入到采样管内,往下压使其头部折断掉进采样管内,拧紧管盖,密闭送检。
4、骨髓样本
抽取受检者骨髓3-5mL,注入含EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的无菌收集管,立即轻轻颠倒混合5~10次,使抗凝剂与静脉血充分混匀,密闭送检。
5、尿液样本
采集10-15mL尿液收集于无菌容器中,4-8℃保存。
6、粪便样本
采集患者的粪便样本,每份粪便样本采集量为5mL/5g以上,采集后立即置于无菌采便管内。液体粪便(或含病毒维持液/生理盐水)应充分悬浮,静置后取上清用于检测。或用拭子在生理盐水中浸湿,******2-3cm处,自***周围皱襞处拭取,或在***口内轻轻旋转涂擦,然后***盛有生理盐水的试管内备用。
标本保存和运送:标本可立即用于测试,也可以保存于-20℃待测。保存期根据PCR试剂盒所规定时间。标本运送采用0℃冰壶。
试剂盒使用方法
样本处理与核酸提取
1手动操作
1.1液态标本处理
1.1.1在1.5mL离心管中依次加入10μL磁珠,20μL蛋白酶K,200μL样本,400μL裂解液。旋涡混匀后在56℃金属浴中静置12分钟;
1.1.2瞬时离心后,吸磁3分钟,弃上清;
1.1.3依次加入600μL的洗涤液A和200μL的洗涤液B,盖紧管盖,旋涡混匀1分钟;
1.1.4瞬时离心后,吸磁2分钟,弃上清;
1.1.5瞬时离心后,吸磁1分钟,用200μL枪头移液器再次去除剩余液体;注:切勿吸入磁珠
1.1.6室温静置1分钟后,向离心管中加入PCR扩增体系,再用洗脱液补充至试剂盒规定的扩增体积,旋涡混匀后,将全部试剂连带磁珠一起转入PCR管中,即可上机扩增检测。
1.2咽拭子等拭子类标本处理
宫颈刷、咽拭子等标本须在运输(保存)液中充分搅动(至少40下),以洗下拭子上粘附的细胞等,然后取1~1.5mL保存液于1.5mL离心管中,12000rpm离心3分钟,去除大部分上清,保留约200μL液体,振荡混匀,后续处理同1.1(液态标本处理)操作。
2自动操作
根据本发明优选地实施方案,快速磁珠法提取试剂盒可用于Smart 32或同等类型的仪器上进行自动化提取,其步骤包括:
①根据提取样本的数量,在96深孔板的第3、9列中加入600μL的洗涤液A;
②根据提取样本的数量,在96深孔板的第3、9列中加入200μL的洗涤液B;
③根据提取样本的数量,在96深孔板的第6、12列中加入45μL的洗脱液;
④根据提取样本的数量,在96深孔板的第1、7列中按顺序加入20μL蛋白酶K、10μL磁珠、200μL的样本、400μL裂解液。
注:1.添加磁珠前需充分混匀磁珠,如提取的样本数量较多,建议每添加完8个样品孔重悬一次磁珠;
2.第2、4、5、8、10、11列空置,不添加试剂,不参与提取。
程序设置
本试剂盒性能指标
1.本试剂盒能达到国内外同类试剂相同性能指标。
2.可用于不同类型样本的核酸提取,对低浓度样本的提取效率更佳。
3.本试剂盒具有很好的重复性,其批内和批间的CV值均小于5%。
实施例2试剂盒线性验证
本实施例中,对表1试剂盒进行了线性验证。
使用小牛血清将HBV-国家标准物质(购自中检院,原液靶值浓度为1.0E8IU/mL)经10倍梯度稀释以后,获得浓度为1E8IU/mL、1E7IU/mL、1E6IU/mL、1E5IU/mL、1E4IU/mL、1E3IU/mL、1E2IU/mL以及20IU/mL的样本。使用本试剂盒在达安基因的Smart 32半自动核酸提取仪上进行核酸提取,具体步骤如实施例1中所描述。提取完测病毒核酸使用中山大学达安基因股份有限公司生产的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(国械注准20163400142)进行扩增检测,具体操作步骤参照试剂盒说明书。检测结果如图1所示,各浓度之间梯度均一,线性良好,线性相关系数r>0.98。
实施例3试剂盒灵敏度验证
使用小牛血清稀释HBV-国家标准物质(购自中检院,原液靶值浓度为1.0E8IU/mL)至试剂盒灵敏度10IU/mL,重复20次检测。使用本试剂盒在达安基因的Smart 32半自动核酸提取仪上进行核酸提取,具体步骤如实施例1中所描述。提取完测病毒核酸使用中山大学达安基因股份有限公司生产的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(国械注准20163400142)进行扩增检测,具体操作步骤参照试剂盒说明书。灵敏度结果如图2所示,10IU/mL的阳性检出率为100%,达到试剂盒的灵敏度指标。
实施例4试剂盒精密度验证
使用小牛血清稀释HBV-国家标准物质(购自中检院,原液靶值浓度为1.0E8IU/mL)分别至1E5IU/mL和1E3IU/mL,每个浓度重复10次检测。使用本试剂盒在达安基因的Smart32半自动核酸提取仪上进行核酸提取,具体步骤如实施例1中所描述。提取完测病毒核酸使用中山大学达安基因股份有限公司生产的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(注册证号:国械注准20163400142)进行扩增检测,具体操作步骤参照试剂盒说明书。精密度结果如图3所示,1E5IU/mL和1E3IU/mL定量值的Log的CV值分别为1.8%和2.3%,符合试剂盒的性能指标。
实施例5显示了10例临床样本结果图
取10例HBV临床收集的血清样本,使用本试剂盒在达安基因的Smart 32半自动核酸提取仪上进行核酸提取,具体步骤如实施例1中所描述。提取完测病毒核酸使用中山大学达安基因股份有限公司生产的乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(国械注准20163400142)进行扩增检测,具体操作步骤参照试剂盒说明书。检测结果如图4所示,提取HBV临床样本效果良好,符合试剂盒的性能要求。
对比例
核酸检测中首先需要进行核酸提取,核酸提取质量的好坏直接关系到检测结果的成败,特别是对检测的灵敏度有显著的影响。
本发明人在研究过程中发现,核酸提取试剂盒的中裂解液和洗涤液对检测灵敏度有较大影响,使用不同组分或组分含量差异较大的裂解液和洗涤液进行核酸提取,然后进行PCR检测,表现出了极大的灵敏度差异。
表2
使用对照裂解液1、对照洗涤液A1、对照洗涤液B1进行样品核酸提取,参照实施例3中的方法进行灵敏度检测,灵敏度检测结果如图5所示,该对照提取试剂的灵敏度较差,10IU/mL的乙型肝炎病毒的阳性检出率为0%,达不到试剂盒的性能指标。
使用对照裂解液1、对照洗涤液A1、对照洗涤液B1进行样品核酸提取,参照实施例4中的方法进行精密度检测,检测结果如图6所示,精密度结果定量值的Log的CV值超过5%,不符合试剂盒性能要求。
使用对照裂解液1、对照洗涤液A1、对照洗涤液B1进行样品核酸提取,参照实施例5中的方法提取同一例HBV样本临床样本检测,检测结果如图7所示,对照试剂1的检测结果靠后4个Ct值,提取效率远低于本核酸提取试剂盒。
使用对照裂解液2、对照洗涤液A2、对照洗涤液B2进行样品核酸提取,参照实施例3中的方法进行灵敏度检测,灵敏度检测结果如图8所示,对照试剂1灵敏度试验10IU/mL的乙型肝炎病毒核酸的阳性检出率为0%,达不到试剂盒的性能指标。
使用对照裂解液2、对照洗涤液A2、对照洗涤液B2进行样品核酸提取,参照实施例4中的方法进行精密度检测,检测结果如图9所示,精密度试验结果的定量值的Log的CV值超过5%,不符合试剂盒性能要求。
使用对照裂解液2、对照洗涤液A2、对照洗涤液B2进行样品核酸提取,参照实施例5中的方法提取同一例HBV样本临床样本检测,检测结果如图10所示,对照试剂2的检测结果靠后3.5个Ct值,提取效率远低于本核酸提取试剂盒。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括裂解液,所述裂解液包括:离液盐、硫酸铵、聚乙二醇、表面活性剂、EDTA、和异丙醇。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述裂解液中离液盐的浓度为2-5mol/L,优选为4mol/L;优选地,所述离液盐选自下组的一种或多种:硫氰酸胍、盐酸胍、和硫氰酸钾;更优选地,所述离液盐为硫氰酸胍。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述裂解液中硫酸铵的浓度为20-200mmol/L,优选为100mmol/L。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述裂解液中所含的聚乙二醇为平均分子量200-20000的聚乙二醇;优选为平均分子量为6000的聚乙二醇;较佳地所述裂解液中聚乙二醇的浓度为1%-10%(w/v),优选为5%(w/v)。
5.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述裂解液中表面活性剂的浓度为1%-20%(w/v),优选为15%(w/v);更优选地,所述表面活性剂选自下组的一种或多种:曲拉通(Triton)、十二烷基磺酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、聚醚醇、和Brij58。
6.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述裂解液中EDTA浓度为1mmol/L-20mmol/L,优选为15mmol/L。
7.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述裂解液中异丙醇的浓度为30%-50%(v/v),优选为35%(v/v)。
8.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括洗涤液A和洗涤液B,其中,所述洗涤液A包括:表面活性剂、和氯化钠;所述洗涤液B为石蜡油。
9.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括纳米磁珠;和/或
所述试剂盒还包括蛋白酶K。
10.一种病毒核酸提取方法,其特征在于,所述方法使用权利要求1所述的试剂盒,并且所述方法包括步骤:
(1)磁珠分离病毒核酸
在生物样品中加入所述裂解液和所述磁珠,破坏病毒的结构,释放病毒颗粒中的核酸,使病毒核酸结合到磁珠上,并在外加磁场的作用下,分离结合有病毒核酸的磁珠;
(2)核酸的纯化
将步骤(1)分离出来的结合有病毒核酸的磁珠转移到所述洗涤液中,用洗涤液洗涤结合有病毒核酸的磁珠;
(3)扩增检测
将步骤(2)获得的经洗涤液洗涤的结合有病毒核酸的磁珠直接加入到PCR反应体系中扩增检测。
Priority Applications (1)
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