CN111437398A

CN111437398A - 转甲状腺素蛋白进入眼内以及在制备滴剂中的应用

Info

Publication number: CN111437398A
Application number: CN202010506950.7A
Authority: CN
Inventors: 辛瑜
Original assignee: Tongyan Shanghai Medical Equipment Co ltd
Current assignee: Yizhou Shanghai Biomedical Co ltd
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2040-06-05
Also published as: CN111437398B; CN110960687A

Abstract

本发明提供了转甲状腺素蛋白作为蛋白质类和/或多肽类药物通过眼部屏障进入眼内的载体方面的应用，所述转甲状腺素蛋白为由SEQ ID NO:1或其突变或其修饰所示氨基酸组成的蛋白质。本发明还提供了转甲状腺素蛋白和/或转甲状腺素蛋白与药物的融合蛋白在制备滴剂中的应用以及一种滴剂，所述药物为蛋白质类和/或多肽类药物。转甲状腺素蛋白在人体内具有较好的生物相容性与安全性，能够有效地将外源蛋白和/或多肽输送到眼内，达到治疗眼部疾病的作用。通过使用滴眼的方式，在治疗DR、AMD、ROP等眼部疾病时，转甲状腺素蛋白可跨越角膜屏障进入玻璃体及眼底，显著抑制眼球视网膜渗漏，显著降低视网膜新生血管数，有效缓解眼部疾病的病理现象。

Description

转甲状腺素蛋白进入眼内以及在制备滴剂中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及转甲状腺素蛋白作为蛋白质类和/或多肽类药物通过眼部屏障进入眼内的载体方面的应用，本发明还涉及转甲状腺素蛋白、和/或转甲状腺素蛋白与蛋白质类和/或多肽类药物组成的融合蛋白在制备滴剂中的应用以及一种滴剂。

背景技术

糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)简称“糖网”，是糖尿病微血管病的临床表现，也是糖尿病最严重的并发症之一，现在已经成为主要的致盲眼病之一。主要是在眼部长期高糖及缺氧的微环境下，逐步发生微血管阻塞、微血管瘤、出血、静脉扩张、黄斑水肿、新生血管、大量玻璃体出血、眼内纤维化、视网膜脱离等临床症状。

老年性黄斑变性(Age-related macular degeneration，AMD)，为黄斑区结构的衰老性改变。主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化的能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出，沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。由于黄斑部结构与功能上的特殊性，此种改变更为明显。玻璃膜疣也见于正常视力的老年人，但由此继发的种种病理改变后，则导致黄斑部变性发生。或者引起Bruch膜断裂，脉络膜毛细血管通过破裂的Bruch膜进入RPE(retinal pigmentepithelium，视网膜色素上皮)下及视网膜神经上皮下，形成脉络膜新生血管，脉络膜新生血管为视网膜下新生血管。由于新生血管壁的结构异常，导致血管的渗漏和出血，进而引发一系列的继发性病理改变。老年性黄斑变性大多发生于45岁以上，其患病率随年龄增长而增高，是当前老年人致盲的重要疾病。

早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)是指在孕36周以下、低出生体重、长时间吸氧的早产儿，其未血管化的视网膜发生纤维血管瘤增生、收缩，并进一步引起牵拉性视网膜脱离和失明。以往曾称为Terry综合征或晶状体后纤维增生症，但后者仅反映了该病的晚期表现。孕期更短或更低出生体重者，发生率可达60％～80％。其病因是由于早产儿出生后在温箱内高氧环境中过度吸氧，而移出温箱后处于相对缺氧的状态，未完全血管化的视网膜对氧产生血管收缩和血管增殖。

针对眼部疾病的治疗，需要将药物有效的传递到眼内，特别是上述糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性以及早产儿视网膜病变等眼部疾病；但由于眼部存在较多的屏障，将药物有效的传递到眼内充满了挑战性。因此，近来眼部给药***受到了广泛的关注。

根据眼部解剖结构，眼部屏障主要包括了泪液屏障、角膜/结膜屏障、以及血眼屏障；多重屏障在保护眼部的同时，能够有效的阻挡外源化学及生物分子的侵入，但也给药物的传递带来了较大的阻碍。目前，眼部常用的给药方式主要包括常规滴眼、结膜下注射及巩膜给药，以及玻璃体内注射给药。其中，常规滴眼液与眼表接触时间较短，由于自身的结构与特性，一些外源药物及蛋白很难有效进入眼内；而结膜下注射及玻璃体内注射通常会带来一定程度的创伤。视网膜激光治疗、玻璃体切除联合硅油填充术这些方法损伤较大，视力恢复不理想。目前治疗DR、AMD以及ROP的最常规手段为玻璃体腔内注射抗vegf抗体，但这种方式通常会带来一定程度的创伤，多次给药必须有较长时间的间隔期。

目前，也有一些专利文献设计了能够有效突破各种眼部屏障到达眼内的功能性小肽，如郑颖，许讯等人的专利(一类新的抑制新生血管的小肽及其应用，CN2013100527142)，苏莉等人的专利(一类抑制新生血管的小肽及其应用，CN201310058978.9)，杨晓璐等人的专利(一种预防和/或治疗炎症反应的小分子多肽及其应用)。

以上研究均存在一定的局限性，眼内注射会带来一定的创伤，而功能性小肽的输送效率较低半衰期较短，为此，有必要寻找更为安全稳定、有效且对眼部无伤害或伤害较小的药物及给药方法。

发明内容

本发明为了克服现有技术中由于眼部屏障的存在而没有能够安全稳定、有效且对眼部无伤害或伤害较小的将药物传递至眼内的给药方法和药物以治疗糖尿病视网膜病变(DR)、老年性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP)等眼部疾病的缺陷，提供了一种转甲状腺素蛋白(TTR)作为蛋白质类和/或多肽类药物通过眼部屏障进入眼内的载体方面的应用，一种转甲状腺素蛋白、和/或转甲状腺素蛋白与蛋白质类和/或多肽类药物组成的融合蛋白在制备滴剂中的应用以及一种滴剂。

本发明人通过大量实验，意外发现通过使用滴剂进行滴眼而非本领域常规的进行注射的方式，转甲状腺素蛋白可有效跨越角膜屏障进入玻璃体及眼底，并且还能有效地输送外源蛋白和/或多肽，由此，可以根据眼部疾病的病理特征，选择合适的蛋白质类和/或多肽类药物，通过转甲状腺素蛋白输送至眼内，从而达到治疗眼部疾病的作用，在医药领域作为注射类药物的替代物方面具有重要的应用前景。

本发明人通过大量实验，还意外地发现在转甲状腺素蛋白跨越角膜屏障进入玻璃体及眼底之后，转甲状腺素蛋白可以显著抑制眼球视网膜渗漏，显著降低视网膜新生血管数，有效缓解DR、AMD、ROP等眼部疾病。即，无需与蛋白质类和/或多肽类药物融合，转甲状腺素蛋白本身即可治疗或缓解DR、AMD、ROP等眼部疾病，并且能够达到足够的治疗浓度和治疗时间(半衰期很长)。

而且，本领域技术人员仅知晓透明质酸具有湿润的作用，并不知晓其可以增加转甲状腺素蛋白的透过量，而本发明人还进一步发现在制备滴剂例如滴眼液时，使用透明质酸可以增加玻璃体腔内及眼底转甲状腺素蛋白的透过量，进而有效增加转甲状腺素蛋白的浓度。

为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了转甲状腺素蛋白作为蛋白质类和/或多肽类药物通过眼部屏障进入眼内的载体方面的应用，所述转甲状腺素蛋白如(a)、(b)或(c)所示：

(a)由SEQ ID NO:1所示氨基酸组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的序列所示的具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的蛋白质；

(c)在(a)或(b)中的氨基酸序列上经过亲水性修饰或疏水性修饰的序列所示的蛋白质。

较佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过22个氨基酸的取代。

较佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过25个氨基酸的取代。

较佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列的T3、T5、I26、N27、H31、R34、A36、A37、D38、D39、T40、S50、E61、E63、V65、I68、K70、I73、A81、H90、E92、P102、R104、T123、K126和/或E127发生取代。更佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过T3G、T5A、I26V、N27D、H31K、R34K、A36T、D39G、T40S、S50A、E61D、E63K、V65T、I68V、K70R、I73L、H90Y、P102H、R104H、T123S、K126Q和E127N的取代。更佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过T3G、T5A、I26V、N27D、H31K、R34K、A36T、A37S、D38E、D39G、T40S、S50A、E61D、E63K、I68V、K70R、I73L、A81T、H90F、E92D、P102H、R104H、T123S、K126Q和E127N的取代。

较佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过5个氨基酸的缺失。更佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列的第123-127位发生缺失。

较佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示。

较佳地，所述(c)中，所述亲水性修饰或疏水性修饰在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上进行。较佳地，所述疏水性修饰为使用长链疏水片段例如正十二烷进行修饰。在本发明某一较佳实施例中，所述蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸通过马来酰亚胺连接正十二烷修饰的序列所示的蛋白质。本发明中，所述的在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸还可以是连接有5-氨基荧光素等荧光标记，以便追踪修饰后的蛋白。

较佳地，所述转甲状腺素蛋白与所述蛋白质类和/或多肽类药物融合表达；所述融合优选是将所述蛋白质类和/或多肽类药物融合在所述转甲状腺素蛋白的N端或C端。

较佳地，所述转甲状腺素蛋白与所述蛋白质类和/或多肽类药物融合是在微生物细胞中表达，并经过纯化。所述的微生物细胞可以为大肠杆菌，所述大肠杆菌包括但不限于E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli K12。所述纯化优选是通过内毒素吸附柱(例如使用Pierce^TMHigh Capacity Endotoxin Removal SpinColumns,ThermoFisher)去除内毒素，再通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。

较佳地，所述蛋白质类和/或多肽类药物包括但不限于：溶菌酶、白蛋白和/或EGFR抗体，且分子量不超过45kDa。其中，所述溶菌酶优选为鸡蛋清溶菌酶，其GenBank登录号为AAL69327.1。其中，所述白蛋白优选为鸡蛋清白蛋白。

较佳地，所述蛋白质类和/或多肽类药物包括治疗糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变的蛋白质类和/或多肽类药物。

较佳地，编码所述转甲状腺素蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

较佳地，所述转甲状腺素蛋白通过使用重组表达载体进行表达，所述重组表达载体的骨架质粒中的启动子为鼠李唐诱导型启动子，优选为rhaPBAD启动子。

较佳地，所述转甲状腺素蛋白通过使用重组表达载体进行表达，所述重组表达载体的骨架载体可以为pET-21a或与其具有25％及以上同源性的载体，所述与其具有25％及以上同源性的载体的序列优选如SEQ ID NO:8所示。

较佳地，表达所述转甲状腺素蛋白的重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

较佳地，所述转甲状腺素蛋白可以是在微生物细胞中进行表达(形成转化体的形式)，并进一步可以经过纯化；所述的微生物细胞可以为大肠杆菌，所述大肠杆菌包括但不限于E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli K12。所述纯化可以是通过内毒素吸附柱(Pierce^TMHigh Capacity Endotoxin Removal Spin Columns,ThermoFisher)去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。

较佳地，表达所述转甲状腺素蛋白时，通过培养包含所述转甲状腺素蛋白的基因的转化体至所得菌体的OD600达到1.5-2.0(例如1.6、1.7、1.8或1.9)时进行表达。

较佳地，表达所述转甲状腺素蛋白时为使用诱导表达的试剂进行诱导表达，所述诱导表达的试剂的质量体积百分比为0.1-2％，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.7％、0.8％、1.2％或1.6％，所述诱导表达的时间优选为8-20h，例如10h、12h、14h、16h、17h、18h或19h；所述诱导表达的试剂优选为鼠李糖或者IPTG。

在本发明某一较佳实施例中，所述应用是将所述转甲状腺素蛋白与所述蛋白质类和/或多肽类药物融合表达所得的融合蛋白，通过滴眼的方式(例如制备成滴剂如滴眼液的形式)作用于眼睛，每日滴加次数为1-3次，每次滴加量为0.6-0.8nmol蛋白/眼。所述滴剂可以是以每日2次、每次1滴、持续3个月进行施用。所述滴剂可以是以每日2次、每次1滴、持续5天进行施用。所述滴剂可以是以每日2次、每次1滴、持续3周进行施用。

为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供了转甲状腺素蛋白、和/或转甲状腺素蛋白与药物组成的融合蛋白在制备滴剂中的应用，所述药物为蛋白质类和/或多肽类药物，所述转甲状腺素蛋白如(a)、(b)或(c)所示：

(a)由SEQ ID NO:1所示氨基酸组成的蛋白质；

较佳地，所述融合蛋白的含量≥4μmol/L，优选10-15μmol/L。

较佳地，所述转甲状腺素蛋白的含量为≥4μmol/L，优选5-30μmol/L，更优选10-20μmol/L，例如15、20、25μmol/L。

较佳地，所述滴剂中还含有生理盐水。

较佳地，所述滴剂中还含有透明质酸，所述透明质酸的质量体积百分比的含量≤6％，优选1-4％，更优选2％。

较佳地，所述滴剂优选滴眼液。

较佳地，所述滴剂优选为治疗糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变的滴剂。

较佳地，所述滴剂的每日滴加次数为1-3次，每次滴加量优选为0.6-0.8nmol蛋白/眼。

较佳地，所述滴剂以每日2次、每次1滴、持续3个月进行施用；和/或，所述滴剂以每日2次、每次1滴、持续5天进行施用；和/或，所述滴剂以每日2次、每次1滴、持续3周进行施用。

较佳地，所述转甲状腺素蛋白通过使用重组表达载体进行表达，所述重组表达载体的骨架载体为pET-21a或与其具有25％及以上同源性的载体，所述与其具有25％及以上同源性的载体的序列优选如SEQ ID NO:8所示。

较佳地，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。

较佳地，所述转甲状腺素蛋白与所述蛋白质类和/或多肽类药物融合表达；所述融合优选是将所述蛋白质类和/或多肽类药物融合在所述转甲状腺素蛋白的N端或C端；所述转甲状腺素蛋白与所述蛋白质类和/或多肽类药物融合优选是在微生物细胞中表达，并经过纯化。所述的微生物细胞可以为大肠杆菌，所述大肠杆菌包括但不限于E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli K12。所述纯化优选是通过内毒素吸附柱去除内毒素，再通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。

较佳地，所述蛋白质类和/或多肽类药物包括但不限于：溶菌酶、白蛋白和/或EGFR抗体，且分子量不超过45kDa；所述溶菌酶优选为鸡蛋清溶菌酶，其GenBank登录号为AAL69327.1；所述白蛋白优选为鸡蛋清白蛋白。

为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种滴剂(例如以滴眼液的形式)，其含有转甲状腺素蛋白、和/或转甲状腺素蛋白与药物组成的融合蛋白；所述药物为蛋白质类和/或多肽类药物，所述转甲状腺素蛋白如(a)、(b)或(c)所示：

(a)由SEQ ID NO:1所示氨基酸组成的蛋白质；

较佳地，当所述滴剂含有转甲状腺素蛋白与蛋白质类和/或多肽类药物组成的融合蛋白时，所述融合蛋白的含量≥4μmol/L，优选10-15μmol/L。

较佳地，当所述滴剂含有转甲状腺素蛋白时，所述转甲状腺素蛋白的含量为≥4μmol/L，优选5-30μmol/L，更优选10-20μmol/L，例如15、20、25μmol/L。

较佳地，所述滴剂中还含有生理盐水。

在本发明某一较佳实施例中，所述滴剂(例如以滴眼液的形式)还含有生理盐水与1-6％透明质酸。

在本发明某一较佳实施例中，所述滴剂(例如以滴眼液的形式)还含有生理盐水与1-4％透明质酸。

在本发明某一较佳实施例中，所述滴剂(例如以滴眼液的形式)还含有生理盐水与2％透明质酸。

较佳地，所述滴剂优选滴眼液。

较佳地，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。

在本发明某一较佳实施例中，上述滴剂例如滴眼液中转甲状腺素蛋白的含量为5-20μmol/L，每日2次，每次1滴，持续3个月。

在本发明某一较佳实施例中，上述滴剂例如滴眼液中转甲状腺素蛋白的含量为10-15μmol/L，每日2次。

在本发明某一较佳实施例中，上述滴剂例如滴眼液中转甲状腺素蛋白的含量为10μmol/L，每日2次。

在本发明某一较佳实施例中，上述滴剂例如滴眼液中转甲状腺素蛋白的含量为5-20μmol/L，每日2次，每次1滴，持续5天。

在本发明某一较佳实施例中，上述滴剂例如滴眼液中转甲状腺素蛋白的含量为5-20μmol/L，每日2次，每次1滴，持续3周。

本发明中，所列的滴眼剂量和滴剂中转甲状腺素蛋白的含量仅为建议。本领域技术人员应当理解的是，根据本发明的剂量和含量进行适度调整以施用于合适的受试者时的用量也应该在本发明的保护范围内。

本发明中，所述的转甲状腺素蛋白是一种四聚体载体蛋白，可在血浆和脑脊液中运输甲状腺激素。研究发现转甲状腺素蛋白进入细胞是通过高密度脂蛋白受体SRB1所介导的(Landers,K.A.,et al.,Transthyretin uptake in placental cells is regulatedby the high-density lipoprotein receptor,scavenger receptor class B member1.Mol Cell Endocrinol,2018.474:p.89-96)。从结构上看(三维结构见图1)，转甲状腺素蛋白的四聚体表面具有显著的亲水结构域(深色)与疏水结构域(浅色)，转甲状腺素蛋白的核心疏水结构域能够携带强疏水的甲状腺素分子跨越各种细胞(见图2)。此外，不同物种的转甲状腺素蛋白的氨基酸序列高度保守，人源的转甲状腺素蛋白与SD大鼠及C57BL/6小鼠来源的转甲状腺素蛋白的氨基酸序列相似度>95％(见图3)。

本发明人在制备滴剂的过程中，发现转甲状腺素蛋白在大肠杆菌内的重组表达水平极低，大部分为不可溶的包涵体形式。常用的提高蛋白表达量的方法有表达载体选择，发酵条件优化(温度、pH值、时间、诱导剂浓度等)或者分子伴侣共表达辅助等，但是本发明人尝试了上述知悉方法均不能有效提升转甲状腺素蛋白在大肠杆菌中的表达水平。本发明人经过大量实验，发现基于pET-21a质粒、利用鼠李唐诱导型(例如rhaPBAD启动子)替代质粒上的启动子(例如T7启动子)后，或对pET-21a质粒的核苷酸序列进行密码子优化(核酸序列如SEQ ID NO:2所示)后，或对于pET-21a质粒本身进行序列重构后，或对表达蛋白时的OD值、诱导蛋白表达的试剂的用量、诱导表达的时间进行优化后，能够构建转甲状腺素蛋白成熟片段(NCBI Reference Sequence:NP_000362.1)的高效生产质粒，从而使得最终所得转甲状腺素蛋白的表达量显著提升。因此，本发明中进一步提供了一种表达转甲状腺素蛋白的基因、包含其的重组表达载体和转化体，一种用于表达转甲状腺素蛋白的重组质粒，一种转甲状腺素蛋白的表达方法等。使用本发明的表达转甲状腺素蛋白的基因、或使用表达转甲状腺素蛋白的重组质粒进行表达、或使用本发明所述的转甲状腺素蛋白的表达方法时，转甲状腺素蛋白的表达量显著提高。具体的：

本发明第四方面还提供了一种表达转甲状腺素蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明第五方面还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体中含如本发明第四方面所述的基因。

较佳地，所述重组表达载体的骨架载体中的启动子为鼠李唐诱导型启动子；所述鼠李唐诱导型启动子优选为rhaPBAD启动子。

较佳地，所述重组表达载体的骨架载体为pET-21a或与pET-21a具有25％及以上同源性的载体，所述与pET-21a具有25％及以上同源性的载体的序列优选如SEQ ID NO:8所示。

更佳地，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明第六方面还提供了一种重组质粒，其序列如SEQ ID NO:8所示。

本发明第七方面还提供了一种表达转甲状腺素蛋白的重组质粒，所述重组质粒包含骨架质粒和转甲状腺素蛋白的表达片段，

其中，所述骨架质粒中的启动子为鼠李唐诱导型启动子；和/或，所述重组表达载体的骨架载体为pET-21a或与其具有25％及以上同源性的载体，所述与其具有25％及以上同源性的载体的序列优选如SEQ ID NO:8所示。

较佳地，编码所述转甲状腺素蛋白表达片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

较佳地，所述鼠李唐诱导型启动子为rhaPBAD启动子。

更佳地，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明第八方面还提供了一种转化体，其包括如本发明第四方面所述的基因、或者如本发明第五方面所述的重组表达载体、或者如本发明第六或七方面所述的重组质粒。

较佳地，在宿主中导入如本发明第四方面所述的基因、如本发明第五方面所述的重组表达载体或者如本发明第六或七方面所述的重组质粒，所述宿主为大肠杆菌，优选为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)、E.coli TG1、E.coli JM109、E.coli DH5α或者E.coli K12。

本发明第九方面还提供了一种转甲状腺素蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

(1)获得如本发明第八方面所述的转化体；

(2)筛选所述转化体，表达并纯化所述蛋白。

较佳地，所述表达为培养所述转化体至所得菌体的OD600达到1.5-2.0(例如1.6、1.7、1.8或1.9)时进行表达。

较佳地，所述表达为使用诱导表达的试剂进行诱导表达，所述诱导表达的试剂的质量体积百分比为0.1-2％，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.7％、0.8％、1.2％或1.6％，所述诱导表达的时间优选为8-20h，例如10h、12h、14h、16h、17h、18h或19h；所述诱导表达的试剂优选为鼠李糖或者IPTG。

本发明第十方面还提供了一种转甲状腺素蛋白的表达方法，其包括获得包含转甲状腺素蛋白的基因的转化体并筛选、表达、纯化所述转甲状腺素蛋白的步骤。

基于上述所述，本发明人通过大量实验，还意外地发现在转甲状腺素蛋白跨越角膜屏障进入玻璃体及眼底之后，转甲状腺素蛋白可以显著抑制眼球视网膜渗漏，显著降低视网膜新生血管数，有效缓解DR、AMD、ROP等眼部疾病。因此，本发明中还进一步提供了转甲状腺素蛋白在制备治疗糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病等眼部疾病的药物中的应用。

本发明第十一方面还提供了转甲状腺素蛋白在制备治疗老年性黄斑变性、早产儿视网膜病变和/或糖尿病视网膜病变的药物中的应用。

较佳地，所述转甲状腺素蛋白以非注射剂型的方式存在，所述非注射剂型优选抹剂或滴剂，所述抹剂优选膏体(如眼药膏)或凝胶(如眼用凝胶)，所述滴剂例如为滴眼液。

较佳地，使用如本发明第四方面所述的基因、如本发明第五方面所述的重组表达载体或者如本发明第六或七方面所述的重组质粒、如本发明第八方面所述的转化体表达所述的转甲状腺素蛋白。

更佳地，所述滴眼液中，所述转甲状腺素蛋白的含量为≥4μmol/L，优选5-30μmol/L，更优选10-20μmol/L，例如15、20、25μmol/L。

更佳地，所述滴眼液中还含有生理盐水。

更佳地，所述滴眼液中还含有透明质酸，所述透明质酸的质量体积百分比的含量≤6％，优选1-4％，更优选2％。

进一步更佳地，所述滴眼液以每日2次、每次1滴、持续3个月进行施用；和/或，所述滴眼液中以每日2次、每次1滴、持续5天进行施用；和/或，所述滴眼液以每日2次、每次1滴、持续3周进行施用。

本发明还提供了转甲状腺素蛋白和/或如本发明第三方面所述的滴剂在治疗眼部疾病中的应用。所述的眼部疾病优选为糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变。所述的转甲状腺素蛋白优选如上所述。

本发明还提供了一种治疗眼部疾病例如糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变等的方法，其包括施用上述转甲状腺素蛋白和/或如本发明第三方面所述的滴剂。

本发明还提供了一种使用上述的转甲状腺素蛋白将外源蛋白和/或多肽通过眼部屏障输送至眼内的方法。

在本发明的某一较佳实施例中，上述融合蛋白的制备方法为：(1)将转甲状腺素蛋白与药物蛋白和/或多肽的编码基因连接在pET 21a(+)质粒上，获得重组质粒；(2)将步骤(1)构建的重组质粒转化至宿主细胞内进行表达；(3)使用TB培养基，发酵温度为30-40℃，OD_600nm达到1.5-2.0时利用0.1-0.5mM IPTG进行诱导，诱导时间为8-16h；(4)通过镍柱亲和吸附纯化制备表达的目标蛋白后，通过内毒素吸附柱(Pierce^TMHigh Capacity EndotoxinRemoval Spin Columns,ThermoFisher)去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。

在本发明的某一较佳实施例中，所述转甲状腺素蛋白的表达和纯化的步骤包括：将构建的pETx-rhaPBAD-ttr质粒(质粒整体的核酸序列如SEQ ID NO:3所示)转化入E.coliBL21(DE3)细胞，将所得重组E.coli BL21(DE3)在LB培养基中培养，制备种子液，再以5％的接种量，接入至5L TB培养基中，温度37℃，搅拌桨转速150rpm，培养至OD₆₀₀为1.5-2.0；加入0.4-2％鼠李糖诱导16-20h。使用内毒素吸附柱(Pierce^TMHigh Capacity EndotoxinRemoval Spin Columns,ThermoFisher)去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1-1所示。

表1-1

所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表1-2所示。

表1-2

本发明的积极进步效果在于：转甲状腺素蛋白在人体内具有较好的生物相容性与安全性，不仅自身能够通过眼部屏障，还能有效地将外源蛋白和/或多肽输送到眼内，达到治疗眼部疾病的作用，在医药领域作为注射药物的替代物方面具有重要的应用前景。本发明中，通过使用滴剂进行滴眼而非直接注射的方式，转甲状腺素蛋白在治疗DR、AMD、ROP等眼部疾病时，转甲状腺素蛋白可跨越角膜屏障进入玻璃体及眼底，显著抑制眼球视网膜渗漏，显著降低视网膜新生血管数，有效缓解DR、AMD、ROP等眼部疾病的病理现象。

附图说明

图1显示了转甲状腺素蛋白(TTR)的三维结构(PDB ID：1ICT)。

图2显示了TTR核心疏水结构域携带强疏水的甲状腺素分子跨越各种细胞。

图3显示了人源TTR与SD大鼠、C57BL/6小鼠、家兔来源的TTR氨基酸序列相似度>95％。

图4为pET 21a(+)-His-tag-TTR-X质粒图。基因序列前端融合表达His-tag序列，并通过Nde I与EcoR I两个限制性内切酶酶切位点连接入质粒；“X”表示与TTR融合的蛋白。

图5为E.coli BL21(DE3)表达人源转甲状腺素蛋白，融合蛋白纯化产物以及绿色荧光蛋白，鸡蛋清溶菌酶与鸡蛋清白蛋白标准品的电泳图谱图谱。

图6显示了TTR滴眼后C57BL/6小鼠及SD大鼠的角膜、玻璃体与眼底样本(视网膜，脉络膜)中TTR的含量。

图7为人源转甲状腺素蛋白及其融合蛋白对大鼠及家兔滴眼两周后，玻璃体腔内目标蛋白的western-blot图谱，左眼为滴加眼，右眼为对照眼。由于人源/大鼠源/兔源TTR具有较高的同源性，TTR经过滴眼后，玻璃体样本使用抗TTR抗体检测存在本底TTR阳性信号；而使用抗His-tag抗体检测时，滴加眼内阳性信号显著上升，说明人源TTR可以有效进入眼内到达玻璃体；TTR与GFP,Lysozyme以及Ovalbumin等外源蛋白融合表达后能有效进入眼内，而未融合表达的上述蛋白则无法进入。

图8显示了TTR滴眼STZ诱导DR SD大鼠后的视网膜渗漏与视网膜新生血管数。

图9显示了TTR滴眼阻止了ROP的造模过程。

图10显示了TTR滴眼抑制了ROP的病理过程。

图11显示了TTR滴眼抑制了AMD模型的病理过程。

图12显示了化学修饰人源TTR的过程。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

第一部分：转甲状腺素蛋白(TTR)及其融合蛋白的制备

实施例1：转甲状腺素蛋白的制备

包括如下步骤：

(1)重组质粒pET 21a(+)-His-tag-TTR的构建：合成核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的His-tag-TTR(其中所用TTR的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，pET 21a购于ATCC)，将其用Nde I和EcoR I酶与pET 21a(+)连接，经测序验证，构建成功。

(2)重组TTR的表达和纯化：将步骤(1)构建的pET 21a(+)-His-tag-TTR质粒转化入E.coli BL21(DE3)细胞，将所得重组E.coli BL21(DE3)在LB培养基中培养，制备种子液，再以5％的接种量，接入至5L TB培养基中，温度37℃，搅拌桨转速150rpm，培养至OD₆₀₀为1.5-2.0；加入0.1-0.5mM IPTG诱导8-16h(表1)。利用高压均质破菌并将上清液通过镍柱亲和吸附制备得到TTR。所得蛋白通过内毒素吸附柱(Pierce^TMHigh Capacity EndotoxinRemoval Spin Columns,ThermoFisher)去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。对TTR蛋白产量进行检测，结果如表1所示。在OD₆₀₀为1.5～1.8时，以0.3～0.5mM IPTG诱导12～14h，可获得的蛋白产量≥17mg/g湿菌体。

表1不同诱导条件下TTR的表达

实施例2：

转甲状腺素蛋白-绿色荧光蛋白的融合蛋白(TTR-GFP)按照如下方法制备：

(1)重组质粒pET 21a(+)-His-tag-TTR-GFP(以下重组质粒pET 21a(+)-His-tag-TTR-X质粒图如图4所示)的构建：合成如SEQ ID NO:5所示的His-tag-TTR-GFP序列，将其用Nde I和EcoR I酶与pET 21a(+)连接，经测序验证，构建成功。

(2)TTR-GFP融合蛋白的表达：将步骤(1)构建的重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)细胞以5％的接种量，接入5L TB培养基，温度37℃，搅拌桨转速150rpm，培养OD_600nm至1.5-2.0；加入0.1-0.5mM IPTG进行诱导8-16h；利用高压均质破菌并将上清液通过镍柱亲和吸附制备得到TTR-GFP融合蛋白。所得蛋白通过内毒素吸附柱(Pierce^TMHigh CapacityEndotoxin Removal Spin Columns,ThermoFisher)去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。对TTR-GFP蛋白产量进行检测，结果如表2所示。在OD₆₀₀为1.5～1.9时，以0.3～0.5mM IPTG诱导12h，可获得的蛋白产量≥10mg/g湿菌体。

表2不同诱导条件下TTR-GFP的表达

实施例3：

转甲状腺素蛋白-鸡蛋清溶酶菌的融合蛋白(TTR-Lysozyme)按照如下方法制备：

(1)重组质粒pET 21a(+)-His-tag-TTR-Lysozyme的构建：合成如SEQ ID NO:6所示的His-tag-TTR-Lysozyme序列，将其用Nde I和EcoR I酶与pET 21a(+)连接，经测序验证，构建成功。

(2)TTR-Lysozyme融合蛋白的表达：将步骤(1)构建的pET 21a(+)-His-tag-TTR-Lysozyme转化入E.coli BL21(DE3)细胞以5％的接种量，接入5L TB培养基，温度37℃，搅拌桨转速150rpm，培养OD_600nm至1.5-2.0；加入0.1-0.5mM IPTG进行诱导8-16h；利用高压均质破菌并将上清液通过镍柱亲和吸附制备得到TTR-Lysozyme融合蛋白。所得蛋白通过内毒素吸附柱(Pierce^TMHigh Capacity Endotoxin Removal Spin Columns,ThermoFisher)去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。对TTR-Lysozyme蛋白产量进行检测，结果如表3所示。

表3不同诱导条件下TTR-Lysozyme的表达

实施例4：

转甲状腺素蛋白-鸡蛋清白蛋白(TTR-Ovalbumin)按照如下方法制备：

(1)重组质粒pET 21a(+)-His-tag-TTR-Ovalbumin的构建：合成如SEQ ID NO:7所示的His-tag-TTR-Ovalbumin序列，将其用Nde I和EcoR I酶与pET 21a(+)连接，经测序验证，构建成功。

(2)TTR-Ovalbumin融合蛋白的表达：将步骤(1)构建的pET 21a(+)-His-tag-TTR-Ovalbumin质粒转化至E.coli BL21(DE3)细胞以5％的接种量，接入5L TB培养基，温度37℃，搅拌桨转速150rpm，培养OD_600nm至1.5-2.0；加入0.1-0.5mM IPTG进行诱导8-16h；利用高压均质破菌并将上清液通过镍柱亲和吸附制备得到TTR-Ovalbumin融合蛋白。所得蛋白通过内毒素吸附柱(Pierce^TMHigh Capacity Endotoxin Removal Spin Columns,ThermoFisher)去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。对TTR-Ovalbumin蛋白产量进行检测，结果如表4所示。

表4不同诱导条件下TTR-Ovalbumin的表达

图5中显示了E.coli BL21(DE3)表达转甲状腺素蛋白，融合蛋白纯化产物以及绿色荧光蛋白、鸡蛋清溶菌酶与鸡蛋清白蛋白标准品的电泳图谱。由图中可知，上述这些蛋白均正确表达。

实施例5人源转甲状腺素蛋白的重组制备

(1)重组质粒pETx-rhaPBAD-ttr的构建：对pET-21a质粒(购于ATCC中国菌种保藏中心)进行改造重构(重构后所得质粒与原始pET-21a质粒在序列上的差别在约75％左右，具体序列如SEQ ID NO:8所示)，利用rhaPBAD启动子(鼠李唐诱导型)替代T7启动子，同时连接人源TTR优化核酸序列(如SEQ ID NO:2所示)，所得质粒整体的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。经测序验证(测序公司为南京金斯瑞生物科技有限公司)，构建成功。

(2)重组人源TTR的表达和纯化：将步骤(1)构建的pETx-rhaPBAD-ttr质粒转化入E.coli BL21(DE3)细胞，将所得重组E.coli BL21(DE3)在LB培养基中培养，制备种子液，再以5％的接种量，接入至5L TB培养基中，温度37℃，搅拌桨转速150rpm，培养至OD₆₀₀为1.5-2.0；加入0.4-2％鼠李糖诱导16-20h(表5)。通过高压均质机将菌体破碎后，上清液通过镍(Ni⁺)柱层析制备得到人源TTR。使用内毒素吸附柱(Pierce^TMHigh Capacity EndotoxinRemoval Spin Columns,ThermoFisher)去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。所得人源TTR蛋白产量如表5所示。在OD₆₀₀为1.5-2.0时，以0.4-2％(质量体积百分比)鼠李糖诱导16-20h，可获得的蛋白产量≥50mg/g湿菌体。

表5人源TTR的重组表达

(3)重组大鼠源TTR和小鼠源TTR的表达和纯化同上所述，仅将人源TTR优化核酸序列替换成对应的鼠源核酸序列，其余的步骤均相同。其中，大鼠源TTR的氨基酸序列如SEQID NO:9所示，小鼠源TTR的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

(4)人源成熟TTR丢失C末端-TNPKE后的蛋白质产物依据上述重组表达的步骤纯化得到，其产物命名为人源TTR-CL，氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

(5)化学修饰人源TTR：设计并合成一段化学修饰基团，其是由马来酰亚胺、正十二烷以及5-氨基荧光素连接而成的疏水性修饰片段(Ex 490nm，Em 520nm)，然后将该化学修饰基团与上述重组表达及纯化的人源TTR中唯一的半胱氨酸(C)残基进行靶向的化学修饰。在4℃情况下，人源TTR与化学修饰基团以1：5的摩尔比例缓慢震荡反应(反应过程如图12所示)。反应终止后，通过超滤去除残留的化学修饰试剂并对TTR进行浓缩，样品通过荧光光谱仪检测，在490nm波长下激发，发射波长为520nm，说明成功对TTR的唯一半胱氨酸残基进行了靶向修饰，将其命名为人源TTR-Modified。

实施例6人源TTR核酸序列优化前后的对比

将实施例5中改造重构后的pET-21a质粒上面的T7启动子利用rhaPBAD启动子(鼠李唐诱导型)进行替代，与核酸序列未优化的人源TTR连接，构建得到重组质粒pETx-rhaPBAD-ttr(未优化)，即所得重组质粒与实施例中重组质粒pETx-rhaPBAD-ttr的区别仅在于ttr是否经过优化。再使用与实施例5第(2)部分相同的方法进行重组人源TTR的表达和纯化，所得结果如下表6所示。由表中可以看出，TTR蛋白均有表达，且在OD600为1.6-2.0时，以1.2～2％鼠李糖诱导17～20h，可获得的蛋白产量≥17mg/g湿菌体，蛋白表达量高。

表6人源TTR的重组表达(pETx-rhaPBAD-ttr(未优化))

第二部分：TTR本身及与蛋白融合后可以通过角膜屏障

实施例7人源TTR滴眼方式跨越角膜屏障进入玻璃体腔及眼底

(1)将实施例5所得的人源TTR配置为10μmol/L(含有生理盐水)，分别对C57BL/6小鼠(购于上海实验动物研究中心，8周龄)及SD大鼠(购于上海实验动物研究中心，8周龄)进行滴眼一滴(～30μl)，等待3h后处死，分别取下角膜、玻璃体与眼底样本(视网膜，脉络膜)，并分别提取蛋白。由于重组人源TTR带有His-tag标签，使用兔抗-His-tag抗体为一抗，驴抗兔抗体为二抗，通过western-blot，测定C57BL/6小鼠及SD大鼠的角膜及玻璃体与眼底样本中，是否存在重组的人源TTR。结果显示，角膜组织提取蛋白中，信号不显著，而玻璃体与眼底样本中信号显著(图6)，说明通过滴眼方式，TTR可跨越角膜屏障进入玻璃体及眼底。

(2)将实施例5所得的人源TTR配置为5-20μmol/L(含有生理盐水，或1-10％低分子量透明质酸)，分别对C57BL/6小鼠(8周龄)及SD大鼠(8周龄)进行滴眼，经过3-72h后处死取玻璃体与眼底样本样本提取蛋白，使用兔抗-His-tag抗体为一抗，驴抗兔抗体为二抗，通过ELISA，测定C57BL/6小鼠及SD大鼠的玻璃体与眼底样本中，人源TTR的含量。结果显示，滴眼液中TTR含量为10-15μmol/L时，滴眼3h后玻璃体与眼底样本人源TTR含量达到最高峰，TTR浓度的增加对玻璃体与眼底样本人源TTR浓度的作用不大；滴眼液中，透明质酸含量为2％时，滴眼3h后玻璃体与眼底样本人源TTR含量达到最高峰；滴眼后，人源TTR在C57BL/6小鼠及SD大鼠玻璃体与眼底样本内的含量半衰期接近60h，说明可以在玻璃体与眼底样本内有效存在60h，有足够的治疗浓度和治疗时间(表7-1)。

表7-1人源TTR跨越C57BL/6小鼠及SD大鼠角膜屏障进入眼底

(3)将实施例5所得的人源TTR以及人源TTR-Modified配置为10μmol/L(含有生理盐水，或2％低分子量透明质酸)，分别对C57BL/6小鼠(8周龄)及SD大鼠(8周龄)进行滴眼，经过3-72h后处死取玻璃体与眼底样本(视网膜，脉络膜)提取蛋白，使用兔抗-His-tag抗体为一抗，驴抗兔抗体为二抗，通过ELISA，测定C57BL/6小鼠及SD大鼠的玻璃体与眼底样本中，人源TTR的含量。结果显示，人源TTR-Modified经过长疏水片段修饰后，进入眼底的效率显著高于未修饰的人源TTR(表7-2)。

表7-2

实施例8：

将实施例1制备的去除内毒素及细菌后的纯化后的TTR蛋白(浓度为4μmol/L)，通过滴眼的方式处理健康SD大鼠(rattus norregicus)(6周龄)及新西兰大耳兔(Oryctolagus cuniculus)(2月龄，～2.5kg)，左眼为滴加蛋白样本眼，右眼滴加生理盐水作为空白对照。每日滴加次数为1-3次，每次滴加量为0.4-0.8nmol。两周后摘取眼球并分离获得玻璃体样本，通过western-blot法初步验证(图7A)TTR能够从眼表进入玻璃体腔，以Anti-His tag抗体为一抗的western-blot结果显示SD大鼠左眼玻璃体内外源TTR的信号强度为右眼的28.7倍，新西兰大耳兔左眼玻璃体内外源TTR的信号强度为右眼的35.6倍；利用ELISA法，以Anti-His tag抗体为一抗测定玻璃体样本内TTR的含量(表8，9)。结果显示，每日以0.6nmol含量滴加2次后，SD大鼠及新西兰大耳兔玻璃体内检测到较高值的外源TTR含量。

此外，图3中显示了人/大鼠/家兔源转甲状腺素蛋白经同源性比对，序列相似性达到近95％，可见图7A中的本体TTR阳性信号是眼内的同源蛋白信号。

表8不同处理方式下TTR到达SD大鼠眼内的效果

表9不同处理方式下TTR到达新西兰大耳兔眼内的效果

实施例9：

将实施例2去除内毒素及细菌后的纯化后的TTR-GFP蛋白(浓度为4μmol/L)，通过滴眼的方式处理健康SD大鼠(rattus norregicus(6周龄)及新西兰大耳兔(Oryctolaguscuniculus)(2月龄，～2.5kg)，左眼为滴加蛋白样本眼，右眼滴加生理盐水作为空白对照。每日滴加次数为1-3次，每次滴加量为0.4-0.8nmol。两周后摘取眼球并分离获得玻璃体样本，通过western-blot法初步验证(图7B)TTR-GFP能够从眼表进入玻璃体腔，以Anti-GFP抗体为一抗的western-blot结果显示SD大鼠左眼玻璃体内外源GFP的信号强度为右眼的62.3倍，新西兰大耳兔左眼玻璃体内外源GFP的信号强度为右眼的47.6倍；以Anti-His tag抗体为一抗的western-blot结果显示SD大鼠左眼玻璃体内外源GFP的信号强度较强而右眼无信号，新西兰大耳兔左眼玻璃体内外源GFP的信号强度为右眼的45.4倍。利用ELISA法以Anti-His tag抗体为一抗测定玻璃体样本内TTR-GFP的含量(表10，11)。结果显示，每日以0.6nmol含量滴加2次后，SD大鼠及新西兰大耳兔玻璃体内检测到较高值的外源GFP含量。

表10不同处理方式下TTR-GFP到达SD大鼠眼内的效果

表11不同处理方式下TTR-GFP到达新西兰大耳兔眼内的效果

实施例10：

将实施例3去除内毒素及细菌后的纯化制备的TTR-Lysozyme蛋白(浓度为4μmol/L)，通过滴眼的方式处理健康SD大鼠(rattus norregicus)(6周龄)及新西兰大耳兔(Oryctolagus cuniculus)(2月龄，～2.5kg)，左眼为滴加蛋白样本眼，右眼滴加生理盐水作为空白对照。每日滴加次数为1-3次，每次滴加量为0.4-0.8nmol。两周后摘取眼球并分离获得玻璃体样本，通过western-blot法初步验证(图7C)TTR-Lysozyme能够从眼表进入玻璃体腔，以Anti-Lysozyme抗体为一抗的western-blot结果显示SD大鼠左眼玻璃体内外源Lysozyme的信号强度为右眼的34.6倍，新西兰大耳兔左眼玻璃体内外源Lysozyme的信号强度较强而右眼无信号；以Anti-His tag抗体为一抗的western-blot结果显示SD大鼠左眼玻璃体内外源Lysozyme的信号强度为右眼的30.2倍，新西兰大耳兔左眼玻璃体内外源Lysozyme的信号强度为右眼的46.3倍。利用ELISA法以Anti-His tag抗体为一抗测定玻璃体样本内TTR-Lysozyme的含量(表12，13)。结果显示，每日以0.6nmol含量滴加2次后，SD大鼠及新西兰大耳兔玻璃体内检测到较高值的外源Lysozyme含量。

表12不同处理方式下TTR-Lysozyme到达SD大鼠眼内的效果

表13不同处理方式下TTR-Lysozyme到达新西兰大耳兔眼内的效果

实施例11：

将实施例4去除内毒素及细菌后，纯化制备的TTR-Ovalbumin蛋白(浓度为4μmol/L)，通过滴眼的方式处理健康SD大鼠(rattus norregicus)(6周龄)及新西兰大耳兔(Oryctolagus cuniculus)(2月龄，～2.5kg)，左眼为滴加蛋白样本眼，右眼滴加生理盐水作为空白对照。每日滴加次数为1-3次，每次滴加量为0.4-0.8nmol。两周后摘取眼球并分离获得玻璃体样本，通过western-blot法初步验证(图7D)TTR-Ovalbumin能够从眼表进入玻璃体腔，以Anti-Ovalbumin抗体为一抗的western-blot结果显示SD大鼠左眼玻璃体内外源Ovalbumin的信号强度为右眼的25.3倍，新西兰大耳兔左眼玻璃体内外源Ovalbumin的信号较强而右眼无信号；以Anti-His tag抗体为一抗的western-blot结果显示SD大鼠左眼玻璃体内外源Ovalbumin的信号信号强度为右眼的37.8倍，新西兰大耳兔左眼玻璃体内外源Ovalbumin的信号强度较强而右眼无信号。利用ELISA法以Anti-His tag抗体为一抗测定玻璃体样本内TTR-Ovalbumin的含量(表14，15)。结果显示，每日以0.6nmol含量滴加2次后，SD大鼠及新西兰大耳兔玻璃体内检测到较高值的外源Ovalbumin含量。

表14不同处理方式下TTR-Ovalbumin到达SD大鼠眼内的效果

表15不同处理方式下TTR-Ovalbumin到达新西兰大耳眼内的效果

第三部分：TTR治疗糖网等眼部疾病

实施例12人源TTR滴眼方式治疗DR SD大鼠

(1)8周龄SD大鼠，体重200-250g，禁食12-18h，腹腔注射2％STZ(60mg/kg)48h及72h后剪尾采血，血糖试纸检测均高于16.7mM，造模成功；STZ大鼠分为2大组，一组为STZ不加任何处理(5只)，一组为实施例5所制得的人源TTR滴眼(25只)组(左眼每日滴加2次TTR(5-20μmol/L)(生理盐水+2％透明质酸)，右眼滴加生理盐水+2％透明质酸；此外，另有1组正常大鼠作为对照(5只)。大鼠继续饲养3个月后，分别剥取视网膜进行EB染色，Trypsin酶解观察新生血管密度；结果显示，STZ诱导糖尿病大鼠饲养3个月后，与正常对照相比，视网膜血管渗漏，新生血管数量均显著提升，而滴加人源TTR的眼球视网膜渗漏现象显著抑制，视网膜新生血管数显著下降(图8)，说明了DR的临床病理现象得到了缓解。其中，每日滴加10μmol/L人源TTR(生理盐水+2％透明质酸)的效果最佳(表16)。

表16人源TTR治疗STZ诱导糖尿病SD大鼠DR病理状况

实施例13人源TTR滴眼方式治疗ROP SD大鼠

出生一周乳鼠(SD大鼠)，放入高压氧舱饲养，对照放入正常环境饲养(正常组，6-8只)。高压氧舱中，一组乳鼠使用5-20μmol/L实施例5所制得的TTR(生理盐水+2％透明质酸)滴眼，每天滴1次，每次30μl(ROP/TTR(造模)组，6只)；高压氧舱中，一组乳鼠使用生理盐水+2％透明质酸滴眼，每天滴1次，每次30μl(ROP组，24只)；高压氧舱饲养5天后，将所有乳鼠从高压氧舱转移至正常环境饲养，并在ROP组中分出一组每日使用5-20μmol/L实施例5所制得的TTR(生理盐水+2％透明质酸)滴眼，每天滴1次，每次30μl(ROP/TTR(成模)组)；而ROP组其余乳鼠则使用生理盐水+2％透明质酸滴眼作为对照；正常环境饲养5天后处死乳鼠并剥取视网膜进行EB染色。

结果如图9所示，图中显示，造模过程中，正常对照组视网膜EB染色形态正常；ROP组存在显著无灌注区及新生血管；而造模同时TTR滴眼的ROP/TTR组则均没有形成显著的无灌注区及畸形新生血管；这说明在缺氧状态下对正常血管有保护作用，对新生血管具有抑制作用(图9)。

对已成模的ROP乳鼠进行TTR(10μmol/L)滴眼，持续5天。比较ROP及ROP/TTR组，在实验后期(5天)，ROP组内畸形新生血管布满视网膜后，出现大量的渗漏区域，而TTR滴眼能够逆转这种趋势(图10)。

不同浓度TTR(5-20μmol/L)对已成模的ROP乳鼠进行滴眼，持续5天。在实验后期(5天)，ROP对照组内畸形新生血管布满视网膜，出现大量的渗漏区域，而TTR滴眼能够逆转这种趋势，其中10μmol/L TTR滴加量效果最佳(表17)。

表17人源TTR治疗高压氧舱诱导SD大鼠乳鼠ROP病理状况

实施例14人源TTR滴眼方式治疗AMD C57BL/6小鼠

9周龄C57/BL6小鼠，用氪激光(647nm)对视网膜进行光凝，功率360mW，直径50um，时间0.05s，每眼8个光凝点，诱导脉络膜新生血管生成，并逐步向视网膜增生移行。对C57小鼠进行TTR滴眼，每日右眼滴加5-20μmol/L实施例5所制得的TTR(生理盐水+2％透明质酸)两次，每次30μL，左眼滴加生理盐水+2％透明质酸作为对照(滴眼组14只，未滴眼组6只，未打激光组2只)；滴眼2周后，处死动物，剥离视网膜并进行Evans Blue染色观察视网膜血管渗漏情况，以及Trypsin酶解观察新生血管密度。

结果如图11所示，图中显示，正常对照组视网膜EB染色形态正常；AMD组存在显著视网膜渗漏及新生血管；而10μmol/L TTR滴眼的AMD/TTR组视网膜渗漏情况及新生血管情况得到显著的缓解(图11)。

不同浓度TTR(5-20μmol/L)对已成模的AMD小鼠进行滴眼，持续两周。AMD对照组内出现较多的渗漏区域，新生血管数量显著增多，而TTR滴眼能够逆转这种趋势，其中10μmol/L TTR滴加量效果最佳(表18)。

表18人源TTR治疗激光视网膜光凝诱导C57BL/6小鼠AMD病理状况

由以上实施例可知，通过TTR滴眼的方式，在DR、AMD以及ROP的动物模型中，能够有效治疗DR、AMD以及ROP的病理状态。

实施例15人源TTR/大鼠源TTR滴眼方式治疗DR SD大鼠

8周龄SD大鼠，体重200-250g，禁食12-18h，腹腔注射2％STZ(60mg/kg)48h及72h后剪尾采血，血糖试纸检测均高于16.7mM，造模成功；STZ大鼠分为4大组，一组为实施例5所制得的人源TTR滴眼(5只)组(左眼每日滴加2次人源TTR(10μmol/L)(生理盐水+2％透明质酸)，右眼滴加生理盐水+2％透明质酸；1组实施例5所制得的大鼠源TTR滴眼(5只)组，左眼每日滴加2次实施例5所制得的大鼠源TTR(10μmol/L)(生理盐水+2％透明质酸)，右眼滴加生理盐水+2％透明质酸；1组实施例5所制得的人源TTR-CL滴眼(5只)组，左眼每日滴加2次实施例5所制得的人源TTR-CL(10μmol/L)(生理盐水+2％透明质酸)，右眼滴加生理盐水+2％透明质酸；1组实施例5所制得的人源TTR-Modified滴眼(5只)组，左眼每日滴加2次实施例5所制得的人源TTR-Modified(10μmol/L)(生理盐水+2％透明质酸)，右眼滴加生理盐水+2％透明质酸；另有非STZ大鼠(未滴眼)作为正常对照组(5只)。大鼠继续饲养3个月后，分别剥取视网膜进行EB染色，Trypsin酶解观察新生血管密度；结果显示，STZ诱导糖尿病大鼠饲养3个月后，与正常对照相比，视网膜血管渗漏，新生血管数量均显著提升，而滴加人源TTR、人源TTR-CL、人源TTR-Modified以及大鼠源TTR的眼球视网膜渗漏现象显著抑制，视网膜新生血管数显著下降，说明了DR的临床病理现象得到了缓解。

表19人源TTR/大鼠源TTR治疗STZ诱导糖尿病SD大鼠DR病理状况

实施例16人源TTR/大鼠源TTR滴眼方式治疗ROP SD大鼠

出生一周乳鼠(SD大鼠)，放入高压氧舱饲养；高压氧舱饲养5天后，将所有乳鼠从高压氧舱转移至正常环境饲养，对已成模的ROP乳鼠进行TTR(10μmol/L)滴眼，持续5天。比较ROP未滴眼组(5只)，ROP+人源TTR滴眼组(5只)，ROP+人源TTR-CL滴眼组(5只)，ROP+人源TTR-Modified滴眼组(5只)，ROP+大鼠源TTR滴眼组(5只，)另有非ROP模型大鼠(未滴眼)作为正常对照组(5只)。ROP组内畸形新生血管布满视网膜后，出现大量的渗漏区域，而TTR滴眼能够逆转这种趋势。

表20人源TTR/大鼠源TTR治疗高压氧舱诱导SD大鼠乳鼠ROP病理状况

实施例17人源TTR/小鼠源TTR滴眼方式治疗AMD C57BL/6小鼠

9周龄C57/BL6小鼠，用氪激光(647nm)对视网膜进行光凝，功率360mW，直径50um，时间0.05s，每眼8个光凝点，诱导脉络膜新生血管生成，并逐步向视网膜增生移行。对C57小鼠进行TTR滴眼，每日右眼滴加10μmol/L人源TTR或小鼠源TTR(生理盐水+2％透明质酸)两次，每次30μL，左眼滴加生理盐水+2％透明质酸作为对照(人源TTR滴眼组5只，人源TTR-CL滴眼组5只，人源TTR-Modified滴眼组5只，小鼠源TTR滴眼组5只，未滴眼组5只)；另有非激光光凝小鼠(未滴眼)作为正常对照组(5只)。滴眼2周后，处死动物，剥离视网膜并进行Evans Blue染色观察视网膜血管渗漏情况，以及Trypsin酶解观察新生血管密度。由表21中可知，滴加人源TTR、人源TTR-CL、人源TTR-Modified以及大鼠源TTR的眼球视网膜渗漏现象显著抑制，视网膜新生血管数显著下降，说明了AMD的临床病理现象得到了缓解。

表21人源TTR/小鼠源TTR治疗激光视网膜光凝诱导C57BL/6小鼠AMD病理状况

对比例1人源TTR使用不同质粒进行重组表达

(1)重组质粒pET-28a-ttr,pQE-30-ttr，pQE-60-ttr的构建：成熟TTR优化的DNA序列(如SEQ ID NO:2所示)通过Nde I及Hind III两个酶切位点连接入pET-28a质粒(pET-28a、pQE-30，pQE-60均购于ATCC)，构建了pET-28a-ttr质粒；成熟TTR优化的DNA序列(如SEQID NO:2所示)通过BamH I及Hind III两个酶切位点连接入pQE-30质粒，构建了pQE-30-ttr质粒；成熟TTR优化的DNA序列(如SEQ ID NO:2所示)通过EcoR I及Hind III两个酶切位点连接入pQE-60质粒，构建了pQE-60-ttr质粒。经测序验证(南京金斯瑞生物科技有限公司)，构建成功。

(2)重组人源TTR的表达和纯化：将步骤(1)构建的pET-28a-ttr,pQE-30-ttr，pQE-60-ttr质粒以及实施例5中所构建的pETx-rhaPBAD-ttr转化入E.coli BL21(DE3)细胞，将所得重组E.coli BL21(DE3)在LB培养基中培养，制备种子液，再以5％的接种量，接入至5LTB培养基中，温度37℃，搅拌桨转速150rpm，培养至OD600为1.5-2.0；前三种培养基加入0.2mM IPTG诱导18h，最后一种培养基加入1.6％鼠李糖诱导18h。通过高压均质机将菌体破碎后，上清液通过Ni+柱层析制备得到人源TTR。使用内毒素吸附柱(Pierce^TMHigh CapacityEndotoxin Removal Spin Columns,ThermoFisher)去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。所得人源TTR蛋白产量如表22所示。

表22人源TTR使用不同质粒进行重组表达

由以上结果可知，使用pET-28a、pQE-30，pQE-60等进行表达时，均不存在可溶性表达。

对比例2

相对于实施例7中的表7，滴加TTR的浓度为1μmol/L时，玻璃体腔内人源TTR的浓度仅为0.10±0.00μmol/L。

对比例3：

具体实施方式同实施例9，区别在于，按照实施例2的方法表达不与TTR融合的GFP蛋白(Genbank登录号为QAA95705.1)，将未融合TTR的GFP蛋白按照实施例9相同的操作步骤对SD大鼠及新西兰大耳兔进行滴眼测试，结果显示，GFP未进入SD大鼠及新西兰大耳兔玻璃体内(表23，24)。

表23每次滴加GFP含量0.6nmol，滴加不同次数后GFP到达SD大鼠眼内的效果

其中，“-”表示未检出。

表24每次滴加GFP含量0.6nmol，滴加不同次数后GFP到达新西兰大耳眼内的效

果

其中，“-”表示未检出。

对比例4：

具体实施方式同实施例10，区别在于，按照实施例3的方法表达不与TTR融合的Lysozyme蛋白(Genbank登录号为:AAL69327.1)，将未融合的Lysozyme蛋白按照实施例10相同的操作步骤对SD大鼠及新西兰大耳兔进行滴眼测试，结果显示，Lysozyme未进入SD大鼠及新西兰大耳兔玻璃体内(表25，26)。

表25每次滴加Lysozyme含量0.6nmol，滴加不同次数后Lysozyme到达SD大鼠眼内的效果

表26每次滴加Lysozyme含量0.6nmol滴加不同次数后不同处理方式下Lysozyme到达新西兰大耳眼内的效果

对比例5：

具体实施方式同实施例11，区别在于，按照实施例4的方法表达不与TTR融合的Ovalbumin蛋白(UniProt登录号为P01012)，将未融合的Ovalbumin蛋白按照实施例11相同的操作步骤对SD大鼠及新西兰大耳兔进行滴眼测试，结果显示，Ovalbumin未进入SD大鼠及新西兰大耳兔玻璃体内(表27，28)。

表27每次滴加Ovalbumin含量0.6nmol，每日滴加不同次数后Ovalbumin到达SD大鼠眼内的效果

表28每次滴加Ovalbumin含量0.6nmol，每日滴加不同次数后Ovalbumin到达新西兰大耳眼内的效果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 童妍（上海）医疗器械有限公司

<120> 转甲状腺素蛋白进入眼内以及在制备滴剂中的应用

<130> P20013185C

<150> 201911302937.3

<151> 2019-12-17

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val

1 5 10 15

Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val

20 25 30

Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys

35 40 45

Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe

50 55 60

Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys

65 70 75 80

Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr

85 90 95

Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser

100 105 110

Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu

115 120 125

<210> 2

<211> 381

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TTR成熟片段优化的核酸序列

<400> 2

ggtccgaccg gtaccggtga atctaaatgc ccgctgatgg ttaaagttct ggacgctgtt 60

cgtggttctc cggctatcaa cgttgctgtt cacgttttcc gtaaagctgc tgacgacacc 120

tgggaaccgt tcgcttctgg taaaacctct gaatctggtg aactgcacgg tctgaccacc 180

gaagaagaat tcgttgaagg tatctacaaa gttgaaatcg acaccaaatc ttactggaaa 240

gctctgggta tctctccgtt ccacgaacac gctgaagttg ttttcaccgc taacgactct 300

ggtccgcgtc gttacaccat cgctgctctg ctgtctccgt actcttactc taccaccgct 360

gttgttacca acccgaaaga a 381

<210> 3

<211> 4693

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 质粒整体核酸序列

<400> 3

aattcttaag aaggagatat acatatgaga ggatcgcatc atcatcatca tcatggatcc 60

ggtccgaccg gtaccggtga atctaaatgc ccgctgatgg ttaaagttct ggacgctgtt 120

cgtggttctc cggctatcaa cgttgctgtt cacgttttcc gtaaagctgc tgacgacacc 180

tgggaaccgt tcgcttctgg taaaacctct gaatctggtg aactgcacgg tctgaccacc 240

gaagaagaat tcgttgaagg tatctacaaa gttgaaatcg acaccaaatc ttactggaaa 300

gctctgggta tctctccgtt ccacgaacac gctgaagttg ttttcaccgc taacgactct 360

ggtccgcgtc gttacaccat cgctgctctg ctgtctccgt actcttactc taccaccgct 420

gttgttacca acccgaaaga atgaaagctt ctgttttggc ggatgagaga agattttcag 480

cctgatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg 540

cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc 600

cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac 660

gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc 720

tcctgagtag gacaaatccg ccgggagcgg atttgaacgt tgcgaagcaa cggcccggag 780

ggtggcgggc aggacgcccg ccataaactg ccaggcatca aattaagcag aaggccatcc 840

tgacggatgg cctttttgcg tttctacaaa ctcttttgtt tatttttcta aatacattca 900

aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 960

aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 1020

cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 1080

ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 1140

cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 1200

ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 1260

gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 1320

gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 1380

acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 1440

cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 1500

acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 1560

ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 1620

ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 1680

gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 1740

atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 1800

ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 1860

attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 1920

ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 1980

aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 2040

aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 2100

ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 2160

tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 2220

ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 2280

cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 2340

agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 2400

gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 2460

ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 2520

tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 2580

tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 2640

cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 2700

tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 2760

gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 2820

atatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac 2880

tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga 2940

cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc 3000

cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg 3060

gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc 3120

cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt 3180

aagggcggtt ttttcctgtt tggtcacttg atgcctccgt gtaaggggga atttctgttc 3240

atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat 3300

gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg 3360

gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt 3420

ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct 3480

gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct 3540

caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca 3600

ttctgctaac cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg 3660

atcatgcgca cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tgcgccgcgt gcggctgctg 3720

gagatggcgg acgcgatgga tatgttctgc caagggttgg tttgcgcatt cacagttctc 3780

cgcaagaatt gattggctcc aattcttgga gtggtgaatc cgttagcgag gtgccgccgg 3840

cttccattca ggtcgaggtg gcccggctcc atgcaccgcg acgcaacgcg gggaggcaga 3900

caaggtatag ggcggcgcct acaatccatg ccaacccgtt ccatgtgctc gccgaggcgg 3960

cataaatcgc cgtgacgatc agcggtccag tgatcgaagt taggctggta agagccgcga 4020

gcgatccttg aagctgtccc tgatggtcgt catctacctg cctggacagc atggcctgca 4080

acgcgggcat cccgatgccg ccggaagcga gaagaatcat aatggggaag gccatccagc 4140

ctcgcgtcgc gaacgccagc aagacgtagc ccagcgcgtc ggccgccatg ccggcgataa 4200

tggcctgctt ctcgccgaaa cgtttggtgg cgggaccagt gacgaaggct tgagcgaggg 4260

cgtgcaagat tccgaatacc gcaagcgaca ggccgatcat cgtcgcgctc cagcgaaagc 4320

ggtcctcgcc gaaaatgacc cagagcgctg ccggcacctg tcctacgagt tgcatgataa 4380

agaagacagt cataagtgcg gcgacgatag tcatgccccg cgcccaccgg aaggagctga 4440

ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta 4500

ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat 4560

gcatcgatca ccacaattca gcaaattgtg aacatcatca cgttcatctt tccctggttg 4620

ccaatggccc attttcctgt cagtaacgag aaggtcgcga attcaggcgc tttttagact 4680

ggtcgtaatg aac 4693

<210> 4

<211> 420

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> His-tag-TTR

<400> 4

atgagaggat cgcatcatca tcatcatcat ggatccggtc cgaccggtac cggtgaatct 60

aaatgcccgc tgatggttaa agttctggac gctgttcgtg gttctccggc tatcaacgtt 120

gctgttcacg ttttccgtaa agctgctgac gacacctggg aaccgttcgc ttctggtaaa 180

acctctgaat ctggtgaact gcacggtctg accaccgaag aagaattcgt tgaaggtatc 240

tacaaagttg aaatcgacac caaatcttac tggaaagctc tgggtatctc tccgttccac 300

gaacacgctg aagttgtttt caccgctaac gactctggtc cgcgtcgtta caccatcgct 360

gctctgctgt ctccgtactc ttactctacc accgctgttg ttaccaaccc gaaagaatga 420

<210> 5

<211> 1137

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> His-tag-TTR-GFP

<400> 5

atgcgtggtt ctcaccacca ccaccaccac ggttctggtc cgaccggtac cggtgaatct 60

aaatgcccgc tgatggttaa agttctggac gctgttcgtg gttctccggc tatcaacgtt 120

gctgttcacg ttttccgtaa agctgctgac gacacctggg aaccgttcgc ttctggtaaa 180

acctctgaat ctggtgaact gcacggtctg accaccgaag aagaatttgt tgaaggtatc 240

tacaaagttg aaatcgacac caaatcttac tggaaagctc tgggtatctc tccgttccac 300

gaacacgctg aagttgtttt caccgctaac gactctggtc cgcgtcgtta caccatcgct 360

gctctgctgt ctccgtactc ttactctacc accgctgttg ttaccaaccc gaaagaaggt 420

tctatgtcta aaggtgaaga actgttcacc ggtgttgttc cgatcctggt tgaactggac 480

ggtgacgtta acggtcacaa attctctgtt tctggtgaag gtgaaggtga cgctacctac 540

ggtaaactga ccctgaaatt catctgcacc accggtaaac tgccggttcc gtggccgacc 600

ctggttacca ccttcaccta cggtgttcag tgcttctctc gttacccgga ccacatgaaa 660

cagcacgact tcttcaaatc tgctatgccg gaaggttacg ttcaggaacg taccatcttc 720

ttcaaagacg acggtaacta caaaacccgt gctgaagtta aattcgaagg tgacaccctg 780

gttaaccgta tcgaactgaa aggtatcgac ttcaaagaag acggtaacat cctgggtcac 840

aaactggaat acaactacaa ctctcacaac gtttacatca tggctgacaa acagaaaaac 900

ggtatcaaag ttaacttcaa aatccgtcac aacatcgaag acggttctgt tcagctggct 960

gaccactacc agcagaacac cccgatcggt gacggtccgg ttctgctgcc ggacaaccac 1020

tacctgtcta cccagtctgc tctgtctaaa gacccgaacg aaaaacgtga ccacatggtt 1080

ctgctggaat ttgttaccgc tgctggtatc acccacggta tggacgaact gtacaaa 1137

<210> 6

<211> 864

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> His-tag-TTR-Lysozyme

<400> 6

atgcgtggtt ctcaccacca ccaccaccac ggttctggtc cgaccggtac cggtgaatct 60

aaatgcccgc tgatggttaa agttctggac gctgttcgtg gttctccggc tatcaacgtt 120

gctgttcacg ttttccgtaa agctgctgac gacacctggg aaccgttcgc ttctggtaaa 180

acctctgaat ctggtgaact gcacggtctg accaccgaag aagaatttgt tgaaggtatc 240

tacaaagttg aaatcgacac caaatcttac tggaaagctc tgggtatctc tccgttccac 300

gaacacgctg aagttgtttt caccgctaac gactctggtc cgcgtcgtta caccatcgct 360

gctctgctgt ctccgtactc ttactctacc accgctgttg ttaccaaccc gaaagaaggt 420

tctatgcgtt ctctgctgat cctggttctg tgcttcctgc cgctggctgc tctgggtaaa 480

gttttcggtc gttgcgaact ggctgctgct atgaaacgtc acggtctgga caactaccgt 540

ggttactctc tgggtaactg ggtttgcgct gctaaattcg aatctaactt caacacccag 600

gctaccaacc gtaacaccga cggttctacc gactacggta tcctgcagat caactctcgt 660

tggtggtgca acgacggtcg taccccgggt tctcgtaacc tgtgcaacat cccgtgctct 720

gctctgctgt cttctgacat caccgcttct gttaactgcg ctaaaaaaat cgtttctgac 780

ggtaacggta tgaacgcttg ggttgcttgg cgtaaccgtt gcaaaggtac cgacgttcag 840

gcttggatcc gtggttgccg tctg 864

<210> 7

<211> 1581

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> His-tag-TTR-Ovalbumin

<400> 7

atgcgtggtt ctcaccacca ccaccaccac ggttctggtc cgaccggtac cggtgaatct 60

aaatgcccgc tgatggttaa agttctggac gctgttcgtg gttctccggc tatcaacgtt 120

gctgttcacg ttttccgtaa agctgctgac gacacctggg aaccgttcgc ttctggtaaa 180

acctctgaat ctggtgaact gcacggtctg accaccgaag aagaatttgt tgaaggtatc 240

tacaaagttg aaatcgacac caaatcttac tggaaagctc tgggtatctc tccgttccac 300

gaacacgctg aagttgtttt caccgctaac gactctggtc cgcgtcgtta caccatcgct 360

gctctgctgt ctccgtactc ttactctacc accgctgttg ttaccaaccc gaaagaaggt 420

tctatgggtt ctatcggtgc tgcttctatg gaattttgct tcgacgtttt caaagaactg 480

aaagttcacc acgctaacga aaacatcttc tactgcccga tcgctatcat gtctgctctg 540

gctatggttt acctgggtgc taaagactct acccgtaccc agatcaacaa agttgttcgt 600

ttcgacaaac tgccgggttt cggtgactct atcgaagctc agtgcggtac ctctgttaac 660

gttcactctt ctctgcgtga catcctgaac cagatcacca aaccgaacga cgtttactct 720

ttctctctgg cttctcgtct gtacgctgaa gaacgttacc cgatcctgcc ggaatacctg 780

cagtgcgtta aagaactgta ccgtggtggt ctggaaccga tcaacttcca gaccgctgct 840

gaccaggctc gtgaactgat caactcttgg gttgaatctc agaccaacgg tatcatccgt 900

aacgttctgc agccgtcttc tgttgactct cagaccgcta tggttctggt taacgctatc 960

gttttcaaag gtctgtggga aaaagctttc aaagacgaag acacccaggc tatgccgttc 1020

cgtgttaccg aacaggaatc taaaccggtt cagatgatgt accagatcgg tctgttccgt 1080

gttgcttcta tggcttctga aaaaatgaaa atcctggaac tgccgttcgc ttctggtacc 1140

atgtctatgc tggttctgct gccggacgaa gtttctggtc tggaacagct ggaatctatc 1200

atcaacttcg aaaaactgac cgaatggacc tcttctaacg ttatggaaga acgtaaaatc 1260

aaagtttacc tgccgcgtat gaaaatggaa gaaaaataca acctgacctc tgttctgatg 1320

gctatgggta tcaccgacgt tttctcttct tctgctaacc tgtctggtat ctcttctgct 1380

gaatctctga aaatctctca ggctgttcac gctgctcacg ctgaaatcaa cgaagctggt 1440

cgtgaagttg ttggttctgc tgaagctggt gttgacgctg cttctgtttc tgaagaattt 1500

cgtgctgacc acccgttcct gttctgcatc aaacacatcg ctaccaacgc tgttctgttc 1560

ttcggtcgtt gcgtttctcc g 1581

<210> 8

<211> 4311

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pET-21a质粒重构后的序列

<400> 8

aattcttaag aaggagatat acatatggga tcccatcatc atcatcatca ttgactgcag 60

ccaagcttct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa 120

cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct 180

gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc 240

catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 300

ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 360

gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 420

ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt 480

tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 540

aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 600

tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 660

aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 720

aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 780

tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc 840

aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 900

tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 960

ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 1020

taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 1080

agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa 1140

caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 1200

tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 1260

gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 1320

cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 1380

caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 1440

ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 1500

aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 1560

gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 1620

atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 1680

tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 1740

gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 1800

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 1860

gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 1920

agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 1980

ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 2040

aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 2100

cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 2160

gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 2220

cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 2280

cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 2340

gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt 2400

attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atatggtgca ctctcagtac 2460

aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg 2520

gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 2580

ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 2640

ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagctgcggt aaagctcatc agcgtggtcg 2700

tgaagcgatt cacagatgtc tgcctgttca tccgcgtcca gctcgttgag tttctccaga 2760

agcgttaatg tctggcttct gataaagcgg gccatgttaa gggcggtttt ttcctgtttg 2820

gtcacttgat gcctccgtgt aagggggaat ttctgttcat gggggtaatg ataccgatga 2880

aacgagagag gatgctcacg atacgggtta ctgatgatga acatgcccgg ttactggaac 2940

gttgtgaggg taaacaactg gcggtatgga tgcggcggga ccagagaaaa atcactcagg 3000

gtcaatgcca gcgcttcgtt aatacagatg taggtgttcc acagggtagc cagcagcatc 3060

ctgcgatgca gatccggaac ataatggtgc agggcgctga cttccgcgtt tccagacttt 3120

acgaaacacg gaaaccgaag accattcatg ttgttgctca ggtcgcagac gttttgcagc 3180

agcagtcgct tcacgttcgc tcgcgtatcg gtgattcatt ctgctaacca gtaaggcaac 3240

cccgccagcc tagccgggtc ctcaacgaca ggagcacgat catgcgcacc cgtggccagg 3300

acccaacgct gcccgagatg cgccgcgtgc ggctgctgga gatggcggac gcgatggata 3360

tgttctgcca agggttggtt tgcgcattca cagttctccg caagaattga ttggctccaa 3420

ttcttggagt ggtgaatccg ttagcgaggt gccgccggct tccattcagg tcgaggtggc 3480

ccggctccat gcaccgcgac gcaacgcggg gaggcagaca aggtataggg cggcgcctac 3540

aatccatgcc aacccgttcc atgtgctcgc cgaggcggca taaatcgccg tgacgatcag 3600

cggtccagtg atcgaagtta ggctggtaag agccgcgagc gatccttgaa gctgtccctg 3660

atggtcgtca tctacctgcc tggacagcat ggcctgcaac gcgggcatcc cgatgccgcc 3720

ggaagcgaga agaatcataa tggggaaggc catccagcct cgcgtcgcga acgccagcaa 3780

gacgtagccc agcgcgtcgg ccgccatgcc ggcgataatg gcctgcttct cgccgaaacg 3840

tttggtggcg ggaccagtga cgaaggcttg agcgagggcg tgcaagattc cgaataccgc 3900

aagcgacagg ccgatcatcg tcgcgctcca gcgaaagcgg tcctcgccga aaatgaccca 3960

gagcgctgcc ggcacctgtc ctacgagttg catgataaag aagacagtca taagtgcggc 4020

gacgatagtc atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg 4080

catcggtcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt 4140

gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc atcgatcacc acaattcagc 4200

aaattgtgaa catcatcacg ttcatctttc cctggttgcc aatggcccat tttcctgtca 4260

gtaacgagaa ggtcgcgaat tcaggcgctt tttagactgg tcgtaatgaa c 4311

<210> 9

<211> 127

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 9

Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val

1 5 10 15

Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Val Asp Val Ala Val Lys Val

20 25 30

Phe Lys Lys Thr Ala Asp Gly Ser Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys

35 40 45

Thr Ala Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Thr Glu Gly Val Tyr Arg Val Glu Leu Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys

65 70 75 80

Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu Tyr Ala Glu Val Val Phe Thr

85 90 95

Ala Asn Asp Ser Gly His Arg His Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser

100 105 110

Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Ser Asn Pro Gln Asn

115 120 125

<210> 10

<211> 127

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Gly Pro Ala Gly Ala Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val

1 5 10 15

Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Val Asp Val Ala Val Lys Val

20 25 30

Phe Lys Lys Thr Ser Glu Gly Ser Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys

35 40 45

Thr Ala Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Val Glu Gly Val Tyr Arg Val Glu Leu Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys

65 70 75 80

Thr Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu Phe Ala Asp Val Val Phe Thr

85 90 95

Ala Asn Asp Ser Gly His Arg His Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser

100 105 110

Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Ser Asn Pro Gln Asn

115 120 125

<210> 11

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源TTR-CL

<400> 11

Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val

1 5 10 15

Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val

20 25 30

Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys

35 40 45

Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe

50 55 60

Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys

65 70 75 80

Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr

85 90 95

Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser

100 105 110

Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val

115 120

Claims

1.转甲状腺素蛋白作为蛋白质类和/或多肽类药物通过眼部屏障进入眼内的载体方面的应用，所述转甲状腺素蛋白如(a)、(b)或(c)所示：

(a)由SEQ ID NO:1所示氨基酸组成的蛋白质；

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过22个氨基酸的取代、25个氨基酸的取代、或5个氨基酸的缺失；

和/或，所述(c)中，所述亲水性修饰或疏水性修饰在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上进行；

较佳地：

所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列的T3、T5、I26、N27、H31、R34、A36、A37、D38、D39、T40、S50、E61、E63、V65、I68、K70、I73、A81、H90、E92、P102、R104、T123、K126和/或E127发生取代；或在(a)中的氨基酸序列的第123-127位发生缺失；优选在(a)中的氨基酸序列上经过T3G、T5A、I26V、N27D、H31K、R34K、A36T、D39G、T40S、S50A、E61D、E63K、V65T、I68V、K70R、I73L、H90Y、P102H、R104H、T123S、K126Q和E127N的取代，或在(a)中的氨基酸序列上经过T3G、T5A、I26V、N27D、H31K、R34K、A36T、A37S、D38E、D39G、T40S、S50A、E61D、E63K、I68V、K70R、I73L、A81T、H90F、E92D、P102H、R104H、T123S、K126Q和E127N的取代；

和/或，所述(c)中，所述蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上使用长链疏水片段例如正十二烷进行修饰；

更佳地：

所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示；

和/或，所述(c)中，所述蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上通过马来酰亚胺连接正十二烷修饰的序列所示的蛋白质。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述转甲状腺素蛋白与所述蛋白质类和/或多肽类药物融合表达；所述融合优选是将所述蛋白质类和/或多肽类药物融合在所述转甲状腺素蛋白的N端或C端；所述转甲状腺素蛋白与所述蛋白质类和/或多肽类药物融合优选是在微生物细胞中表达，并经过纯化；所述纯化优选是通过内毒素吸附柱去除内毒素，再通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体；

和/或，所述蛋白质类和/或多肽类药物包括溶菌酶、白蛋白和/或EGFR抗体，且分子量不超过45kDa；所述溶菌酶优选为鸡蛋清溶菌酶，其GenBank登录号为AAL69327.1；所述白蛋白优选为鸡蛋清白蛋白；

和/或，所述蛋白质类和/或多肽类药物包括治疗糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变的蛋白质类和/或多肽类药物。

4.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，编码所述转甲状腺素蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

和/或，所述转甲状腺素蛋白通过使用重组表达载体进行表达，所述重组表达载体的骨架质粒中的启动子为鼠李唐诱导型启动子，优选为rhaPBAD启动子；

和/或，所述转甲状腺素蛋白通过使用重组表达载体进行表达，所述重组表达载体的骨架载体为pET-21a或与其具有25％及以上同源性的载体，所述与其具有25％及以上同源性的载体的序列优选如SEQ ID NO:8所示；

和/或，表达所述转甲状腺素蛋白的重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

和/或，所述转甲状腺素蛋白是在微生物细胞中表达，并优选经过纯化；所述的微生物细胞优选为大肠杆菌，所述大肠杆菌优选包括E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coliJM109、E.coli DH5α、E.coli K12；所述纯化优选是通过内毒素吸附柱去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体；

和/或，表达所述转甲状腺素蛋白时，通过培养包含所述转甲状腺素蛋白的基因的转化体至所得菌体的OD600达到1.5-2.0，例如1.6、1.7、1.8或1.9时进行表达；

和/或，表达所述转甲状腺素蛋白时为使用诱导表达的试剂进行诱导表达，所述诱导表达的试剂的质量体积百分比为0.1-2％，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.7％、0.8％、1.2％或1.6％，所述诱导表达的时间优选为8-20h，例如10h、12h、14h、16h、17h、18h或19h；所述诱导表达的试剂优选为鼠李糖或者IPTG。

5.转甲状腺素蛋白和/或转甲状腺素蛋白与药物组成的融合蛋白在制备滴剂中的应用，所述药物为蛋白质类和/或多肽类药物，所述转甲状腺素蛋白如(a)、(b)或(c)所示：

(a)由SEQ ID NO:1所示氨基酸组成的蛋白质；

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过22个氨基酸的取代、25个氨基酸的取代、或5个氨基酸的缺失；

较佳地：

更佳地：

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白的含量≥4μmol/L，优选10-15μmol/L；

和/或，所述转甲状腺素蛋白的含量为≥4μmol/L，优选5-30μmol/L，更优选10-20μmol/L，例如15、20、25μmol/L；

和/或，所述滴剂中还含有生理盐水；

和/或，所述滴剂中还含有透明质酸，所述透明质酸的含量≤6％，优选1-4％，更优选2％；

和/或，所述滴剂优选滴眼液；

和/或，所述滴剂优选为治疗糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变的滴剂；

和/或，所述滴剂以每日滴加1-3次、每次滴加量优选为0.6-0.8nmol蛋白/眼进行施用；

和/或，所述滴剂以每日2次、每次1滴、持续3个月进行施用；和/或，所述滴剂以每日2次、每次1滴、持续5天进行施用；和/或，所述滴剂以每日2次、每次1滴、持续3周进行施用；

和/或，编码所述转甲状腺素蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

和/或，表达所述转甲状腺素蛋白时为使用诱导表达的试剂进行诱导表达，所述诱导表达的试剂的质量体积百分比为0.1-2％，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.7％、0.8％、1.2％或1.6％，所述诱导表达的时间优选为8-20h，例如10h、12h、14h、16h、17h、18h或19h；所述诱导表达的试剂优选为鼠李糖或者IPTG；

和/或，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示；

和/或，所述转甲状腺素蛋白与所述蛋白质类和/或多肽类药物融合表达；所述融合优选是将所述蛋白质类和/或多肽类药物融合在所述转甲状腺素蛋白的N端或C端；所述转甲状腺素蛋白与所述蛋白质类和/或多肽类药物融合优选是在微生物细胞中表达，并经过纯化；所述纯化优选是通过内毒素吸附柱去除内毒素，再通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体；

8.一种滴剂，其特征在于，其含有转甲状腺素蛋白和/或转甲状腺素蛋白与药物组成的融合蛋白；所述药物为蛋白质类和/或多肽类药物，所述转甲状腺素蛋白如(a)、(b)或(c)所示：

(a)由SEQ ID NO:1所示氨基酸组成的蛋白质；

9.如权利要求8所述的滴剂，其特征在于，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过22个氨基酸的取代、25个氨基酸的取代、或5个氨基酸的缺失；

较佳地：

更佳地：

10.如权利要求8或9所述的滴剂，其特征在于，当所述滴剂含有转甲状腺素蛋白与药物组成的融合蛋白时，所述融合蛋白的含量≥4μmol/L，优选10-15μmol/L；

和/或，当所述滴剂含有转甲状腺素蛋白时，所述转甲状腺素蛋白的含量为≥4μmol/L，优选5-30μmol/L，更优选10-20μmol/L，例如15、20、25μmol/L；

和/或，所述滴剂中还含有生理盐水；

和/或，所述滴剂优选滴眼液；

和/或，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示；