CN111455086B

CN111455086B - 一种鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法

Info

Publication number: CN111455086B
Application number: CN202010298737.1A
Authority: CN
Inventors: 龚达平; 陈明丽; 向小华; 高军平; 郝俊杰; 蒲文宣; 徐秀红; 解敏敏
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-04-16
Filing date: 2020-04-16
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2040-04-16
Also published as: CN111455086A

Abstract

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法。该方法包括如下步骤：检测待测烟草的基因型为基因型I还是基因型II，基因型I的烟草具有或疑似具有黑胫病抗性，基因型II的烟草不具有或疑似不具有黑胫病抗性。基因型I的烟草为基于SNP位点1的基因型为TT纯合型和/或基于SNP位点2的基因型为GG纯合型的烟草；基因型II的烟草为基于SNP位点1的基因型为CC纯合型和/或基于SNP位点2的基因型为AA纯合型的烟草；SNP位点1为烟草基因组中SEQ ID NO：1自5’末端起第101位核苷酸；SNP位点2为烟草基因组中SEQ ID NO：2自5’末端起第101位核苷酸。本发明具有重要价值。

Description

一种鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法。

背景技术

烟草(Nicotianatabacum L.)是一种重要的经济作物，也是研究植物-病原菌相互作用的模式***。黑胫病是由土传烟草疫霉(PhytophthoraNicotianae)引起的一种严重影响烟草生产的病害，可以广泛侵染各类植物。与化学防治策略相比，定位抗病基因并培育抗病品种是减少该病原菌经济损失最安全、经济有效的方法。

目前已报道的烟草黑胫病生理小种有0号、1号、2号和3号小种，中国烟草黑胫病生理小种以0号和1号小种为主。来源于烟草野生种蓝茉莉叶烟草(NicotianaPlumaginifolia)(Apple 1962；Chaplin 1962)和长花烟草(NicotianaLongiflora)(Valleau et al.，1960)的抗病基因php和phl高抗烟草黑胫病0号生理小种，并且抗病基因php和phl被成功导入普通烟草中培育烟草新品种。但是，具有PHP或Ph1基因的抗性品种的多年连续种植，会使1号生理小种成为优势小种。研究还发现，单基因抗性机制的持久性较低，单基因抗性品种和多基因高抗品种轮作有利于减少发病率，同时降低病原菌的小种转移。

对0号小种和1号小种均表现出较高抗性的抗源主要有雪茄烟‘Florida 301’(Tisdale 1931)和‘Beinhart-1000’(Heggestad and Lautz 1957；Chaplin 1966；Wills1971；Nielsen 1992)。但是‘Beinhart-1000’中的黑胫病抗性基因和雪茄特征密切关联，该品系的抗性在白肋烟和烤烟品种中利用较少。‘Florida 301’中的黑胫病抗性位点与产量呈负相关。由此可见，烟草黑胫病抗源‘Florida 301’和‘Beinhart-1000’应用于烤烟黑胫病抗性品种的育种工作中，需要精细定位黑胫病抗源中的QTL位点，利用分子标记辅助育种，同时打破不利连锁。

高密度遗传图谱构建是成功定位烟草黑胫病抗性位点的基础。烟草(包括TN90、K326和Basma Xanthi)的基因组草图测序完成，为构建高密度遗传连锁图谱提供了强有力的工具。

发明内容

本发明的目的为如何鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性。

本发明首先保护鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法。

本发明所保护的鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：检测待测烟草的基因型为基因型I还是基因型II，然后进行如下判断：如果待测烟草的基因型为基因型I，则具有或疑似具有黑胫病抗性；如果待测烟草的基因型为基因型II，则不具有或疑似不具有黑胫病抗性；

所述基因型I的烟草为基于SNP位点1的基因型为TT纯合型和/或基于SNP位点2的基因型为GG纯合型的烟草；

所述基因型II的烟草为基于SNP位点1的基因型为CC纯合型和/或基于SNP位点2的基因型为AA纯合型的烟草；

所述SNP位点1为烟草基因组中SEQ ID NO：1自5’末端起第101位核苷酸；

所述SNP位点2为烟草基因组中SEQ ID NO：2自5’末端起第101位核苷酸。

本发明所保护的鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：检测待测烟草基因组中是否含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1、SEQ IDNO：4所示的DNA片段2、SEQ ID NO：5所示的DNA片段3和SEQ ID NO：6所示的DNA片段4，然后进行如下判断：

如果待测烟草基因组中含有所述DNA片段1和/或所述DNA片段3，则待测烟草具有或疑似具有黑胫病抗性；

如果待测烟草基因组中含有所述DNA片段2和/或所述DNA片段4，则待测烟草不具有或疑似不具有黑胫病抗性。

本发明所保护的鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法，具体可为方法三，可包括如下步骤：检测待测烟草基因组中是否含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1、SEQ IDNO：4所示的DNA片段2、SEQ ID NO：5所示的DNA片段3和SEQ ID NO：6所示的DNA片段4，然后进行如下判断：

如果待测烟草基因组中含有所述DNA片段1和/或所述DNA片段3，且不含有所述DNA片段2和/或所述DNA片段4，则待测烟草具有或疑似具有黑胫病抗性；

如果待测烟草基因组中含有所述DNA片段2和/或所述DNA片段4，且不含有所述DNA片段1和/或所述DNA片段3，则待测烟草不具有或疑似不具有黑胫病抗性。

上述任一所述的方法中，所述“检测待测烟草的基因型为基因型I还是基因型II”或所述“检测待测烟草基因组中是否含有所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3和所述DNA片段4”的方法可为a1)或a2)：

a1)直接测序；

a2)以待测烟草的基因组DNA为模板，采用引物对1和/或引物对2进行PCR扩增，之后测序；

所述引物对1的靶序列可包括SEQ ID NO：1所示的DNA片段；

所述引物对2的靶序列可包括SEQ ID NO：2所示的DNA片段。

所述引物对1的靶序列具体可为SEQ ID NO：1所示的DNA片段。

所述引物对2的靶序列具体可为SEQ ID NO：2所示的DNA片段。

本发明还保护具有或疑似具有黑胫病抗性烟草的选育方法，可为选择“基因型I的烟草”、“基因组中含有所述DNA片段1和/或所述DNA片段3的烟草”或“基因组中含有所述DNA片段1和/或所述DNA片段3且不含有所述DNA片段2和/或所述DNA片段4的烟草”进行育种；

所述SNP位点1为烟草基因组中SEQ ID NO：1自5’末端起第101位核苷酸。

本发明还保护不具有或疑似不具有黑胫病抗性烟草的选育方法，可为选择“基因型II的烟草”、“基因组中含有所述DNA片段2和/或所述DNA片段4的烟草”或“基因组中含有所述DNA片段2和/或所述DNA片段4且不含有所述DNA片段1和/或所述DNA片段3的烟草”进行育种；

本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定烟草黑胫病抗性的试剂盒，可包括检测待测烟草的基因型为基因型I还是基因型II的物质；

所述试剂盒具体可由检测待测烟草的基因型为基因型I还是基因型II的物质组成。

上述任一所述“检测待测烟草的基因型为基因型I还是基因型II的物质”可为引物对1和/或引物对2；

所述引物对1的靶序列可包括SEQ ID NO：1所示的DNA片段；

所述引物对2的靶序列可包括SEQ ID NO：2所示的DNA片段。

所述引物对1的靶序列具体可为SEQ ID NO：1所示的DNA片段。

所述引物对2的靶序列具体可为SEQ ID NO：2所示的DNA片段。

本发明还保护SEQ ID NO：1所示的分子标记甲或SEQ ID NO：2所示的分子标记乙。

(z1)或(z2)或(z3)或(z4)或(z5)或(z6)也属于本发明的保护范围。

(z1)上述任一所述试剂盒、所述分子标记甲或所述分子标记乙在鉴定或辅助鉴定烟草黑胫病抗性中的应用。

(z2)上述任一所述试剂盒、所述分子标记甲或所述分子标记乙在制备用于鉴定或辅助鉴定烟草黑胫病抗性的产品中的应用。

(z3)上述任一所述试剂盒、所述分子标记甲或所述分子标记乙在筛选或辅助筛选具有黑胫病抗性烟草品种或不具有黑胫病抗性烟草品种中的应用。

(z4)上述任一所述试剂盒、所述分子标记甲或所述分子标记乙在制备用于筛选或辅助筛选具有黑胫病抗性烟草品种或不具有黑胫病抗性烟草品种的产品中的应用。

(z5)上述任一所述试剂盒、所述分子标记甲或所述分子标记乙在烟草育种中的应用。

(z6)上述任一所述试剂盒、所述分子标记甲或所述分子标记乙在制备用于烟草育种的产品中的应用。

上述任一所述的应用中，当分子标记甲中SNP位点1的基因型为TT纯合型和/或分子标记乙中SNP位点2的基因型为GG纯合型，则判定为基因型I的烟草。当分子标记甲中SNP位点1的基因型为CC纯合型和/或分子标记乙中SNP位点2的基因型为AA纯合型，则判定为基因型II的烟草。基因型I的烟草具有或疑似具有黑胫病抗性。基因型II的烟草不具有或疑似不具有黑胫病抗性。

实验证明，采用本发明所提供的方法可以鉴定或辅助鉴定待测烟草是否具有黑胫病抗性，且具有较高的准确性。本发明具有重要价值。

附图说明

图1为177个RIL家系黑胫病病情指数的统计结果。

图2为烟草高密度SNP遗传图谱及烟草黑胫病抗性QTL分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

燕麦培养基：向1000mL水中加入30g燕麦片，60℃水浴1h；之后双层纱布过滤，收集滤液；向滤液中加入20g琼脂，加水定容至1000mL；121℃高压蒸汽灭菌20min。

菌谷培养基：将饱满谷子浸泡5h，沥干水分倒入锅内，加适量清水煮开，当谷粒炸开成半开花状时停止加热，冷却后过滤留谷粒；将谷粒分装到500mL三角瓶中，115℃高压灭菌1h。

实施例1、烤烟黑胫病抗性QTL的精细定位

一、RIL群体的构建

1、将烟草黑胫病高抗烤烟品种‘云烟85’和感病烤烟品种‘大白筋599’杂交，得到F₁代种子。

2、完成步骤1后，种植F₁代种子，自花授粉，获得F₂代种子。

3、完成步骤2后，种植F₂代种子，通过单粒传法获得177个F7:8-9RIL家系。177个F7:8-9RIL家系组成RIL群体。

二、烟草黑胫病抗性分析

待测烟草材料分别为‘云烟85’、‘大白筋599’和177个RIL家系。

1、本发明的发明人分别于2017年山东省潍坊市诸城(简称ZC2017)、2018年山东省潍坊市诸城(简称ZC2018)、2019年山东省潍坊市诸城(简称ZC2019)和2018年山东省青岛市即墨区(简称JM2018)将待测烟草材料按常规方法播种于育苗盘中，温室培养2个月左右，获得待测烟草幼苗。

2、完成步骤1后，按照随机完全区组设计，将待测烟草幼苗移栽至黑胫病病圃。‘云烟85’、‘大白筋599’和每个RIL家系均种植15株；行间距为1.2m，行内株距为0.5m；ZC2017和JM2018均设置2个重复，ZC2019年设置3个重复，ZC2018设置4个重复。

3、进行步骤2期间，鉴定田间黑胫病抗性。

田间黑胫病抗性的鉴定方法如下：

(1)从移栽至大田后第45d开始，每隔15d根据《烟草病虫害分级及调查方法GB/T23222-2008》评定黑胫病的发病情况，获得相应的病级代表值；0为无症状，1为高达33％的茎病或黄化叶片，3为高达50％的茎病或黄化叶片，5为高达90％的茎病或66％的黄化叶片，7为高达100％的茎病或黄化叶片；9为死亡。

(2)根据下述公式获得病情指数(DI)。

病情指数(DI)＝100×∑[(病级代表值×该级植株数)]/(调查总叶片数×最高级代表)]

4、本发明的发明人于2019年山东省青岛市即墨区(简称GH2019)将待测烟草材料按常规方法播种于育苗盘中，温室培养2个月左右，获得待测烟草幼苗。

5、完成步骤4后，按照随机完全区组设计，将待测烟草幼苗进行假植，常规培养。其中，‘云烟85’、‘大白筋599’和每个RIL家系均种植8株；设置3个重复。

6、进行步骤5期间，鉴定温室黑胫病抗性。温室黑胫病抗性的鉴定方法如下：

(1)将烟草黑胫病0号生理小种接种于燕麦培养基，28℃培养7天；之后转接至菌谷培养基，28℃培养20天，获得菌谷。

(2)待测烟草幼苗假植第30d左右，用刀伤茎基部，接种5g菌谷；之后30℃培养，培养期间，土壤水分保持均匀。接种第7d开始，每隔7d根据《烟草病虫害分级及调查方法GB/T23222-2008》评定黑胫病的发病情况，获得相应的病级代表值；0为无症状，1为高达33％的茎病或黄化叶片，3为高达50％的茎病或黄化叶片，5为高达90％的茎病或66％的黄化叶片，7为高达100％的茎病或黄化叶片；9为死亡。

(2)根据下述公式获得病情指数(DI)。

统计结果见图1(A为步骤3中177个RIL家系田间黑胫病抗性的鉴定结果；B为步骤6中177个RIL家系温室黑胫病抗性的鉴定结果，10为0≤DI<10，10≤DI<20，20≤DI<30，30≤DI<40，40≤DI<50，50≤DI<60，60≤DI<70，70≤DI<80，80≤DI<90，90≤DI≤100)。结果表明，‘云烟85’在五个环境中对黑胫病原菌均表现出极高的抗性水平，病情指数均小于20；‘大白筋599’在五个环境中对黑胫病原菌均表现出较高的感病反应水平，DI值均大于90；177个RIL家系在五个环境中对黑胫病原菌变异范围很大，病情指数在0-100(平均DI值为55)，其在黑胫病抗性水平上具有明显的偏正态分布。由此可见，‘云烟85’的黑胫病抗性由主效基因在内的多基因控制。

7、完成步骤3和步骤6后，用SPSS23.0软件对五个环境(即ZC2017、ZC2018、ZC2019、JM2018和GH2019)下RIL群体的病情指数进行方差分析(ANOVA)。

结果见表1。结果表明，RIL家系间差异极显著(P<0.0001)，环境和RIL家系间交互作用显著(P<0.0001)。

表1. 177个RIL家系在五个环境下的病情指数方差分析

来源	自由度	均值	F值	P值
					环境	4	68378.49	1240.05	<0.0001
基因型(家系)	178	5038.72	91.37	<0.0001
					环境*区组	6	3461.44	62.77	<0.0001
环境*基因型	712	535.46	9.71	<0.0001
					基因型*区组	534	59.50	1.07	0.152

三、烟草高密度遗传图谱构建

1、RAD-seq文库的制备

待测烟草分别为‘云烟85’、‘大白筋599’和177个RIL家系。

采用CTAB方法分别提取待测烟草叶片的基因组DNA，然后按照Baird等人的方法构建RAD文库(Baird et al.2008)，最终获得179个RAD-seq文库。具体步骤依次如下：

(1)用限制性核酸内切酶EcoRI酶切待测烟草叶片的基因组DNA，回收酶切片段。

(2)将酶切片段与P1接头(Illumina)连接；再混池，随机打断带有P1接头的片段。

(3)使用QIAick Gel提取试剂盒(Qiagen)回收300-500bp的DNA片段。

(4)使用快速钝化酶混合物试剂盒(NEB)在3’末端加A，将打碎片段的末端修复为平末端。

(5)将改良的Solexa P2接头(Illumina)连接到DNA片段上。

(6)用Phusion Master Mix(NEB)对DNA进行PCR扩增。

(7)利用Illumina HiSeq X Ten测序，获得RAD-seq文库。

结果表明，利用Illumina HiSeq X Ten共构建179个RAD-seq文库，测序数据约1394.81Gb。

2、SNP鉴定与分型

(1)对步骤1获得的下机数据进行质量控制，过滤掉低质量数据、接头信息等，得到高质量数据(即clean Data)。

结果表明，共获得4618576318个高质量的成对末端reads，每个reads的长度约为151bp；34944329个reads来自‘云烟85’；39685656个reads来自‘大白筋599’；其余reads来自177个RIL家系，每个单株的reads数量在10648452到68786148之间，平均为25672013。

(2)用BWA软件(Li et al，2009)将Clean Data比对到烟草参考基因组序列，获得序列的位置归属，得到BAM文件；用Samtools软件处理BAM文件格式的比对结果文件，对格式文件进行转换。

(3)用GATK的Best Practices流程(McKenna et al，2010)对BAM文件进行校正，并进行SNP和small InDel(***缺失标记)的检测。

结果表明，‘云烟85’的测序平均深度为7.95倍，‘大白筋599’的测序平均深度为为8.40倍，177个RIL家系的测序平均深度为5.94倍。GATK软件共检测到2404474个SNP。对于SNP基因座，有2-4个等位基因被鉴定为多态，则被认为是潜在的标记。在RIL群体中成功鉴定了460210个多态性标记。SNP标记分为4种基因型，分别为aa×bb、hk×hk、lm×ll和nn×np(aa×bb表示双亲均为纯合子，hk×hk表示双亲均为杂合子，lm×11和nn×np表示双亲之一为纯合子、另一个为杂合子)，四种标记类型的SNP数量依次为150489、120264、87089和102368个。

3、遗传连锁图谱构建与分析

(1)为保证遗传图谱质量且使连锁群上的标记数目尽可能均匀，对测序深度不高的亲本基因型和严重偏分离的标记进行了过滤，以免影响图谱构建和QTL定位结果。

最终从基因型为aa×bb的150489个SNP标记中，得到可用于作图的SNP标记7878个。

(2)利用HighMap软件对SNP标记进行排序并纠正基因分型错误(Liu etal.2014)。使用Kosambi映射函数(Kosambi 1944)计算图谱距离。构建热图和单倍型图谱用于评估图谱质量(West et al.2006)。

结果见图2和表2。结果表明，7734个SNP标记被定位到烟草24个LG；遗传图谱包含2800个重组位点，共分离标记占63.79％；图谱的总图距为2689.06cM，平均标记间距为0.35cM；LG3是最大的类群，包含1230个标记，跨度为190.83cM，平均标记间距为0.16cM；最短的连锁群是LG4，包含184个标记，遗传长度为53.82cM，平均标记间距离为0.29cM；标记间的连锁程度用“Gap≤5”表示相邻标记间距离小于5cM的空隙所占的百分比，数值范围为95.28％-100.00％，平均值为98.61％；图谱最大缺口为16.74cM，位于LG12上。

表2

四、烟草黑胫病抗性QTL检测

利用QTL IciMapping4.1软件中的复合区间作图法定位烟草黑胫病抗性QTL(Menget al.2015)，其中LOD阈值设定为≥2，permutation times设为1000。根据五个环境中检测到的主效QTL侧翼标记的位置，置信区间内的所有基因均为候选基因。

对烟草黑胫病的抗性QTL定位分析，共检测到7个QTL与烟草黑胫病抗性相关，分布在7个连锁群上(见图2)，定位分析结果如表3。结果如下：

QTL qBS7位于LG7连锁群上，是一个主效QTL，五种不同环境下解释的表型变异为16.48％—62.20％；在ZC2017、ZC2018和ZC2019环境下，QTL qBS7位于标记M376697和标记M336593之间，遗传距离约为1.5cM，其峰值LOD分别为28.33、43.40和38.72，加性效应分别为22.68、31.63和19.39；在GH2019环境下，QTL qBS7定位于标记M403163和标记M376697之间，遗传距离约为4cM，峰值LOD为13.75，加性效应为14.26；在JM2018环境下，QTL qBS7被定位于标记M376697和标记M336601之间，遗传距离为2cM，LOD峰值为7.54，加性效应为8.32。

QTL qBS14位于LG14连锁群，QTL qBS14两侧有两个标记M356486和M136059，遗传距离为0.75cM，五种不同环境下解释的表型变异为3.94％—11.49％，LOD峰值为3.23—7.53，加性效应为-5.23—-11.06。

qBS16是一个较小的QTL，可解释四个环境中2.95％—5.31％的表型变异，LOD值为2.70—3.39。

QTL qBS1、qBS21和qBS24在三个环境中检测到。QTL qBS1在ZC2017、ZC2019和GH2019同时被检测，分别解释表型变异的2.46％、2.23％和3.33％。qBS21和qBS24则只与大田环境下烟草黑胫病抗性相关。

在GH2019和ZC2019环境中还发现了PVE和LOD值较低的微效QTL qBS6。

表3.烟草黑胫病抗性QTL的定位结果

注：LOD优势对数值(QTL峰值),PVE QTL解释的方差百分比,ADD加性效应。

主效QTLqBS7的部分标记含有的SNP位点的信息见表4。

表4.烟草黑胫病抗性QTL的标记信息

五、烟草黑胫病抗性验证

1、根据步骤三中2的高通量测序结果，获得黑胫病高抗品种‘云烟85’和黑胫病感病‘大白筋599’基于2个SNP位点的基因型。

结果见表4。

2、根据步骤三中2的高通量测序结果，获得177个RIL家系基于2个SNP位点的基因型。根据步骤二的结果，获得177个RIL家系的黑胫病抗性。

结果表明，177个RIL家系中，五个环境均具有黑胫病抗性(病情指数小于25)的RIL家系为50个，其中48个家系基于SNP位点1的基因型均为TT纯合型，与‘云烟85’一致，准确性达到96.0％；44个家系基于SNP位点2的基因型均为GG纯合型，与‘云烟85’一致，准确性达到88.0％；五个环境均不具有黑胫病抗性(病情指数为80以上)的RIL家系为65个，其中62家系基于SNP位点1的基因型均为CC纯合型，与‘大白筋599’一致，准确性达到95.4％；57个家系基于SNP位点2的基因型均为AA纯合型，与‘大白筋599’一致，准确性达到87.7％。

由此可见，通过检测SNP位点1和/或SNP位点2的基因型可以鉴定待测烟草的黑胫病抗性，且具有较高的准确性。

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 一种鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<222> （101）…（101）

<223> n为t或c

<400> 1

tatagaagtc aagacttgct tttccgtcac gaattatatg ccctcacaat tatatcaaca 60

aaaactgagt ttaatccatc acattcaatt catatgccca natatatcaa ggaaatcact 120

caatttcaca aaagaggtca catgcatgca attggtacca taagcttgcc cttaatgtaa 180

atctctacta atgtaggata g 201

<210> 2

<211> 201

<212> DNA

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<222> （101）…（101）

<223> m为a或g

<400> 2

tccaaccatg ttgtatattg gactacccga atcactcctg ttttcagttg tttggtgatc 60

tcctctttaa tcttgtcact gacctcagtt ttgaactttc mttgcttttg ttgaactgga 120

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tcatcatatg accaagcaaa c 201

<210> 3

<211> 201

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tatagaagtc aagacttgct tttccgtcac gaattatatg ccctcacaat tatatcaaca 60

aaaactgagt ttaatccatc acattcaatt catatgccca tatatatcaa ggaaatcact 120

caatttcaca aaagaggtca catgcatgca attggtacca taagcttgcc cttaatgtaa 180

atctctacta atgtaggata g 201

<210> 4

<211> 201

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tatagaagtc aagacttgct tttccgtcac gaattatatg ccctcacaat tatatcaaca 60

aaaactgagt ttaatccatc acattcaatt catatgccca catatatcaa ggaaatcact 120

caatttcaca aaagaggtca catgcatgca attggtacca taagcttgcc cttaatgtaa 180

atctctacta atgtaggata g 201

<210> 5

<211> 201

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

tccaaccatg ttgtatattg gactacccga atcactcctg ttttcagttg tttggtgatc 60

tcctctttaa tcttgtcact gacctcagtt ttgaactttc gttgcttttg ttgaactgga 120

ggacaatcaa gatgaatcgg caatttatga accactagat caacacctag tcccggcatg 180

tcatcatatg accaagcaaa c 201

<210> 6

<211> 201

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

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tcctctttaa tcttgtcact gacctcagtt ttgaactttc attgcttttg ttgaactgga 120

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tcatcatatg accaagcaaa c 201

Claims

1.一种鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测烟草的基因型为基因型I还是基因型II，然后进行如下判断：如果待测烟草的基因型为基因型I，则具有或疑似具有黑胫病抗性；如果待测烟草的基因型为基因型II，则不具有或疑似不具有黑胫病抗性；

2.一种鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测烟草基因组中是否含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1、SEQ ID NO：4所示的DNA片段2、SEQ ID NO：5所示的DNA片段3和SEQ ID NO：6所示的DNA片段4，然后进行如下判断：

3.一种鉴定或辅助鉴定待测烟草黑胫病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测烟草基因组中是否含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1、SEQ ID NO：4所示的DNA片段2、SEQ ID NO：5所示的DNA片段3和SEQ ID NO：6所示的DNA片段4，然后进行如下判断：

4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述“检测待测烟草的基因型为基因型I还是基因型II”或所述“检测待测烟草基因组中是否含有DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3和DNA片段4”的方法为a1）或a2）：

a1）直接测序；

a2）以待测烟草的基因组DNA为模板，采用引物对1和/或引物对2进行PCR扩增，之后测序；

所述引物对1的靶序列包括SEQ ID NO：1所示的DNA片段；

所述引物对2的靶序列包括SEQ ID NO：2所示的DNA片段。

5.具有或疑似具有黑胫病抗性烟草的选育方法，为选择“基因型I的烟草”、“基因组中含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1和/或SEQ ID NO：5所示的DNA片段3的烟草”或“基因组中含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1和/或SEQ ID NO：5所示的DNA片段3且不含有SEQ ID NO：4所示的DNA片段2和/或SEQ ID NO：6所示的DNA片段4的烟草”进行育种；

6.不具有或疑似不具有黑胫病抗性烟草的选育方法，为选择“基因型II的烟草”、

“基因组中含有SEQ ID NO：4所示的DNA片段2和/或SEQ ID NO：6所示的DNA片段4的烟草”或“基因组中含有SEQ ID NO：4所示的DNA片段2和/或SEQ ID NO：6所示的DNA片段4且不含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1和/或SEQ ID NO：5所示的DNA片段3的烟草”进行育种；

7.一种鉴定或辅助鉴定烟草黑胫病抗性的试剂盒，包括检测待测烟草的基因型为基因型I还是基因型II的物质；

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述“检测待测烟草的基因型为基因型I还是基因型II的物质”为引物对1和/或引物对2；

所述引物对1的靶序列包括SEQ ID NO：1所示的DNA片段；

所述引物对2的靶序列包括SEQ ID NO：2所示的DNA片段。

9.SEQ ID NO：1所示的分子标记甲或SEQ ID NO：2所示的分子标记乙。

10.（z1）或（z2）或（z3）或（z4）或（z5）或（z6）：

（z1）权利要求7或8所述试剂盒、权利要求9所述分子标记甲或所述分子标记乙在鉴定或辅助鉴定烟草黑胫病抗性中的应用；

（z2）权利要求7或8所述试剂盒、权利要求9所述分子标记甲或所述分子标记乙在制备用于鉴定或辅助鉴定烟草黑胫病抗性的产品中的应用；

（z3）权利要求7或8所述试剂盒、权利要求9所述分子标记甲或所述分子标记乙在筛选或辅助筛选具有黑胫病抗性烟草品种或不具有黑胫病抗性烟草品种中的应用；

（z4）权利要求7或8所述试剂盒、权利要求9所述分子标记甲或所述分子标记乙在制备用于筛选或辅助筛选具有黑胫病抗性烟草品种或不具有黑胫病抗性烟草品种的产品中的应用；

（z5）权利要求7或8所述试剂盒、权利要求9所述分子标记甲或所述分子标记乙在烟草育种中的应用；

（z6）权利要求7或8所述试剂盒、权利要求9所述分子标记甲或所述分子标记乙在制备用于烟草育种的产品中的应用。