CN111443198A - 一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，本方法通过胶体金法判断人体体液中是否含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白，从而判断是否患有结核病。本发明提供一种利用胶体金法判断人体体液中是否含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白，其通过试纸条进行检测，其操作简单，一步法即可完成，且检测时间短只需要15min即可得出结果，无需专业技术，即使不在实验室环境下也能完成操作，且成本低，其敏感度和特异性虽然略低于结核菌培养法和GeneXperts的荧光DNA分子生物学方法，但是高于痰抗酸染色法，且其成本低，操作简单，测试时间快，故而适合广泛用于初步的结核病检测。
Description
技术领域
本发明属于结核病检测领域，具体地说是一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法。
背景技术
结核病是严重危害群众健康的经由空气飞沫传染的呼吸道疾病，及病的防治工作负担重，对社会影响很大，是全球每个国家重大公共卫生和社会问题。根据WHO的估算2018年全球新结核患者约1000万人，结核病发病率为10万人有133人。而我国新发的结核病人约90万人，是全球第三高负担国家。我国结核病死亡率稳步下降，但约八成以上的肺结核病人在农村或是流动人口，为结核病防治目标带来巨大挑战。WHO以「终止全球结核病流行」作为2016至2035年重要的目标，其中对肺核病高危险人群进行***筛检为主要的策略，包括:(1)确保活动性结核病的早期检测和适当的治疗；(2)降低治疗不良的风险及结核病治疗的后遗症、社会对立与经济耗损；(3)降低结核病传播，最终目标是减少未来发病率。因此，对于肺结核病如何提供一个快速的，简易的，有效性的，安全性，经济性的筛查检测方法，是属可以遍及到县区级定点医疗机构或者居家中做检测监控及追踪的第一线的初步筛査检测的工具。
结核病的检测自1882年就已经开始使用痰抗酸染色法通过显镜观察分枝杆菌，但是这种方法操作复杂，出报告时间需要两天，还需要特殊的专业技术，且对于实验室要求较高，需要至少二级P2实验室，且敏感度和特异性较低；1980年结核菌培养法诞生，其也需要特殊的专业技术，且对于实验室要求较高，需要至少二级P2实验室，但是其敏感度和特异性远高于痰抗酸染色法，但是其出报告时间太长需要7-56天，且成本高昂远高于痰抗酸染色法的成本，无形中增加了被检测的经济负担；2010年GeneXperts以荧光DNA分子生物学方法来检测活动性结核分枝杆菌的在2小时内以快速方法来检测并鉴定，且不需要特殊专业技术，实验室要求低，普通实验室即可满足要求，且其敏感度和特异性高于结核菌培养法，但是成本十分高昂较之结核菌培养法，大大增加了被测者的经济负担。故而目前需要一种操作简单，检测迅速且成本较低的结核病检测方法。
本公司在研究中发现目前虽然有用结核菌的分泌蛋白作为检测目标物，但是目前还没有人将结核菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白运用到结核病的检测中。
核菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段早就在1996年被Saharan等学者的研究中发现，其从致病性结核分枝杆菌与卡介苗菌株的基因序列中比对出三段具有差异的区域称为RD1、RD2以及RD3。代表这些RDs只存在于致病性的分枝杆菌在所有BCG菌株和大多数的NTM中皆没有存在。有许多研究朝向利用RDs所转译出的蛋白，作为疫苗展或检验诊断工具的相关抗原。RD1是位于MTB基因体中一段9.5kb的DNA片段，此序列中有两段基因编码出两种重要的蛋白，分别是基因位置Rv3875的esxA基因所转译的6kDa早期分泌型抗原标靶( EarlySecretory Antigenarget6，ESAT-6)为早期的小分子分泌蛋白27和基因位置Rv3874的esxB基因所转译的108kDa培养滤液蛋白10（ Culture Filtrate Protein10.cFP-10），其与ESAT6具有相同的操纵子所转译出的分泌性蛋白，是由基因产物在早期培养滤液中出现而命名。两种蛋白都属于T细胞抗原，在人体感染MTB后，此两种抗原能刺激细胞性免疫，引起DTH，当再次受MTB刺激时会大量释出具特异性的干扰素|NFy，具有显着的免疫原性且对MTB有专一性，是目前MTB感染研究最多的蛋白。另外有研究显示，ESAT-6和CFP-10造成的免疫反应，在ATB患显高于LTB感染。故两种蛋白质是做为临床结核菌抗原检测主要的目标RD2是一段10.7kb的DNA片段，可编码出分泌蛋白是基因位置Rv1980c的mpt64基因所转译的24kDa免疫原性蛋白MPT64和基因位置Rv1984c的cfp21基因所转译的21kDa的培养滤液蛋白21(Culture Filtrate Protein21CFP-21)。MPT64是MTB的特异性抗原，不存在于BCG菌株、牛分枝杆菌( Mycobacterium bovis)、瘋疯杆菌( Mycobacterium leprae)和其他分枝杆菌。些研究证实，MPT64是RD2区域表达最显着的抗原之一，具有高度免疫原性，会诱发结核病患者的T细胞增生，产生大量的干扰素|NFY，且只在MTB的活跃分化细胞中发现，是许多应用于TB诊断检测所使用的特异性抗原。RD3是存在于M. bovis和少部分毒力结核菌中，一段9.3kb的DNA片段，不存在于BCG和84%的毒力结核菌。
经过研究以上这些RD1-RD3编码出CFP-10、ESAT6、MPT64分泌蛋白是由活动性结核菌所释放出来的特异性蛋白，因此，我们利用基因重组方法制造特异性和敏感度高的抗体来检测活动性结核菌分泌蛋白的检验试剂，可以直接检测痰液中是否含有这些分泌蛋白，来判断是否有活菌正在代谢分泌这些产物，进而及早发现具高传染力的活动性结核病患者，但是如何能够快速且高效的通过RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白进行检测，是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，用以解决现有技术中的缺陷。
本发明通过以下技术方案予以实现：
一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，本方法通过胶体金法判断人体体液中是否含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白，从而判断是否患有结核病。
如上所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，包括如下步骤 ：
步骤一：获取人体体液样品；
步骤二：对人体体液样品进行处理；
步骤三：取一条带有聚合胶金垫的试纸条对处理后的人体体液样品吸收并进行抗原抗体结合反应，检测其是否含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白；
步骤四：试纸条吸收与处理后的人体体液样品结合完成后，室温下静置15分钟，判断结果。
如上所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，所述的人体体液样品为痰液或尿液。
如上所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，所述的试纸条包括样品垫、聚合胶金垫、硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜检测线、对照线以及吸收垫，所述的试纸条试纸自上而下依次为样品垫、聚合胶金垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，所述的硝酸纤维素膜检测线和对照线设置在硝酸纤维素膜上，所述的硝酸纤维素膜检测线位于对照线下方。
如上所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，所述的聚合胶金垫内有特异性活动性结核分枝杆菌抗体捕捉样品抗原和胶金抗体复合物结合形成抗体-抗原-抗体*的三明治夹心法，确保有效的捕捉到样品抗原，所述的硝酸纤维素膜检测线包被检测抗体，对照线包被可与捕捉抗体结合的对照抗体，吸收垫是样品毛细管现象终结的区域。
如上所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，所述的特异性活动性结核分枝杆菌抗体为氯金酸标记活动性结核分枝杆菌细胞表面释放的分泌蛋白抗体。
如上所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，所述的步骤四中判断结果的依据是：
阳性显示：两条红色反应线，一条位于硝酸纤维素膜检测线区，另一条位于对照线区，阳性结果表示样品中含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白；
阴性显示：一条红色反应线，位于对照线区，硝酸纤维素膜检测线区内无红色反应线，阴性结果表示样品中不含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白；
检测无效：若试纸条都没有出现红色反应线或仅在硝酸纤维素膜检测线区内无红色反应线，表明不正确操作过程或试纸条已变质损坏，需要重试。
如上所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，所述的试纸条的最低检出浓度为4ng/ml。
本发明的优点是：本发明提供一种利用胶体金法判断人体体液中是否含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白，其通过试纸条进行检测，其操作简单，一步法即可完成，且检测时间短只需要15min即可得出结果，无需专业技术，即使不在实验室环境下也能完成操作，且成本低，其敏感度和特异性虽然略低于结核菌培养法和GeneXperts的荧光DNA分子生物学方法，但是高于痰抗酸染色法，且其成本低，操作简单，测试时间快，故而适合广泛用于初步的结核病检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实际应用检测检测结果图之一；
图2是本发明实际应用检测检测结果图之二；
图3是本发明实际应用检测检测结果图之三；
图4是本发明判断结果方法示意图；
图5是本发明的结核菌试纸条结构示意图。
附图标记：1、样品垫；2、聚合胶金垫；3、硝酸纤维素膜；4、硝酸纤维素膜检测线；5、对照线；6、吸收垫。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，本方法通过胶体金法判断人体体液中是否含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白，从而判断是否患有结核病。
优选的，一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，包括如下步骤 ：
步骤一：获取人体体液样品；
步骤二：对人体体液样品进行处理；
步骤三：取一条带有聚合胶金垫的试纸条对处理后的人体体液样品吸收并进行抗原抗体结合反应，检测其是否含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白；
步骤四：试纸条吸收与处理后的人体体液样品结合完成后，室温下静置15分钟，判断结果。
优选的，所述的人体体液样品为痰液或尿液。
优选的，所述的试纸条包括样品垫、聚合胶金垫、硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜检测线、对照线以及吸收垫，所述的试纸条试纸自上而下依次为样品垫、聚合胶金垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，所述的硝酸纤维素膜检测线和对照线设置在硝酸纤维素膜上，所述的硝酸纤维素膜检测线位于对照线下方。
优选的，所述的聚合胶金垫内有特异性活动性结核分枝杆菌抗体捕捉样品抗原和胶金抗体复合物结合形成抗体-抗原-抗体*的三明治夹心法，确保有效的捕捉到样品抗原，所述的硝酸纤维素膜检测线包被检测抗体，对照线包被可与捕捉抗体结合的对照抗体，吸收垫是样品毛细管现象终结的区域。
优选的，所述的特异性活动性结核分枝杆菌抗体为氯金酸标记活动性结核分枝杆菌细胞表面释放的分泌蛋白抗体。
优选的，所述的步骤四中判断结果的依据是：
阳性显示：两条红色反应线，一条位于硝酸纤维素膜检测线区，另一条位于对照线区，阳性结果表示样品中含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白；
阴性显示：一条红色反应线，位于对照线区，硝酸纤维素膜检测线区内无红色反应线，阴性结果表示样品中不含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白；
检测无效：若试纸条都没有出现红色反应线或仅在硝酸纤维素膜检测线区内无红色反应线，表明不正确操作过程或试纸条已变质损坏，需要重试。
优选的，所述的试纸条的最低检出浓度为4ng/ml。
根据大量的医院其其他正规体检的测试结果数据收集，将本申请所用方法与现有技术做出详细的对比，其结果如表一所示：
表一
通过表一的对比可知，本申请的操作方法完全优于痰抗酸染色法，虽然本申请的敏感度与特异性均不如结核菌培养法和荧光分子生物学，但是本申请的方法较结核菌培养法和荧光分子生物学操作简单，使用便捷，且出报告时间最短，最关键的是在确保较高的敏感度与特异性的同时成本低廉，从而能够广泛的应用在一般的身体检查中，便于发现还未确诊的结核病患者，从而使患者得到快速有效的治疗的同时，还能避免其他人群感染，有效的抑制结核病的传播。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，其特征在于：本方法通过胶体金法判断人体体液中是否含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白，从而判断是否患有结核病。
2.根据权利要求1所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤 ：
步骤一：获取人体体液样品；
步骤二：对人体体液样品进行处理；
步骤三：取一条带有聚合胶金垫的试纸条对处理后的人体体液样品吸收并进行抗原抗体结合反应，检测其是否含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白；
步骤四：试纸条吸收与处理后的人体体液样品结合完成后，室温下静置15分钟，判断结果。
3.根据权利要求2所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，其特征在于：所述的人体体液样品为痰液或尿液。
4.根据权利要求2所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，其特征在于：所述的试纸条包括样品垫、聚合胶金垫、硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜检测线、对照线以及吸收垫，所述的试纸条试纸自上而下依次为样品垫、聚合胶金垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，所述的硝酸纤维素膜检测线和对照线设置在硝酸纤维素膜上，所述的硝酸纤维素膜检测线位于对照线下方。
5.根据权利要求4所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，其特征在于：所述的聚合胶金垫内有特异性活动性结核分枝杆菌抗体捕捉样品抗原和胶金抗体复合物结合形成抗体-抗原-抗体*的三明治夹心法，确保有效的捕捉到样品抗原，所述的硝酸纤维素膜检测线包被检测抗体，对照线包被可与捕捉抗体结合的对照抗体，吸收垫是样品毛细管现象终结的区域。
6.根据权利要求5所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，其特征在于：所述的特异性活动性结核分枝杆菌抗体为氯金酸标记活动性结核分枝杆菌细胞表面释放的分泌蛋白抗体。
7.根据权利要求5所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤四中判断结果的依据是：
阳性显示：两条红色反应线，一条位于硝酸纤维素膜检测线区，另一条位于对照线区，阳性结果表示样品中含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白；
阴性显示：一条红色反应线，位于对照线区，硝酸纤维素膜检测线区内无红色反应线，阴性结果表示样品中不含有活动性结核分枝杆菌基因序列中RD1、RD2以及RD3片段所转译出的分泌蛋白；
检测无效：若试纸条都没有出现红色反应线或仅在硝酸纤维素膜检测线区内无红色反应线，表明不正确操作过程或试纸条已变质损坏，需要重试。
8.根据权利要求2所述的一种基于胶体金法快速检测结核菌分泌蛋白的方法，其特征在于：所述的试纸条的最低检出浓度为4ng/ml。
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