CN111432834A - 用于增强和维持car-t细胞功效的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种技术，所述技术整体涉及免疫学领域，并且部分地涉及用于激活T细胞和其他细胞从而导致针对靶抗原的免疫应答的组合物和方法。所述技术还涉及用于增强和维持表达嵌合抗原受体的T细胞，同时降低CAR‑T细胞疗法的细胞毒性作用的组合物和方法。

Description

用于增强和维持CAR-T细胞功效的方法
相关专利申请
要求2018年12月8日由Aaron Edward Foster和David Michael Spencer提交的名称为“Methods for Enhancing and Maintaining CAR-T cell Efficacy”的美国临时专利申请序列号62/596,744的优先权，该专利申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
该技术整体涉及免疫学领域，并且部分地涉及用于激活T细胞和其他细胞从而导致针对靶抗原的免疫应答的组合物和方法。该技术还涉及用于增强和维持表达嵌合抗原受体的T细胞，同时降低CAR-T细胞疗法的细胞毒性作用的组合物和方法。
背景技术
T细胞活化是针对环境中的病原微生物(例如，病毒、细菌和寄生虫)、外来蛋白质和有害化学物质的保护性免疫的重要步骤，并且还作为针对癌症和其他过度增殖性疾病的免疫。T细胞在其表面上表达受体(即，T细胞受体)，该受体识别存在于细胞表面上的抗原。在正常免疫应答期间，在MHC抗原呈递的情况下，这些抗原与T细胞受体的结合启动了导致T细胞活化的胞内变化。
嵌合抗原受体(CAR)是设计用于向T细胞传递抗原特异性而不需要MHC抗原呈递的人工受体。表达嵌合抗原受体的T细胞可用于多种疗法，包括癌症疗法。例如，表达CAR的T细胞的过继转移是治疗某些血液恶性肿瘤的有效疗法。在这些患者中，抗肿瘤活性与输注后稳健的CAR-T细胞扩增相关联，后者通常与毒性(即，严重的细胞因子释放综合征和神经毒性)相关联，而CAR-T增殖和持久性差的患者表现出耐久缓解率降低。因此，成功的过继性CAR T细胞疗法需要CAR-T扩增和输注后耐久的持久性，同时平衡CAR-T的效力与安全性。
发明内容
本文提供了用于增强和维持表达嵌合抗原受体的T细胞，同时降低CAR-T细胞疗法的细胞毒性作用的经修饰的细胞群和方法。在一些实施方案中，提供了包含经修饰的T细胞的经修饰的细胞群，其中所述经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中所述嵌合抗原受体包含：跨膜区；T细胞活化分子；以及抗原识别部分，其中经修饰的细胞群中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为3:2或更大。在本申请的一些实施方案中，嵌合抗原受体包含：跨膜区；共刺激多肽细胞质信号传导区、缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区、缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和共刺激多肽细胞质信号传导区、或缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；T细胞活化分子；以及抗原识别部分。在一些实施方案中，经修饰的T细胞包含编码诱导型嵌合促凋亡多肽的第二多核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的T细胞包含编码嵌合信号传导多肽的第二多核苷酸，其中该嵌合信号传导多肽包含：共刺激多肽细胞质信号传导区；缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区；缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和共刺激多肽细胞质信号传导区；或缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区。在一些实施方案中，嵌合信号传导多肽包含膜靶向区。在一些实施方案中，共刺激多肽细胞质信号传导区是激活由MyD88、CD40和/或MyD88-CD40融合嵌合多肽激活的信号传导途径的信号传导区。
在一些实施方案中，经修饰的细胞群包含经修饰的T细胞，该经修饰的T细胞包含核酸，该核酸包含启动子，该启动子可操作地连接至编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸；以及编码嵌合信号传导多肽的第二多核苷酸，其中嵌合信号传导多肽包含：共刺激多肽细胞质信号传导区；缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区；缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和共刺激多肽细胞质信号传导区；或缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区。在一些实施方案中，核酸以5'至3'的顺序包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些实施方案中，第一多核苷酸以5'至3'的顺序编码抗原识别部分、跨膜区和T细胞活化分子，并且第二多核苷酸是编码T细胞活化分子的多核苷酸序列的3'。在一些实施方案中，该核酸包含编码第一多核苷酸和第二多核苷酸之间的接头多肽的第三多核苷酸。在一些实施方案中，该接头多肽包含2A多肽。在一些实施方案中，该核酸包含编码诱导型嵌合促凋亡多肽的第四多核苷酸。在一些实施方案中，共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10，或激活由MyD88、CD40、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10激活的信号传导途径的信号传导区。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含两个共刺激多肽细胞质信号传导区，这两个共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10，或激活由CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10激活的信号传导路径的信号传导区，或激活由MyD88、CD40、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10激活的信号传导途径的信号传导区。在一些实施方案中，嵌合信号传导多肽包含选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10的两个共刺激多肽细胞质信号传导区，或激活由MyD88、CD40、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10激活的信号传导途径的信号传导区。
在一些实施方案中，提供了本申请的经修饰的细胞群，其中80％或更多的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
在一些实施方案中，提供了用于刺激针对受试者的靶细胞或组织的细胞介导免疫应答的方法，包括施用本申请的经修饰的细胞群。在一些实施方案中，提供了用于治疗患有与靶抗原的表达升高相关联的疾病或病症的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的本申请的经修饰的细胞群。在一些实施方案中，提供了用于减小受试者的肿瘤的大小的方法，包括向受试者施用本申请的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与肿瘤上的抗原结合。在一些实施方案中，提供了用于制备本申请的经修饰的细胞群的方法，该方法包括在将包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸的核酸掺入到T细胞中的条件下使具有该核酸的细胞与细胞群接触，并且富集这些T细胞以获得经修饰的细胞群，其中该细胞群中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为3:2或更大。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用经修饰的细胞群的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的经修饰的细胞群与细胞因子或趋化因子中和剂(例如，中和抗体)的组合疗法。在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的经修饰的细胞群与TNFα中和剂(例如，抗TNFα抗体)的组合疗法。
在以下描述、实施例、权利要求和附图中进一步描述了某些实施方案。
附图说明
附图示出了本技术的实施方案，并且不是限制性的。为了清楚和便于说明，附图未按比例绘制，并且在一些情况下，可以夸大或放大的方式示出各个方面以便于理解特定实施方案。
图1A和图1B提供了将常规的第1代CAR与增强的CAR进行比较的示意图，该增强的CAR包括与CD3ζ胞内结构域顺式表达的来自MC的信号传导结构域。这些双顺反子载体也在逆转录病毒载体的第一位置处表达iC9。图1C和图1D：使用流式细胞术的CD3+CD34+表达用于测量转导效率和CAR平均荧光强度(MFI)。图1E：在与CD19+Raji-EGPFluc肿瘤细胞的7天共培养测定中，以1:1的效应细胞与靶细胞(E:T)比率评估非转导(NT)的T细胞或用iC9-CD19.ζ或iC9-CD19.MC.ζ修饰的T细胞的效力。在共培养开始48小时后，通过流式细胞术分析肿瘤和T细胞频率(％)，并通过ELISA评估IL-2的产量。图1F和图1G：在第0天经由尾静脉注射将CD19+Raji-EGFPluc肿瘤细胞植入免疫缺陷型NSG小鼠，随后在肿瘤注射后第4天用NT、iC9-CD19.ζ或iC9-CD19.MC.ζ修饰的T细胞处理。大约每周一次通过生物发光成像(BLI)评估小鼠，以确定肿瘤的生长和CAR-T细胞的活性。图1H：在T细胞注射后第14天评估肿瘤BLI的分析。**表示P值<0.01；***表示P值<0.005。
图2A提供了可用于表达靶向CD19的嵌合抗原受体、MyD88/CD40嵌合共刺激分子和诱导型嵌合iCaspase-9安全开关多肽的构建体的实施例的示意图。图2B提供了流式细胞术数据，表明尽管转导效率不受影响，但由于包含了MyD88信号传导结构域而降低了CAR水平。图2C提供了CD3+CD34+细胞的百分比的图，并且图2D提供了用图2A所示的载体转导的细胞的CD34MFI的图。***表示P值<0.005。
图3A提供了可用于表达靶向CD19的嵌合抗原受体、MyD88/CD40嵌合共刺激分子和诱导型嵌合iCaspase-9安全开关多肽的构建体的实施例的示意图。图3B：比较非转导(NT)的和用每种载体转导的T细胞的转导效率和CAR MFI。标记“CD3(MFI)”的虚线指示NT的和iC9-CD19.ζ的T细胞上CD3表达的近似下限。图3C：评估48小时后NT的和iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞的基础细胞因子产量。图3D：使用抗MyD88、抗Casp-9和β-肌动蛋白抗体对NT、iMC-CD19.ζ和iC9-CD19.ζ-MC进行蛋白质印迹分析，证实CAR-MC的融合和高水平的iCasp-9表达。图3E：建立了长期培养以评估在有或没有外源细胞因子支持(100U/ml IL-2)的情况下基础活化对CAR-T存活和增殖的贡献，表明CAR-MC的基础活性足以在存在IL-2的情况下驱动T细胞扩增。图3F提供了在用普可那利处理经修饰的T细胞之前和之后CD3+CD34+的百分比的图。(左：无普可那利(正方形)；右：加10nM普可那利(圆形))。图3G提供了表达嵌合MyD88/CD40共刺激分子的经修饰的细胞和对照细胞中IL-2产量的图。(从左到右：非转导细胞(正方形)；第14天的iC9-CD19.ζ(三角形)；第14天的iC9-CD19.ζ-MC(倒三角形)；第100天的iC9-CD19.ζ-MC(圆形))；图3H提供了表达嵌合MyD88/CD40共刺激分子的经修饰的细胞和对照细胞中PD-1表达的图。(从左到右：第8天的iC9-CD19.ζ(正方形)；第8天的iC9-CD19.ζ-MC(三角形)；第100天的iC9-CD19.ζ-MC(圆形))；
图4A：在7天后，经由静脉注射，用5×106个非转导(NT)的或1.25×106或5×106个iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞处理植入有CD19+Raji-EGFPluc肿瘤细胞的NSG小鼠。图4B：在肿瘤攻击后的70天内，每周一次通过生物发光成像(BLI)评估肿瘤生长。图4C：测量对照(NT)和CAR-T处理的动物的重量以评估CAR-相关的毒性。小鼠在接受5×106和1×106个iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞后，分别在第6天和第13天表现出>20％的体重减轻。此时，5mg/kg普可那利的单次注射经腹膜内施用，可迅速解决毒性。图4D：在未免疫(未处理的)、NT和CAR处理的情况下评估了在普可那利注射之前以及之后的第24小时的血清细胞因子水平，示出了在药物施用之前高水平的hlFN-y和hlL-6，并且在激活iC9安全开关之后恢复到背景水平。图4E和图4F：随后用Raji-EGFPluc肿瘤细胞再次攻击未免疫小鼠和接受CAR-T细胞和普可那利的小鼠，表明残余iC9-CD19.ζ-MC修饰可有效地控制肿瘤生长。图4G：在肿瘤再攻击后的第25天，处死小鼠，并通过流式细胞术分析脾细胞中CAR-T细胞(CD3+CD34+)的存在，并与原始产物进行频率比较，以及图4H：CAR表达(平均荧光强度；MFI)。在图4H中，“输注前”表示普可那利施用前。***表示P值<0.005。
图5A和图5B：将CD123+THP-1-EGFPIuc肿瘤细胞植入NSG小鼠，并且随后用2.5×106个非转导(NT)的或iC9-CD123.ζ-MC修饰的T细胞处理。使用BLI测量每周评估肿瘤生长(图5B)，并且评估100天存活率(图5C)，显示与iC9-CD19.ζ修饰的T细胞相比，来自表达组成型活性MC的T细胞的稳健且长期的抗肿瘤活性。图5D：类似于靶向CD19的、MC增强的CAR，表达iC9-CD123.ζ-MC的T细胞在NSG动物中显示出类似的毒性，但该体重减轻可通过施用普可那利来解决，而不影响抗肿瘤活性。
图6A：将未修饰的CD19+Raji肿瘤细胞植入NSG小鼠，并且随后在肿瘤注射后第7天用iC9-CD19.ζ-MC和EGFPluc逆转录病毒载体转导的5×106个T细胞处理。经腹膜内注射普可那利(0.00005mg/kg、0.0005mg/kg、0.005mg/kg、0.05mg/kg、0.5mg/kg和5mg/kg)之前以及之后的第24小时和第48小时，通过BLI评估CAR-T细胞水平。测量了CAR-T细胞BLI(图6B)以及在普可那利处理后第24小时的IFN-γ、IL-6、IL-13和TNF-α血清细胞因子水平(图6C)。**、***和****分别表示<0.01、0.005和0.001的P值。
图7A：设计另外的载体以更好地理解CAR-MC基础效应对动物模型中抗肿瘤活性和细胞因子相关毒性的贡献。将iC9-CD19.ζ(i)和iC9-CD19.ζ-MC(ii)与携带高效2A裂解肽(GSG-2A)的构建体(iii)或将MC移至第一位置以消除CAR-MC融合配对的构建体(iiii)进行比较。此外，构建具有肉豆蔻酰化MC结构域的载体，以通过将信号传导结构域连接至细胞膜来增强基础活性(iv)。图7B：通过在不存在抗原的情况下测量IFN-γ和IL-6来评估CAR修饰的T细胞的基础活性。图7C：为了测量CAR-T扩增，将T细胞与CAR载体和EGFPluc共转导，随后施用于携带CD19+Raji的小鼠。图7D和图7E：在第0天(T细胞注射后)、第12天和第19天测量CAR-T扩增。图7F：通过测量体重减轻来评估基于MC的CAR-T细胞的毒性。将表现出>10％体重减轻的组用单次注射0.5mg/kg的普可那利来处理。图7G：在CAR-T细胞注射后第7天评估细胞因子和趋化因子的血清水平。细胞因子/趋化因子水平的变化表示为来自CAR-T输注前样品的倍数变化。
图8A：使用CD28和4-1BB胞内域开发了包含iC9的另外的CD19特异性CAR构建体。将CD19+Raji-EGFPluc肿瘤细胞植入小鼠，随后在肿瘤植入后第7天用非转导(NT)或CAR修饰的T细胞处理。图8B和图8C：每周一次通过生物发光成像测量肿瘤生长。图8D：在第12天(红色箭头)用5mg/kg普可那利处理已用iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞处理的小鼠，以解决CAR相关的急性体重减轻。
图9A：植入有CD19+Raji-EGFPluc肿瘤细胞的NSG小鼠用5×106个非转导(NT)的或iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞处理。随后通过每周两次腹膜内注射处理接受CAR-T细胞的小鼠。观察到在>15％体重减轻之后，注射中和抗体至hlFN-y、hlL-6或hTNF-α或对照非特异性同种型抗体(第15天)。作为对照，向一组给予5mg/kg普可那利以解决毒性。图9B：通过生物发光成像(BLI)测量肿瘤生长，并且通过测量体重减轻测量CAR依赖性毒性。图9C：在中和抗体周期的施用后第-7天、第7天和第14天测量hTNF-α的血清浓度。
图10A：使用MACS柱纯化包含CD4+(高细胞因子产生者)和CD8+(产生低细胞因子)两者的大量群体的转导的T细胞，以用于CD4或CD8表达。图10B：非转导(NT)的、未选择的或CD4选择的和CD8选择的CAR-T细胞的CAR表达。图10C：未选择和选择的CAR-T细胞的纯度。
图11A：将非转导(NT)的、未选择的(CD3+)、CD4选择的和CD8选择的iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞与CD19+Raji肿瘤细胞一起培养，并测量48小时后的IL-6和TNF-α分泌。图11B和图11C：将NT、未选择的、CD4选择的和CD8选择的CAR-T细胞输注到CD19+Raji-EGFPluc细胞中，并通过生物发光成像测量肿瘤生长。处死在CAR-T输注后表现出严重毒性的小鼠。未施用给任何动物时激活iC9的普可那利。图11D：在第4天用6.3×105、1.3×106、2.5×106或5×106个CD8选择的iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞治疗携带CD19+Raji-EGFPluc肿瘤的小鼠，并测量BLI和体重减轻。没有一组接受普可那利来控制CAR相关的毒性。图11E：接受5×106个CD8选择的iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞的小鼠的代表性生物发光图像。箭头表示颅内肿瘤的晚期消退。**和****分别表示<0.01和0.001的P值。
图12提供了转导的和iC9-CD19.ζ-MC转导的细胞中的基础细胞因子产量的图。对于每种细胞因子，从左到右，柱条表示非转导的CD3+细胞、非转导的CD4+细胞、非转导的CD8+细胞、CD3+转导的细胞、CD4+转导的细胞和CD8+转导的细胞。
图13A是来自非转导(NT)的和转导的所选择细胞的IL-6浓度的图；图13B是来自非转导(NT)的和转导的所选择细胞的IL-13浓度的图；图13C是来自非转导(NT)的和转导的所选择细胞的TNF-α浓度的图。
图14A提供了在施用非转导的或增加剂量的转导的CAR-T细胞后荷瘤小鼠的生物发光的图(图右侧上的线，从上到下：NT、0.625、1.25、2.5和5×106个转导细胞)。图14B提供了在施用非转导的或增加剂量的转导的CAR-T细胞后小鼠重量的图(图右侧上的线，从上到下：0.625、2.5或5、1.25×106个转导细胞；第15天，从上到下：NT、1.25、2.5、0.625和5×106个转导细胞)。
图15A提供了非转导T细胞的FAC分析；图15B提供了转导后5天的转导CAR-T细胞的FAC分析，以使用CD34表位测量CAR表达。
图16A提供了CD4选择的iC9-Her2.ζ-MC转导的T细胞的FAC分析；图16B提供了CD8选择的iC9-Her2.ζ-MC转导的CAR-T细胞的FAC分析。
图17A提供了在施用非转导的T细胞后，在荷瘤小鼠中通过卡尺测量的肿瘤大小的图；图17B提供了在施用转导的、未选择的CAR-T细胞后的肿瘤大小的图；图17C提供了在施用转导的、CD4选择的CAR-T细胞后的肿瘤大小的图；图17D提供了在施用转导的、CD8选择的CAR-T细胞后的肿瘤大小的图。
图18A提供了在施用非转导的T细胞后，在荷瘤小鼠中通过生物发光测量的肿瘤大小的图；图18B提供了施用转导的未选择的CAR-T细胞后的肿瘤大小的图；图18C提供了施用转导的CD4选择的CAR-T细胞后的肿瘤大小曲线图；图18D提供了施用转导的CD8选择的CAR-T细胞之后的肿瘤大小的图。
图19A提供了在施用非转导的T细胞后，荷瘤小鼠的体重变化的图；图19B提供了在施用转导的、未选择的CAR-T细胞后的体重变化的图；图19C提供了在施用转导的、CD4选择的CAR-T细胞后的体重变化的图；图19D提供了在施用转导的、CD8选择的CAR-T细胞后的体重变化的图。
图20提供了在施用非转导的或转导的CAR-T细胞后小鼠存活率的图(图右侧，从上到下的线：未选择的、CD8选择的、CD4选择的)；在第20天接触x轴的线为NT。
图21A提供了在非转导的、未选择时转导的、CD4选择时转导的和CD8选择时转导的CAR-T细胞中的CAR表达的图；图21B提供了在非转导的、未选择时转导的、CD4选择时转导的和CD8选择时转导的CAR-T细胞中的CD4纯度的图；图21C提供了在非转导的、未选择时转导的、CD4选择时转导的和CD8选择时转导的CAR-T细胞中的CD8纯度的图。
图22A提供了在施用非转导的、未选择时转导的、CD4选择时转导的和CD8选择时转导的CAR-T细胞后，荷瘤小鼠的生物发光的照片。图22B提供了经处理的小鼠(从左到右、平行于y轴的线：CD4选择的、未选择的、非转导的、CD8选择的)的存活百分比的图。
图23A是在将非转导的细胞施用于荷瘤小鼠后的体重变化的图；图23B是在将未选择的转导CAR-T细胞施用于荷瘤小鼠后的体重变化的图；图23C是在将CD4选择的CAR-T细胞施用于荷瘤小鼠后的体重变化的图；图23D是在将CD8选择的CAR-T细胞施用于荷瘤小鼠后的体重变化的图。
图24A是在将非转导的细胞施用于荷瘤小鼠后的肿瘤大小的图；图24B是在将未选择的转导CAR-T细胞施用于荷瘤小鼠后的肿瘤大小的图；图24C是在将CD4选择的CAR-T细胞施用于荷瘤小鼠后的肿瘤大小的图；图24D是在将CD8选择的CAR-T细胞施用于荷瘤小鼠后的肿瘤大小的图。
图25A提供了长期培养后iC9-CD19.ζ和iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞的FAC分选的结果。图25B提供了长期培养后iC9-CD19.ζ和iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞的T细胞亚群分布的图。
图26A和图26B提供了比较与诱导型Casp-9多肽共表达的组成型MC-CAR多肽和与第一代CAR多肽共表达的诱导型MC多肽的示意图。图26C和图26D提供了测定的略图和使用CD19+Raji肿瘤模型对表达图26A和图26B的多肽的经修饰T细胞的施用结果进行比较的图。
具体实施方式
用于治疗癌症的免疫疗法策略涉及利用患者的免疫***攻击和杀死肿瘤细胞。一种类型的免疫疗法是过继性细胞转移，其中收集受试者的免疫细胞并离体修饰，以在经修饰的细胞返回体内时提供特异性和靶向的肿瘤细胞杀伤。特定过继性细胞转移方法使用CAR修饰的T细胞，并且极有希望用于治疗各种恶性肿瘤。在该疗法中，从患者血液中提取T细胞，并对其进行基因工程改造以在细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)。
如上所述，CAR-T细胞的抗肿瘤活性与输注后稳健的CAR-T细胞扩增相关联，后者通常与毒性(即，严重的细胞因子释放综合征和神经毒性)相关联，而CAR-T增殖和持久性差的患者表现出耐久缓解率降低。在本文所提供的实施例中，证明了来自共刺激分子例如MyD88和CD40(MC)的信号传导可增强CAR-T存活率、增殖能力和抗肿瘤活性。重要的是，也如实施例部分所示，可使用诱导型半胱天冬酶-9(iC9)控制来自这些高活性CAR-T细胞的细胞因子相关毒性以安全地最大化肿瘤杀伤。
不旨在受限于任何理论，实施例中所述的研究显示，产生高水平细胞因子(即，IFN-γ、TNF-α和IL-6)的CAR-T细胞的毒性可通过使用普可那利来解决。此外，可滴定普可那利以“部分地”消除CAR-T细胞，从而保留长期抗肿瘤功效。此外，在发现CAR-T分泌的细胞因子负责恶病质时，CD8+效应T细胞的选择导致毒性水平较低，并且抗肿瘤作用以CD4+辅助细胞非依赖性方式增加。结果在使用具有不同抗原靶标的CAR-T细胞进行的实验中是一致的。
在一个方面，本文所述的发明涉及用于增强和维持表达嵌合抗原受体的T细胞，同时降低CAR-T细胞疗法的细胞毒性作用的组合物和方法。
在一些实施方案中，本发明提供包含CAR-T细胞群的组合物和方法。在一些实施方案中，选择或富集或纯化CAR-T细胞群，以包含例如表达某种标记、受体或细胞表面糖蛋白(例如，CD8、CD4、CD3、CD34)的细胞类型的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，本发明提供包含CAR-T细胞群的组合物和方法，该CAR-T细胞群包含共刺激多肽。共刺激多肽可以是诱导型或组成型活化的。共刺激多肽可包含一个或多个共刺激信号传导区，诸如CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、MyD88或CD40。共刺激多肽可包含激活由CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、MyD88或CD40激活的信号传导途径的一个或多个共刺激信号传导区。在一些实施方案中，选择或富集或纯化包含共刺激多肽的CAR-T细胞群，以包含表达某种标记、受体或细胞表面糖蛋白(例如，CD8、CD4、CD3、CD34)的细胞类型的例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，本发明提供包含CAR-T细胞群的组合物和方法，该CAR-T细胞群包含含有MyD88和/或CD40的共刺激多肽，或激活MyD88和/或CD40信号传导途径的任何合适的细胞质信号传导区。共刺激多肽可以是诱导型或组成型活化的。在一些实施方案中，选择或富集或纯化包含共刺激多肽的CAR-T细胞群，以包含表达某种标记、受体或细胞表面糖蛋白(例如，CD8、CD4、CD3、CD34)的细胞类型的例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，本发明提供包含CAR-T细胞群的组合物和方法，该CAR-T细胞群包含诱导型促凋亡多肽。在一些实施方案中，选择或富集或纯化包含促凋亡多肽的CAR-T细胞群，以包含表达某种标记、受体或细胞表面糖蛋白(例如，CD8、CD4、CD3、CD34)的细胞类型的例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，本发明提供包含CAR-T细胞群的组合物和方法，该CAR-T细胞群包含共刺激多肽和诱导型促凋亡多肽。共刺激多肽可以是诱导型或组成型活化的。在一些实施方案中，选择或富集或纯化包含促凋亡多肽和共刺激多肽的CAR-T细胞群，以包含表达某种标记、受体或细胞表面糖蛋白(例如，CD8、CD4、CD3、CD34)的细胞类型的例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
T细胞
T细胞(也称为T淋巴细胞)属于称为淋巴细胞的一组白细胞。淋巴细胞通常参与细胞介导的免疫。“T细胞”中的“T”是指来源于胸腺或其成熟受胸腺影响的细胞。通过被称为T细胞受体的细胞表面蛋白的存在，可将T细胞与其他淋巴细胞类型诸如B细胞和自然杀伤(NK)细胞区分开来。如本文所用，术语“活化的T细胞”是指已通过识别抗原决定簇(例如，在II类主要组织相容性(MHC)标记的背景下呈递的抗原决定簇)而被刺激产生免疫应答(例如，活化的T细胞的克隆扩增)的T细胞。T细胞通过抗原决定簇、细胞因子和/或淋巴因子和分化细胞表面蛋白(例如CD3、CD4、CD8等以及它们的组合)的簇的存在而被活化。表达一簇分化蛋白的细胞通常被称为对该蛋白在T细胞表面上的表达是“阳性的”(例如，对CD3、CD4或CD8表达呈阳性的细胞被称为CD3+、CD4+或CD8+)。CD3蛋白和CD4蛋白为可直接和/或间接参与T细胞信号转导的细胞表面受体或共受体。
T细胞在其表面上表达受体(即，T细胞受体)，该受体识别存在于细胞表面上的抗原。在正常免疫应答期间，在MHC抗原呈递的情况下，这些抗原与T细胞受体的结合启动了导致T细胞活化的胞内变化。嵌合抗原受体(CAR)是设计用于向T细胞传递抗原特异性而不需要MHC抗原呈递的人工受体。它们包括抗原特异性组分、跨膜组分和经选择以激活T细胞并提供特异性免疫的胞内组分。表达嵌合抗原受体的T细胞可用于多种疗法，包括癌症疗法。
所谓“嵌合抗原受体”或“CAR”是指例如嵌合多肽，该嵌合多肽包含识别靶抗原(抗原识别结构域、抗原识别区、抗原识别部分或抗原结合区)的多肽序列，该靶抗原连接至被选择用于激活T细胞并提供特异性免疫的跨膜多肽和胞内结构域多肽。抗原识别结构域可为结合至抗原的任何多肽或其片段，诸如天然来源的或合成的抗体片段可变结构域。抗原识别部分的示例包括但不限于来源于抗体的多肽，诸如单链可变片段(scFv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段和Fv片段；来源于T细胞受体的多肽，诸如TCR可变结构域；来源于模式识别受体的多肽，以及结合至胞外同源蛋白的任何配体或受体片段。
所谓“T细胞活化分子”是指当掺入到表达嵌合抗原受体的T细胞中时增强T细胞活化的多肽。示例包括但不限于含ITAM的信号1赋予分子诸如CD3ζ多肽，以及赋予Fc受体γ诸如Fcε受体γ(FcεRIy)亚基(Haynes,N.M.等人，J.Immunol.，第166卷，第182-187页，2001年，J.Immunology)。胞内结构域包含至少一种引起T细胞活化的多肽，例如但不限于CD3ζ。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)的基本组分包括以下组分。肿瘤特异性单克隆抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)与来自T细胞受体复合物的CD3ζ链(ζ)框内融合。VH和VL通常使用柔性甘氨酸-丝氨酸接头连接在一起，然后通过间隔区(例如CD8a茎部或CH2CH3)连接到跨膜结构域，以使scFv远离细胞表面延伸，使得其可与肿瘤抗原相互作用。
术语“嵌合抗原受体”还可指并非来源于抗体但为嵌合T细胞受体的嵌合受体。这些嵌合T细胞受体可包含识别靶抗原的多肽序列，其中该识别序列可为例如但不限于来源于T细胞受体或scFv的识别序列。胞内结构域多肽是用于活化T细胞的那些多肽。嵌合T细胞受体在例如Gross,G.和Eshhar,Z.，FASEB Journal，第6卷，第3370-3378页，1992年和Zhang,Y.等人，PLOS Pathogens，第6卷，第1-13页，2010年中有所讨论。
在一些实施方案中，本发明提供包含CAR-T细胞群的组合物和方法。在一些实施方案中，选择或富集或纯化CAR-T细胞群，以包含例如表达某种标记、受体或细胞表面糖蛋白(例如，CD8、CD4、CD3、CD34)的细胞类型的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，CAR-T细胞群包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些实施方案中，富集CAR-T细胞群以包含至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的CD8+T细胞。在一些实施方案中，富集CAR-T细胞群以包含至少80％的CD8+T细胞。在一些实施方案中，富集CAR-T细胞群以包含至少90％的CD8+T细胞。因此，在一些实施方案中，在组合物中存在比经基因修饰的CD4+T细胞更多的经基因修饰的CD8+T细胞，即，CD4+细胞与CD8+细胞的比率小于1，例如，小于0.9、小于0.8、小于0.7、小于0.6或小于0.5。
共刺激
在一些实施方案中，本发明提供包含CAR-T细胞群的组合物和方法，该CAR-T细胞群包含共刺激多肽。
尽管CAR首先设计有单个信号传导结构域，例如CD3ζ，也称为“第一代CAR”(参见，例如，Becker等人，1989年，Cell，第58卷，第911-921页；Goverman等人，1990年，Cell，第60卷，第929-939页；Gross等人，1989年，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，第86卷，第10024-10028页；Kuwana等人，1987年，Biochem Biophys Res Commun，第149卷，第960-968页)，但评估CAR免疫疗法可行性的临床试验显示出有限的临床有益效果(参见例如，Till等人，2012年，Blood，第19卷，第3040-3050页；Pule等人，2008年，Nat Med，第14卷，第1264-1270页；Jensen等人，2010年，Biol Blood Marrow Transplant，第16卷，第1245-1256页；Park等人，2007年，Mol Ther，第15卷，第825-833页)。有限的临床有益效果主要归因于肿瘤识别后T细胞的不完全活化，这导致体内细胞的有限持久性和扩增(参见例如，Ramos等人，2011年，Expert Opin Biol Ther，第11卷，第855-873页)。
为了解决该缺陷，CAR已被工程改造为包括另一刺激结构域，该刺激结构域通常来源于T细胞共刺激分子的细胞质部分，包括CD28、4-1BB、OX40、ICOS和DAP10(参见例如，Carpenito等人，2009年，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，第106卷，第3360-3365页；Finney等人，1998年，J Immunol，第161卷，第2791-2797页；Hombach等人，J Immunol，第167卷，第6123-6131页；Maher等人，2002年，Nat Biotechnol，第20卷，第70-75页；Imai等人，2004年，Leukemia，第18卷，第676-684页；Wang等人，2007年，Hum Gene Ther，第18卷，第712-725页；Zhao等人，2009年，J Immunol，第183卷，第5563-5574页；Milone等人，2009年，Mol Ther，第17卷，第1453-1464页；Yvon等人，2009年，Clin Cancer Res，第15卷，第5852-5860页)，其允许CAR-T细胞在与靶抗原结合时接受适当的共刺激。最常用的共刺激分子包括CD28和4-1BB，其在肿瘤识别后可启动信号级联放大，导致NF-kB活化，从而促进T细胞增殖和细胞存活。用具有CD28或4-1BB信号传导结构域的抗CD19CAR进行的用于治疗难治性急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的临床试验已证明过继性转移后显著的T细胞持久性、扩增和系列肿瘤杀伤(Kalos等人，2011年，Sci Transl Med，第3卷，第95ra73页；Porter等人，2011年，N EnglJ Med，第365卷，第725-733页；Brentjens等人，2013年，Sci Transl Med，第5卷，第177ra38页)。第三代CAR-T细胞将CD28修饰的CAR与来自肿瘤坏死因子(TNF)家族蛋白的另外的信号分子附加在一起，另外的信号分子诸如OX40和4-1BB(Finney HM等人，J Immunol，第172卷，第104-113页，2004年；Guedan S等人，Blood，2014年)。
由于高度活化的T细胞引起的细胞因子风暴和肿瘤溶解综合征，一些第二代和第三代CAR-T细胞与患者死亡有关。在一个方面，本文所述的发明涉及包含CAR-T细胞的组合物和方法，该CAR-T细胞包含共刺激多肽，这些组合物和方法用于增强和维持表达嵌合抗原受体的T细胞，同时降低CAR-T细胞疗法的细胞毒性作用。
本发明的共刺激多肽可以是诱导型或组成型活化的。共刺激多肽可包含一个或多个共刺激信号传导区，诸如CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、MyD88或CD40，或例如其胞质区。共刺激多肽可包含激活由CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、MyD88或CD40激活的信号传导途径的一个或多个合适的共刺激信号传导区。共刺激多肽包括激活肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族(即，CD40、RANK/TRANCE-R、OX40、4-1BB)和CD28家族成员(CD28、ICOS)的NF-kB途径、Akt途径和/或p38途径的任何分子或多肽。多于一种共刺激多肽或共刺激多肽胞质区可在本文讨论的经修饰的T细胞中表达。
在一些实施方案中，选择或富集或纯化包含共刺激多肽的CAR-T细胞群，以包含表达某种标记、受体或细胞表面糖蛋白(例如，CD8、CD4、CD3、CD34)的细胞类型的例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，包含共刺激多肽的CAR-T细胞群包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些实施方案中，富集包含共刺激多肽的CAR-T细胞群以包含至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的CD8+T细胞。在一些实施方案中，富集包含共刺激多肽的CAR-T细胞群以包含至少80％的CD8+T细胞。在一些实施方案中，富集包含共刺激多肽的CAR-T细胞群以包含至少90％的CD8+T细胞。因此，在一些实施方案中，在组合物中存在比经基因修饰的CD4+T细胞更多的经基因修饰的CD8+T细胞，即，CD4+细胞与CD8+细胞的比率小于1，例如，小于0.9、小于0.8、小于0.7、小于0.6或小于0.5。
由MyD88和CD40提供的共刺激
在一些实施方案中，本文所述的CAR T细胞群包含共刺激多肽。共刺激多肽可包含激活由CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、MyD88或CD40激活的信号传导途径的一个或多个共刺激信号传导区。
第二代CAR的主要功能之一是产生IL-2的能力，该IL-2通过CD3ζ(信号1)和由CD28或4-1BB.32激活的NF-kB(信号2)激活活化T细胞核因子(NFAT)转录因子来支持T细胞存活和生长。类似地激活NF-kB的其他分子也可与CAR分子内的CD3ζ链配对。一种方法采用最初作为树突状细胞(DC)疫苗的佐剂开发的T细胞共刺激分子(Narayanan等人，2011年，J ClinInvest，第121卷，第1524-1534页；Kemnade等人，2012年，Mol Ther，第20卷，第7期，第1462-1471页)。对于DC的完全活化或许可，通常涉及Toll样受体(TLR)信号传导。在TLR信号传导中，TLR的胞质TLR/IL-1结构域(称为TIR结构域)发生二聚化，这导致募集和结合胞质衔接蛋白，例如髓样分化主反应蛋白(MyD88；全长氨基酸序列参见SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:83，编码它的核苷酸序列参见SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:84)。
在一些实施方案中，本文所述的CAR T细胞群包含共刺激多肽，该共刺激多肽包含激活由MyD88、CD40和/或MyD88-CD40融合嵌合多肽激活的信号传导途径的一个或多个共刺激信号传导区。
MyD88是TLR的通用衔接分子和先天免疫***的关键信号传导组分，触发对外来入侵者的警报，引发免疫细胞募集和活化。MyD88是在先天和适应性免疫应答中起核心作用的胞质衔接蛋白。该蛋白质在白介素-1和Toll样受体信号传导途径中用作必需的信号转导子。这些途径调控许多促炎基因的激活。所编码的蛋白质由N末端死亡结构域和C末端Toll-白介素1受体结构域组成。MyD88TIR结构域能够与TLR异源二聚化并与其他MyD88蛋白同源二聚化。这继而通过MyD88氨基末端的死亡结构域(DD)和IRAK激酶的相互作用导致IRAK家族激酶的募集和激活，从而启动了导致JNK、p38MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)和NF-kB(诱导细胞因子和趋化因子编码的基因(以及其他基因)表达的转录因子)激活的信号传导途径。MyD88经由IRAK1、IRAK2、IRF7和TRAF6起作用，导致NF-kappa-B激活、细胞因子分泌和炎性反应。它还激活IRF1，导致其快速迁移到核中，以介导IFN-β、NOS2/INOS和IL12A基因的有效诱导。MyD88介导的肠上皮细胞信号传导对于维持肠内稳态是至关重要的，并且控制抗微生物凝集素REG3G在小肠中的表达。TLR信号传导还上调肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员CD40的表达，CD40与抗原引发的CD4+T细胞上的CD40配体(CD154或CD40L)相互作用。
CD40是适应性免疫应答的重要部分，有助于通过与其同源CD40L结合来激活APC，继而极化更强的CTL反应。CD40/CD154信号传导***是T细胞功能和B细胞与T细胞相互作用中的重要组成部分。CD40信号传导通过CD40同源二聚体的形成以及与TNFR相关因子(TRAF)的相互作用而继续进行，通过将TRAF募集至CD40的胞质结构域来进行，这导致T细胞活化，该活化涉及几种次要信号，诸如NF-kB、JNK和AKT途径。
除存活和生长优势之外，基于MyD88或MyD88-CD40融合嵌合多肽的共刺激还可为CAR修饰的T细胞提供另外的功能。MyD88信号传导对于Th1和Th17反应均至关重要，并经由IL-1发挥作用，以使CD4+T细胞不易受到调节性T细胞(Treg)驱动的抑制的影响(参见例如，Schenten等人，2014年，Immunity，第40卷，第78-90页)。此外，CD8+T细胞中经由Ras、PI3K和蛋白激酶C进行的CD40信号传导会导致NF-KB依赖性诱导细胞毒性介质颗粒酶和穿孔素，这两者裂解CD4+CD25+Treg细胞(Martin等人，2010年，J Immunol，第184卷，第5510-5518页)。因此，MyD88和CD40的共激活可使CAR-T细胞对Treg细胞的免疫抑制作用产生抗性，这是在实体瘤和其他类型的癌症的治疗中可能非常重要的功能。
免疫细胞(包括T细胞)中的MyD88和CD40可在下游作用于转录因子，以上调促炎细胞因子I型IFN，并促进增殖和存活。MyD88/CD40与来自CAR的CD3ζ的信号传导输入一起构成了有效且多效的共刺激分子。在一些实施方案中，本发明提供包含共刺激多肽的CAR T细胞，该共刺激多肽包含激活由MyD88、CD40和/或MyD88-CD40融合嵌合多肽激活的信号传导途径的一个或多个共刺激信号传导区。合适的共刺激信号传导区的示例包括但不限于IRAK-4、IRAK-1、TRAF6、TRAF2、TRAF3、TRAF5、Act、JAK3或其任何功能片段。
共刺激CAR-T细胞的一种方法是表达MyD88的信号传导元件的融合蛋白(称为MC)。此类细胞的存活和生长可通过由CD3ζ(信号1)和由MyD88和CD40激活的NF-kB(信号2)激活NFAT转录因子来增强，该CD3ζ是嵌合抗原受体的一部分。对于缺少膜靶向区的细胞质MyD88/CD40嵌合融合蛋白，以及对于包含MyD88/CD40和膜靶向区(例如，肉豆蔻酰化区)的嵌合融合蛋白，观察到表达MC的CAR-T细胞的活化。CAR-T细胞可共表达诱导型嵌合信号传导多肽，该多肽包含多聚体配体结合区诸如FKBP12v36，以及MyD88多肽或截短的MyD8多肽，或者MyD88-CD40或截短的MyD88-CD40多肽(iMC)。同时表达iMC和第一代CAR的细胞允许需要通过CAR进行iMC和肿瘤识别两者的完全T细胞活化，从而导致IL-2产生、CD25受体上调和T细胞扩增，并且治疗功效由AP1903在体内控制。在一些实施方案中，诱导型嵌合信号传导多肽包含两个共刺激多肽细胞质信号传导区，诸如4-1BB和CD28，或一个或两个或更多个选自CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10而不是MyD88、截短的MyD88、MyD88-CD40或截短的MyD88-CD40多肽的共刺激多肽细胞质信号传导区。在一些实施方案中，CAR-T细胞包含编码第一多核苷酸(其编码诱导型嵌合信号传导多肽)和第二多核苷酸(其编码CAR)的核酸。在一些实施方案中，第一多核苷酸位于第二多核苷酸的5'端。在一些实施方案中，第一多核苷酸位于第二多核苷酸的3'端。在一些实施方案中，编码接头多肽的第三多核苷酸位于第一多核苷酸和第二多核苷酸之间。在一些实施方案中，接头多肽为2A多肽，其可在翻译期间或翻译后分离由第一多核苷酸和第二多核苷酸编码的多肽。
所谓MyD88或MyD88多肽是指髓样分化主反应基因88的多肽产物，例如但不限于人型式，称为ncbi基因ID 4615。MyD88多肽的一个示例如SEQ ID NO:83所示。MyD88多肽的另一个示例如SEQ ID NO:35所示。所谓“截短的”是指蛋白质不是全长的并且可缺少例如结构域。例如，截短的MyD88不是全长的，并且可例如缺失TIR结构域。在一些实施方案中，截短的MyD88多肽由SEQ ID NO:28的核酸序列编码，并且包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。所谓编码“截短的MyD88”的核酸序列是指编码截短的MyD88肽的核酸序列，该术语也可指包括编码作为克隆产物添加的任何氨基酸(包括由接头编码的任何氨基酸)的部分的核酸序列。应当理解，在方法或构建体是指截短的MyD88多肽的情况下，也可使用该方法，或者该构建体被设计成指另一种MyD88多肽，诸如全长MyD88多肽。在方法或构建体是指全长MyD88多肽的情况下，也可使用该方法，或者该构建体被设计成指截短的MyD88多肽。MyD88多肽的“功能等同”或“功能片段”是指，例如，无论是否缺少TIR结构域，当在细胞(例如，T细胞、NK细胞或NK-T细胞)中表达时均能够通过例如激活NFkB途径来扩增细胞介导的肿瘤杀伤反应(例如，T细胞介导的、NK细胞介导的或NK-T细胞介导的反应)的截短的MyD88多肽。截短的MyD88多肽可例如包含全长MyD88氨基酸序列的第1-172位氨基酸残基，例如SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:83的第1-172位残基。在一些实施方案中，截短的MyD88多肽可例如包含全长MyD88氨基酸序列的第1-151位或第1-155位氨基酸残基，例如SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:83的第1-151位或第1-155位残基。在一些实施方案中，截短的MyD88多肽可例如包含全长MyD88氨基酸序列的第1-152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170或171位氨基酸残基；全长MyD88氨基酸序列的示例以SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:83的形式被提供。在一些实施方案中，截短的MyD88氨基酸序列不包括全长MyD88氨基酸序列的第173-296位连续氨基酸残基。在一些实施方案中，截短的MyD88氨基酸序列不包括全长MyD88氨基酸序列的连续氨基酸残基152-296。在一些实施方案中，截短的MyD88氨基酸序列不包括全长MyD88氨基酸序列的连续氨基酸残基156-296。在一些实施方案中，截短的MyD88氨基酸序列不包括全长MyD88氨基酸序列的第152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171或172-296位连续氨基酸残基。所谓“全长MyD88氨基酸序列”是指对应于例如SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:83的全长MyD88氨基酸序列。在本文提供的实施方案中，缺少胞外结构域的细胞质CD40多肽可位于MyD88或截短的MyD88多肽部分的上游或下游。
术语“嵌合信号传导多肽”可与“嵌合共刺激分子”、“嵌合共刺激多肽”互换。
此外，在不存在多聚体配体结合区的情况下，嵌合共刺激分子MyD88/CD40(MC)当作为双顺反子的一部分(包含编码CAR的多核苷酸和编码MC多肽的多核苷酸)提供，以及当作为三顺反子的一部分(包括编码CAR的多核苷酸、编码MC多肽的多核苷酸，以及编码诱导型嵌合促凋亡多肽的多核苷酸)提供时，提供CAR-T细胞的共刺激。在组成型MC多肽位于编码CAR的多核苷酸的3'端(例如，CAR核苷酸的编码CD3ζ区的部分的3'端)的位置处检测该共刺激；在用表达载体转染或转导的CAR-T细胞中检测该共刺激，该表达载体包含或不包含对CD3ζ编码多核苷酸序列和MC编码多核苷酸序列之间的2A序列进行编码的多核苷酸。
术语“嵌合”、“融合”和“嵌合融合”在本文中可互换使用，指含有已连接而产生嵌合多肽的两种或更多种蛋白质(或者所述两种或更多种蛋白质中的一种或多种的一部分)的多肽。所述两种或更多种蛋白质(或其部分)可彼此直接连接，其中一种蛋白质(或其部分)的末端氨基酸残基与另一种蛋白质(或其部分)的末端氨基酸残基直接键合，或者可通过一个或多个居间元件(例如，不是任一蛋白质的一部分的一个或多个氨基酸，诸如接头或衔接子，或非氨基酸聚合物)连接。例如，由编码多聚化蛋白(或其部分)和另一种蛋白(例如，DNA结合蛋白、转录激活蛋白、促凋亡蛋白或免疫细胞激活途径的蛋白组分)或其部分的融合体的核酸产生的多肽可称为嵌合、融合或嵌合融合多肽。
在一些实施方案中，本文提供的细胞群包含被设计成提供组成型活性疗法的CAR-T细胞。在一些实施方案中，CAR-T细胞包含核酸，该核酸包含编码CAR的第一多核苷酸和编码嵌合信号传导多肽的第二多核苷酸。在一些实施方案中，第二多核苷酸位于第一多核苷酸的5'端。在一些实施方案中，第二多核苷酸位于第一多核苷酸的3'端。在一些实施方案中，编码接头多肽的第三多核苷酸位于第一多核苷酸和第二多核苷酸之间。在第三多核苷酸位于第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端的情况下，接头多肽可在翻译后保持完整，或者可在翻译期间或翻译后分离由第一多核苷酸和第二多核苷酸编码的多肽。在一些实施方案中，接头多肽为2A多肽，其可在翻译期间或翻译后分离由第一多核苷酸和第二多核苷酸编码的多肽。通过另选的机制组成型地提供高水平共刺激，其中使用渗漏的2A共翻译序列(例如来源于猪捷申病毒-1的序列(P2A))将CAR与嵌合信号传导多肽分离。在2A分离(例如，从渗漏的2A序列中分离)不完全的情况下，大多数表达的嵌合信号传导多肽分子从嵌合抗原受体多肽中分离出来，并且可保持为胞质的，并且嵌合信号传导多肽分子的一些部分保持附接或连接至CAR。
所谓“组成型活性”是指嵌合刺激分子的T细胞活化活性(如本文所示)在不存在诱导剂的情况下是有活性的。本专利申请中的组成型活性嵌合刺激分子不包含多聚体配体结合区或功能性多聚体配体结合区，并且不被AP1903、AP20187或其他CID诱导。
在一些实施方案中，嵌合信号传导多肽包含截短的MyD88多肽和缺少胞外结构域的CD40多肽，或两个共刺激多肽细胞质信号传导区。在一些实施方案中，嵌合信号传导多肽包含两个共刺激多肽细胞质信号传导区，例如4-1BB和CD28，或者一个或两个或更多个选自CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10的共刺激多肽细胞质信号传导区。在一些实施方案中，嵌合信号传导多肽包含MyD88多肽或截短的MyD88多肽以及选自CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10的共刺激多肽细胞质信号传导区。
在一些实施方案中，还提供了本文提供的细胞群，该细胞群包含诱导型安全开关，以在需要时停止治疗或降低治疗水平。在一些实施方案中，免疫细胞诸如CAR-T细胞表达嵌合抗原受体和嵌合信号传导多肽，该嵌合信号传导多肽包含例如截短的MyD88多肽和缺少胞外结构域的CD40多肽，或两个共刺激多肽细胞质信号传导区。
在由MyD88和CD40多肽以及由包含共刺激多肽细胞质信号传导区的嵌合信号传导多肽表达嵌合抗原受体的T细胞中的共刺激在于2015年9月1日提交的美国专利申请序列号14/842,710、于2016年3月3日公布为名称为“Costimulation of Chimeric AntigenReceptors by MyD88and CD40 Polypeptides”的US2016-0058857-A1，以及于2017年5月9日提交的名称为“Methods to Augment or Alter Signal Transduction”的美国临时专利申请序列号62/503,565中有所讨论。
可用于诱导细胞活化的嵌合多肽的非限制性示例，以及用于诱导CAR-T细胞活化的相关方法，包括例如表达构建体、构建载体的方法以及活性或功能的测定，也可在以下专利和专利申请中找到，这些专利和专利申请中的每一个出于所有目的均全文以引用方式并入本文。于2014年3月13日提交的名称为“METHODS FOR CONTROLLING T CELLPROLIFERATION”的美国专利申请14/210,034，于2014年9月25日公布为US2014-0286987-A1；Spencer等人的于2014年3月13日提交的国际专利申请PCT/US2014/026734，并于2014年9月25日公布为WO2014/151960；于2014年2月13日提交的名称为“METHODS FOR ACTIVATINGT CELLS USING AN INDUCIBLE CHIMERIC POLYPEPTIDE”的美国专利申请14/622,018，于2016年2月18日公布为US2016-0046700-A1；于2015年2月13日提交的国际专利申请PCT/US2015/015829，于2015年8月20日公布为WO2015/123527；Spencer等人的于2004年2月18日提交的名称为“INDUCED ACTIVATION OF DENDRITIC CELLS”的美国专利申请10/781,384，于2004年10月21日公布为US2004-0209836-A1，于2008年6月29日颁发为美国专利7,404,950；于2004年2月18日提交的国际专利申请PCT/US2004/004757，于2005年3月24日公布为WO2004/073641A3；Spencer等人的于2010年10月26日提交的名称为“METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR GENERATING AN IMMUNE RESPONSE BY INDUCING CD40AND PATTERNRECOGNITION RECEPTORS AND ADAPTORS THEREOF”的美国专利申请12/445,939，于2011年2月10日公布为US2011-0033388-A1，于2014年4月8日颁发为美国专利8,691,210；于2007年10月19日提交的国际专利申请PCT/US2007/081963，于2008年4月24日公布为WO2008/049113；Spencer等人的于2013年2月8日提交的名称为“METHODS AND COMPOSITIONS FORGENERATING AN IMMUNE RESPONSE BY INDUCING CD40AND PATTERN RECOGNITIONRECEPTOR ADAPTERS”的美国专利申请13/763,591，于2014年3月27日公布为US2014-0087468-A1，于2016年4月19日颁发为美国专利9,315,559；于2009年9月21日提交的国际专利申请PCT/US2009/057738，于2010年3月25日公布为WO201033949；Slawin等人的于2011年4月14日提交的名称为“METHODS FOR TREATING SOLID TUMORS”的美国专利申请13/087,329，于2011年11月24日公布为US2011-0287038-A1；Slawin等人的于2011年4月14日提交的国际专利申请PCT/US2011/032572，于2011年10月20日公布为WO2011/130566；Spencer等人的于2015年12月14日提交的名称为“METHODS FOR CONTROLLED ACTIVATION ORELIMINATION OF THERAPEUTIC CELLS”的美国专利申请14/968,853，于2016年6月23日公布为US2016-0175359-A1；于2016年3月10日公布为WO2016/036746的名称为“COSTIMULATIONOF CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS BY MYD88 AND CD40POLYPEPTIDES”的国际专利申请PCT/US2015/047957；Spencer等人的于2015年12月14日提交的国际专利申请PCT/US2015/065646，于2016年9月15日公布为WO2016/100241；Bayle等人的于2016年12月13日提交的名称为“DUAL CONTROLS FOR THERAPEUTIC CELL ACTIVATION OR ELIMINATION”的美国专利申请15/377,776，于2017年6月15日公布为US2017-0166877-A1；Bayle等人的于2016年12月13日提交的国际专利申请PCT/US2016/066371，于2017年6月22日公布为WO2017/106185；Bayle等人的于2018年5月8日提交的名称为“METHODS TO AUGMENT OR ALTER SIGNALTRANSDUCTION”的国际专利申请PCT/US2018/031689，于2018年11月15日公布为WO2018/208849，这些专利申请中的每一个出于所有目的全文以引用方式并入本文，包括所有文本、表格和附图。
安全开关
本发明的经基因修饰的T细胞可表达安全开关，也称为诱导型***基因或***开关，如果需要，例如如果GVHD发展，该开关可用于在体内根除T细胞。在一些示例中，向患者提供表达嵌合抗原受体的T细胞，该T细胞触发不良事件，诸如脱靶毒性。在一些治疗情况下，在使用嵌合抗原受体修饰的细胞的疗法期间，患者可经历阴性症状。在一些情况下，这些疗法已导致副作用，部分原因是对健康组织的非特异性攻击。在一些示例中，可能不再需要治疗性T细胞，或者治疗旨在持续指定量的时间，例如，治疗性T细胞可用于减小肿瘤细胞或缩小肿瘤大小并且可能不再需要。因此，在一些实施方案中，提供了核酸、细胞，以及其中经修饰的T细胞还表达诱导型半胱天冬酶-9多肽的方法。如果需要例如减少嵌合抗原受体修饰的T细胞的数量，则可将诱导型配体施用给患者，从而诱导经修饰的T细胞的凋亡。
这些开关响应于触发物诸如药理学药剂，该触发物在期望根除T细胞时提供，并导致细胞死亡(例如，通过触发坏死或细胞凋亡)。这些药剂可导致毒性基因产物的表达，但是如果经基因修饰的T细胞已表达响应于该药剂而转变成毒性形式的蛋白质，则可获得更快速的响应。
在一些实施方案中，安全开关基于可通过向受试者施用二聚化的化学诱导剂而触发的促凋亡蛋白。如果促凋亡蛋白与结合到二聚化的化学诱导剂的多肽序列融合，则该化学诱导剂的递送可使两种促凋亡蛋白接近，使得它们触发细胞凋亡。例如，半胱天冬酶-9可与经修饰的人FK结合蛋白融合，该经修饰的人FK结合蛋白可响应于药理学药剂普可那利(AP1903)而被诱导二聚化。基于人促凋亡蛋白(诸如，半胱天冬酶-9)的安全开关的使用使表达该开关的细胞被人受试者免疫***识别为外来的风险最小化。因此，向受试者递送普可那利可触发表达半胱天冬酶-9开关的T细胞的细胞凋亡。
半胱天冬酶-9开关在下述文献中有所描述：Di Stasi等人，2011年，出处同上；还参见Yagyu等人，2015年，Mol Ther，第23卷第9期，第1475-1485页；Rossigloni等人，2018年，Cancer Gene Ther，doi.org/10.1038/s41417-018-0034-1；Jones等人，2014年，FrontPharmacol，doi.org/10.3389/fphar.2014.00254；2016年9月16日颁发的名称为“ModifiedCaspase Polypeptides and Uses Thereof”的美国专利9,434,935；2018年3月13日颁发的名称为“Methods for Inducing Partial Apoptosis Using Caspase Polypeptides”的美国专利9,913,882；2016年7月19日颁发的名称为“Methods for Inducing SelectiveApoptosis”的美国专利9,393,292；以及2015年11月19日公布的名称为“CaspasePolypeptides Having Modified Activity and Uses Thereof”的专利申请US2015/0328292；***开关也可基于Fas或HSV胸苷激酶。
开关的配体诱导剂的示例包括，例如，在Kopytek,S.J.等人，Chemistry&Biology，第7卷，第313-321页，2000年和Gestwicki,J.E.等人，Combinatorial Chem.&HighThroughput Screening，第10卷，第667-675页，2007年；Clackson T，2006年，Chem BiolDrug Des，第67卷，第440-442页；Clackson,T.，Chemical Biology:From Small Moleculesto Systems Biology and Drug Design(Schreiber,s.等人编辑，Wiley，2007年)中所述的那些。
结合到安全开关中的配体结合区可包含FKBP12v36修饰的FKBP12多肽，或其他合适的FKBP12变体多肽，包括结合到AP1903的变体多肽，或其他合成的同源二聚体，例如AP20187或AP2015。变体可包括例如在位置36处具有选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸的氨基酸取代的FKBP区域(Clackson T等人，Proc Natl Acad Sci USA.，1998年，第95卷，第10437-10442页)。AP1903，也称为普可那利(CAS索引名称：2-哌啶羧酸，1-[(2S)-1-氧代-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁基]-1,2-乙二基双[亚氨基(2-氧代-2,1-乙二基)氧代-3,1-亚苯基[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)亚丙基]]酯、[2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9CI)CAS登记号：195514-63-7；分子式：C78H98N4O20，分子量：1411.65)，为已证明在健康志愿者中安全的合成分子(luliucci JD等人，J Clin Pharmacol.，2001年，第41卷，第870-879页)。
在一些实施方案中提供了安全开关，诸如在Di Stasi等人，2011年，出处同上中所讨论的安全开关，该安全开关由具有F36V突变的人FK506结合蛋白(FKBP12)(GenBankAH002 818)的序列组成，通过SGGGS接头连接到缺少其内源性半胱天冬酶激活和募集结构域的经修饰的人半胱天冬酶9(CASP9)。F36V突变增加FKBP12与合成同源二聚体AP20187和AP1903(普可那利)的结合亲和力。
该安全开关可包含经修饰的半胱天冬酶-9多肽，该多肽具有经修饰的活性，例如在不存在同源二聚体配体的情况下降低的基础活性。经修饰的半胱天冬酶-9多肽在例如美国专利9,913,882和US-2015-0328292(出处同上)中讨论，并且可包括例如第330位处的氨基酸取代(例如，D330E或D330！)或例如第450位处的氨基酸取代(例如，N405Q)，或其组合，包括例如D330E-N405Q和D330A-N405Q。
药物组合物(诸如本文所提供的二聚化或多聚化配体)的有效量将是实现在表达半胱天冬酶-9的细胞T细胞中诱导细胞凋亡的这一选定结果的量，使得超过60％、70％、80％、85％、90％、95％或97％，或低于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的治疗细胞被杀死。该术语还与“足量”同义。可使用任何合适的测定来确定杀死的治疗细胞的百分比。测定可包括以下步骤：在施用二聚化或多聚化配体之前从受试者获得第一样品，在施用二聚化或多聚化配体之后从受试者获得第二样品，以及比较第一样品和第二样品中治疗细胞的数量或浓度，以确定杀死的治疗细胞的百分比。可凭经验确定本文所提供的特定组合物的有效量，而不必进行过度的实验。
可用于诱导细胞死亡或细胞凋亡的嵌合多肽的非限制性示例，以及用于诱导细胞死亡或细胞凋亡的相关方法，包括表达构建体、用于构建载体的方法、对活性或功能的测定，以及通过使表达诱导型嵌合多肽的细胞与多聚化合物或其药学上可接受的盐接触来进行嵌合多肽的多聚化，该多聚化合物或其药学上可接受的盐离体和在体内均结合到嵌合多肽的多聚区，向受试者施用表达载体、细胞或本文所述的多聚化合物或其药学上可接受的盐，并且向已施用表达诱导型嵌合多肽的细胞的受试者施用本文所述的多聚化合物或其药学上可接受的盐，也可在以下专利和专利申请中找到，这些专利和专利申请中的每一个出于所有目的以引用方式全文并入本文。于2011年5月20日提交的名称为“METHODS FORINDUCING SELECTIVE APOPTOSIS”的美国专利申请13/112,739，于2011年11月24日公布为US2011-0286980-A1，于2015年7月28日颁发为美国专利9,089,520；Spencer等人的于2013年3月10日提交的名称为“MODIFIED CASPASE POLYPEPTIDES AND USES THEREOF”的美国专利申请13/792,135，于2014年9月11日公布为US2014-0255360-A1，于2016年9月6日颁发为美国专利9,434,935；于2014年3月7日提交的国际专利申请PCT/US2014/022004，于2014年10月9日公布为WO2014/16438；Slawin等人的于2014年6月4日提交的名称为“METHODS FORINDUCING PARTIAL APOPTOSIS USING CASPASE POLYPEPTIDES”的美国专利申请14/296,404，于2016年6月2日公布为US2016-0151465-A1；Slawin等人的于2014年6月4日提交的国际申请PCT/US2014/040964，于2015年2月5日公布为WO2014/197638；于2015年3月6日提交的名称为“CASPASE POLYPEPTIDES HAVING MODIFIED ACTIVITY AND USES THEREOF”的美国专利申请14/640,553，于2015年11月19日公布为US2015-0328292-A1；Spencer等人的于2015年3月6日提交的国际专利申请PCT/US2015/019186，并于2015年9月11日公布为WO2015/134877；Spencer等人的于2015年12月14日提交的名称为“METHODS FORCONTROLLED ELIMINATION OF THERAPEUTIC CELLS”的美国专利申请14/968,737，于2016年6月16日公布为US2016-0166613-A1；Spencer等人的于2015年12月14日提交的国际专利申请PCT/US2015/065629，于2016年6月23日公布为WO2016/100236；Spencer等人的于2015年12月14日提交的名称为“METHODS FOR CONTROLLED ACTIVATION OR ELIMINATION OFTHERAPEUTIC CELLS”的美国专利申请14/968,853，于2016年6月23日公布为US2016-0175359-A1；Spencer等人的于2015年12月14日提交的国际专利申请PCT/US2015/065646，于2016年9月15日公布为WO2016/100241；Bayle等人的于2016年12月13日提交的名称为“DUAL CONTROLS FOR THERAPEUTIC CELL ACTIVATION OR ELIMINATION”的美国专利申请15/377,776，于2017年6月15日公布为US2017-0166877-A1；以及Bayle等人的于2016年12月13日提交的国际专利申请PCT/US2016/066371，于2017年6月22日公布为WO2017/106185；这些专利中的每一个出于所有目的全文以引用方式并入本文，包括所有文本、表格和附图。本文所述的多聚化合物或其药学上可接受的盐可基本上如在这些出版物中提供的示例以及本文提供的其他示例中所讨论的那样使用。
如本文所用，术语“药学上或药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不会产生不利的、过敏的或其他不良的反应的分子实体和组合物。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除了任何常规的介质和药剂与本文所提供的载体或细胞不相容之外，还设想了其在治疗组合物中的用途。还可将补充的活性成分掺入组合物中。在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。
用杀死细胞的百分比表示的“杀死”是指细胞通过细胞凋亡而死亡，如使用任何已知的用于测量细胞凋亡的方法所测量的。该术语还可指细胞消融。
富集的T细胞群
在一些实施方案中，提供了富集的细胞群，其中已选择富集的细胞群以包含指定比率或百分比的一种或多种细胞类型。所谓“细胞群”或“经修饰的细胞群”是指一组细胞，诸如多于两个细胞。细胞群可以是同质的，包含相同类型的细胞，或者各自包含相同的标记，或者它可以是异质的。在一些示例中，细胞群来源于从受试者获得的样品并且包含由例如骨髓、脐带血、外周血或任何组织制备的细胞。在一些示例中，细胞群已与核酸接触，其中该核酸包含异源多核苷酸，例如，编码嵌合抗原受体、诱导型嵌合促凋亡多肽或共刺激多肽(诸如嵌合MyD88或截短的MyD88和CD40多肽)的多核苷酸。术语细胞群和经修饰的细胞群还指已与包含异源多核苷酸的核酸接触的原始细胞的子代。可选择或富集或纯化细胞群以包含例如表达某种标记、受体或细胞表面糖蛋白(例如，CD8、CD4、CD3、CD34)的细胞类型的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。不旨在受限于任何理论，在一些实施方案中，富集T细胞群以获得增加的CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率可降低CAR-T细胞相关细胞因子释放综合征和神经毒性的水平。
嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)的功效取决于它们在过继性转移后的体内扩增。改善CAR-T扩增的附加基因扩增可改善治疗功效，但有增加CAR-T毒性的风险。组成型地或在诱导型多聚区的控制下CAR-T细胞、表达共刺激多肽的CAR-T细胞以及表达MyD88或MyD88-CD40嵌合蛋白的CAR-T细胞在消除肿瘤方面有效，但可诱导急性细胞因子相关毒性。细胞毒性的潜力可降低可施用于受试者的CAR-T细胞的剂量。实施例部分显示，可通过在施用之前富集CAR-T细胞来避免或降低毒性，以提供具有增加的CD8+T细胞浓度的经修饰的细胞群。
T细胞可来源于任何健康供体。供体通常将是成人(至少18岁)，但儿童也适合作为T细胞供体(例如，参见Styczynski，2018年，Transfus Apher Sci，第57卷，第3期，第323-330页)。用于从供体获得T细胞的合适方法的示例在Di Stasi等人，2011年，N Engl J Med，第365卷，第1673-1683页中有所描述。一般而言，T细胞得自供体，经过基因修饰和选择，然后可施用于受体受试者。T细胞的可用来源是供体的外周血。外周血样本通常将经受白细胞单采术，以提供富集白细胞的样本。这种富集的样本(也称为白细胞)可由多种血细胞组成，包括单核细胞、淋巴细胞、血小板、血浆和红细胞。与静脉穿刺或血沉棕黄层产品相比，白细胞通常含有更高浓度的细胞。
富集CD8+的T细胞群
经修饰的细胞群中的细胞类型的选择、富集或纯化可通过任何合适的方法实现。在一些实施方案中，CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例可通过流式细胞术确定。在一些示例中，可使用MAC列。在一些示例中，在施用于受试者之前将经修饰的细胞群冷冻并解冻，并且在施用于受试者之前测试活细胞的某种细胞类型的百分比或比率。在转导或转染后，通过磁性选择(MACS柱)将T细胞分离成纯化的CD4+T细胞和CD8+T细胞。
该组合物可包括CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且理想地，该组合物内的经基因修饰的CD3+T细胞群包括CD4+细胞和CD8+细胞。尽管白细胞中CD4+细胞与CD8+细胞的比率通常高于2，但在一些实施方案中，本发明组合物中经基因修饰的CD4+细胞与经基因修饰的CD8+细胞的比率小于2，例如小于1.5。在一些实施方案中，在组合物中存在比经基因修饰的CD4+T细胞更多的经基因修饰的CD8+T细胞，即，CD4+细胞与CD8+细胞的比率小于1，例如，小于0.9、小于0.8、小于0.7、小于0.6或小于0.5。因此，从供体细胞开始并产生经基因修饰的T细胞的整个程序被设计成相对于CD4+T细胞富集CD8+细胞T细胞。在一些实施方案中，60％或更多的经基因修饰的T细胞为CD8+T细胞，并且在一些实施方案中，65％或更多的经基因修饰的T细胞为CD8+T细胞。在经基因修饰的CD3+T细胞群内，在一些实施方案中，CD8+T细胞的百分比在55％-75％之间，例如63％-73％、60％-70％或65％-71％。在一些实施方案中，提供了一种细胞群，其被选择或富集或纯化为包含一种细胞类型与另一种细胞类型的比率，例如，CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为例如3:2、7:3、4:1、9:1、19:1或39:1或更高。在一些实施方案中，经修饰的细胞群被选择或富集或纯化为包含至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或9:1或更大。
在一些实施方案中，对于包含如本文所述的共刺激多肽的经基因修饰的CD3+T细胞群，CD8+T细胞的百分比在55％-75％之间，例如63％-73％、60％-70％或65％-71％。在一些实施方案中，CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为3:2、7:3、4:1、9:1、19:1或39:1或更大。在一些实施方案中，经修饰的细胞群被选择或富集或纯化为包含至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或9:1或更大。共刺激多肽可包含一个或多个共刺激信号传导区，诸如CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、MyD88或CD40。共刺激多肽可包含激活由CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、MyD88或CD40激活的信号传导途径的一个或多个共刺激信号传导区。
在一些实施方案中，本发明提供包含CAR-T细胞群的组合物和方法，该CAR-T细胞群包含含有MyD88和/或CD40的共刺激多肽，或激活MyD88和/或CD40信号传导途径的任何合适的细胞质信号传导区，其中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是CD8+T细胞。共刺激多肽可以是诱导型或组成型活化的。在一些实施方案中，经修饰的细胞群为至少80％的CD8+T细胞。在一些实施方案中，经修饰的细胞群为至少90％的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，本发明提供包含CAR-T细胞群的组合物和方法，该CAR-T细胞群包含诱导型促凋亡多肽，其中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％为CD8+T细胞。在一些实施方案中，经修饰的细胞群为至少80％的CD8+T细胞。在一些实施方案中，经修饰的细胞群为至少90％的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，本发明提供包含CAR-T细胞群的组合物和方法，该CAR-T细胞群包含共刺激多肽和诱导型促凋亡多肽，其中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％为CD8+T细胞。在一些实施方案中，经修饰的细胞群为至少80％的CD8+T细胞。在一些实施方案中，经修饰的细胞群为至少90％的CD8+T细胞。共刺激多肽可以是诱导型或组成型活化的。在一些实施方案中，共刺激多肽包含MyD88和/或CD40，或激活MyD88和/或CD40信号传导途径的任何合适的细胞质信号传导区。
工程改造表达构建体
本文提供了表达本发明的嵌合抗原受体、嵌合信号传导多肽和诱导型安全开关的表达构建体。
如本文所用，术语“cDNA”旨在指使用信使RNA(mRNA)作为模板制备的DNA。与基因组DNA或从基因组、未加工或部分加工的RNA模板聚合而来的DNA不同，使用cDNA的优点是cDNA主要包含对应蛋白质的编码序列。有时使用全基因组序列或部分基因组序列，诸如在需要非编码区才能实现最佳表达的情况下，或者在反义策略中靶向非编码区诸如内含子的情况下。
如本文所用，术语“多肽”被定义为通常具有确定序列的氨基酸残基链。如本文所用，术语多肽可与术语“蛋白质”互换。
如本文所用，术语“表达构建体”或“转基因”被定义为包含编码基因产物的核酸的任何类型的基因构建体，其中能够被转录的核酸编码序列的部分或全部可***到载体中。转录物被翻译成蛋白质，但不是必须的。在某些实施方案中，表达包括基因转录和mRNA翻译成基因产物两者。在其他实施方案中，表达仅包括编码所关注的基因的核酸的转录。术语“治疗构建体”也可用于指表达构建体或转基因。表达构建体或转基因可用作例如治疗过度增殖性疾病或障碍诸如癌症的疗法，因此表达构建体或转基因是治疗性构建体或预防性构建体。如本文结合疾病、障碍或病症所用，术语“治疗(treatment、treat、treated或treating)”是指预防和/或疗法。
如本文所用，术语“表达载体”是指包含核酸序列的载体，该核酸序列编码能够被转录的基因产物的至少一部分。在某些情况下，RNA分子随后被翻译成蛋白质、多肽或肽。在其他情况下，这些序列例如在反义分子或核酶的产生中不被翻译。表达载体可含有多种控制序列，这些控制序列是指在特定宿主生物中有效地连接的编码序列的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体还可含有也发挥其他功能并在下文讨论的核酸序列。
在某些示例中，编码嵌合抗原受体的多核苷酸包括在同一载体(例如，病毒或质粒载体)中，作为编码第二多肽的多核苷酸。该第二多肽可为例如嵌合信号传导多肽、如本文所讨论的诱导型半胱天冬酶多肽或标记多肽。在这些示例中，该构建体可被设计成具有一个可操作地连接至核酸的启动子，该核酸包含编码通过2A多肽连接的两种多肽的多核苷酸。在该示例中，第一多肽和第二多肽在翻译期间分离，从而产生两种多肽，或者在包括渗漏的2A的示例中，产生一种或两种多肽。在其他示例中，这两种多肽可与相同载体分开表达，其中包含编码多肽之一的多核苷酸的每种核酸可操作地连接至单独的启动子。在其他示例中，一个启动子可以可操作地连接至两种多核苷酸，从而引导产生两种单独的RNA转录物，并因此引导产生两种多肽；在一个示例中，启动子可以是双向的，并且编码区可在相反的方向5'-3'上。因此，本文讨论的表达构建体可包含至少一个或至少两个启动子。
在一些实施方案中，核酸构建体包含在病毒载体内。在某些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在某些实施方案中，病毒载体是腺病毒载体或慢病毒载体。应当理解，在一些实施方案中，细胞离体与病毒载体接触，并且在一些实施方案中，细胞在体内与病毒载体接触。因此，可将表达构建体***载体，例如病毒载体或质粒。所提供的方法的步骤可使用任何合适的方法来执行；这些方法包括但不限于本文所述的转导、转化或以其他方式向细胞提供核酸的方法。
如本文所用，术语“基因”定义为功能性蛋白质、多肽或肽编码单元。应当理解，该功能术语包括表达或适于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和/或突变体的基因组序列、cDNA序列和较小的经工程改造的基因片段。
如本文所用，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。核酸是可水解成单体“核苷酸”的多核苷酸。单体核苷酸可水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段(包括但不限于重组手段，即，使用普通克隆技术和PCRTM等，以及通过合成手段从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列)获得的所有核酸序列。此外，多核苷酸包括多核苷酸的突变，包括但不限于通过本领域熟知的方法对核苷酸或核苷进行的突变。核酸可包含一种或多种多核苷酸。
“功能保守变体”是其中给定的氨基酸残基已被改变而不改变该蛋白质或酶的整体构象和功能的蛋白质或酶，包括但不限于用具有相似特性(包括极性或非极性特征、大小、形状和电荷)的氨基酸置换氨基酸。许多通常已知的非基因编码的氨基酸的保守氨基酸取代是本领域熟知的。其他未编码的氨基酸的保守取代可基于它们的物理特性与基因编码的氨基酸的特性进行比较来确定。
除指示为保守的那些之外的氨基酸可在蛋白质或酶方面不同，使得功能相似的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分比可不同，并且可为例如至少70％、至少80％、至少90％和至少95％，如根据比对方案所确定的。如本文所提及的，“序列相似性”意指核苷酸或蛋白质序列相关的程度。两个序列之间的相似性程度可基于序列同一性和/或保守性百分比。本文中的“序列同一性”意指两个核苷酸或氨基酸序列不变的程度。“序列比对”意指为了评估相似性程度而排列两个或更多个序列以实现最大水平的同一性(以及，就氨基酸序列而言，保守性)的过程。用于比对序列和评估相似性/同一性的许多方法是本领域已知的，例如簇方法，其中相似性基于MEGALIGN算法，以及BLASTN、BLASTP和FASTA。当使用这些程序中的任一个时，可选择导致最高序列相似性的设置。
如本文所用，术语“启动子”被定义为由引发基因的特异性转录所需的细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。在一些实施方案中，启动子是发育调控的启动子。如本文所用，术语“在转录控制下”、“可操作地连接”或“有效地连接”被定义为启动子相对于核酸处于正确的位置和取向以控制基因的RNA聚合酶起始和表达。在一些示例中，一种或多种多肽被称为“有效地连接”。一般来讲，术语“可操作地连接”意指启动子序列功能性地连接至第二序列，其中启动子序列起始并介导对应于第二序列的DNA的转录。
据信用于控制所关注的多核苷酸序列的表达的特定启动子并不重要，只要其能够引导该多核苷酸在靶向细胞中的表达即可。因此，在人细胞被靶向的情况下，多核苷酸序列编码区可例如放置在能够在人细胞中表达的启动子附近并受其控制。一般来讲，此类启动子可包括人或病毒启动子。可选择适合于用于表达本文提供的CAR和其他多肽的载体的启动子。
在各种实施方案中，其中例如表达载体是逆转录病毒，合适启动子的示例是鼠莫洛尼白血病病毒启动子。在其他实施方案中，启动子可以是例如(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复序列、β-肌动蛋白、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶可用于获得所关注的编码序列的高水平表达。还设想了使用本领域熟知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现所关注的编码序列的表达，前提条件是表达水平足以用于给定目的。通过采用具有熟知特性的启动子，可优化转染或转化后所关注的蛋白的表达水平和表达模式。
选择启动子和其他调控元件，以使其在所需细胞或组织中发挥功能。此外，该启动子列表不应理解为穷举性的或限制性的；与本文所公开的启动子和方法结合使用的其他启动子。
本文所述的核酸可包含一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸可被描述为被定位或者处于另一多核苷酸的“5”或“3”端，或者以“5'至3'顺序”定位。在这些语境中，参考5'至3'应理解为是指核酸中多核苷酸的编码区的方向，例如，其中第一多核苷酸定位在第二多核苷酸的5'端并与编码不可切割的接头多肽的第三多核苷酸连接，翻译产物将导致由位于较大多肽的氨基末端的第一多核苷酸编码的多肽，该较大多肽包含第一多核苷酸、第三多核苷酸和第二多核苷酸的翻译产物。
在其他示例中，可使用两种单独的载体在细胞中表达两种多肽，例如嵌合刺激分子或MyD88/CD40嵌合抗原受体多肽和第二多肽。可将细胞与载体共转染或共转化，或者可将载体在不同时间引入细胞。
多肽的顺序可从氨基末端到羧基末端变化。例如，在嵌合刺激分子中，MyD88多肽、CD40多肽和任何另外的多肽的顺序可变化。在嵌合抗原受体中，MyD88多肽、CD40多肽和任何另外的多肽(例如，CD3ζ多肽)的顺序可变化。可使用例如本文所述的那些方法测定各种结构域的顺序，以获得最佳的表达和活性。
在表达构建体编码MyD88多肽的一些实施方案中，多肽可以是全长MyD88多肽的一部分。所谓MyD88或MyD88多肽是指髓样分化主反应基因88的多肽产物，例如但不限于人型式，称为NCBI基因ID 4615。在一些实施方案中，表达构建体编码缺少TIR结构域的MyD88多肽的一部分。在一些实施方案中，表达构建体编码包含DD(死亡结构域)或DD和中间结构域的MyD88多肽的一部分。所谓“截短的”是指蛋白质不是全长的并且可缺少例如结构域。例如，截短的MyD88不是全长的，并且可例如缺失TIR结构域。在一些实施方案中，截短的MyD88多肽具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其功能等同的片段。在一些实施方案中，截短的MyD88多肽由SEQ ID NO:28的核苷酸序列或其功能等同的片段编码。MyD88多肽的功能等同部分具有与SEQ ID NO:27的多肽基本上相同的刺激胞内信号传导的能力，具有SEQ ID NO:27的多肽活性的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，表达构建体编码缺少TIR结构域的MyD88多肽的一部分，诸如由pM006、pM007或pM009的编码MyD88多肽的核苷酸序列编码的多肽。所谓编码“截短的MyD88”的核酸序列是指编码截短的MyD88多肽的核酸序列，该术语也可指包括编码作为克隆产物添加的任何氨基酸(包括由接头编码的任何氨基酸)的部分的核酸序列。
应当理解，在方法或构建体是指截短的MyD88多肽的情况下，也可使用该方法，或者该构建体被设计成指另一种MyD88多肽，诸如全长MyD88多肽。在方法或构建体是指全长MyD88多肽的情况下，也可使用该方法，或者该构建体被设计成指截短的MyD88多肽。在本文的方法中，其中嵌合多肽包含MyD88多肽(或其部分)和CD40多肽(或其部分)，嵌合多肽的MyD88多肽可位于CD40多肽的上游或下游。在某些实施方案中，MyD88多肽(或其部分)位于CD40多肽(或其部分)的上游。如本文所用，当涉及MyD88或其一部分时，术语“功能等同的”例如是指刺激细胞信号传导反应的MyD88多肽或编码此类MyD88多肽的核酸。“功能等同的”是指例如缺少TIR结构域但能够刺激细胞信号传导反应的MyD88多肽。
在某些实施方案中，经修饰的细胞群包含核酸分子，该核酸分子包含可操作地连接至编码嵌合刺激分子的第一多核苷酸的启动子，其中该嵌合刺激分子包含(i)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；和(ii)CD40细胞质多肽区，该CD40细胞质多肽区缺少CD40胞外结构域，并且其中该嵌合刺激分子不包括膜靶向区；以及
b)编码T细胞受体、基于T细胞受体的嵌合抗原受体或嵌合抗原受体的第二多核苷酸；以及
c)编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第三多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。应当理解，多核苷酸的顺序可变化，并且可被测试以确定构建体对于任何特定方法的适用性，因此，核酸可以变化的顺序包括多核苷酸，这也考虑了第一多核苷酸中MyD88多肽或截短的MyD88多肽编码序列和CD40细胞质多肽区编码序列顺序的变化。因此，第一多核苷酸可编码具有MyD88/CD40、截短的MyD88/CD40、CD40/MyD88或CD40/截短的MyD88顺序的多肽。并且，核酸可包括以下顺序中任一种的第一至第三多核苷酸，其中1、2、3指示核酸中从5'至3'方向的多核苷酸的第一、第二或第三顺序。应当理解，其他多核苷酸，诸如编码2A多肽的那些，例如可存在于所列出的三种多核苷酸之间；该表旨在指定第一多核苷酸至第三多核苷酸的顺序：
表1
Figure BDA0002522459880000361
类似地，核酸可仅包括编码上表中提供的多肽中的两者的多核苷酸中的两者。在一些示例中，用包含上表1中包括的三种多核苷酸的核酸转染或转导细胞。在其他示例中，用编码这些多核苷酸中的两种(编码这些多肽中的两种)的核酸转染或转导细胞，如例如在表2中所提供的。
表2
Figure BDA0002522459880000362
在一些实施方案中，用编码这些多核苷酸中的两种的核酸转染或转导细胞，并且该细胞还包含核酸，该核酸包含编码第三多肽的多核苷酸。例如，细胞可包含具有第一多核苷酸和第二多核苷酸的核酸，并且该细胞还可包含具有编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的多核苷酸的核酸。另外，细胞可包含具有第一多核苷酸和第三多核苷酸的核酸，并且该细胞还可包含具有编码T细胞受体、基于T细胞受体的嵌合抗原受体或嵌合抗原受体的多核苷酸的核酸。
所提供的方法的步骤可使用任何合适的方法来执行；这些方法包括但不限于本文提出的转导、转化或以其他方式向细胞提供核酸的方法。在一些实施方案中，截短的MyD88肽由SEQ ID NO:28的核苷酸序列编码(具有或不具有DNA接头或具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列)。在一些实施方案中，CD40细胞质多肽区由SEQ ID NO:30中的多核苷酸序列编码。
载体
应当理解，可使用本领域已知的方法修饰本文提供的载体以改变区域的位置或顺序，从而用一个区域取代另一个区域。例如，包含编码包含截短MC的嵌合信号传导多肽的多核苷酸的载体可用编码嵌合信号传导多肽的多核苷酸取代，该嵌合信号传导多肽包含一个或两个或更多个共刺激多肽细胞质信号传导区，例如选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10的那些。还可修饰编码CAR的多核苷酸，使得scFv区可被具有相同或不同靶特异性的区域取代；跨膜区可被不同的跨膜区取代；可添加茎部多肽。编码标记多肽的多核苷酸可包括在多肽之一内或与多肽之一分离；可添加编码额外的编码安全开关的多肽的多核苷酸，可添加编码接头多肽的多核苷酸，或者可添加非编码的多核苷酸或间隔区，或者可改变多核苷酸5'至3'的顺序。
本申请中提供的载体可如本文所讨论的进行修饰，例如以取代编码嵌合抗原受体区域的多核苷酸，该嵌合抗原受体例如CD19特异性scFV或所提供的其他scFv，以及针对其他靶抗原的scFV，其他靶抗原诸如CD33、NKG2D、PSMA、PSCA、MUC1、CD19、ROR1、间皮素、GD2、CD123、MUC16、Her2/Neu、CD20、CD30、PRAME、NY-ESO-1和EGFRvlll。载体也可用每个多肽区的适当取代进行修饰，如本文所讨论的。可修饰载体以移除诱导型半胱天冬酶-9安全开关(1)，将诱导型半胱天冬酶-9安全开关定位到MyD88-CD40多肽(**)的3'位，将诱导型半胱天冬酶-9安全开关取代为不同的诱导型半胱天冬酶多肽基开关，或将诱导型半胱天冬酶-9安全开关取代为不同的多肽安全开关。
本文所提供的载体可被修饰以用一个或两个或更多个共刺激多肽细胞质信号传导区(诸如例如选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RACE、TRANCE和DAP10的那些)取代MyD88-CD40(MC)部分。共刺激多肽可包含但不限于本文提供的氨基酸序列，并且可包括功能保守突变，包括缺失或截短，并且可包含与本文提供的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。
本文所提供的载体可被修饰以在CAR多肽和MC多肽或其他共刺激多肽之间取代编码接头序列的多核苷酸，其中接头多肽不是2A多肽。例如，本文提供的核酸可包含编码MC多肽的多核苷酸，或编码CAR的CD3ζ部分的多核苷酸的共刺激多肽信号传导区3'，其中两种多核苷酸被编码2A接头的多核苷酸分开，或者其中两种多核苷酸不被编码2A接头的多核苷酸分开。
在一些实施方案中，这两种多核苷酸可由编码具有例如约5至20个氨基酸或例如约6至10个氨基酸的接头多肽的多核苷酸分开，其中接头多肽不包含2A多肽序列。
选择性标记
在某些实施方案中，表达构建体包含核酸构建体，该核酸构建体的表达通过在表达构建体中包括标记而在体外或体内鉴定。此类标记将赋予细胞可鉴定的变化，从而允许容易地鉴定含有表达构建体的细胞。通常包括药物选择标记有助于转化体的克隆和选择。例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博莱霉素和组氨醇的抗性的基因是有用的选择性标记。另选地，采用酶诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)。也可采用含有胞外、非信号传导结构域或各种蛋白质(例如，CD34、CD19、LNGFR)的免疫学表面标记，从而为磁性或荧光抗体介导的分选提供了一种直接方法。只要能够与编码基因产物的核酸同时表达，则认为所采用的选择性标记并不重要。选择性标记的其他示例包括例如报告基因诸如GFP、EGFP、β-gal或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在某些实施方案中，标记蛋白诸如CD19用于选择用于输血的细胞，例如在免疫磁性选择中。如本文讨论的，CD19标记区别于抗CD19抗体，或例如scFv、TCR，或结合到CD19的其他抗原识别部分。
在某些实施方案中，标记多肽连接至诱导型嵌合刺激分子。例如，标记多肽可通过多肽序列(例如，可切割的2A样序列)连接至诱导型嵌合刺激分子。
本文提供的CAR-T细胞可表达细胞表面转基因标记，该细胞表面转基因标记存在于表达CAR的表达载体上，或者在一些实施方案中，存在于编码除CAR之外的蛋白质的表达载体上，例如与CAR共表达的促凋亡多肽安全开关，诸如i-Casp9。
在一个实施方案中，细胞表面转基因标记是截短的CD19(ΔCD19)多肽(Di Stasi等人，2011年，出处同上)，其包含在333位氨基酸处截短的人CD19以除去大部分的胞质内结构域。胞外CD19结构域仍可被识别(例如，在流式细胞术、FACS或MACS中)，但触发胞内信号传导的可能性被最小化。CD19通常由B细胞而不是T细胞表达，因此CD19+T细胞的选择允许经基因修饰的T细胞与未修饰的供体T细胞分离。
在一些实施方案中，多肽可包括在如下多肽中，例如由表达载体编码的CAR，以有助于分选细胞。在一些实施方案中，用于表达本文提供的嵌合抗原受体或嵌合刺激分子的表达载体还包含编码16位氨基酸的CD34最小表位的多核苷酸。在一些实施方案中，诸如本文示例中提供的某些实施方案，CD34最小表位掺入在CD8茎部的氨基末端位置处。
接头多肽
接头多肽包括例如可切割和不可切割的接头多肽。不可切割的多肽可包括例如可操作地连接在MyD88-CD40嵌合多肽、MyD88多肽、CD40多肽或共刺激多肽细胞质信号传导区与嵌合抗原受体的CD3ζ部分之间的任何多肽。接头多肽包括例如由约2至约30个氨基酸组成的那些多肽(例如，弗林蛋白酶切割位点(GGGGS)n)。在一些实施方案中，接头多肽由约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头多肽由约18至22个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头多肽由20个氨基酸组成。在一些实施方案中，可切割接头包括由对群体中经修饰的细胞外源的酶切割的接头，例如由多核苷酸编码的酶，该多核苷酸通过转染或转导与编码接头的多核苷酸在相同或不同的时间引入细胞中。在一些实施方案中，可切割接头包括由对群体中经修饰的细胞内源的酶切割的接头，包括例如在细胞中天然表达的酶，以及由细胞天然的多核苷酸编码的酶，诸如溶菌酶。
2A肽键跳过序列
2A样序列或“肽键跳过”2A序列来源于例如许多不同的病毒，包括例如明脉扁刺蛾(Thosea asigna)。这些序列有时也称为“肽跳过序列”。当将这种类型的序列置于顺反子内，在打算分离的两种多肽之间时，就明脉扁刺蛾而言，核糖体似乎跳过肽键；羧基末端“P-G-P”处的Gly氨基酸和Pro氨基酸之间的键被省略。这可留下两至三种多肽，例如诱导型嵌合促凋亡多肽和嵌合抗原受体，或者例如标记多肽和诱导型嵌合促凋亡多肽。当使用该序列时，编码2A序列的5'端的多肽可在羧基末端以另外的氨基酸(包括Gly残基和2A序列中的任何上游残基)结束。编码2A序列的3'端的肽可在氨基末端以另外的氨基酸结束，包括Pro残基和2A序列之后的任何下游残基。在一些实施方案中，可切割接头为来源于猪捷申病毒-1的2A多肽(P2A)。在一些实施方案中，2A共翻译序列为2A样序列。在一些实施方案中，2A共翻译序列为T2A(明脉扁刺蛾病毒2A)、F2A(***病毒2A)、P2A(猪捷申病毒-1 2A)、BmCPV2A(细胞质多角体病毒2A)、BmIFV 2A(家蚕(B.mori)软化病病毒2A)或E2A(马鼻炎A病毒2A)。在一些实施方案中，2A共翻译序列为T2A-GSG、F2A-GSG、P2A-GSG或E2A-GSG。在一些实施方案中，2A共翻译序列选自T2A、P2A和F2A。所谓“可切割接头”意指该接头通过任何手段切割，包括例如非酶手段，诸如肽跳过或酶手段。(Donnelly,ML，2001年，J.Gen.Virol.，第82卷，第1013-1025页)。
2A样序列有时是“渗漏的”，因为一些多肽在翻译期间不分离，而是在翻译后保持为一个长的多肽。关于渗漏接头原因的一个理论是，短2A序列偶尔不会折叠成促进核糖体跳过的所需结构(“2A折叠”)。在这些情况下，核糖体可能不会缺失脯氨酸肽键，从而产生融合蛋白。为了降低渗漏的水平，从而减少形成的融合蛋白的数量，可在2A多肽的氨基末端侧添加GSG(或类似的)接头；GSG接头阻断新翻译的多肽的二级结构自发地折叠和破坏“2A折叠”。
在某些实施方案中，2A接头包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在某些实施方案中，2A接头还包括多肽的氨基末端处的GSG氨基酸序列，在其他实施方案中，2A接头包括多肽的氨基末端处的GSGPR氨基酸序列。因此，所谓“2A”序列，该术语可指本文所述示例中的2A序列，或者也可指在接头的氨基末端还包含GSG或GSGPR序列的如本文所列的2A序列。
在一些实施方案中，接头(例如，2A接头)在嵌合抗原受体的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中被切割，即，嵌合抗原受体部分与嵌合MyD88和CD40、MyD88多肽、CD40多肽或共刺激多肽细胞质信号传导区，诸如CD28、OX40、4-1BB等分离。在其他实施方案中，2A接头在嵌合抗原受体的约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中被切割。在一些实施方案中，2A接头在嵌合抗原受体的约80％-99％中被切割。在一些实施方案中，2A接头在嵌合抗原受体的约90％中被切割。在一些实施方案中，组成型活性嵌合抗原受体多肽存在于经修饰的细胞中，其中2A接头不被切割，即嵌合抗原受体部分连接至嵌合MyD88和CD40、MyD88多肽、CD40多肽或共刺激多肽细胞质信号传导区，诸如CD28、OX40、4-1BB等，代表嵌合抗原受体多肽的约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在其他实施方案中，2A接头在嵌合抗原受体的约5％、10％、15％、20％或25％中不被切割。在一些实施方案中，2A接头在嵌合抗原受体的约5％-20％中不被切割。在一些实施方案中，2A接头在嵌合抗原受体的约10％中不被切割。
膜靶向
膜靶向序列提供了嵌合蛋白到细胞表面膜的转运，其中相同或其他序列可编码嵌合蛋白与细胞表面膜的结合。与细胞膜结合的分子包含促进膜结合的某些区域，并且此类区域可掺入嵌合蛋白分子中以产生膜靶向分子。例如，一些蛋白质在N末端或C末端含有被酰化的序列，并且这些酰基部分促进膜结合。此类序列被酰基转移酶识别，并且通常符合特定的序列基序。某些酰化基序能够被单个酰基部分修饰(通常随后是多个带正电的残基(例如，人c-Src：M-G-S-N-K-S-K-P-K-D-A-S-Q-R-R-R)以改善与阴离子脂质头部基团的结合)，而另一些则能够被多个酰基部分修饰。例如，蛋白质酪氨酸激酶Src的N末端序列可包含单个肉豆蔻酰部分。双酰化区域位于某些蛋白激酶的N末端区域内，诸如Src家族成员(例如，Yes、Fyn、Lck)和G-蛋白α亚基的子集。此类双酰化区域通常位于此类蛋白质的前十八个氨基酸内，并且符合序列基序Met-Gly-Cys-Xaa-Cys，其中Met被切割，Gly是N-酰化的并且Cys残基之一是S-酰化的。Gly通常为肉豆蔻酰化的并且Cys可为棕榈酰化的。也可利用符合序列基序Cys-Ala-Ala-Xaa(所谓的“CAAX框”)的酰化区，该区域可用来自G-蛋白γ亚基和其他蛋白的C末端的C15或C10异戊二烯基部分修饰(例如，万维网地址ebi.ac.uk/interpro/DisplaylproEntry？ac＝IPR001230)。这些和其他酰化基序包括例如在Gauthier-Campbell等人，Molecular Biology of the Cell，第15卷，第2205-2217页，2004年；Glabati等人，Biochem.J.，第303卷，第697-700页，1994年和Zlakine等人，J.Cell Science，第110卷，第673-679页，1997年中所讨论的，并且可掺入嵌合分子中以诱导膜定位。在一些实施方案中，包含本文提供的共刺激多肽细胞质信号传导区的嵌合多肽包含膜靶向区，并且任选地，包含多聚配体结合区，在一些实施方案中，嵌合MyD88、嵌合截短的MyD88、嵌合MyD88-CD40或嵌合截短的MyD88-CD40、本文提供的多肽包含膜靶向区，并且任选地包含多聚配体结合区。在一些实施方案中，膜靶向区包括肉豆蔻酰化区。在一些实施方案中，膜靶向区选自肉豆蔻酰化靶向序列、棕榈酰化靶向序列、异戊二烯化序列(即，法尼基化、香叶基香叶基化、CAAX框)、来自受体的蛋白质-蛋白质相互作用基序或跨膜序列(利用信号肽)。示例包括例如在如下文献中讨论的那些：ten Klooster JP等人，Biology of the Cell，2007年，第99卷，第1-12页，Vincent,S.等人，Vincent,S，第21卷，第936-940页，1098，2003年。
在多肽不包括膜靶向区或缺少膜靶向区，诸如本文提供的某些嵌合多肽的情况下，该多肽不包括提供嵌合蛋白向细胞膜转运的区域。该多肽可例如不包括将该多肽转运至细胞表面膜的序列，或者该多肽可例如包括不将该多肽转运至细胞表面膜的功能失调的膜靶向区，例如，包括破坏肉豆蔻酰化靶向区功能的脯氨酸的肉豆蔻酰化区(参见例如Resh,M.D.，Biochim.Biophys.Acta.，第1451卷，第1-16页，1999年)。未转运至膜的多肽被认为是细胞质多肽。
嵌合抗原受体
抗原识别部分
“抗原识别部分”可为结合至抗原的任何多肽或其片段，诸如天然来源的或合成的抗体片段可变结构域。抗原识别部分的示例包括但不限于来源于抗体的多肽，诸如单链可变片段(scFv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段和Fv片段；来源于T细胞受体的多肽，诸如TCR可变结构域；可人工融合至信号传导结构域(例如“细胞因子”)的分泌因子(例如，细胞因子、生长因子)，以及结合至胞外同源蛋白的任何配体或受体片段(例如CD27、NKG2D)。组合文库也可用于鉴定与肿瘤相关靶标以高亲和力结合的肽。此外，“通用”CAR可通过结合生物素酰化肿瘤靶向抗体(Urbanska(12)Ca Res)将亲和素融合到信号传导结构域，或者通过使用Fcγ受体/CD16结合到IgG靶向肿瘤(Kudo K(13)Ca Res)来制备。
跨膜区
本文的嵌合蛋白可包括单程或多程跨膜序列(例如，在嵌合蛋白的N末端或C末端)。单程跨膜区存在于某些CD分子、酪氨酸激酶受体、丝氨酸/苏氨酸激酶受体、TGFβ、BMP、激活素和磷酸酶中。单程跨膜区通常包括信号肽区和约20至约25个氨基酸的跨膜区，其中许多是疏水性氨基酸并且可形成α螺旋。带正电的氨基酸的短轨迹通常沿循跨膜跨度，以将蛋白质锚定在膜中。多次跨膜蛋白包括离子泵、离子通道和转运蛋白，并且包括多次跨膜的两个或更多个螺旋。有时将多次跨膜蛋白的全部或基本上全部掺入嵌合蛋白中。单程和多程跨膜区的序列是已知的，并且可被选择用于掺入嵌合蛋白分子中。
在一些实施方案中，跨膜结构域融合至CAR的胞外结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在其他实施方案中，使用不与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可通过氨基酸取代(例如，通常带电荷到疏水残基)来选择或修饰，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
跨膜结构域可例如来源于T细胞受体CD3-ε、CD3ζCD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD38、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的α、β或ζ链。或者，在一些示例中，跨膜结构域可从头合成，包含大部分疏水残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在某些实施方案中，短多肽接头可形成嵌合抗原受体的跨膜结构域与胞内结构域之间的连接。嵌合抗原受体还可包含茎部，即，在胞外结构域和跨膜结构域之间的氨基酸的胞外区。例如，茎部可以是与所选跨膜结构域天然相关的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含CD8跨膜结构域，在某些实施方案中，嵌合抗原受体包含CD8跨膜结构域，以及跨膜结构域的胞外部分上的另外的氨基酸，在某些实施方案中，嵌合抗原受体包含CD8跨膜结构域和CD8茎部。嵌合抗原受体还可包含跨膜结构域和胞质结构域之间的氨基酸的区域，该区域与跨膜结构域所来源于的多肽天然相关。
靶抗原
嵌合抗原受体与靶抗原结合。在体外或离体测定T细胞活化时，可从多种来源获得或分离靶抗原。如本文所用，靶抗原是抗原或抗原上的免疫表位，这对于免疫识别和最终消除或控制哺乳动物中的致病因子或疾病状态至关重要。免疫识别可以是细胞的和/或体液的。就胞内病原体和癌症而言，免疫识别可例如为T淋巴细胞反应。
靶抗原可来源于或分离自例如病原微生物，诸如病毒，包括HIV(Korber等人编辑，HIV Molecular Immunology Database，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，N.Mex.，1977年)流行性感冒、单纯疱疹、人***状瘤病毒(美国专利5,719,054)、乙型肝炎(美国专利5,780,036)、丙型肝炎(美国专利5,709,995)、EBV、细胞巨化病毒(CMV)等。靶抗原可来源于或分离自致病菌，例如，来自衣原体(Chlamydia)(美国专利5,869,608)、分枝杆菌(Mycobacteria)、军团杆菌(Legionella)、脑膜炎球菌(Meningiococcus)、A群链球菌(Group A Streptococcus)、沙门氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)(美国专利No.5,955,596)等。靶抗原可来源于或分离自例如致病性酵母，包括曲霉菌(Aspergillus)、侵袭性假丝酵母菌(Candida)(美国专利5,645,992)、诺卡氏菌(Nocardia)、组织胞浆病(Histoplasmosis)、隐孢子虫(Cryptosporidia)等。靶抗原可来源于或分离自例如致病性原生动物和致病性寄生虫，包括但不限于卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、锥虫(Trypanosoma)、利什曼原虫(Leishmania)(美国专利5,965,242)、疟原虫(Plasmodium)(美国专利5,589,343)和弓形虫(Toxoplasmagondii)。
如本文所用，术语“抗原”被定义为引发免疫应答的分子。该免疫应答可涉及抗体的产生，或特异性免疫感受态细胞的激活，或两者兼而有之。抗原可来源于生物体、蛋白质/抗原的亚基、被杀死或灭活的全细胞或裂解物。因此，任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽，均可用作抗原。此外，抗原可来源于重组DNA或基因组DNA，包括例如含有致病基因组的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA，或者引起免疫应答从而导致抗原合成的蛋白质的基因或基因片段。
靶抗原包括与肿瘤前或增生状态相关的抗原。靶抗原也可与癌症相关或导致癌症。此类靶抗原可为例如肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原(TAA)或组织特异性抗原、其表位及其表位激动剂。此类靶抗原包括但不限于癌胚抗原(CEA)及其表位，诸如CAP-1、CAP-1-6D等(GenBank登录号M29540)、MART-1(Kawakarni等人，J.Exp.Med.，第180卷，第347-352页，1994年)、MAGE-1(美国专利5,750,395)、MAGE-3、GAGE(美国专利5,648,226)、GP-100(Kawakarni等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA，第91卷，第6458-6462页，1992年)、MUC-1、MUC-2、点突变的ras癌基因、正常和点突变的p53癌基因(Hollstein等人，Nucleic AcidsRes.，第22卷，第3551-3555页，1994年)、PSMA(Israel等人，Cancer Res.，第53卷，第227-230页，1993年)、酪氨酸酶(Kwon等人，PNAS，第84卷，第7473-7477页，1987年)、TRP-1(gp75)(Cohen等人，Nucleic Acid Res.，第18卷，第2807-2808页，1990年；美国专利5,840,839)、NY-ESO-1(Chen等人，PNAS，第94卷，第1914-1918页，1997年)、TRP-2(Jackson等人，EMBOJ，第11卷，第527-535页，1992年)、TAG72、KSA、CA-125、CD-123、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2(美国专利5,550,214)、BRC-I、BRC-II、bcr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、TAA和组织特异性抗原的修饰、TAA的剪接变体、表位激动剂等。其他TAA可通过本领域已知的方法鉴定、分离和克隆，例如美国专利4,514,506中所公开的那些。靶抗原还可包括一种或多种生长因子以及每种生长因子的剪接变体。肿瘤抗原是在宿主中触发针对肿瘤的免疫应答的任何抗原，例如肽或多肽。肿瘤抗原可为与赘生性肿瘤细胞相关的肿瘤相关抗原。
T细胞的基因转移/基因修饰方法
为了介导转基因表达在细胞中的影响，有必要将表达构建体转移到细胞中。这种转移可采用病毒或非病毒的基因转移方法。本部分提供了对基因转移的方法和组合物的讨论。
通过将表达载体引入细胞中来产生包含表达载体的转化细胞。与当前方法一起使用的用于转化细胞器、细胞、组织或生物体的多核苷酸递送的合适方法实际上包括可通过其将多核苷酸(例如，DNA)引入细胞器、细胞、组织或生物体中的任何方法。
如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括它们的子代，即任何和所有的后代。应当理解，由于有意或无意的突变，所有子代可能不相同。如本文所用，术语“离体”是指身体的“外部”。术语“离体”和“体外”在本文中可互换使用。
术语“转染”和“转导”是可互换的，并且是指将外源核酸序列引入真核宿主细胞的过程。
转染(或转导)可通过多种手段中的任一种来实现，包括电穿孔、显微注射、基因枪递送、逆转录病毒感染、脂转染、超转染等。
可使用任何适当的方法来转染或转化细胞，例如T细胞，或施用本发明方法的核苷酸序列或组合物。
本文提供了某些非限制性示例。在一些实施方案中，virsl载体为基于SFG的病毒载体，如Tey等人，2007年，Biol Blood Marrow Transpl，第13卷，第913-924页，以及DiStasi等人，2011年，N Engl J Med，第365卷，第1673-1683页，2011年中所讨论的。
如本文所公开的经基因修饰的T细胞可用于向可受益于供体淋巴细胞施用的受试者施用。这些受试者通常将是人，因此本发明通常将使用人T细胞进行。
经修饰的细胞可得自供体，或可为得自患者的细胞，例如，这些细胞可为自体同源的、同系的或同种异体的。这些细胞可例如用于再生，例如以代替患病细胞的功能。还可对细胞进行修饰以表达异源基因，使得可将生物剂递送至特定微环境，例如患病的骨髓或转移性沉积物。所谓“治疗细胞”是指用于细胞治疗的细胞，即施用给受试者以治疗或预防病症或疾病的细胞。
例如，就细胞而言，所谓“获得或制备”是指从来源分离、纯化或部分纯化细胞或细胞培养物，其中来源可为例如脐带血、骨髓或外周血。该术语还可适用于已培养原始来源或细胞培养物并且细胞已复制的情况，以及子代细胞现在来源于原始来源的情况。
外周血：如本文所用，术语“外周血”是指血液的细胞组分(例如，红细胞、白细胞和血小板)，其从血液循环池中获得或制备并且不被隔离在淋巴***、脾脏、肝脏或骨髓内。
脐带血：脐带血不同于外周血和被隔离在淋巴***、脾脏、肝脏或骨髓内的血液。术语“脐带血”、“脐血”或“胎血”可互换使用，是指在儿童出生后保留在胎盘和附着的脐带中的血液。胎血通常含有干细胞，包括造血细胞。
如本文所用，术语“同种异体”是指在宿主细胞和供体细胞之间在抗原上不同的HLA或MHC基因座。因此，从相同物种转移的细胞或组织可在抗原上不同。同系小鼠可在一个或多个基因座(同类系)上不同，并且同种异体小鼠可具有相同的背景。术语“自体同源的”是指来源于相同个体的细胞、核酸、蛋白质、多肽等，随后对其进行施用。本发明方法的经修饰的细胞可以是例如自体细胞，诸如自体T细胞。
供体T细胞通常在进行基因修饰之前培养(通常在活化条件下培养，例如使用抗CD3和/或抗CD28抗体，任选地与IL-2一起培养)。该步骤在修饰过程结束时提供更高收率的T细胞。
在一些实施方案中，样品可经受同种异体排除，或可不经受同种异体排除。在本文提供的示例中，样品不经受同种异体排除，并且因此是同种异体的，如Zhou等人，2015年，Blood，第125卷，第4103-4113页中所讨论的。这些群体提供了更强大的T细胞库，以提供供体细胞的治疗优势。
T细胞可使用编码本申请的多核苷酸的病毒载体进行转导。合适的转导技术可涉及纤连蛋白片段CH-296。作为使用病毒载体进行转导的另选方案，可用本领域已知的任何合适方法转染细胞，诸如用编码所关注的***开关和所关注的细胞表面转基因标记的DNA，例如使用磷酸钙、阳离子聚合物(诸如PEI)、磁珠、电穿孔和基于脂质的商业药剂诸如LipofectamineTM和FugeneTM。转导/转染步骤的一个结果是，各种供体T细胞现在将是可表达所关注的***开关的经基因修饰的T细胞。
在一些实施方案中，用于转导的病毒载体是如下公开的逆转录病毒载体：Tey等人，2007年，Biol Blood Marrow Transpl，第13卷，第913-924页，以及Di Stasi等人，2011年，出处同上。该载体基于长臂猿白血病病毒(Gal-V)假型逆转录病毒，其编码iCasp9***开关和ΔCD19细胞表面转基因标记(进一步参见下文)。它可在PG13包装细胞系中产生，如Tey等人，2007年，出处同上中所讨论的。也可使用编码所需蛋白质的其他病毒载体。在一些实施方案中，每个细胞可提供高拷贝数的前病毒整合体的逆转录病毒载体用于转导。
在转导/转染后，可将细胞与转导/转染材料分离并再次培养，以允许经基因修饰的T细胞扩增。可扩增T细胞，使得实现所需最少数量的经基因修饰的T细胞。
然后可从已获得的细胞群中选择经基因修饰的T细胞。***开关通常将不适合阳性选择所需T细胞，因此在一些实施方案中，经基因修饰的T细胞应表达所关注的细胞表面转基因标记。可例如使用免疫磁性技术来选择表达该表面标记的细胞。例如，可使用与识别所关注的细胞表面转基因标记的单克隆抗体缀合的顺磁珠，例如，使用CliniMACS***(得自美天旎生物公司(Miltenyi Biotec))。
在另选的程序中，在转导步骤之后选择经基因修饰的T细胞，进行培养，然后补料。因此，转导、补料和选择的顺序可改变。
这些方法的结果是包含供体T细胞的组合物，这些供体T细胞已经过基因修饰并且因此可表达例如共刺激多肽和/或所关注的***开关(以及通常所关注的细胞表面转基因标记)。这些经基因修饰的T细胞可施用于受体，但它们在被施用之前通常将被冷冻保存(任选地在进一步扩增之后)。
治疗方法
术语“患者”或“受试者”是可互换的，并且如本文所用，包括但不限于生物体或动物；哺乳动物，包括例如人、非人灵长类动物(例如，猴)、小鼠、猪、牛、山羊、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、马、猴、绵羊或其他非人哺乳动物；非哺乳动物，包括例如非哺乳动物的脊椎动物，诸如鸟(例如，鸡或鸭)或鱼，以及非哺乳动物的无脊椎动物。受试者可以是例如人，例如患有感染性疾病的患者，和/或免疫失能的受试者，或患有过度增殖性疾病的受试者。
本文提供的经修饰的细胞群可用于治疗对其有需要的人类受试者的方法中，并且可用于制备用于治疗此类受试者的药物。通常通过输注将细胞递送至接受的受试者。受试者的T细胞的典型剂量为105-107个细胞/kg。儿科患者通常将接受约106个细胞/kg的剂量，而成人患者将接受更高的剂量，例如，3×106个细胞/kg。
接受者可在接受包含经基因修饰的T细胞的经修饰的细胞群之前经历清髓性调理。因此，接受者自身的α/βT细胞(和B细胞)可在接受经基因修饰的T细胞之前被耗尽。类似地，施用给接受者的造血细胞(干细胞)可耗尽α/β细胞。相比之下，施用给接受者的经基因修饰的供体T细胞通常不会耗尽α/β细胞。
接受者可以是儿童，例如年龄为0-16岁或0-10岁的儿童。在一些实施方案中，接受者为成人。
接受经基因修饰的T细胞的受试者也可接受来自同种异体供体的其他组织，例如它们可接受造血细胞和/或造血干细胞(例如，CD34+细胞)。该同种异体移植组织和经基因修饰的T细胞理想地来源于相同供体，使得它们将是基因匹配的。在一些实施方案中，供体和受体是匹配的不相关供体或合适的家族成员。例如，供体可以是接收者的父母或孩子。因此，在受试者被鉴定为需要经基因修饰的T细胞的情况下，合适的供体可被鉴定为T细胞供体。
在本文提供的经修饰的细胞群(例如，包含经修饰的T细胞的经修饰的细胞群)与造血细胞和/或造血干细胞结合使用的情况下，在一些示例中，经修饰的细胞群可在稍后的时间点(例如，在20-100天之后)施用。
如果接受者在接受经基因修饰的T细胞之后出现并发症(例如，他们出现了GVHD)，则***开关可例如通过向接受者施用普可那利来触发。消除经修饰的细胞(其中经修饰的细胞包含诱导型嵌合促凋亡多肽)所需的诱导型配体(例如，普可那利)的最小剂量将取决于受体中存在的经基因修饰的T细胞的数量。可施用高于该最小剂量的剂量，但根据正常药学原理，应避免过量给药。在一些实施方案中，可用普可那利触发***开关，例如0.4mg/kg的剂量可消除以1.5×107个细胞/kg的剂量输注的细胞。一般而言，施用0.1-5mg/kg之间的普可那利剂量，并且通常0.1-2mg/kg或0.1-1mg/kg就足够了，并且在一些实施方案中，剂量为0.4mg/kg。可施用一系列多剂量的普可那利，例如，如果发现第一剂量不消除所有经基因修饰的T细胞，则可施用第二剂量，依此类推。
在一些实施方案中，施用杀死最敏感细胞的第一剂量的诱导型配体(例如，普可那利)，然后施用杀死不太敏感的细胞的第二剂量(该剂量高于第一剂量)。如果需要，可施用更多的剂量(必要时逐步增加剂量)。
本发明方法还涵盖治疗或预防由病原微生物和/或过度增殖性疾病引起的疾病的方法。
可治疗或预防的疾病包括由病毒、细菌、酵母、寄生虫、原生动物、癌细胞等引起的疾病。药物组合物(转导的T细胞、表达载体、表达构建体等)可用作广义免疫增强剂(T细胞活化组合物或***)，并因此具有治疗疾病的效用。可治疗和/或预防的示例性疾病包括但不限于病毒病因学的感染，诸如HIV、流行性感冒、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘、***瘤病毒等；或细菌病因学的感染，诸如肺炎、肺结核、梅毒等；或寄生虫病因学的感染，诸如疟疾、锥虫病、利什曼病、毛滴虫病、阿米巴病等。
可使用药物组合物(转导的T细胞、表达载体、表达构建体等)治疗或预防的肿瘤前或增生状态包括但不限于肿瘤前或增生状态，诸如结肠息肉、克隆氏病、溃疡性结肠炎、乳腺病变等。
可使用药物组合物治疗的癌症，包括实体瘤，包括但不限于原发性或转移性黑色素瘤、腺癌、鳞状上皮细胞癌、腺鳞状细胞癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、乳腺癌、***癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、NPC、膀胱癌、***等。
可使用本发明的方法治疗来自任何组织或器官的实体瘤，包括例如存在于例如肺、骨、肝脏、***或脑中，并且还存在于例如***、卵巢、肠、睾丸、结肠、胰腺、肾、膀胱、神经内分泌***、软组织、骨块和淋巴***中的实体瘤。可治疗的其他实体瘤包括例如胶质母细胞瘤和恶性骨髓瘤。
接受者可患有血液学癌症(诸如难治性血液学癌症)或遗传性血液疾病。例如，接受者可患有急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、严重联合免疫缺陷(SCID)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(WA)、范可尼贫血、慢性髓细胞性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)或多发性骨髓瘤。
如本文所用，术语“癌症”被定义为细胞的过度增殖，这些细胞的独特性状-正常对照的丧失-导致不受控制的生长、缺乏分化、局部组织浸润和转移。示例包括但不限于黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、白血病、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、牙龈瘤、舌肿瘤、神经母细胞瘤、头部肿瘤、颈部肿瘤、***肿瘤、胰腺癌、***癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子***、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌、肉瘤或膀胱癌。
术语“过度增殖性疾病”被定义为由细胞过度增殖引起的疾病。可使用本文所提供的T细胞和其他治疗性细胞活化***治疗的其他过度增殖性疾病，包括实体瘤，包括但不限于类风湿性关节炎、炎性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化、肿瘤前病变(诸如腺瘤样增生和***上皮内瘤)、原位癌、口腔毛状白斑或牛皮癣。
如本文所用，术语“治疗(treatment、treat、treated或treating)”是指预防和/或疗法。当用于实体瘤诸如癌性实体瘤时，该术语指通过预防性治疗进行预防，这增加了受试者对实体瘤或癌症的抵抗力。在一些示例中，可治疗受试者以预防癌症，其中癌症是家族性的或遗传相关的。例如，当用于感染性疾病时，该术语指的是预防性治疗，其增加了受试者对病原体感染的抵抗力，或者换句话讲，降低了受试者被病原体感染或者显示出可归因于感染的疾病迹象的可能性，以及在受试者被感染后进行治疗以对抗感染，例如，减少或消除感染或防止其恶化。
本文所提供的方法可用于例如治疗其中肿瘤抗原的表达升高的疾病、障碍或病症。
药物组合物(表达构建体、表达载体、融合蛋白、转导的细胞和活化的T细胞、转导的和负载的T细胞)的施用可用于“预防性”或“治疗性”目的。当预防性地提供时，在任何症状之前提供药物组合物。经修饰的细胞群的预防性施用用于预防或改善任何后续的感染或疾病。当在治疗学上提供时，经修饰的细胞群在感染或疾病的症状发作时或之后提供。因此，本文所提供的组合物可在预期暴露于致病因子或疾病状态之前或在感染或疾病开始之后提供。因此，本文提供了使用本文所讨论的经修饰的细胞群预防性地治疗实体瘤诸如存在于癌症中的实体瘤，或例如但不限于***癌的实体瘤的方法。例如，提供了预防性地预防或减小受试者肿瘤大小的方法，该方法包括施用本文所讨论的经修饰的细胞群，由此经修饰的细胞群以有效预防或减小受试者肿瘤大小的量施用。
药物组合物的有效量将是实现增强免疫应答的这一选定结果的量，并且可确定这一量。例如，用于治疗免疫***缺陷的有效剂量可以是引起免疫***活化，导致暴露于抗原时产生抗原特异性免疫应答所需的量。该术语还与“足量”同义。在其他示例中，有效量可以是减小肿瘤大小或肿瘤数量，或减小肿瘤生长速率或肿瘤增殖速率所需的量。在其他示例中，有效量可为降低受试者中靶抗原的量或浓度所需的量，通过比较在施用本文提供的经修饰的细胞群之前、期间和/或之后获得的样品中靶抗原的量或浓度来测量。
任何特定应用的有效量可根据诸如所治疗的疾病或病症、所施用的特定组合物、受试者的体型和/或疾病或病症的严重程度等因素而变化。可凭经验确定本文所提供的特定组合物的有效量，而不必进行过度的实验。因此，例如，在一个实施方案中，转导的T细胞或其他细胞以有效用于例如诱导免疫应答，或例如减小肿瘤大小或减少肿瘤脉管***量的量施用于受试者。
在一些实施方案中，将多剂量的经修饰的细胞施用给受试者，其中在多剂量中剂量水平逐步提高。在一些实施方案中，剂量水平的逐步提高增加了CAR-T细胞活性的水平，并因此提高了治疗效果，例如靶细胞(诸如肿瘤细胞)的量或浓度的降低。
在一些实施方案中，提供了个性化治疗，其中疾病或病症的阶段或水平在施用经修饰的细胞之前、在施用另外剂量的经修饰的细胞之前或在确定施用经修饰的细胞中所涉及的方法和剂量中确定。这些方法可用于本申请的任何方法中。在例如治疗患有实体瘤的受试者的上下文中讨论在施用经修饰的细胞之前评估患者的这些方法的情况下，应当理解，这些方法可类似地应用于治疗其他病症和疾病。因此，例如，在本申请的一些实施方案中，该方法包括向受试者施用本申请的经修饰的细胞，并且还包括确定经修饰的细胞的适当剂量以达到有效减小肿瘤大小的水平。例如，细胞的量可基于受试者的临床状况、体重和/或性别或其他相关物理特性来确定。通过控制施用给受试者的经修饰的细胞的量，可降低不良事件(例如，细胞因子风暴)的可能性。
术语“剂量”意在包括剂量的量和施用频率，例如下一剂量的时间。术语“剂量水平”是指相对于受试者的体重施用的经修饰的细胞群的量。
在一些示例中，术语剂量可指配体诱导剂的剂量。例如，为了诱导嵌合半胱天冬酶-9多肽，术语“剂量水平”是指相对于受试者体重施用的多聚配体的量。因此，增加剂量水平将意味着相对于受试者的体重增加所施用的配体的量。此外，增加所施用剂量的浓度，例如当使用连续输注泵施用多聚配体时，将意味着每分钟或每秒所施用的浓度(以及因此所施用的量)增加。
如本文提供的方法包括但不限于递送有效量的经修饰的细胞群、核酸或编码该细胞群的表达构建体。经修饰的细胞群、核酸或表达构建体的“有效量”通常被定义为足以可检测地和重复地达到所述期望结果(例如，改善、减少、最小化或限制疾病或其症状的程度)的量。其他更严格的定义可能适用，包括消除、根除或治愈疾病。在一些实施方案中，可存在监测生物标记或其他疾病症状诸如肿瘤大小或肿瘤抗原表达的步骤，以评估治疗的有效性并控制毒性。
如果需要，该方法还可包括另外的白细胞单采术，以获得更多的细胞用于治疗。
优化和个性化治疗处理
经修饰的细胞的剂量和给药方案可通过确定待治疗疾病或病症的水平来优化。例如，可确定保留在患者体内的任何剩余实体瘤的大小或靶向细胞诸如肿瘤细胞或表达CD19的B细胞的水平。
在一些示例中，将约1×104、5×104,1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108或1×109个经修饰的细胞或来自经修饰的细胞群的细胞/kg受试者体重施用给受试者。在一些实施方案中，剂量基于总细胞的期望固定剂量和期望比率，并且/或者基于一种或多种(例如，每种)单独亚型或亚群的期望固定剂量。因此，在一些实施方案中，剂量基于T细胞的期望固定剂量或最小剂量以及CD4+细胞与CD8+细胞的期望比率，并且/或者基于CD4+细胞和/或CD8+细胞的期望固定剂量或最小剂量。因此，在一些实施方案中，将约1×104、5×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108或1×109个经修饰的细胞或来自经修饰的细胞群的细胞/kg受试者体重施用给受试者，其中经修饰的细胞群包含60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为3:2、4:1或9:1或更大。
例如，在初始治疗后确定患者具有临床相关水平的肿瘤细胞或实体瘤，向临床医生提供可能需要施用经修饰的细胞群的指示。又如，确定患者在用经修饰的细胞群治疗后肿瘤细胞水平降低或肿瘤大小减小可向临床医生指示不需要另外剂量的经修饰的细胞。类似地，在用经修饰的细胞治疗后，确定患者继续表现出疾病或病症症状或症状复发可向临床医生指示可能需要施用至少一个另外剂量的经修饰的细胞。
因此，例如，在某些实施方案中，该方法包括相对于施用第一剂量或先前剂量的经修饰的细胞后肿瘤大小和/或肿瘤细胞数量，确定受试者中肿瘤大小增加和/或肿瘤细胞数量增加的存在或不存在，以及在确定肿瘤大小增加和/或肿瘤细胞数量增加的存在的情况下，向受试者施用另加剂量的经修饰的细胞酸。该方法还包括例如相对于第一次或先前施用经修饰的细胞群后表达CD19的B细胞的水平，确定受试者中非实体瘤细胞(例如，表达CD19的B细胞)增加的存在或不存在，以及在确定受试者中表达CD19的B细胞增加的存在的情况下，向受试者施用另外剂量的经修饰的细胞。在这些实施方案中，例如，根据本文提供的方法，最初用治疗细胞治疗患者。在初始治疗之后，例如，相对于初始治疗之前的时间，肿瘤的大小、肿瘤细胞的数量或表达CD19的B细胞的数量可减少。在该初始治疗后的某个时间，再次对患者进行测试，或者可持续监测患者的疾病症状。如果确定例如肿瘤的大小、肿瘤细胞的数量或表达CD19的B细胞的数量相对于刚好在初始治疗之后的时间增加，则可施用另外剂量的经修饰的细胞群。
所谓实体瘤的“减小肿瘤大小”或“抑制肿瘤生长”意指根据标准指南(例如，实体瘤疗效评价(RECIST)标准)是指对治疗的反应或疾病的稳定。例如，这可包括实体瘤的直径减小约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或者肿瘤、循环肿瘤细胞或肿瘤标记的数量减少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。肿瘤的大小可通过任何方法分析，包括例如CT扫描、MRI(例如，CT-MRI)、胸部X射线(用于肺部肿瘤)，或分子成像(例如，PET扫描，例如，在施用碘123标记后的PSA(例如，PSMA配体，例如其中抑制剂为TROFEXTM/MIP-1072/1095)后进行的PET扫描)，或分子成像例如SPECT或使用PSA(例如PSMA抗体，诸如卡罗单抗喷地肽(Prostascint)、111-铱标记的PSMA抗体)进行的PET扫描。
所谓“减少、减慢或抑制肿瘤血管形成”是指与治疗前肿瘤血管形成的量相比，肿瘤血管形成减少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或新脉管***出现减少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。该减少可指一种肿瘤，或者可为多于一种肿瘤中血管形成的总和或平均值。测量肿瘤血管形成的方法包括例如CAT扫描、MRI(例如CT-MRI)或分子成像(例如SPECT或PET扫描，例如，在施用碘123标记后的PSA(例如，PSMA配体，例如其中抑制剂为TROFEXTM/MIP-1072/1095)后进行的PET扫描，或使用PSA(例如，PSMA抗体，诸如卡罗单抗喷地肽(Prostascint)、111-铱标记的PSMA抗体)进行的PET扫描)。
当例如肿瘤存在于***中，或者来源于***中的肿瘤或已从***中的肿瘤转移，或者产生PSA时，肿瘤被分类或命名为器官的一部分，诸如***癌肿瘤。例如，当确定肿瘤具有与受试者的***中的肿瘤相同或相似的染色体断点时，肿瘤已从***中的肿瘤转移。
在其他实施方案中，在施用其中经修饰的细胞表达诱导型嵌合促凋亡多肽(例如，诱导型半胱天冬酶-9多肽)的经修饰的细胞群后，在需要减少经修饰的细胞或体内的经修饰的细胞的数量的情况下，可将多聚配体施用给患者。在这些实施方案中，该方法包括确定阴性症状或病症的存在或不存在，例如细胞因子风暴、神经毒性、细胞毒性、移植物抗宿主病或脱靶毒性，以及施用一定剂量的多聚配体。该方法还可包括监测症状或病症，并且在症状或病症持续的情况下施用另外剂量的多聚配体。当表达嵌合抗原受体或嵌合刺激分子的治疗细胞留在患者体内时，该监测和治疗方案可继续。在一些实施方案中，在向受试者施用多聚配体后，包含嵌合半胱天冬酶-9多肽的经修饰的细胞的数量减少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。
可以任何便利的方式提供调节或维持后续药物剂量(例如，经修饰的细胞或核酸的后续剂量和/或后续药物剂量)的指示。在一些实施方案中，指示可以表格形式(例如，在物理或电子介质中)提供。例如，肿瘤细胞的大小或样本中肿瘤细胞的数量或水平可在表中提供，并且临床医生可将症状与疾病阶段的列表或表进行比较。然后，临床医生可从表中识别后续药物剂量的指示。在某些实施方案中，在将症状提供给计算机(例如，输入到计算机上的存储器中)之后，指示可由计算机呈现(例如，显示)。例如，该信息可提供给计算机(例如，由用户输入到计算机存储器中或通过计算机网络中的远程装置传输到计算机)，并且计算机中的软件可生成用于调节或维持后续药物剂量的指示，并且/或者提供后续药物剂量。
一旦基于该指示确定了后续剂量，临床医生就可施用后续剂量或向另一个人或实体提供调节剂量的指令。如本文所用，术语“临床医生”是指决策者，并且在某些实施方案中，临床医生是医疗专业人员。在一些实施方案中，决策者可以是计算机或显示的计算机程序输出，并且健康服务提供方可对由计算机显示的指示或后续药物剂量采取行动。决策者可直接施用后续剂量(例如，将后续剂量输注到受试者中)，或远程施用后续剂量(例如，泵参数可由决策者远程改变)。
实体瘤癌症(包括，例如，***癌)的治疗可通过在治疗过程中确定与肿瘤相关的生物标记的浓度来优化。由于患者对治疗过程可能有不同的反应，因此可通过跟踪各种体液或组织中生物标记的浓度或水平来监测对治疗的反应。生物标记多肽的浓度、水平或量的确定可包括全长多肽或其片段或变体的检测。片段或变体可足以通过例如免疫学方法、质谱法、核酸杂交等进行检测。优化对个体患者的治疗可有助于避免因过量给药而产生的副作用，可有助于确定治疗何时无效并改变治疗过程，或者可有助于确定何时可增加剂量，或者确定治疗的时间。
例如，已确定某些生物标记的量或浓度在实体瘤的治疗过程中改变。提供了此类生物标记的预定目标水平或可在正常受试者中鉴定出的生物标记阈值，这允许临床医生确定向对其有需要的受试者(例如，患有实体瘤诸如***肿瘤的受试者)施用的药物的后续剂量可增加、减少还是维持。在某些实施方案中，临床医生可基于生物标记的存在、不存在，或者量是分别低于、高于生物标记阈值还是与其大致相同来作出这样的确定。
细胞因子是由不同来源的细胞在全身范围内广泛产生的一大类多样的多肽调节因子。细胞因子的存在或水平可用作生物标记。术语“细胞因子”是对一大类蛋白质和糖蛋白的一般描述。其他名称包括淋巴因子(由淋巴细胞产生的细胞因子)、单核因子(由单核细胞产生的细胞因子)、趋化因子(具有趋化活性的细胞因子)和白介素(由一种白细胞产生并作用于其他白细胞的细胞因子)。细胞因子可作用于分泌它们的细胞(自分泌作用)，作用于附近细胞(旁分泌作用)，或在一些情况下作用于远处细胞(内分泌作用)。可通过检测与受试者毒性相关的细胞因子水平来监测用本申请的经修饰的细胞群对受试者的治疗，或者任选地，药物例如普可那利的随后施用，以诱导细胞凋亡并消除细胞。细胞因子的示例包括但不限于白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18等)、干扰素(例如，IFN-β、IFN-γ等)、肿瘤坏死因子(例如，TNF-α、TNF-β等)、淋巴因子、单核因子和趋化因子；生长因子(例如，转化生长因子(例如，TGF-α、TGF-β等))；集落刺激因子(例如，GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等)；等等。
可使用任何合适的方法来进行检测，包括但不限于质谱法(例如，基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)、电喷雾质谱法(ES-MS))、电泳法(例如，毛细管电泳)、高效液相色谱(HPLC)、核酸亲和力(例如，杂交)、扩增和检测(例如实时或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR))以及抗体测定(例如，抗体阵列、酶联免疫吸附测定(ELISA))。
在将经修饰的细胞群或药物递送至受试者后，可在任何合适的收集时间从受试者获得样品。例如，可在将药物递送给受试者后约一小时内(例如，在递送药物后约5、10、15、20、25、30、35、40、45、55或60分钟内)、在将药物递送给受试者后约一天内(例如，在递送药物后约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时内)或在将药物递送给受试者后约两周内(例如，在递送药物后约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天内)收集样本。例如，可以按指定的时间表进行收集，包括每小时、每天、每半周、每周、每两周、每月、每两个月、每季度和每年等。如果药物在一段时间内连续施用(例如，输注)，则可根据药物被引入受试者的第一时刻、从药物施用停止的时间、或其间的点(例如，施用时间范围中点或其他点)确定延迟。例如，“向受试者施用经修饰的细胞群”应理解为可与短语“施用经修饰的细胞或经修饰的T细胞”互换。也就是说，在关于施用或制备经修饰的细胞的讨论中，一组经修饰的细胞(以复数形式)应理解为也指经修饰的细胞群。
向患者施用的制剂和途径
在设想临床应用的情况下，有必要以适合于预期应用的形式制备药物组合物-表达构建体、表达载体、融合蛋白、转导细胞、活化的T细胞、转导的和负载的T细胞。一般来讲，这将需要制备基本上不含热原以及可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。
多聚配体，例如AP1903(普可那利)，可例如以约0.01至1mg/kg受试者体重、约0.05至0.5mg/kg受试者体重、0.1至2mg/kg受试者体重、约0.05至1.0mg/kg受试者体重、约0.1至5mg/kg受试者体重、约0.2至4mg/kg受试者体重、约0.3至3mg/kg受试者体重、约0.3至2mg/kg受试者体重或约0.3至1mg/kg受试者体重，例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10mg/kg受试者体重的剂量递送。在一些实施方案中，配体以每剂量0.4mg/kg提供，例如以5mg/ml的浓度提供。可提供含有配体的小瓶或其他容器，例如每小瓶约0.25ml至约10ml的体积，例如约0.25ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、5ml、5.5ml、6ml、6.5ml、7ml、7.5ml、8ml、8.5ml、9ml、9.5ml或10ml，例如约2ml。激活诱导型半胱天冬酶-9安全开关的合适方法在例如Di Stasi等人，2011年，N Engl J Med，第365卷，第1673-1683页中提供，并且在于2011年5月20日提交的美国专利申请13/112,739，于2011年11月24日公布为US2011-0286980，于2015年7月28日颁发为美国专利9,089,520中提供。
组合疗法
为了增加本文提供的表达载体的有效性，可能期望将这些组合物和方法与在疾病的治疗中有效的药剂组合。
在某些实施方案中，抗癌剂可与本发明的方法组合使用。“抗癌”剂能够例如通过杀死一种或多种癌细胞，在一种或多种癌细胞中诱导细胞凋亡，降低一种或多种癌细胞的生长速率，降低转移的发生率或数量，减小肿瘤的大小，抑制肿瘤的生长，减少对肿瘤或一种或多种癌细胞的血液供应，促进针对一种或多种癌细胞或肿瘤的免疫应答，预防或抑制癌症的进展，或延长患有癌症的受试者的寿命。抗癌剂包括例如化学治疗剂(化学疗法)、放射治疗剂(放射疗法)、外科手术(手术)、免疫治疗剂(免疫疗法)、基因治疗剂(基因疗法)、激素疗法、其他生物剂(生物疗法)和/或替代疗法。
在一些实施方案中，抗生素可与药物组合物组合使用以治疗和/或预防感染性疾病。此类抗生素包括但不限于阿米卡星、氨基糖苷类(例如，庆大霉素)、阿莫西林、两性霉素B、氨苄青霉素、锑制剂(antimonials)、阿托伐醌葡萄糖酸锑钠、阿齐霉素、卷曲霉素、头孢噻肟、头孢西丁、头孢曲松、氯霉素、克拉霉素、克林霉素、氯法齐明、环丝氨酸、氨苯砜、强力霉素、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氟康唑、氟喹诺酮、异烟碱、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、米诺环素、氧氟沙星)、对氨基水杨酸、喷他脒、菌素防卫素(polymixin definsins)、丙硫异烟胺、吡嗪酰胺、乙嘧啶、磺胺嘧啶、喹诺酮(例如，环丙沙星)、利福布汀、利福平、司帕沙星、链霉素、磺酰胺、四环素、氨硫尿、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑、紫霉素或它们的组合。
更一般地，此类药剂将以与有效杀死癌细胞和/或微生物或抑制其增殖的表达载体组合的量提供。该方法可涉及同时或在一段时间内使细胞与药剂和药物组合物接触，其中向细胞、组织或生物体单独施用药物组合物和药剂产生期望的治疗有益效果。这可通过使细胞、组织或生物体与包含药物组合物和一种或多种药剂两者的单一组合物或药理制剂接触，或通过使细胞与两种或更多种不同的组合物或制剂接触来实现，其中一种组合物包含药物组合物，并且另一种包含一种或多种药剂。
当应用于细胞、组织或生物体时，术语“接触”和“暴露”在本文中用来描述将药物组合物和/或另一种药剂(诸如化学治疗剂或放射治疗剂)递送至靶细胞、组织或生物体或与靶细胞、组织或生物体直接并置的过程。为了实现细胞杀伤或停滞，将药物组合物和/或另外的药剂以有效杀死细胞或防止细胞***的组合量递送至一个或多个细胞。在一些实施方案中，化学治疗剂选自卡铂、磷酸雌莫司汀(Emcyt)和沙利度胺。在一些实施方案中，化学治疗剂是紫杉烷。紫杉烷可例如选自多西他赛(泰素帝)、紫杉醇和卡巴他赛。在一些实施方案中，紫杉烷是多西他赛。在一些实施方案中，在施用经修饰的细胞或核酸的同时或之后一周内施用化学治疗剂。在其他实施方案中，在施用经修饰的细胞或核酸后1周至4周或1周至1个月、1周至2个月、1周至3个月、1周至6个月、1周至9个月、或1周至12个月施用化学治疗剂。在一些实施方案中，在施用细胞或核酸之前至少1个月施用化学治疗剂。
药物组合物的施用可在其他药剂之前、与其他药剂同时和/或在其他药剂之后间隔数分钟至数周。在其中药物组合物和其他药剂单独施用于细胞、组织或生物体的实施方案中，通常确保在每次递送的时间之间相当长的时间段内不会失效，使得药物组合物和药剂仍能够对细胞、组织或生物体发挥有利的组合效果。例如，在这种情况下，可以设想的是，可与药物组合物基本上同时(即，在小于约一分钟内)以两种、三种、四种或更多种形式接触细胞、组织或生物体。在其他方面，在施用表达载体之前和/或之后，可在基本上同时、约1分钟至约24小时至约7天至约1至约8周或更长的时间内，以及其中可衍生的任何范围内施用一种或多种药剂。此外，可采用本文提供的药物组合物与一种或多种药剂的各种组合方案。
在一些实施方案中，化学治疗剂可以是耗尽淋巴的化学治疗剂。在其他示例中，化学治疗剂可以是泰素帝(多西他赛)或另一种紫杉烷，诸如卡巴他赛。化学治疗剂可在用细胞和诱导剂治疗之前、期间或之后施用。例如，化学治疗剂可在施用第一剂量的活化核酸之前约1年、11、10、9、8、7、6、5或4个月，或18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1周施用。或者，例如，化学治疗剂可在施用第一剂量的细胞或诱导剂后约1周或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18周或4、5、6、7、8、9、10或11个月或1年施用。
化学治疗剂的施用可包括施用多于一种的化学治疗剂。例如，除了泰素帝或其他紫杉烷(诸如卡巴他赛)之外，还可施用顺铂。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的经修饰的细胞群与细胞因子或趋化因子中和剂(例如，中和抗体)的组合疗法。在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的经修饰的细胞群与TNFα中和剂(例如，抗TNFα抗体)的组合疗法。
实施例
实施例1：MyD88/CD40增强的CAR-T细胞在使用诱导型半胱天冬酶-9解决细胞因子 相关毒性后维持治疗功效
摘要
针对血液恶性肿瘤的成功过继性嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法需要CAR-T扩增和输注后耐久的持久性。平衡增加的CAR-T的效力与安全性(包括严重的细胞因子释放综合征(sCRS)和神经毒性)保证包括控制体内的CAR-T活性的安全机制。在此，我们描述了一种新型CAR-T细胞平台，该平台利用toll样受体(TLR)衔接分子MyD88和肿瘤坏死因子家族成员CD40(MC)的表达，通过有意低效的2A接头***连接到CAR分子，从而提供驱动CAR-T存活、增殖和对抗CD19+和CD123+血液学癌症的抗肿瘤活性的组成型信号。在与高水平的人细胞因子产生相对应的动物模型中，MC增强的CAR-T细胞的稳健活性与恶病质相关。但是，可通过使用诱导型半胱天冬酶-9(iC9)减少血清细胞因子，通过施用抗TNF-α的中和抗体或通过选择产生“低”细胞因子的CD8+T细胞而不会丧失抗肿瘤活性，来减轻毒性。有趣的是，高基础活性是体内CAR-T扩增所必需的。该研究显示，新型信号传导元件(即，MyD88和CD40)的共选择和独特CAR-T结构的开发可驱动T细胞在体内增殖以增强CAR-T疗法。
表达构建体
质粒构建
基于pB001三顺反子SFG的逆转录病毒载体是在一些示例中用于制备经修饰的CD19CAR-T细胞群的载体的一个示例，该载体表达CD19特异性嵌合抗原受体、组成型活性MyD88-CD40嵌合多肽和iC9安全开关。
质粒pB001在5'至3'方向上包含编码以下内容的核酸：
(1)MLEMLE接头(SEQ ID NO:31，由SEQ ID NO:32编码)、突变型人FKBP12蛋白(FKBP12(F36V)，也称为FKBP12v36、Fvse、FKBPV或Fv；由SEQ ID NO:2编码的SEQ ID NO:1)，其中氨基酸位置36(或37，如果对蛋白质的初始甲硫氨酸进行计数的话)处的苯丙氨酸被缬氨酸取代，该缬氨酸通过8-氨基酸接头(由SEQ ID NO:4编码的SEQ ID NO:3)与人半胱天冬酶9多肽的一部分(Δ半胱天冬酶9，其含有半胱天冬酶9的氨基酸135-416；由SEQ ID NO:6编码的SEQ ID NO:5)融合(整个融合蛋白被称为iC9)，
(2)T2A多肽(由SEQ ID NO:8编码的SEQ ID NO:7)，
(3)膜信号肽(由SEQ ID NO:10编码的SEQ ID NO:9)，该膜信号肽融合至抗CD19单克隆抗体FMC63的轻链(由SEQ ID NO:12编码的SEQ ID NO:11)可变区和重链(由SEQ IDNO:16编码的SEQ ID NO:15)可变区(在链之间具有居间的8-氨基酸柔性甘氨酸-丝氨酸接头，即，柔性肽(由SEQ ID NO:14编码的SEQ ID NO:13))，该抗CD19单克隆抗体FMC63融合至人CD34表位多肽(CD34的第30-45位氨基酸；由SEQ ID NO:18编码的SEQ ID NO:17)，该表位多肽融合至人CD8的α茎部区(CD8的第141-182位氨基酸；由SEQ ID NO:20编码的SEQ IDNO:19)，该α茎部区融合至人CD8的跨膜结构域(CD8的第183-219位氨基酸；由SEQ ID NO:22编码的SEQ ID NO:21)，该跨膜结构域融合至人CD3ζ的一部分(CD3ζ同种型X2的第83-194位氨基酸；由SEQ ID NO:24编码的SEQ ID NO:23)，
(4)P2A多肽(由SEQ ID NO:26编码的SEQ ID NO:25)，
(5)融合蛋白，该融合蛋白包含截短的人MyD88多肽(包含DD结构域和中间结构域的MyD88的氨基末端172个氨基酸；由SEQ ID NO:28编码的SEQ ID NO:27)，该截短的人MyD88多肽融合至人CD40多肽的一部分(羧基末端62个氨基酸，即，CD40的第216-277位氨基酸；由SEQ ID NO:30编码的SEQ ID NO:29)，(整个融合蛋白被称为MC)。
基于pB002三顺反子SFG的逆转录病毒载体是在一些示例中用于制备经修饰的Her2CAR-T细胞群的载体的一个示例，该载体表达Her2特异性嵌合抗原受体、组成型活性MyD88-CD40嵌合多肽和iC9安全开关。
质粒pB002在5'至3'方向上包含编码以下内容的核酸：
(1)MLE接头(SEQ ID NO:43，由SEQ ID NO:44编码)、突变型人FKBP12蛋白(FKBP12(F36V)，也称为FKBP12v36、Fvse、FKBPV或Fv；由SEQ ID NO:2编码的SEQ ID NO:1)，其中氨基酸位置36(或37，如果对蛋白质的初始甲硫氨酸进行计数的话)处的苯丙氨酸被缬氨酸取代，该缬氨酸通过8-氨基酸接头(由SEQ ID NO:4编码的SEQ ID NO:3)与人半胱天冬酶9多肽的一部分(Δ半胱天冬酶9，其含有半胱天冬酶9的氨基酸135-416；由SEQ ID NO:6编码的SEQ ID NO:5)融合；不含SEQ ID NO:5的末端脯氨酸，或不含编码SEQ ID NO:6的脯氨酸的末端密码子)(整个融合蛋白被称为iC9)，
(2)T2A多肽(由SEQ ID NO:8编码的SEQ ID NO:7)，
(3)膜信号肽(由SEQ ID NO:10编码的SEQ ID NO:9)，该膜信号肽融合至抗Her2单克隆抗体FRP5的重链(由SEQ ID NO:46编码的SEQ ID NO:45)可变区和轻链(由SEQ ID NO:48编码的SEQ ID NO:47)可变区(在链之间具有居间的接头(由SEQ ID NO:50编码的SEQ IDNO:49))，该抗Her2单克隆抗体FRP5融合至人CD34表位多肽(CD34的第30-45位氨基酸；由SEQ ID NO:18编码的SEQ ID NO:17)，该表位多肽融合至人CD8的α茎部区(CD8的第141-182位氨基酸；由SEQ ID NO:20编码的SEQ ID NO:19)，该α茎部区融合至人CD8的跨膜结构域(CD8的第183-219位氨基酸；由SEQ ID NO:22编码的SEQ ID NO:21)，该跨膜结构域融合至人CD3ζ的一部分(CD3ζ同种型X2的第83-194位氨基酸；由SEQ ID NO:24编码的SEQ ID NO:23)，
(4)P2A多肽(由SEQ ID NO:26编码的SEQ ID NO:25)，
(5)融合蛋白，该融合蛋白包含肉豆蔻酰化结构域(由SEQ ID NO:52编码的SEQ IDNO:51)、截短的人MyD88多肽(含有DD结构域和中间结构域的MyD88的氨基末端172个氨基酸；由SEQ ID NO:28编码的SEQ ID NO:27)，该截短的人MyD88多肽融合至人CD40多肽的一部分(羧基末端62个氨基酸，即，CD40的第216-277位氨基酸；由SEQ ID NO:30编码的SEQ IDNO:29)，(整个融合蛋白被称为MC)。
基于pB003三顺反子SFG的逆转录病毒载体是在一些示例中用于制备经修饰的PSCA CAR-T细胞群的载体的一个示例，该载体表达PSCA特异性嵌合抗原受体、组成型活性MyD88-CD40嵌合多肽和iC9安全开关。
质粒pB003在5'至3'方向上包含编码以下内容的核酸：
(1)MLE接头(SEQ ID NO:43，由SEQ ID NO:44编码)、突变型人FKBP12蛋白(FKBP12(F36V)，也称为FKBP12v36、Fvse、FKBPV或Fv；由SEQ ID NO:2编码的SEQ ID NO:1)，其中氨基酸位置36(或37，如果对蛋白质的初始甲硫氨酸进行计数的话)处的苯丙氨酸被缬氨酸取代，该缬氨酸通过8-氨基酸接头(由SEQ ID NO:4编码的SEQ ID NO:3)与人半胱天冬酶9多肽的一部分(Δ半胱天冬酶9，其含有半胱天冬酶9的氨基酸135-416；由SEQ ID NO:6编码的SEQ ID NO:5)融合；不含SEQ ID NO:5的末端脯氨酸，或不含编码SEQ ID NO:6的脯氨酸的末端密码子)(整个融合蛋白被称为iC9)，
(2)T2A多肽(由SEQ ID NO:8编码的SEQ ID NO:7)，
(3)膜信号肽(由SEQ ID NO:10编码的SEQ ID NO:9)，该膜信号肽融合至抗PSCA单克隆抗体A11的轻链(由SEQ ID NO:54编码的SEQ ID NO:53)可变区和重链(由SEQ ID NO:56编码的SEQ ID NO:55)可变区(在链之间具有居间的8-氨基酸柔性甘氨酸-丝氨酸接头，即，柔性肽(由SEQ ID NO:14编码的SEQ ID NO:13))，该抗PSCA单克隆抗体A11融合至人CD34表位多肽(CD34的第30-45位氨基酸；由SEQ ID NO:18编码的SEQ ID NO:17)，该表位多肽融合至人CD8的α茎部区(CD8的第141-182位氨基酸；由SEQ ID NO:20编码的SEQ ID NO:19)，该α茎部区融合至人CD8的跨膜结构域(CD8的第183-219位氨基酸；由SEQ ID NO:22编码的SEQ ID NO:21)，该跨膜结构域融合至人CD3ζ的一部分(CD3ζ同种型X2的第83-194位氨基酸；由SEQ ID NO:24编码的SEQ ID NO:23)，
(4)P2A多肽(由SEQ ID NO:26编码的SEQ ID NO:25)，
(5)融合蛋白，该融合蛋白包含肉豆蔻酰化结构域(由SEQ ID NO:52编码的SEQ IDNO:51)、截短的人MyD88多肽(含有DD结构域和中间结构域的MyD88的氨基末端172个氨基酸；由SEQ ID NO:28编码的SEQ ID NO:27)，该截短的人MyD88多肽融合至人CD40多肽的一部分(羧基末端62个氨基酸，即，CD40的第216-277位氨基酸；由SEQ ID NO:30编码的SEQ IDNO:29)，(整个融合蛋白被称为MC)。
材料和方法
小鼠：NOD.Cg-Prkdcscid ll2rgtm1wjl/SzJ(NSG)小鼠获自缅因州巴港的杰克逊实验室(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)。
细胞系、培养基和试剂：293T(HEK 293T/17)、Raji、Daudi和THP-1细胞系获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。将细胞系在37℃和5％CO2下维持在补充有10％胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酰胺(英杰公司(Invitrogen))的DMEM(纽约州格兰德岛市英杰公司(Invitrogen,Grand Island,NY))中。将由外周血单核细胞(PBMC)产生的T细胞在45％RPMI 1640、45％克里克培养基(英杰公司(Invitrogen))中培养，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺(T细胞培养基；TCM)和100U/ml IL-2(德国贝尔吉施格拉德巴赫的美天旎生物公司(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany))，除非另外指明。将临床级普可那利在乙醇中稀释至100mM工作溶液以用于体外测定，或用0.9％盐水稀释以用于动物研究。
逆转录病毒和质粒构建体：生成编码iC9连同第一代抗CD19CAR的基于初始双顺反子SFG的逆转录病毒载体，第一代抗CD19CAR包含FMC63单链可变片段(scFv)、CD8a茎部和跨膜结构域以及CD3ζ链胞质结构域(iC9-CD19.ζ)。在所有CAR载体中，CD34Qbend-10最小表位(10)包括在CD8a茎部中以检测经基因修饰的T细胞上的CAR表达。构建第三代CAR，其包括邻近CD8a跨膜区的MC共刺激蛋白(iC9-CD19.MC.ζ)。此外，对于第三代构建仅具有MyD88(M)或CD40(C)的载体(分别为iC9-CD19.M.ζ或iC9-CD19.C.ζ)。构建具有组成型表达的MC嵌合蛋白的激活三顺反子iC9的CD19和CD123(331292scFv(11,12))CAR构建体(iC9-CD19.ζ-MC)。如先前所述(13,14)，还合成了编码CD28和4-1BB胞内域的iC9表达的CD19载体。用增强的2A序列合成另外的载体，包括提高核糖体跳过效率的GSG接头(15)，以及上述转基因的替代取向。对于共培养测定和体内研究，肿瘤细胞系用编码EGFP荧光素酶(EGFPluc)的逆转录病毒载体修饰。
经基因修饰的T细胞的产生：使用GeneJuice(新泽西州吉布斯敦市的EMDBiosciences公司(EMD Biosciences,Gibbstown,NJ))转染试剂，通过293T细胞与SFG载体质粒、含有MoMLV gag-pol序列的EQ-PAM3(-E)质粒和RD114包膜编码质粒的瞬时共转染产生逆转录病毒上清液。活化的T细胞由得自德克萨斯州休斯顿的墨西哥湾沿岸血库(GulfCoast Blood Bank,Houston,TX)的外周血单核细胞(PBMC)制成，并使用抗CD3/抗CD28抗体进行活化，如前所述(5)。活化3天后，随后将T细胞在包被有纤维连接蛋白的平板(日本滋贺县大津市的Takara生物公司(Takara Bio,Otsu,Shiga,Japan))上转导并用100U/ml IL-2扩增并扩增10至14天。对于两次转导，方案与上文相同，不同的是将孔用等量的每种逆转录病毒上清液包被。
免疫分型：使用CD3-PerCP.Cy5和CD34-PE(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司(BioLegend,San Diego,CA))，通过流式细胞术分析转导后10至14天的经基因修饰的T细胞的转基因表达。使用CD4和CD8抗体(BioLegend)针对纯度测试评估CAR-T细胞亚群(即，CD4和CD8)的细胞选择的实验。使用针对CD45RA和CD62L(T细胞记忆表型)和PD-1(T细胞衰竭)的抗体进行另外的表型分析。使用Gallios流式细胞仪进行所有流式细胞术，并使用Kaluza软件(加利福尼亚州布雷亚的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Brea,CA))分析数据。
共培养测定：将非转导的和经基因修饰的T细胞以1:1的效应细胞与靶细胞(24孔板中各5×105个细胞)比率与CD19+Raji-EGFPluc肿瘤细胞一起培养，并在不存在外源IL-2的情况下培养7天。然后收获细胞、计数并通过流式细胞术分析T细胞(CD3+)或肿瘤细胞(EGFPIuc+)的频率。在一些测定中，在无靶细胞的情况下培养非转导的和经基因修饰的T细胞(24孔板中各5×105个细胞)。在开始共培养后48小时分析培养上清液的细胞因子水平。
动物模型：为了评估靶向CD19的CAR-T细胞的抗肿瘤活性，通过静脉内(i.v.)尾静脉注射将5×105个CD19+Raji或Raji-EGFPluc肿瘤细胞植入NSG小鼠。4天后，通过静脉内(尾部)注射施用可变剂量的非转导的和经基因修饰的T细胞。在一些实验中，如上所述用Raji-EGFPluc T细胞对小鼠进行再攻击。为了测试CD123特异性CAR-T活性，通过静脉内注射植入1×106个CD123+THP-1-EGFPIuc肿瘤细胞，然后在肿瘤植入后7天输注2.5×106个未修饰细胞或CAR-T细胞。iC9滴定实验通过以下方式进行：用5×106个iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞处理携带Raji肿瘤的小鼠，然后在T细胞注射后7天以0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5和5mg/kg注射普可那利。为了评估细胞因子相关的毒性，通过每周两次经腹膜内注射100μg来施用抗hlL-6、hlFN-y和TNF-α的中和抗体或同种型对照抗体(新罕布什尔州西黎巴嫩的BioXCell公司(Bio X Cell,West Lebanon,NH))。使用阳性选择的CD4+和CD8+iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞，并使用CD4或CD8微珠和MACS柱(美天旎生物公司(Miltenyi Biotec))，进行另外的实验。通过经腹膜内注射150mg/kgD-荧光素(马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,Waltham,MA))进行生物发光成像(BLI)并且使用I VIS成像***(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))成像来测量体内肿瘤生长和T细胞增殖。通过全身感兴趣区域(ROI)来分析光子发射，并以平均辐照度(光子数/秒/平方厘米/球面度)测量信号。
蛋白质印迹分析：收获非转导的和经基因修饰的T细胞并裂解，并且定量裂解物的蛋白质含量。将蛋白质裂解物在10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并用针对β-肌动蛋白(1:1000，赛默飞世尔公司(Thermo))、半胱天冬酶-9(1:400，赛默飞世尔公司(Thermo))和MyD88(1:200，圣克鲁斯公司(Santa Cruz))的一抗进行免疫印迹。所用的二抗是HRP缀合的山羊抗兔抗体或小鼠IgG抗体(1:500，赛默飞世尔公司(Thermo))。使用SuperSignal West Femto最高灵敏度底物试剂盒(赛默飞世尔公司(Thermo)，34096)对膜进行显影，并使用GelLogic 6000Pro相机和CareStream M1软件(v.5.3.1.16369)进行成像。
体外和体内细胞因子产生的分析：根据推荐的ELISA或流式微珠阵列法(加利福尼亚州圣地亚哥的eBioscience公司(eBioscience,San Diego,CA)或新泽西州东拉瑟福德的BD公司(Becton Dickinson,East Rutherford,NJ))分析用iMC或对照载体修饰的T细胞对IFN-γ、IL-2和IL-6的细胞因子产生。在一些实验中，使用多重阵列***(Bio-PlexMAGPIX，加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(Bio-Rad,Hercules,CA)；或Milli-Plex，马萨诸塞州伯灵顿的密理博公司(Millipore,Burlington,MA))分析细胞因子。
统计：数据表示为平均值±SEM。使用曼-惠特尼统计比较来分析数据，以确定组之间的显著差异。使用单因素方差分析，然后进行Bonferroni多重比较检验，以比较多个处理组。使用双因素方差分析，然后进行Bonferroni检验，以评估多个处理组之间在不同时间点的肿瘤生长差异的统计学显著性。通过Kaplan-Meier图记录存活率，其中显著性通过对数秩检验确定。使用GraphPad Prism v5.0软件(加利福尼亚州拉荷亚的GraphPad公司(GraphPad,La Jolla,CA))分析数据。
结果
将MyD88/CD40胞内域包含在CAR结构中提供了共刺激，但降低了体内CAR活性。
为CAR-T细胞提供MC共刺激，同时保持使用普可那利激活的iC9安全开关的能力，我们构建了编码iC9的双顺反子逆转录病毒载体，然后构建CD3ζ信号传导元件上游的编码截短MyD88(缺少TIR结构域)和CD40(缺少胞外结构域)的CD19特异性CAR，并将其与第一代表达iC9的CD19CAR进行比较(图1A和图1B)。“CAR.z”和“CAR.ζ”均是指包含CD3-ζ多肽并且可与“CAR.zeta.”互换的嵌合抗原受体。原代T细胞的转导显示出CD19.ζ和CD19.MC.ζ构建体的等效CAR转导效率(分别为71％±10％与72％±8％)，然而通过添加MC会显著降低CAR表面表达(MFI)(MFI 8513±1587与2824±455；p<0.005)(图1C和图1D)。构建另外的表达MC或仅表达MyD88或CD40的载体显示，MyD88降低了CAR表达水平，但未降低转导效率，这表明在CAR内表达的MyD88引起了膜上CAR的不稳定性(图2)。尽管降低了CAR细胞表面水平，但包含MC信号传导结构域通过增加CAR-T增殖和IL-2细胞因子产生来相比于仅CD19.ζ修饰的T细胞增强针对表达CD19的Raji肿瘤细胞的CAR活性(增加23倍；p<0.0001)(图1E)。我们随后使用植入有CD19+Raji肿瘤的NSG小鼠评估靶向CD19的CAR活性。在此，静脉内注射5×106个iC9-CD19.ζ或iC9-CD19.MC.ζ修饰的T细胞显示出对非转导(NT)的T细胞的显著抗肿瘤控制(***第14天p<0.0001)，但未产生持久应答(图1F和图1G)。重要的是，与第一代构建体相比，MC的添加并未提高抗肿瘤活性。这些数据表明，MyD88与在CAR结构内作为共刺激结构域的正常表达不相容。
MC在CAR-T分子外的组成型表达提供稳健的共刺激，同时保持CAR表达。
为了确定MC是否可用作组成型表达的共刺激模块来驱动T细胞增殖，我们使用三顺反子基因表达方法(使用另外的2A序列)在CAR分子外表达MC(图3A)。从CAR中移除MC并将其表达为单独的多肽(iC9-CD19.ζ-MC)，提高了经基因修饰的T细胞上的CAR表达水平(图3B)，并下调了内源性T细胞受体(TCR)水平，这与T细胞活化一致(图3B)。实际上，在不存在抗原刺激的情况下，iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞分泌促炎细胞因子，包括IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9和TNF-α，表明表达MC提供了组成型T细胞活化信号(图3C)。重要的是，在没有CAR-T参与的情况下，iC9-CD19.ζ-MC不会触发IL-2分泌。通过使用蛋白质印迹分析在非转导的、iC9-CD19.ζ-MC修饰的和用诱导型MyD88/CD40 CD19CAR载体(iMC-CD19.ζ)转导的T细胞中探测MyD88表达，我们能够在iC9-CD19.ζ-MC转导的T细胞中检测快速迁移(约30kDa)片段和较弱的慢速迁移(约90kDa)片段两者，这表明MC与在此背景下表达的CAR.ζ分子不完全分离，可能是由于低效的2A核糖体跳过(图3D)(15)。为了了解MC介导的组成型T细胞活化是否导致自主CAR-T增殖，我们在存在或不存在外源IL-2(100U/ml)的情况下培养了非转导的iC9-CD19.ζ或iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞。在存在IL-2的情况下，该MC CAR连接可在培养60天后诱导CAR-T细胞的持续、广泛扩增(超过108个)，而表达iC9-CD19.ζ-MC的CAR-T细胞在不存在IL-2的情况下不能存活，从而降低了自主生长的风险(图3E)。长期培养(100天)iC9-CD19.ζ-MC转导的T细胞在暴露于普可那利时保持对iC9诱导的细胞凋亡敏感(图3F)，并且在与CD19+靶细胞(如培养了较短时间(14天)的T细胞)的共培养测定中保留细胞毒性活性并产生IL-2(图3G)。有趣的是，与第一代CAR相比，iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞显示出PD-1表达的降低，这表明组成型MC活性可降低iC9-CD19.ζ-MC T细胞对肿瘤微环境中PD-L1表达的敏感性。此外，降低的PD-1表达可延迟或防止T细胞衰竭(图3H)。另外，iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞的长期培养显示，这些细胞表现出与第一代CD19-CAR T细胞(CD45RA+CD62L+TN、CD45RA-CD62L+TCM、CD45RA-CD62L-TEM、CD45RA+CD62L-TEMRA)相似的T细胞亚群分布。然而，在培养100天后，TEM(CD3+CD45-CD62L-)细胞是iC9-CD19.ζ-MC T细胞培养物中存在的主要亚型(图25)。因此，iC9-CD19.ζ-MC是在存在抗原刺激或外源IL-2的情况下具有持续增殖能力的组成型活性CAR构建体，但对通过iC9安全开关的受控消除有反应。
组成型MC-CAR-T在动物中展示出对CD19+淋巴瘤的稳健抗肿瘤活性。
使用植入有CD19+Raji细胞系、经EGFPluc转基因(Raji-EGFPluc)修饰的免疫缺陷型NSG小鼠，评估了表达组成型MC的靶向CD19的CAR-T细胞的体内功效，以允许体内生物发光成像(BLI)。Raji肿瘤细胞在用5×106个非转导(NT)的T细胞处理的小鼠中快速生长，由于后腿瘫痪需要在第21天处死(图4A)。用1×106或5×106个iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞处理的小鼠显示出早期肿瘤控制，这对应于CAR-T细胞剂量依赖性方式的急性体重减轻(图4A和图4C)。然而，当小鼠达到>10％的体重减轻(来自初始测量)时，通过施用5mg/kg普可那利(经腹膜内)成功解决了CAR相关毒性(图4C)。
在施用普可那利后，观察到存活的经修饰CAR-T细胞的治疗性抗肿瘤作用。图4B：将Raji-luc肿瘤细胞植入NSG小鼠(每组n＝5)，然后在第3天用非转导(NT)的或iC9-CD19.ζ-MC CAR修饰的T细胞处理。通过IVIS成像测量肿瘤生长并通过全身BLI计算。图4C：
测量小鼠重量以评估CAR-T相关的细胞因子毒性。在-20％体重减轻后，将小鼠用普可那利处理以消除CAR-T细胞(图4C)。
在普可那利处理之前和之后采集的血清样品显示出人细胞因子(包括IFN-γ和IL-6)的高普可那利处理前水平，其在普可那利暴露后24小时恢复到基线水平(图4D)。长期肿瘤控制不受iC9安全开关的激活的影响，其中所有经CAR-T处理的小鼠在70天外保持无肿瘤(通过BLI得出)(图4A和图4B)。如在基于iC9以降低CAR-T活性的先前研究(16)中所观察到的，由于残余T细胞表达降低水平的iC9-CD19.ζ-MC，与未免疫小鼠相比，动物对后续肿瘤攻击具有抗性(图4E和图4F)，并且残余CAR-T细胞可在经普可那利处理的动物的脾脏中检测到(图4G和图4H)。
与第一代(iC9-CD19.ζ)和第二代(iC9-CD19.28.ζ和iC9-CD19.BB.ζ)CAR构建体的比较显示，尽管在用iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞处理的动物中需要用普可那利部署iC9以控制毒性，但与该动物模型中这些另选的CD19CAR相比，抗肿瘤活性未受损(图15A至图15D)。
体内评估靶向CD123+骨髓细胞系(THP-1-EGFPluc)的组成型MCCAR-T平台，并将其与非转导的和用激活iC9的第一代CAR(iC9-CD123.ζ)修饰的T细胞进行比较(图5A)。THP-1-EGFPluc在用对照T细胞处理的小鼠中显示出快速生长，导致到第35天终止，而iC9-CD123.ζ-修饰的T细胞显示出适度的抗肿瘤活性，将肿瘤生长延迟了2周(图5A和图5B)。然而，向构建体添加MC提供了持久的抗肿瘤应答(>T细胞注射后100天)(图5A至图5C)。如对于表达iC9-CD19.ζ-MC的T细胞所观察到的，3/5(60％)的小鼠在T细胞处理后第14天经历恶病质形式的急性毒性，这可通过施用普可那利来解决而不影响肿瘤控制(图5D)。因此，在多种肿瘤模型中，组成型活性MC驱动的CAR-T细胞展示出稳健的抗肿瘤作用，但由于其高基础活性而在小鼠中引起恶病质，从而需要iC9介导的毒性减轻。
普可那利滴定允许组成型CAR-T活性的部分消融并调节***细胞因子水平。
iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞显示出与其抗肿瘤活性相关的高基础活化状态。虽然施用高剂量普可那利(5mg/kg)允许低水平CAR-T细胞的持久性，但普可那利的滴定可允许保留更多的经基因修饰的T细胞，同时减轻细胞因子相关的毒性。将T细胞与iC9-CD19.ζ-MC和EGFPluc共转导并施用于携带Raji的小鼠中。在恶病质发作(>10％体重减轻)后，以单次经腹膜内注射的方式施用普可那利的对数滴定(5-5x10-5mg/kg)(图6A)。如先前所观察到的(16)，CAR-T BLI以普可那利剂量依赖性方式降低(图6B)。CAR-T降低对应降低的血清细胞因子水平(即，IL-6、IFN-γ和TNF-α)(图6C)。利用这种高活性构建体，可选择性地调节普可那利滴定以使过量活性最小化，同时使治疗效力最大化。
体内CAR-T扩增需要MC基础活性
如图3D所示，低效的2A切割似乎导致了MC与某些CAR分子的结合。分析使用GSG连接的2A序列(GSG接头)(15、17)以更有效地将MC与CAR分离的另外的构建体，以及其中MC定位在CAR的第一位置5'端的构建体，以消除胞内附着到CD3ζ链的可能性(图7A)。此外，通过包括肉豆蔻酰化靶向结构域以增加内膜结合来测定因MC与膜并置而产生的基础信号传导(18)。测定来自转导的T细胞的基础细胞因子产量。细胞因子分析表明，改善的GSG连接的2A切割和将MC移至5'位置显著降低了基础IFN-γ和IL-6的产量，而部分CAR附着(在iC9-CD19.ζ-MC中)和膜结合的MC(Myr-MC)显示出高水平的细胞因子分泌(图7B)。有趣的是，当使用与EGFPluc共修饰的CAR T细胞测量体内T细胞水平时，高度非依赖性信号传导与在第12天的快速扩增(约4倍；p<0.005)和第19天的快速扩增(约8倍；p<0.001)相关联(图7C和图7E)。虽然高基础活性增强了CAR-T扩增，但其也与需要普可那利输注来激活iC9的恶病质相关联(图7F)。在这些动物中，CAR-T产生的人细胞因子的特征图显示，与具有低基础CAR-T活性的构建体相比，iC9-CD19.ζ-MC和MyrMC-iC9-CD19.ζ-修饰的T细胞产生高水平的多种促炎细胞因子(图7G)。此外，使用CD19+Raji肿瘤模型与诱导型MC***(即，iMC[Foster 2017；Mata 2017])的比较表明，高基础活性对于延长抗肿瘤功效是必不可少的(图26)。综上所述，这些数据表明，基础活化可增强体内CAR-T增殖和抗肿瘤活性，但快速增殖T细胞产生的细胞因子可引起不期望的副作用。
CAR修饰的T细胞的选择降低了细胞毒性
临床前研究表明，靶向多种抗原(例如，CD19、Her2和PSCA)的用SFG-iC9-CAR.ζ-MC转导的T细胞展示出更高水平的CAR-T增殖和杀伤肿瘤细胞系。此外，iC9-CAR.ζ-MC修饰的T细胞还产生更高水平的细胞因子，包括IFN-γ、IL-6和TNF-α。在动物模型中，iC9-CAR.ζ-MC修饰的T细胞显示出针对血液学和实体瘤细胞系的功效。然而，这些高活性CAR-T细胞也会在小鼠中引起毒性，其特征在于急性体重减轻。该毒性可通过注射普可那利(0.1至5mg/kg，经腹膜内(i.p.)注射)来消除，而不影响长期的肿瘤控制。在将细胞施用于荷瘤小鼠之前，通过富集经修饰的细胞群以获得更高百分比或比率的CD8+T细胞来降低恶病质的可能性。CD8+CAR-T细胞的富集减少了细胞因子相关的毒性，同时保留了抗肿瘤功效。
iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞的CD8选择通过减少细胞因子产生来消除毒性
为了进一步研究与施用iC9-CAR.ζ-MC修饰的T细胞相关联的恶病质，针对体内CD19+Daudi肿瘤测定CD19重定向构建体，并且施用靶向人IL-6、IFN-γ和TNF-α的中和抗体，所有这些均与小鼠细胞因子受体交叉反应，然后监测小鼠体重减轻。在此，荷瘤小鼠用5×106个iC9-CD19.ζ-MC转导的T细胞处理，并且在>10％体重减轻后，开始用单次经腹膜内注射剂量的普可那利(0.5mg/kg)或溶媒干预，或者每周两次注射100μg/小鼠抗hlFN-y、hlL-6或hTNF-α(图9A)。有趣的是，仅抗hTNF-α处理能够保护小鼠免于进一步健康下降至与激活iC9安全开关相同的保护水平(图9B)。
将5×106个iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞注射到携带Daudi的NSG小鼠中，然后在>10％体重减轻后用0.5mg/kg普可那利处理，或者用同种型抗体(对照)或用抗人TNF-α、IL-6和IFN-γ的中和抗体每周两次以100mg经腹膜内注射。监测体重恢复直到第28天。抗hTNF-α处理对进一步体重下降的保护与血清hTNF-α水平的仅适度、非显著的降低相关联，该降低与配体-受体相互作用的阻断一致，而不是介导抗体结合的hTNF-α的清除(图9C)。相比之下，用普可那利激活iC9显著降低了hTNF-α的血清浓度。与使用iC9一样，用抗hTNF-α控制毒性不影响CAR-T疗法的抗肿瘤活性(图9C)。因此，细胞因子阻断提供了解决该强效方法的毒性的第二有效机制。
由于T细胞亚群可具有不同的特性，我们推测亚群纯化可为控制毒性提供第三条途径。CD4+T细胞已知在抗原识别后被活化后产生高水平的促炎细胞因子。我们的研究还表明，CD4+T细胞分泌高水平的IFN-g(IFN-γ)、IL-13、IL-6、IL-8、IL-9和TNF-α(TNF-α)(图12)。测定不同细胞群中的基础细胞因子分泌水平。
CD4+T细胞比CD8+T细胞或未选择的CAR-T细胞分泌更高水平的IFN-g(IFN-γ)、IL-13、IL-6、IL-8、IL-9和TNF-a(TNF-α)(图12)。在共培养测定中，与CD8选择的iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞相比，CD19特异性(iC9-CD19.ζ-MC)CD4+T细胞产生高水平的IL-6、IL-13和TNF-a(图14)。CD8选择的iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞产生低水平的TNF-α，但保留了对CD19+肿瘤细胞的细胞毒性活性(图14)。
这些数据表明，选择CD8+iC9-CAR.ζ-MC修饰的T细胞可保留抗肿瘤功效，同时避免由CAR-T细胞产生的细胞因子引起的毒性。
由于TNF-α和可能的其他细胞因子在静脉内注射iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞后导致恶病质，因此测试CD8+T细胞的选择(或CD4+细胞的耗尽)以确定其是否可降低毒性，同时保留抗肿瘤活性。在此，使用磁珠选择将非转导的和CAR修饰的T细胞纯化为CD4+T细胞和CD8+T细胞(图10A)。
测试未选择的和选择的T细胞的纯度和转导效率。尽管未选择的CAR-T细胞具有1:2的CD4:CD8比率，选择后，CD4选择的和CD8选择的T细胞的CD4:CD8比率分别为99％和90％(图10B)。iC9-CD19.ζ-MC转导在选择的和未选择的经基因修饰的T细胞中均是等同的(-62％CD3+CD34+)(图10B)。进行针对Raji肿瘤细胞的共培养测定，在48小时测量IL-6和TNF-α的产量。与未选择的CAR-T细胞相比，CD4选择的CAR-T细胞产生的IL-6和TNF-α产量分别高71％和76％，而CD8选择的CAR-T细胞产生的这些分子分别低99％和91％(图11A)。为了测试该修饰是否可减少恶病质，将非转导的、未选择的、富集CD4或CD8的iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞施用于携带Raji-EGFPIuc的NSG小鼠。结果表明，未选择的和富集CD4的CAR-T细胞显示出优于NT的T细胞的改善的肿瘤控制(图11B)，然而，这些小鼠到注射CAR-T后第7天迅速发展出恶病质(图11C)。相比之下，CD8选择的CAR-T细胞展示出优异的肿瘤控制并伴随最小的体重减轻(图11B和图11C)。使用相同的动物模型，对富集CD8的iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞进行剂量滴定。在此，高剂量(>2.5×106个细胞)快速控制肿瘤生长(图11D)。虽然这些动物确实显示出恶病质的一些证据，但不需要用普可那利激活iC9，并且所有动物在CAR-T注射后大约2-3周恢复(图11D)。用较低剂量的富集CD8的CAR-T细胞治疗也显示出肿瘤控制，尽管其肿瘤消除动力学较慢(图11D)。重要的是，少至6.3×105个CD8细胞以持久功效控制高水平的肿瘤负荷(图11E)。这些实验表明，富集CD8的iC9-CD19.ζ-MC修饰的T细胞具有强效的抗肿瘤功效，降低了细胞因子相关的毒性，并且可能与辅助性T细胞无关。
讨论
该实施例描述了经验发现的CAR结构，其利用高基础CAR信号传导和共刺激(即，“始终开启”CAR)来驱动T细胞增殖以及抗侵袭性CD19+和CD123+淋巴瘤和白血病细胞系的抗肿瘤活性。然而，使用组成型活性MC的CAR-T细胞产生高水平的细胞因子(即，IFN-γ、TNF-α和IL-6)，这需要在动物模型中使用普可那利来解决毒性，其中可滴定普可那利以“部分地”消除CAR-T细胞，从而保留长期抗肿瘤功效。此外，认识到CAR-T分泌的细胞因子负责恶病质，我们专注于选择CD8+效应T细胞，这导致毒性水平较低，并且抗肿瘤作用以CD4+辅助细胞非依赖性方式增加。
最初，尝试用CD3ζ顺式表达MC，类似于使用常规共刺激结构域诸如CD28和4-1BB的CAR。然而，MyD88似乎使CAR不稳定，从而降低了表面表达并降低了体内抗肿瘤活性(图1)。发明人随后将MC表达为组成型蛋白质，以向CD19特异性CAR-T细胞提供连续的共刺激。这导致在经修饰的T细胞上CAR表面表达的恢复和肿瘤活性的提高(图3)。蛋白质印迹分析显示了指示融合蛋白形成的另外的MC物质，这可能是由CAR.ζ分子和MC分子之间的低效2A跳过引起的。我们假设将MC与CAR分子的一部分连接会诱导信号级联放大，该信号级联放大负责基础活性以及CAR效力。实际上，向2A添加GSG接头以增加转基因蛋白质分离减少了基础细胞因子分泌，但也消除了体内CAR-T增殖(图7)。MyD88/CD40与CD3ζ连接，可充当支架以募集其他信号传导蛋白(例如，白介素-1受体相关激酶(IRAK)家族)作为MyDDosome复合物来诱导基础信号传导(19-22)。另选地，通过MyD88/CD40扩增的来自scFv的非依赖性信号传导可导致组成型刺激(23)。
与先前关于组成型CAR信号传导的有害影响的报道不同，MC共刺激似乎不诱导CAR-T衰竭(23、24)。实际上，支持MC的CAR-T细胞可增殖超过3个月，而不丧失细胞毒性功能、IL-2产生，并且重要的是，对iC9介导的细胞凋亡的反应。Long及其同事表明，一些CAR共刺激结构域(诸如4-1BB)可防止由非依赖性信号传导引起的细胞衰竭(23)。然而，其他研究表明，在非依赖性CAR条件下4-1BB可能导致FAS依赖性细胞死亡(25)。相比之下，MC似乎磷酸化一系列广泛而独特的信号传导途径。除了通过NF-KB发信号(5、6)之外，MC还激活Akt，这已被证明能增强CAR-T细胞的存活和增殖(26)。另外的信令节点(例如，AP-1、MAPK和IRF)也可有助于增强功能。我们的观察结果(图8和(5))以及其他观察结果(6)表明，MC可能是比CD28或4-1BB更强效的CAR-T活性驱动因子。MyD88/CD40是否克服了表达组成型活性CAR的T细胞中常规共刺激分子的局限性，需要进一步研究。
高活性T细胞疗法存在细胞因子相关毒性的风险，在高肿瘤负荷的患者中这种风险会进一步增加(27)。在该研究中，CAR-T细胞中的组成型MC信号传导导致输注后的急性恶病质，这对于CAR靶标(即，CD19或CD123)不是特异性的，也不在通常对于异种移植物抗宿主病可见的时间范围内。然而，可通过在单次注射普可那利后激活iC9来减轻毒性。如先前所示，普可那利的滴定导致支持MC的CAR-T细胞的部分消除，而不会丧失抗肿瘤活性(16)。中和阻断抗体的使用显示，TNF-α降低了CAR-T相关毒性，表明产生高水平促炎细胞因子(即，CD4+T辅助细胞)的细胞亚群的耗尽可改善使用组成型、支持MC的CAR-T细胞疗法的治疗窗口。实际上，CD8+T细胞的纯化导致具有最小细胞因子相关毒性的功效改善，并且不需要使用普可那利来挽救动物。有趣的是，MC似乎支持CAR-T细胞以CD4+辅助细胞非依赖性方式扩增，这表明在临床应用中，CD8+T细胞的纯化可减少细胞因子释放综合征，并且不包括假定的调节性CAR-T细胞(28)。由于所使用的动物模型不包含人类来源的骨髓细胞，使用最近描述的细胞因子释放综合征的临床前模型对iC9-CD19.ζ-MC CAR T细胞进行的进一步研究将另外深入了解该策略在减轻患者潜在毒性方面的效用(29、30)。总体而言，我们确定了更有效的CAR-T平台。虽然预期与这种改善的效力相关联的毒性风险增加，但我们还确定了三种减轻该毒性的方法：T细胞亚群纯化、促炎细胞因子的中和以及iC9安全开关的使用。
概括地说，组成型MC共刺激提供了靶向CD19或CD123的CAR，其分别在淋巴瘤和髓细胞性白血病的动物模型中具有长期增殖潜力和高抗肿瘤功效。支持MC的CAR-T细胞表现出显著的基础活性并且与免疫缺陷小鼠中的细胞因子相关毒性相关联，但这可通过用普可那利部署iC9安全开关或通过选择具有较低细胞因子分泌倾向的T细胞亚群来管理。
以下出版物在本实施例中引用，或者可提供支持材料。
(1)June CH,Sadelain M.，N Engl J Med.，2018年，第379卷，第64-73页。(2)ParkJH等人，N Engl J Med.，2018年，第378卷，第449-459页。(3)Maude SL等人，N Engl JMed.，2018年，第378卷，第439-448页。(4)Neelapu SS等人，N Engl J Med.，2017年，第377卷，第2531-2534页。(5)Foster AE等人，Mol Ther.，2017年，第25卷，第2176-2188页。(6)Mata M等人，Cancer Discov.，2017年，第7卷，第1306-1319页。(7)Narayanan P等人，JClin Invest.，2011年，第121卷，第1524-1534页。(8)Straathof KC等人，Blood.，2005年，第105卷，第4247-4254页。(9)Zhou X等人，Blood.，2015年，第125卷，第4103-4113页。(10)Philip B等人，Blood.，2014年，第124卷，第1277-1287页。(11)Du X等人，J Immunother.，2007年，第30卷，第607-613页。(12)Mardiros A等人，Blood.，2013年，第122卷，第3138-3148页。(13)Milone MC等人，Mol Ther.，2009年，第17卷，第1453-1464页。(14)Kochenderfer JN等人，Blood.，2010年，第116卷，第4099-4102页。(15)Chng J等人，MAbs.，2015年，第7卷，第403-412页。(16)Diaconu I等人，Mol Ther.，2017年，第25卷，第580-592页。(17)Hofacre A等人，Hum Gene Ther.，2018年，第29卷，第437-451页。(18)Hanks BA等人，Nat Med.，2005年，第11卷，第130-137页。(19)Motshwene PG等人，J Biol Chem.，2009年，第284卷，第25404-25411页。(20)Lin S-C等人，Nature.，2010年，第465卷，第885-890页。(21)Wang L等人，Proc Natl Acad Sci USA.，2017年，第114卷，第13507-13512页。(22)De Nardo D等人，J Biol Chem，第293卷，第15195页等，2018年。(23)Long AH等人，NatMed.，2015年，第21卷，第581-590页。(24)Frigault MJ等人，Cancer Immunol Res.，2015年，第3卷，第356-367页。(25)Gomes-Silva D等人，Cell Rep.，2017年，第21卷，第17-26页。(26)Sun J等人，Mol Ther.，2010年，第18卷，第2006-2017页。(27)Neelapu SS等人，NatRev Clin Oncol.，2018年，第15卷，第47-62页。(28)Lee JC等人，Cancer Res.，2011年，第71卷，第2871-2881页。(29)Norelli等人，Nat Med.，2018年，第24卷，第739-748页。(30)Giavridis等人，Nat Med.，2018年，第24卷，第731-738页。
实施例2：经修饰Her2/Neu定向的CAR-T细胞
为了确定是否可将产生表达iC9-CAR.ζ-MC的T细胞的经修饰的细胞群的CD8选择应用于靶向实体瘤抗原的其他CAR，使用Her2特异性CAR构建体进行动物研究。
用SFG-iC9-Her2.ζ-MC载体转导T细胞，并且在5天后，使用CD34表位测量CAR表达。我们的结果显示，T细胞可用iC9-Her2.ζ-MC有效转导，CAR分子表达>70％(图15)。如在图15A中可见，NT不表达CAR分子，其中图15B示出用SFG-iC9-Her2.ζ-MC转导的T细胞为70.3％CAR阳性。
然后针对CD4+或CD8+T细胞亚群选择经CAR修饰的T细胞，以生成高度纯化的iC9-Her2.ζ-MC修饰的T细胞(图16)。测量iC9-Her2.ζ-MC转导的T细胞的CD4+和CD8+T细胞频率。随后，使用磁珠和MACS柱为CD4+或CD8+T细胞选择经基因修饰的T细胞。4天后，通过荧光激活细胞分选法测量CD4选择的T细胞(图16A)和CD8选择的T细胞(图16B)的各个群体的纯度，通过皮下注射将Her2+HPAC-EGFPluc肿瘤细胞植入NSG小鼠。7天后，通过静脉内注射5×106个NT、未选择的、CD4选择的或CD8选择的iC9-Her2.ζ-MC修饰的T细胞来处理小鼠。在T细胞注射后41天通过卡尺来测量肿瘤大小(图17)，或者在T细胞注射后41天通过注射底物D-荧光素进行体内生物发光成像(IVIS)来测量肿瘤大小(图18)。HPAC肿瘤细胞由所有经CAR-T修饰的细胞类型有效控制(图17和图18)。然而，如在CD19研究中所观察到的，CD4选择的iC9-Her2.ζ-MC修饰的T细胞显示出较高的恶病质率，从而导致2/5小鼠死亡(图19和图20)。
图20示出了小鼠在用选择的经修饰CAR-T细胞处理后的存活率。对存活率作图，其中所有用NT的T细胞处理的小鼠均因肿瘤生长而死亡，而在CD4选择的组中有2只小鼠因体重减轻/恶病质而死亡。
实施例3：经修饰PSCA定向的CAR-T细胞
为了确定是否可将产生表达iC9-CAR.ζ-MC的T细胞的经修饰的细胞群的CD8选择应用于靶向实体瘤抗原的其他CAR，使用***干细胞抗原(PSCA)特异性CAR构建体进行动物研究。
T细胞可用PSCA定向的CAR(iC9-PSCA.ζ-MC)有效转导并纯化用于CD4+或CD8+T细胞(图21)。使用HPAC-EGFPluc肿瘤模型(其也表达高水平的PSCA)，用NT处理的小鼠不能控制肿瘤，而未选择的和CD4选择的iC9-PSCA.ζ-MC修饰的T细胞快速诱导NSG荷瘤动物的恶病质和死亡(图21至图24)。然而，CD8选择的iC9-PSCA.ζ-MC修饰的T细胞可消除肿瘤，同时对体重减轻和小鼠健康具有最小影响。
累积地，使用CD19、Her2和PSCA载体获得的数据表明，CD4+T细胞亚群是在iC9-CAR.ζ-MC修饰的T细胞中观察到的高细胞因子产量的原因，并且细胞因子诸如TNF-α是在NSG肿瘤模型中观察到的毒性的原因。CD8+CAR-T细胞的纯化保留了抗CD19、Her2和PSCA阳性细胞系的抗肿瘤作用，同时将细胞因子相关毒性降至最低。
实施例4：核酸序列和氨基酸序列
表3：氨基酸序列
Figure BDA0002522459880000791
Figure BDA0002522459880000801
Figure BDA0002522459880000811
Figure BDA0002522459880000821
Figure BDA0002522459880000831
表4：核酸序列
Figure BDA0002522459880000832
Figure BDA0002522459880000841
Figure BDA0002522459880000851
Figure BDA0002522459880000861
Figure BDA0002522459880000871
Figure BDA0002522459880000881
Figure BDA0002522459880000891
Figure BDA0002522459880000901
实施例5：代表性实施方案
下文提供了本技术的某些实施方案的示例。
A1.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：
(i)跨膜区；
(ii)T细胞活化分子；以及
(iii)抗原识别部分
其中经修饰的细胞群中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为3:2或更大。
A2.实施方案A1的经修饰的细胞群，其中该嵌合抗原受体包含：
(i)跨膜区；
(ii)共刺激多肽细胞质信号传导区、缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区、缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和共刺激多肽细胞质信号传导区、或缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；
(iii)T细胞活化分子；以及
(iv)抗原识别部分。
A2.1.根据权利要求A1至A2中任一项所述的经修饰的细胞群，其中共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10。
A2.2.根据实施方案A1至A2.1中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合抗原受体包含两个共刺激多肽细胞质信号传导区，这两个共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10。
A3.一种经修饰的细胞群，包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中：
该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；(iv)T细胞活化分子；以及(v)抗原识别部分；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
A4.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；(iv)T细胞活化分子；以及(v)抗原识别部分；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
A5.根据实施方案A1至A4中任一项所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的T细胞包含编码诱导型嵌合促凋亡多肽的第二多核苷酸。
A6.根据实施方案A1至A5中任一项所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；(iv)T细胞活化分子；以及(v)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A7.根据实施方案A1至A5中任一项所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；(iv)T细胞活化分子；以及(v)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A8.一种经修饰的细胞群，包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中：
该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
A9.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分，并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
A10.根据实施方案A1至A9中任一项所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A11.根据实施方案A1至A10所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A12.一种经修饰的细胞群，包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中：
该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的两个共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
A13.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的两个共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
A14.根据实施方案A1至A13中任一项所述的经修饰的细胞群，其中：
该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的两个共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A15.根据实施方案A14所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的两个共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A16.一种经修饰的细胞群，包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中：
该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
A17.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
A18.根据实施方案A1至A17中任一项所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A19.根据实施方案A18所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A20.一种经修饰的细胞群，包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中：
该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
A21.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
A22.根据实施方案A1至A22中任一项所述的经修饰的细胞群，其中：
该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A23.根据实施方案A22所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A24.一种经修饰的细胞群，包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中：
该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少胞外结构域的CD40多肽；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
A25.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少胞外结构域的CD40多肽；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
A26.根据实施方案A1至A25中任一项所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少胞外结构域的CD40多肽；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A27.根据实施方案A26所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少胞外结构域的CD40多肽；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A28.一种经修饰的细胞群，包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中：
该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少胞外结构域的CD40多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
A29.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少胞外结构域的CD40多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
A30.根据实施方案A1至A29中任一项所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少胞外结构域的CD40多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A31.根据实施方案A30所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少胞外结构域的CD40多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；(iii)T细胞活化分子；以及(iv)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
A32.根据实施方案A1至A31中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合抗原受体为包含区域(i)-(v)的多肽，从多肽的氨基末端到羧基末端依次为(v)、(i)、(iv)、(ii)、(iii)。
A33.根据实施方案A1至A31中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合抗原受体为包含区域(i)-(v)的多肽，从多肽的氨基末端到羧基末端依次为(v)、(i)、(iv)、(iii)、(ii)。
A34.根据实施方案A1至A31中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合抗原受体为包含区域(i)-(v)的多肽，从多肽的氨基末端到羧基末端依次为(v)、(i)、(ii)、(iii)、(iv)。
A35.根据实施方案A1至A31中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合抗原受体为包含区域(i)-(v)的多肽，从多肽的氨基末端到羧基末端依次为(v)、(i)、(iii)、(ii)、(iv)。
A36.根据实施方案A32所述的经修饰的细胞群，其中编码嵌合抗原受体的多核苷酸编码区域(iv)和(ii)之间的接头多肽。
A37.根据实施方案A33所述的经修饰的细胞群，其中编码嵌合抗原受体的多核苷酸编码区域(iv)和(iii)之间的接头多肽。
A38.根据实施方案A34所述的经修饰的细胞群，其中编码嵌合抗原受体的多核苷酸编码区域(iii)和(iv)之间的接头多肽。
A39.根据实施方案A35所述的经修饰的细胞群，其中编码嵌合抗原受体的多核苷酸编码区域(ii)和(iv)之间的接头多肽。
A40.根据实施方案A36至A39中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头是不可切割的接头。
A41.根据实施方案A36至A39中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头是可切割的接头。
A42.根据实施方案A41所述的经修饰的细胞群，其中接头由对群体中经修饰的细胞内源的酶切割。
A43.根据实施方案A41所述的经修饰的细胞群，其中接头由对群体中经修饰的细胞外源的酶切割。
A44.根据实施方案A36至A39中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽包含肽键跳过序列。
A45.根据实施方案A36至A39中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽包含2A多肽。
A46.根据实施方案A1至A45中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与靶细胞上的抗原结合。
B1.根据实施方案A1所述的经修饰的细胞群，其中经修饰的T细胞包含编码嵌合信号传导多肽的第二多核苷酸，其中该嵌合信号传导多肽包含：
(i)共刺激多肽细胞质信号传导区；
(ii)缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区；
(iii)缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区，以及
共刺激多肽细胞质信号传导区；或者
(iv)缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区。
B2.根据实施方案B1所述的经修饰的细胞群，其中嵌合信号传导多肽包含膜靶向区。
B3.根据实施方案B1所述的经修饰的细胞群，其中嵌合信号传导多肽不包含膜靶向区。
B4.根据实施方案B1所述的经修饰的细胞群，其中经修饰的T细胞包含核酸，该核酸包含启动子，该启动子可操作地连接至
(i)编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸；以及
(ii)编码嵌合信号传导多肽的第二多核苷酸，其中该嵌合信号传导多肽包含：
a.共刺激多肽细胞质信号传导区；
b.缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区；
c.缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和共刺激多肽细胞质信号传导区；或者
d.缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区。
B5.根据实施方案B4所述的经修饰的细胞群，其中核酸以5'至3'的顺序包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。
B6.根据实施方案B4或B5中任一项所述的经修饰的细胞群，其中第一多核苷酸以5'至3'的顺序编码抗原识别部分、跨膜区和T细胞活化分子，并且第二多核苷酸是编码T细胞活化分子的多核苷酸序列的3'端。
B7.根据实施方案B4至B6中任一项所述的经修饰的细胞群，其中核酸包含第三多核苷酸，该第三多核苷酸编码第一多核苷酸与第二多核苷酸之间的接头多肽。
B8.根据实施方案B7所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽包含2A多肽。
B9.根据实施方案B7至B8中任一项所述的经修饰的细胞群，其中核酸包含编码诱导型嵌合促凋亡多肽的第四多核苷酸。
B10.根据实施方案B1至B9中任一项所述的经修饰的细胞群，其中80％或更多的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
B10.1.根据实施方案B1至B10中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合信号传导多肽包含两个共刺激多肽细胞质信号传导区，这两个共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10。
B11.一种经修饰的细胞群，包含核酸，其中：
该核酸包含：可操作地连接至编码细胞质嵌合刺激分子的第一多核苷酸的启动子，其中该细胞质嵌合刺激分子包含：(i)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；和(ii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+细胞。
B12.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含：
可操作地连接至编码细胞质嵌合刺激分子的第一多核苷酸的启动子，其中该细胞质嵌合刺激分子包含：(i)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；和(ii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
B13.根据实施方案B1至B12中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合抗原受体包含抗原识别部分、跨膜区和T细胞活化分子。
B14.根据实施方案B1至B13中任一项所述的经修饰的细胞群，其中核酸包含多核苷酸，该多核苷酸编码第一多核苷酸和第二多核苷酸之间的接头多肽。
B15.根据实施方案B1至B14中任一项所述的经修饰的细胞群，其中经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
B16.根据实施方案B1至B14中任一项所述的经修饰的细胞群，其中核酸包含编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
B17.根据实施方案B14至B16中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头是不可切割的接头。
B18.根据实施方案B14至B16中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头是可切割的接头。
B19.根据实施方案B18所述的经修饰的细胞群，其中接头由对群体中经修饰的细胞内源的酶切割。
B20.根据实施方案B18所述的经修饰的细胞群，其中接头由对群体中经修饰的细胞外源的酶切割。
B21.根据实施方案B14至B16中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽包含肽键跳过序列。
B22.根据实施方案B14至B16中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽包含2A多肽。
B23.根据实施方案B1至B22中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合信号传导多肽或细胞质嵌合刺激分子包含膜靶向区。
B24.根据实施方案B1至B22中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合信号传导多肽或细胞质嵌合刺激分子不包含膜靶向区。
B25.根据实施方案B1至B24中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与靶细胞上的抗原结合。
B26.一种经修饰的细胞群，包含核酸，其中：
该核酸包含可操作地连接至编码共刺激多肽细胞质信号传导区的第一多核苷酸的启动子，该共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
B26.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含：
可操作地连接至编码共刺激多肽细胞质信号传导区的第一多核苷酸的启动子，该共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
B2.1.一种经修饰的细胞群，包含核酸，其中：
该核酸包含可操作地连接至编码两个共刺激多肽细胞质信号传导区的第一多核苷酸的启动子，这两个共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
B27.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含可操作地连接至编码两个共刺激多肽细胞质信号传导区的第一多核苷酸的启动子，这两个共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
B28.一种经修饰的细胞群，包含核酸，其中：
该核酸包含可操作地连接至第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸编码缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；以及
编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
B29.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含可操作地连接至第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸编码缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
B30.一种经修饰的细胞群，包含核酸，其中：
该核酸包含可操作地连接至第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸编码缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
B31.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含可操作地连接至第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸编码缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
B32.一种经修饰的细胞群，包含核酸，其中：
该核酸包含可操作地连接至第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸编码缺少胞外结构域的CD40多肽；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
B33.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含可操作地连接至第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸编码缺少胞外结构域的CD40多肽；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
B34.一种经修饰的细胞群，包含核酸，其中：
该核酸包含可操作地连接至第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸编码缺少胞外结构域的CD40多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
至少80％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
B35.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
该经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含可操作地连接至第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸编码缺少胞外结构域的CD40多肽和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40的共刺激多肽细胞质信号传导区；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸；并且
CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大。
B36.根据实施方案B26至B35中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合抗原受体包含抗原识别部分、跨膜区和T细胞活化分子。
B37.根据实施方案B26至B36中任一项所述的经修饰的细胞群，其中核酸包含多核苷酸，该多核苷酸编码第一多核苷酸和第二多核苷酸之间的接头多肽。
B38.根据实施方案B26至B37中任一项所述的经修饰的细胞群，其中经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
B39.根据实施方案B26至B38中任一项所述的经修饰的细胞群，其中核酸包含编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
B40.根据实施方案B37至B39中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头是不可切割的接头。
B41.根据实施方案B37至B39中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头是可切割的接头。
B42.根据实施方案B41所述的经修饰的细胞群，其中接头由对群体中经修饰的细胞内源的酶切割。
B43.根据实施方案B41所述的经修饰的细胞群，其中接头由对群体中经修饰的细胞外源的酶切割。
B44.根据实施方案B37至B39中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽包含肽键跳过序列。
B45.根据实施方案B37至B39中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽包含2A多肽。
B46.根据实施方案B26至B45中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合信号传导多肽或细胞质嵌合刺激分子包含膜靶向区。
B47.根据实施方案B26至B45中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合信号传导多肽或细胞质嵌合刺激分子不包含膜靶向区。
B48.根据实施方案B26至B47中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与靶细胞上的抗原结合。
C1.根据实施方案A1至B48中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合抗原受体包含茎部多肽。
C2.根据实施方案A1至C1中任一项所述的经修饰的细胞群，其中T细胞活化分子是含ITAM的信号1赋予分子。
C3.根据实施方案A1至C1中任一项所述的经修饰的细胞群，其中T细胞活化分子是CD3ζ多肽。
C4.根据实施方案A1至C1中任一项所述的经修饰的细胞群，其中T细胞活化分子是Fcε受体γ(FcεRIy)亚基多肽。
C5.根据实施方案A1至C4中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽在翻译期间或翻译后分离第一多核苷酸和第二多核苷酸的翻译产物。
C5.1.根据实施方案C5所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽在第一多核苷酸和第二多核苷酸的翻译期间或之后被切割。
C5.2.根据实施方案A1至C5.1中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合抗原受体包含连接至MyD88或CD40多肽的膜靶向区。
C5.3.根据实施方案A1至C5.1中任一项所述的经修饰的细胞群，其中编码MyD88和CD40多肽的多核苷酸编码连接至MyD88或CD40多肽的膜靶向区。
C5.4.根据实施方案C5.2或C5.3中任一项所述的经修饰的细胞群，其中膜靶向区为肉豆蔻酰化区。
C5.5.根据实施方案A1至C5.4中任一项所述的经修饰的细胞群，其中嵌合抗原受体包含连接到共刺激分子细胞质信号传导区之一的膜靶向区。
C5.6.根据实施方案A1至C5.5中任一项所述的经修饰的细胞群，其中编码共刺激细胞质信号传导区的多核苷酸编码膜靶向区。
C6.根据实施方案A1至C5.6中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽在编码嵌合抗原受体的多核苷酸的翻译期间不被切割，并且经修饰的细胞表达连接至MyD88和CD40多肽的嵌合抗原受体。
C6.1.根据实施方案A1至C6中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽在编码嵌合抗原受体的多核苷酸的翻译期间不被切割。
C6.2.根据实施方案A1至C6中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽在编码嵌合抗原受体的多核苷酸的翻译期间或之后被切割。
C7.根据实施方案A1至C6中任一项所述的经修饰的细胞群，其中接头多肽是2A多肽。
C8.根据实施方案A1至C7中任一项所述的经修饰的细胞群，其中跨膜区是CD8跨膜区。
C9.根据实施方案A1至C8中任一项所述的经修饰的细胞群，其中MyD88多肽具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:83的氨基酸序列或其功能片段。
C10.根据实施方案A1至C8中任一项所述的经修饰的细胞群，其中截短的MyD88多肽具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其功能片段。
C11.根据实施方案A1至C10中任一项所述的经修饰的细胞群，其中截短的MyD88多肽包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:83或缺少TIR结构域的氨基酸序列，或其功能片段。
C11.1.根据实施方案A1至C10中任一项所述的经修饰的细胞群，其中截短的MyD88多肽不包含全长MyD88多肽的C末端的第156位连续氨基酸残基。
C11.2.根据实施方案A1至C10中任一项所述的经修饰的细胞群，其中截短的MyD88多肽不包含全长MyD88多肽的C末端的第152位连续氨基酸残基。
C11.3.根据实施方案A1至C10中任一项所述的经修饰的细胞群，其中截短的MyD88多肽不包含全长MyD88多肽的C末端的第173位连续氨基酸残基。
C11.4.根据实施方案A1至C8中任一项所述的经修饰的细胞群，其中全长MyD88多肽包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
C11.5.根据实施方案A1至C10中任一项所述的经修饰的细胞群，其中截短的MyD88多肽由SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:83的氨基酸序列或其功能片段组成。
C12.根据实施方案A1至C11.5中任一项所述的经修饰的细胞群，其中细胞质CD40多肽包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其功能片段。
C13.根据实施方案A1至C11.5中任一项所述的经修饰的细胞群，其中细胞质CD40多肽由SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其功能片段组成。
C14.根据实施方案A1至C13中任一项所述的经修饰的细胞群，其中CD3ζ多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或其功能片段。
C15.根据实施方案A1至C14中任一项所述的经修饰的细胞群，其中跨膜区多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或其功能片段。
C16.根据实施方案A1至C15中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与肿瘤细胞上的抗原结合。
C17.根据实施方案A1至C16中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与参与过度增殖性疾病的细胞上的抗原结合。
C18.根据实施方案A1至C17中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与选自PSMA、PSCA、MUC1、CD19、ROR1、间皮素、GD2、CD123、MUC16和Her2/Neu的抗原结合。
C19.根据实施方案A1至C18中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与Her2/Neu结合。
C20.根据实施方案A1至C18中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与CD19结合。
C21.根据实施方案A1至C18中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与病毒或细菌抗原结合。
C22.根据实施方案A1至C21中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分为单链可变片段。
C23.根据实施方案A4至C22中任一项所述的经修饰的细胞群，其中多聚配体结合区与二聚体FK506或二聚体FK506样类似物结合。
C23.1.根据实施方案A4至C22中任一项所述的经修饰的细胞群，其中多聚配体结合区与普可那利或AP20187结合。
C23.2.根据实施方案A4至C23.1中任一项所述的经修饰的细胞群，其中多聚配体结合区包含FKBP12变体多肽。
C23.3.根据实施方案C23.2所述的经修饰的细胞群，其中FKBP12变体多肽与多聚配体以比野生型FKBP12多肽更高的亲和力结合。
C23.4.根据实施方案C23.2或C23.3中任一项所述的经修饰的细胞群，其中FKBP12变体多肽在位置36处包含与多聚配体以比野生型FKBP12多肽更高的亲和力结合的氨基酸取代。
C23.5.根据实施方案C23.4所述的经修饰的细胞群，其中在位置36处的氨基酸取代选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和丙氨酸。
C23.6.根据实施方案C23.5所述的经修饰的细胞群，其中多聚配体结合区为FKB12v36区。
C24.根据实施方案A1至C23.6中任一项所述的经修饰的细胞群，其中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为9:1或更大。
C25.根据实施方案A1至C23.6中任一项所述的经修饰的细胞群，其中至少90％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
C26.根据实施方案A1至C23.6中任一项所述的经修饰的细胞群，其中至少95％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
C27.根据实施方案A4至C26中任一项所述的经修饰的细胞群，其中诱导型半胱天冬酶-9多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
C27.1.根据实施方案A4至C26中任一项所述的经修饰的细胞群，其中半胱天冬酶-9多肽是包含选自D330A、D330E和N405Q的氨基酸取代的经修饰的半胱天冬酶-9多肽。
C28.根据实施方案A1至C27.1中任一项所述的经修饰的细胞群，其中核酸或编码嵌合抗原受体的多核苷酸包含在病毒载体内。
C29.根据实施方案C28所述的经修饰的细胞群，其中病毒载体是逆转录病毒载体。
C30.根据实施方案C29所述的经修饰的细胞群，其中逆转录病毒载体是鼠白血病病毒载体。
C31.根据实施方案C29所述的经修饰的细胞群，其中逆转录病毒载体是SFG载体。
C32.根据实施方案C26所述的经修饰的细胞群，其中病毒载体是腺病毒载体。
C33.根据实施方案C26所述的经修饰的细胞群，其中病毒载体是慢病毒载体。
C34.根据实施方案C26所述的经修饰的细胞群，其中病毒载体选自腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和牛痘病毒。
C35.根据实施方案A1至C34中任一项所述的经修饰的细胞群，其中核酸或编码嵌合抗原受体的多核苷酸是在设计用于电穿孔、声穿孔或基因枪法的载体中制备的，或者附着到或掺入到化学脂质、聚合物、无机纳米粒子或复合物。
C36.根据实施方案A1至C34中任一项所述的经修饰的细胞群，其中核酸或编码嵌合抗原受体的多核苷酸包含在质粒内。
C37.保留。
C38.根据实施方案A1至C37中任一项所述的经修饰的细胞群，其中细胞由骨髓获得或制备。
C39.根据实施方案A1至C37中任一项所述的经修饰的细胞群，其中细胞由脐带血获得或制备。
C40.根据实施方案A1至C37中任一项所述的经修饰的细胞群，其中细胞由外周血获得或制备。
C41.根据实施方案A1至C37中任一项所述的经修饰的细胞群，其中细胞由外周血单核细胞获得或制备。
C42.根据实施方案A1至C41中任一项所述的经修饰的细胞群，其中经修饰的细胞是人细胞。
C43.根据实施方案A1至C41中任一项所述的方法，其中经修饰的细胞是自体T细胞。
C44.根据实施方案A1至C41中任一项所述的方法，其中经修饰的细胞是同种异体T细胞。
C45.根据实施方案A1至C44中任一项所述的经修饰的细胞群，其中使用选自电穿孔、声穿孔、基因枪法(例如，具有Au粒子的基因枪)、脂质转染、聚合物转染、纳米粒子或复合物的方法，通过核酸载体转染或转导细胞。
C46-C48.
D1.一种用于刺激针对受试者的靶细胞或组织的细胞介导免疫应答的方法，包括向受试者施用根据实施方案A1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群。
D1.1.一种用于治疗患有与靶抗原的表达升高相关联的疾病或病症的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的根据实施方案A1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群。
D1.2.一种用于减小受试者的肿瘤的大小的方法，包括向受试者施用根据实施方案A1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与肿瘤上的抗原结合。
D2.根据实施方案D1至D1.2中任一项所述的方法，其中靶细胞是肿瘤细胞。
D3.根据实施方案D1至D2中任一项所述的方法，其中在施用经修饰的细胞群后减少受试者中靶细胞的数量或浓度。
D4.根据实施方案D1至D3中任一项所述的方法，包括测量在施用经修饰的细胞群之前从受试者获得的第一样品中靶细胞的数量或浓度，测量在施用经修饰的细胞群之后从受试者获得的第二样品中靶细胞的数量或浓度，并确定与第一样品中靶细胞的数量或浓度相比第二样品中靶细胞的数量或浓度的增加或减少。
D4.根据实施方案D4所述的方法，其中与第一样品中靶细胞的浓度相比第二样品中靶细胞的浓度减少。
D5.根据实施方案D4所述的方法，其中与第一样品中靶细胞的浓度相比第二样品中靶细胞的浓度增加。
D6.根据实施方案D1至D5中任一项所述的方法，其中将另外剂量的经修饰的细胞施用于受试者。
D7.一种用于向受试者提供抗肿瘤免疫的方法，包括向该受试者施用有效量的根据实施方案A1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群。
D8.一种用于治疗患有与靶抗原的表达升高相关联的疾病或病症的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的根据实施方案A1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群。
D9.根据实施方案D8所述的方法，其中靶抗原是肿瘤抗原。
D10.一种用于减小受试者的肿瘤的大小的方法，包括向受试者施用根据实施方案A1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群，其中抗原识别部分与肿瘤上的抗原结合。
D11.根据实施方案D1至D10中任一项所述的方法，其中受试者已被诊断为患有肿瘤。
D12.根据实施方案D1至D11中任一项所述的方法，其中受试者患有癌症。
D13.根据实施方案D1至D12中任一项所述的方法，其中受试者患有实体瘤。
D14.根据实施方案D1至D13中任一项所述的方法，其中静脉内施用经修饰的细胞群。
D15.根据实施方案D1至D14中任一项所述的方法，其中将经修饰的细胞群递送至肿瘤床。
D16.根据实施方案D12所述的方法，其中癌症存在于受试者的血液或骨髓中。
D17.根据实施方案D1至D16中任一项所述的方法，其中受试者患有血液或骨髓疾病。
D18.根据实施方案D1至D17中任一项所述的方法，其中受试者已被诊断患有可通过干细胞移植缓解的任何病症。
D19.根据实施方案D1至D18中任一项所述的方法，其中受试者已被诊断为患有镰状细胞性贫血或异染性脑白质营养不良。
D20.根据实施方案D1至D18中任一项所述的方法，其中患者已被诊断患有选自以下的病症：原发性免疫缺陷病症、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)或其他噬血细胞性病症、遗传性骨髓衰竭病症、血红蛋白病、代谢病症和破骨细胞病症。
D21.根据实施方案D1至D18中任一项所述的方法，其中疾病或病症选自严重联合免疫缺陷(SCID)、联合免疫缺陷(CID)、先天性T细胞缺陷/缺乏症、常见可变免疫缺乏症(CVID)、慢性肉芽肿性疾病、IPEX(X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调综合征)或IPEX样、维斯科特-奥尔德里奇综合征、CD40配体缺陷、白细胞粘附缺陷、DOCA 8缺陷、IL-10缺陷/IL-10受体缺陷、GATA 2缺陷、X-连锁淋巴组织增生病(XLP)、软骨毛发发育不全、ShwachmanDiamond综合征、先天性纯红细胞再生障碍性贫血、先天性角化不良、范可尼贫血、先天性中性粒细胞减少症、镰形细胞病、地中海贫血、粘多糖贮积症、神经鞘脂贮积病和骨硬化病。
D22.根据实施方案D1至D21中任一项所述的方法，包括向受试者施用另外剂量的经修饰的细胞，其中疾病或病症症状在症状减轻后仍然存在或被检测到。
D23.根据实施方案D1至D22中任一项所述的方法，包括
确定受试者中病症或疾病的存在、不存在或阶段；以及
传输施用根据实施方案A1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群的指示，维持经修饰的细胞群的后续剂量，或基于受试者中确定的病症或疾病的存在、不存在或阶段来调节施用给患者的经修饰的细胞群的后续剂量。
D24.根据实施方案D1至D23中任一项所述的方法，其中病症是白血病。
D25.根据实施方案D1至D23中任一项所述的方法，其中受试者已被诊断患有选自HIV、流行性感冒、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘、细胞巨化病毒(CMV)、腺病毒(ADV)、HHV-6(人疱疹病毒6，I)和***瘤病毒的病毒病因学的感染，或者已被诊断患有选自肺炎、肺结核和梅毒的细菌病因学的感染，或者已被诊断患有选自疟疾、锥虫病、利什曼病、毛滴虫病和阿米巴病的寄生虫病因学的感染。
D26.根据实施方案D1至D25中任一项所述的方法，其中已向受试者施用根据实施方案A1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群，其中该经修饰的细胞群包含编码诱导型嵌合促凋亡多肽的多核苷酸，该多肽包含多聚配体结合区，该方法包括在将经修饰的细胞群施用于受试者后，将与多聚配体结合区结合的多聚配体施用于受试者。
D27.根据实施方案D26所述的方法，其中在施用多聚配体后，包含诱导型嵌合促凋亡多肽的经修饰的细胞的数量减少。
D28.根据实施方案D26或D27中任一项所述的方法，其中包含诱导型嵌合促凋亡多肽的经修饰的细胞的数量减少90％。
D28.1.根据实施方案D26或D27中任一项所述的方法，其中包含诱导型嵌合促凋亡多肽的经修饰的细胞的数量减少70％。
D28.2.根据实施方案D26或D27中任一项所述的方法，其中包含诱导型嵌合促凋亡多肽的经修饰的细胞的数量减少50％。
D28.3.根据实施方案D26或D27中任一项所述的方法，其中包含诱导型嵌合促凋亡多肽的经修饰的细胞的数量减少30％。
D28.4.根据实施方案D26或D27中任一项所述的方法，其中包含诱导型嵌合促凋亡多肽的经修饰的细胞的数量减少20％。
D28.5.根据实施方案D26至D28.4中任一项所述的方法，其中诱导型嵌合促凋亡多肽是诱导型嵌合半胱天冬酶-9多肽。
D29.根据实施方案D26至D28.4中任一项所述的方法，包括在向受试者施用经修饰的细胞群后确定受试者正在经历阴性症状，以及施用配体以减少或减轻该阴性症状。
D30.根据实施方案D26至D29中任一项所述的方法，包括以下步骤：检测受试者的细胞因子毒性；
施用足够剂量的与多聚配体结合区结合的多聚配体，以降低受试者的细胞因子毒性水平。
D31.根据实施方案D30所述的方法，其中通过观察受试者的身体症状来检测细胞因子毒性。
D32.根据实施方案D31所述的方法，其中通过测量受试者的体重减轻来检测细胞因子毒性。
D33.根据实施方案D26至D33中任一项所述的方法，其中受试者在施用经修饰的细胞群后被诊断患有恶病质。
D34.根据实施方案D26至D33中任一项所述的方法，其中在施用经修饰的细胞群之后且在施用多聚配体之前，从受试者获得的样品中与细胞因子相关毒性相关联的至少一种细胞因子的水平升高。
D35.根据实施方案D34所述的方法，其中与在施用多聚配体之前从受试者获得的样品中所述至少一种细胞因子的水平相比，在施用多聚配体之后从受试者获得的样品中所述至少一种细胞因子的水平降低。
D36.根据实施方案D26至D35中任一项所述的方法，其中多聚配体是普可那利或AP20187。
D37.根据实施方案D1至D36中任一项所述的方法，包括以下步骤：在向受试者施用经修饰的细胞群之前，富集经修饰的细胞群以获得富集CD8+T细胞的细胞群。
D38.根据实施方案D37所述的方法，包括在将经修饰的细胞群施用于受试者之前，富集经修饰的细胞群以获得包含至少80％CD8+T细胞的细胞群。
D39.根据实施方案D1至D36中任一项所述的方法，包括以下步骤：在向受试者施用经修饰的细胞群之前，纯化CD8+T细胞。
D40.根据实施方案D37至D39中任一项所述的方法，其中使用磁激活细胞分选来富集CD8+T细胞。
D41.根据实施方案D39所述的方法，其中使用磁激活细胞分选来纯化CD8+T细胞。
E1.一种用于制备根据实施方案A1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群的方法，该方法包括在将包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸的核酸掺入到细胞中的条件下使具有该核酸的细胞群与细胞群接触，由此该细胞表达来自掺入的核酸的嵌合抗原受体。
E2.一种用于制备根据实施方案B1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群的方法，该方法包括在将包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸的核酸掺入到细胞中的条件下使具有该核酸的细胞群与细胞群接触，由此该细胞表达来自掺入的核酸的嵌合抗原受体。
E3.一种用于制备实施方案A1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群的方法，包括在将包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸的核酸掺入到T细胞中的条件下使具有该核酸的细胞与细胞群接触，并且富集该T细胞以获得经修饰的细胞群，其中该细胞群中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为3:2或更大。
E3.根据实施方案E1至E2中任一项所述的方法，其中该细胞群的该细胞用该核酸转染或转导。
E4.根据实施方案E1至E3中任一项所述的方法，其中该核酸包含在病毒载体中。
E5.根据实施方案E1至E3中任一项所述的方法，其中该核酸包含在质粒载体中。
E6.一种用于制备根据实施方案A1至C48中任一项所述的经修饰的细胞群的方法，包括富集经修饰的T细胞群以获得3:2或更大的CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率，其中该经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：
(i)跨膜区；
(ii)T细胞活化分子；以及
(iii)抗原识别部分。
E7.根据实施方案E6所述的方法，其中该嵌合抗原受体包含：
(i)跨膜区；
(ii)共刺激多肽细胞质信号传导区、缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区、缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和共刺激多肽细胞质信号传导区、或缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；
(iii)T细胞活化分子；以及
(iv)抗原识别部分。
E8.根据实施方案E6或E7中任一项所述的方法，其中该经修饰的T细胞包含编码诱导型嵌合促凋亡多肽的第二多核苷酸。
E9.根据实施方案E6所述的方法，其中该经修饰的T细胞包含编码嵌合信号传导多肽的第二多核苷酸，其中该嵌合信号传导多肽包含：
(i)共刺激多肽细胞质信号传导区；
(ii)缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区；
(iii)缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区，以及
共刺激多肽细胞质信号传导区；或者
(iv)缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区。
E10.根据实施方案E9所述的方法，其中嵌合信号传导多肽包含膜靶向区。
E11.根据实施方案E9所述的方法，其中嵌合信号传导多肽不包含膜靶向区。
E12.根据实施方案E6所述的方法，其中经修饰的T细胞包含核酸，该核酸包含启动子，该启动子可操作地连接至
(i)编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸；以及
(ii)编码嵌合信号传导多肽的第二多核苷酸，其中该嵌合信号传导多肽包含：
a.共刺激多肽细胞质信号传导区；
b.缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区；
c.缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和共刺激多肽细胞质信号传导区；或者
d.缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区。
E13.根据实施方案E12所述的方法，其中核酸以5'至3'的顺序包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。
E14.根据实施方案E12或E13中任一项所述的方法，其中第一多核苷酸以5'至3'的顺序编码抗原识别部分、跨膜区和T细胞活化分子，并且第二多核苷酸是编码T细胞活化分子的多核苷酸序列的3'端。
E15.根据实施方案E12至E14中任一项所述的方法，其中核酸包含第三多核苷酸，该第三多核苷酸编码第一多核苷酸与第二多核苷酸之间的接头多肽。
E16.根据实施方案E15所述的方法，其中接头多肽包含2A多肽。
E17.根据实施方案E15或E16中任一项所述的方法，其中核酸包含编码诱导型嵌合促凋亡多肽的第四多核苷酸。
E18.根据权利要求E7至E17中任一项所述的方法，其中共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10。
E19.根据实施方案E7至E8中任一项所述的方法，其中嵌合抗原受体包含两个共刺激多肽细胞质信号传导区，这两个共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10。
E20.根据实施方案E9至E17中任一项所述的方法，其中嵌合信号传导多肽包含两个共刺激多肽细胞质信号传导区，这两个共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10。
E21.根据实施方案E1至E20中任一项所述的方法，其中使经修饰的细胞群经受磁激活细胞分选(MACS)。
E22.根据实施方案E1至E21中任一项所述的方法，其中经修饰的细胞群被选择为包含CD4+T细胞级分和CD8+T细胞级分。
E23.根据实施方案E1至E22中任一项所述的方法，其中测试经修饰的细胞群以确定CD8+T细胞的百分比。
E24.根据实施方案E23所述的方法，包括向受试者施用经修饰的细胞群的步骤。
F1.一种用于制备富集CD8+T细胞的经修饰的细胞群的方法，包括富集经修饰的细胞群以获得包含至少80％CD8+T细胞的经修饰的细胞群，其中经修饰的细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中：
该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；(iv)T细胞活化分子；以及(v)抗原识别部分。
F1.1.一种用于制备根据实施方案A1至C48中任一项所述的富集CD8+T细胞的经修饰的细胞群的方法，包括富集经修饰的细胞群以获得包含至少80％CD8+T细胞的经修饰的细胞群。
F2.一种用于制备富集CD8+T细胞的经修饰的细胞群的方法，包括富集经修饰的细胞群以获得其中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大的经修饰的细胞群，其中经修饰的细胞群包含经修饰的T细胞，该经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；(iv)T细胞活化分子；以及(v)抗原识别部分。
F3.根据实施方案F1至F2中任一项所述的方法，其中经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含：
编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；(iv)T细胞活化分子；以及(v)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
F4.根据实施方案F3所述的方法，其中经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含核酸，其中：
该核酸包含编码嵌合抗原受体的第一多核苷酸，其中该嵌合抗原受体包含：(i)跨膜区；(ii)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；(iii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；(iv)T细胞活化分子；以及(v)抗原识别部分；以及
编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的第二多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
F5.根据实施方案F1至F4中任一项所述的方法，其中嵌合抗原受体为包含区域(i)-(v)的多肽，从多肽的氨基末端到羧基末端依次为(v)、(i)、(iv)、(ii)、(iii)。
F6.根据实施方案F1至F4中任一项所述的方法，其中嵌合抗原受体为包含区域(i)-(v)的多肽，从多肽的氨基末端到羧基末端依次为(v)、(i)、(iv)、(iii)、(ii)。
F7.根据实施方案F1至F4中任一项所述的方法，其中嵌合抗原受体为包含区域(i)-(v)的多肽，从多肽的氨基末端到羧基末端依次为(v)、(i)、(ii)、(iii)、(iv)。
F8.根据实施方案F1至F4中任一项所述的方法，其中嵌合抗原受体为包含区域(i)-(v)的多肽，从多肽的氨基末端到羧基末端依次为(v)、(i)、(iii)、(ii)、(iv)。
F9.根据实施方案F5所述的方法，其中编码嵌合抗原受体的多核苷酸编码区域(iv)和(ii)之间的接头多肽。
F10.根据实施方案F6所述的方法，其中编码嵌合抗原受体的多核苷酸编码区域(iv)和(iii)之间的接头多肽。
F11.根据实施方案F7所述的方法，其中编码嵌合抗原受体的多核苷酸编码区域(iii)和(iv)之间的接头多肽。
F12.根据实施方案F8所述的方法，其中编码嵌合抗原受体的多核苷酸编码区域(ii)和(iv)之间的接头多肽。
F13.根据实施方案F9至F12中任一项所述的方法，其中接头是不可切割的接头。
F14.根据实施方案F9至F12中任一项所述的方法，其中接头是可切割的接头。
F15.根据实施方案F14所述的方法，其中接头由对群体中经修饰的细胞内源的酶切割。
F16.根据实施方案F14所述的方法，其中接头由对群体中经修饰的细胞外源的酶切割。
F17.根据实施方案F1至F16中任一项所述的方法，其中抗原识别部分与靶细胞上的抗原结合。
G1.一种用于制备富集CD8+T细胞的经修饰的细胞群的方法，包括富集经修饰的细胞群以获得包含至少80％CD8+T细胞的经修饰的细胞群，其中经修饰的细胞包含核酸，其中：
该核酸包含：可操作地连接至编码细胞质嵌合刺激分子的第一多核苷酸的启动子，其中该细胞质嵌合刺激分子包含：(i)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；和(ii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸。
G1.1.一种用于制备根据实施方案A1至C48中任一项所述的富集CD8+T细胞的经修饰的细胞群的方法。
G2.一种用于制备富集CD8+T细胞的经修饰的细胞群的方法，包括富集经修饰的细胞群以获得其中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为4:1或更大的经修饰的细胞群，其中经修饰的细胞群包含经修饰的T细胞，该经修饰的T细胞包含核酸，其中该核酸包含：
可操作地连接至编码细胞质嵌合刺激分子的第一多核苷酸的启动子，其中该细胞质嵌合刺激分子包含：(i)缺少TIR结构域的MyD88多肽或截短的MyD88多肽；和(ii)缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；以及编码嵌合抗原受体的第二多核苷酸。
G3.根据实施方案G1至G2中任一项所述的方法，其中嵌合抗原受体包含抗原识别部分、跨膜区和T细胞活化分子。
G4.根据实施方案G1至G3中任一项所述的方法，其中核酸包含多核苷酸，该多核苷酸编码第一多核苷酸和第二多核苷酸之间的接头多肽。
G5.根据实施方案G1至G4中任一项所述的方法，其中经修饰的细胞或经修饰的T细胞包含编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
G6.根据实施方案G1至G4中任一项所述的方法，其中核酸包含编码嵌合半胱天冬酶-9多肽的多核苷酸，该嵌合半胱天冬酶-9多肽包含多聚配体结合区和半胱天冬酶-9多肽。
G7.根据实施方案G4至G6中任一项所述的方法，其中接头是不可切割的接头。
G8.根据实施方案G4至G6中任一项所述的方法，其中接头是可切割的接头。
G9.根据实施方案G8所述的方法，其中接头由对群体中经修饰的细胞内源的酶切割。
G10.根据实施方案G8所述的方法，其中接头由对群体中经修饰的细胞外源的酶切割。
G11.根据实施方案G1至G10中任一项所述的方法，其中抗原识别部分与靶细胞上的抗原结合。
G12.根据实施方案E1至G11中任一项所述的方法，包括纯化CD8+T细胞的步骤。
G13.根据实施方案E1至G11中任一项所述的方法，其中使用磁激活细胞分选来富集CD8+T细胞。
G14.根据实施方案G12所述的方法，其中使用磁激活细胞分选来纯化CD8+T细胞。
H1.根据实施方案E1至F17或G1至G14中任一项所述的方法，其中嵌合抗原受体包含茎部多肽。
H2.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1中任一项所述的方法，其中T细胞活化分子是含ITAM的信号1赋予分子。
H3.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1中任一项所述的方法，其中T细胞活化分子是CD3ζ多肽。
H4.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1中任一项所述的方法，其中T细胞活化分子是Fcε受体γ(FcεRIy)亚基多肽。
H5.根据实施方案G4至G14中任一项所述的方法，其中接头多肽在翻译期间或翻译后分离第一多核苷酸和第二多核苷酸的翻译产物。
H5.1.根据实施方案H5所述的方法，其中接头多肽在第一多核苷酸和第二多核苷酸的翻译期间或之后被切割。
H6.根据实施方案F9至F17或G4至G14中任一项所述的方法，其中接头多肽在编码嵌合抗原受体的多核苷酸的翻译期间不被切割，并且经修饰的细胞表达连接至MyD88和CD40多肽的嵌合抗原受体。
H6.1.根据实施方案F9至F17或G4至G14中任一项所述的方法，其中接头多肽在编码嵌合抗原受体的多核苷酸的翻译期间或之后被切割。
H7.根据实施方案F9至F17、G4至G14或H1至H6中任一项所述的方法，其中接头多肽是2A多肽。
H8.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H7中任一项所述的方法，其中跨膜区是CD8跨膜区。
H9.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H8中任一项所述的方法，其中MyD88多肽具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:83的氨基酸序列或其功能片段。
H10.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H8中任一项所述的方法，其中截短的MyD88多肽具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其功能片段。
H11.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H10中任一项所述的方法，其中截短的MyD88多肽包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:83的缺少TIR结构域的氨基酸序列，或其功能片段。
H11.1.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H10中任一项所述的方法，其中截短的MyD88多肽不包含全长MyD88多肽的C末端的第156位连续氨基酸残基。
H11.2.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H10中任一项所述的方法，其中截短的MyD88多肽不包含全长MyD88多肽的C末端的第152位连续氨基酸残基。
H11.3.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H10中任一项所述的方法，其中截短的MyD88多肽不包含全长MyD88多肽的C末端的第173位连续氨基酸残基。
H11.4.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H8中任一项所述的方法，其中全长MyD88多肽包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
H11.5.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H10中任一项所述的方法，其中截短的MyD88多肽由SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其功能片段组成。
H12.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H11中任一项所述的方法，其中细胞质CD40多肽包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其功能片段。
H13.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H11中任一项所述的方法，其中细胞质CD40多肽由SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其功能片段组成。
H14.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H13中任一项所述的方法，其中CD3ζ多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或其功能片段。
H15.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H14中任一项所述的方法，其中跨膜区多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或其功能片段。
H16.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H15中任一项所述的方法，其中靶细胞是肿瘤细胞。
H17.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H16中任一项所述的方法，其中靶细胞是参与过度增殖性疾病的细胞。
H18.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H17中任一项所述的方法，其中抗原识别部分与选自PSMA、PSCA、MUC1、CD19、ROR1、间皮素、GD2、CD123、MUC16和Her2/Neu的抗原结合。
H19.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H18中任一项所述的方法，其中抗原识别部分与Her2/Neu结合。
H20.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H18中任一项所述的方法，其中抗原识别部分与CD19结合。
H21.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H18中任一项所述的方法，其中抗原识别部分与病毒或细菌抗原结合。
H22.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H21中任一项所述的方法，其中抗原识别部分为单链可变片段。
H23.根据实施方案F4至F17、G5至G14或H1至H22中任一项所述的方法，其中多聚配体结合区与二聚体FK506或二聚体FK506样类似物结合。
H23.1.根据实施方案F4至F17、G5至G14或H1至H22中任一项所述的方法，其中多聚配体结合区与普可那利或AP20187结合。
H23.2.根据实施方案F4至F17、G5至G14或H1至H23.1中任一项所述的方法，其中多聚配体结合区包含FKBP12变体多肽。
H23.3.根据实施方案H23.2所述的方法，其中FKBP12变体多肽与多聚配体以比野生型FKBP12多肽更高的亲和力结合。
H23.4.根据实施方案H23.2或H23.3中任一项所述的方法，其中FKBP12变体多肽在位置36处包含与多聚配体以比野生型FKBP12多肽更高的亲和力结合的氨基酸取代。
H23.5.根据实施方案H23.4所述的方法，其中在位置36处的氨基酸取代选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和丙氨酸。
H23.6.根据实施方案H23.5所述的方法，其中多聚配体结合区为FKB12v36区。
H24.根据实施方案F1至H23.6中任一项所述的方法，其中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为9:1或更大。
H25.根据实施方案F1至H23.6中任一项所述的方法，其中至少90％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
H26.根据实施方案F1至H23.6中任一项所述的方法，其中至少95％的经修饰的细胞为CD8+T细胞。
H27.根据实施方案F4至F17、G5至G14或H1至H26中任一项所述的方法，其中诱导型半胱天冬酶-9多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
H27.1.根据实施方案F4至F17、G5至G14或H1至H26中任一项所述的方法，其中半胱天冬酶-9多肽是包含选自半胱天冬酶变体D330A、D330E和N405Q的氨基酸取代的经修饰的半胱天冬酶-9多肽。
H28.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H27.1中任一项所述的方法，其中核酸或编码嵌合抗原受体的多核苷酸包含在病毒载体内。
H29.根据实施方案H28所述的方法，其中病毒载体是逆转录病毒载体。
H30.根据实施方案H29所述的方法，其中逆转录病毒载体是鼠白血病病毒载体。
H31.根据实施方案H29所述的方法，其中逆转录病毒载体是SFG载体。
H32.根据实施方案H26所述的方法，其中病毒载体是腺病毒载体。
H33.根据实施方案H26所述的方法，其中病毒载体是慢病毒载体。
H34.根据实施方案H26所述的方法，其中病毒载体选自腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和牛痘病毒。
H35.根据实施方案E1至F17、G1至G14或H1至H34中任一项所述的方法，其中核酸或编码嵌合抗原受体的多核苷酸是在设计用于电穿孔、声穿孔或基因枪法的载体中制备的，或者附着到或掺入到化学脂质、聚合物、无机纳米粒子或复合物。
H36.根据实施方案E1至F25中任一项所述的方法，其中核酸或编码嵌合抗原受体的多核苷酸包含在质粒内。
H37.保留。
H38.根据实施方案E1至H37中任一项所述的经修饰的细胞，其中细胞由骨髓获得或制备。
H39.根据实施方案E1至H37中任一项所述的经修饰的细胞，其中细胞由脐带血获得或制备。
H40.根据实施方案E1至H37中任一项所述的经修饰的细胞，其中细胞由外周血获得或制备。
H41.根据实施方案E1至H37中任一项所述的经修饰的细胞，其中细胞由外周血单核细胞获得或制备。
H42.根据实施方案E1至H41中任一项所述的经修饰的细胞，其中经修饰的细胞是人细胞。
H43.根据实施方案E1至H41中任一项所述的方法，其中经修饰的细胞是自体T细胞。
H44.根据实施方案E1至H41中任一项所述的方法，其中经修饰的细胞是同种异体T细胞。
H45.根据实施方案E1至H44中任一项所述的方法，其中使用选自电穿孔、声穿孔、基因枪法(例如，具有Au粒子的基因枪)、脂质转染、聚合物转染、纳米粒子或复合物的方法，通过核酸载体转染或转导细胞。
H46-H48.保留。
l1.根据实施方案J1至H48中任一项所述的方法，包括以下步骤：向受试者施用富集CD8+T细胞的经修饰的细胞群。
I2.根据实施方案l1所述的方法，其中抗原识别部分与肿瘤上的抗原结合。
l3-l10.保留。
l11.根据实施方案l1至l10中任一项所述的方法，其中受试者已被诊断为患有肿瘤。
l12.根据实施方案l1至l11中任一项所述的方法，其中受试者患有癌症。
l13.根据实施方案l1至l12中任一项所述的方法，其中受试者患有实体瘤。
l14.根据实施方案l1至l13中任一项所述的方法，其中静脉内施用经修饰的细胞群。
l15.根据实施方案l1至l14中任一项所述的方法，其中将经修饰的细胞群递送至肿瘤床。
l16.根据实施方案l12所述的方法，其中癌症存在于受试者的血液或骨髓中。
l17.根据实施方案l1至l16中任一项所述的方法，其中受试者患有血液或骨髓疾病。
l18.根据实施方案l1至l17中任一项所述的方法，其中受试者已被诊断患有可通过干细胞移植缓解的任何病症。
l19.根据实施方案l1至l18中任一项所述的方法，其中受试者已被诊断为患有镰状细胞性贫血或异染性脑白质营养不良。
I20.根据实施方案l1至l18中任一项所述的方法，其中患者已被诊断患有选自以下的病症：原发性免疫缺陷病症、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)或其他噬血细胞性病症、遗传性骨髓衰竭病症、血红蛋白病、代谢病症和破骨细胞病症。
l21.根据实施方案l1至l18中任一项所述的方法，其中疾病或病症选自严重联合免疫缺陷(SCID)、联合免疫缺陷(CID)、先天性T细胞缺陷/缺乏症、常见可变免疫缺乏症(CVID)、慢性肉芽肿性疾病、IPEX(X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调综合征)或IPEX样、维斯科特-奥尔德里奇综合征、CD40配体缺陷、白细胞粘附缺陷、DOCA 8缺陷、IL-10缺陷/IL-10受体缺陷、GATA 2缺陷、X-连锁淋巴组织增生病(XLP)、软骨毛发发育不全、ShwachmanDiamond综合征、先天性纯红细胞再生障碍性贫血、先天性角化不良、范可尼贫血、先天性中性粒细胞减少症、镰形细胞病、地中海贫血、粘多糖贮积症、神经鞘脂贮积病和骨硬化病。
I22.根据实施方案l1至l21中任一项所述的方法，包括向受试者施用另外剂量的经修饰的细胞，其中疾病或病症症状在症状减轻后仍然存在或被检测到。
I23.根据实施方案l1至l22中任一项所述的方法，包括
确定受试者中病症或疾病的存在、不存在或阶段；以及
传输施用根据实施方案E1至E45中任一项所述的经修饰的细胞群的指示，维持经修饰的细胞群的后续剂量，或基于受试者中确定的病症或疾病的存在、不存在或阶段来调节施用给患者的经修饰的细胞群的后续剂量。
I24.根据实施方案I23中任一项所述的方法，其中病症是白血病。
I25.根据实施方案l1至l22中任一项所述的方法，其中受试者已被诊断患有选自HIV、流行性感冒、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘、细胞巨化病毒(CMV)、腺病毒(ADV)、HHV-6(人疱疹病毒6，I)和***瘤病毒的病毒病因学的感染，或者已被诊断患有选自肺炎、肺结核和梅毒的细菌病因学的感染，或者已被诊断患有选自疟疾、锥虫病、利什曼病、毛滴虫病和阿米巴病的寄生虫病因学的感染。
***
本文引用的每个专利、专利申请、出版物和文献的全文据此以引用方式并入。上述专利、专利申请、出版物和文献的引用并不是承认任何前述内容是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。
在不脱离本技术的基本方面的情况下，可对前述内容进行修改。虽然已参考一个或多个具体实施方案基本上详细地描述了本技术，但本领域普通技术人员将认识到，可对本申请中具体公开的实施方案进行改变，但是这些修改和改进在本技术的范围和实质内。
本文示例性地描述的技术可在不存在本文未具体公开的任何元素的情况下适当地实施。因此，例如，在本文的每个实例中，术语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任一个均可被替换为其他两个术语中的任一个。已采用的术语和表达用作描述性而非限制性的术语，并且这些术语和表达的使用不排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，并且在所要求保护的技术的范围内的各种修改是可能的。术语“一个”或“一种”可指其所修饰的一种或多种元素(例如，“试剂”可意指一种或多种试剂)，除非上下文中清楚地描述了元素中的任一种或元素中的多于一种。如本文所用，当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”一起使用时，词语“一个”或“一种”的使用可意指“一种”，但也与“一种或多种”、“至少一种”和“一种或多于一种”的含义一致。此外，术语“具有”、“包括”、“含有”和“包含”是可互换的，并且本领域技术人员认识到这些术语是开放式术语。如本文所用，术语“约”是指在基础参数的10％内的值(即，加或减10％)，并且在一串值的开始处使用术语“约”修饰每个值(即，“约1、2和3”是指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可包括介于90克和110克之间的重量。此外，当本文描述值的列表时(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)，该列表包括其所有中间值和分数值(例如，54％、85.4％)。因此，应当理解，虽然本技术已通过代表性实施方案和任选特征具体公开，但本领域的技术人员可采取本文所公开的概念的修改和变型，并且此类修改和变型被认为在本技术的范围内。
本技术的某些实施方案在随后的权利要求书中阐述。

Claims (24)

1.一种经修饰的细胞群，包含经修饰的T细胞，其中：
所述经修饰的T细胞包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其中所述嵌合抗原受体包含：
(i)跨膜区；
(ii)T细胞活化分子；以及
(iii)抗原识别部分
其中所述经修饰的细胞群中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为3:2或更大。
2.根据权利要求1所述的经修饰的细胞群，其中所述嵌合抗原受体包含：
(i)跨膜区；
(ii)共刺激多肽细胞质信号传导区、缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区、缺少所述TIR结构域的截短的MyD88多肽区和共刺激多肽细胞质信号传导区、或缺少所述TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区；
(iii)T细胞活化分子；以及
(iv)抗原识别部分。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的经修饰的细胞群，其中所述经修饰的T细胞包含编码诱导型嵌合促凋亡多肽的第二多核苷酸。
4.根据权利要求1所述的经修饰的细胞群，其中所述经修饰的T细胞包含编码嵌合信号传导多肽的第二多核苷酸，其中所述嵌合信号传导多肽包含：
(i)共刺激多肽细胞质信号传导区；
(ii)缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区；
(iii)缺少所述TIR结构域的截短的MyD88多肽区和共刺激多肽细胞质信号传导区；或
(iv)缺少所述TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区。
5.根据权利要求4所述的经修饰的细胞群，其中所述嵌合信号传导多肽包含膜靶向区。
6.根据权利要求4所述的经修饰的细胞群，其中共刺激多肽细胞质信号传导区是激活由MyD88、CD40和/或MyD88-CD40融合嵌合多肽激活的所述信号传导途径的信号传导区。
7.根据权利要求1所述的经修饰的细胞群，其中所述经修饰的T细胞包含核酸，所述核酸包含启动子，所述启动子可操作地连接至
(i)编码所述嵌合抗原受体的第一多核苷酸；和
(ii)编码嵌合信号传导多肽的第二多核苷酸，其中所述嵌合信号传导多肽包含
a.共刺激多肽细胞质信号传导区；
b.缺少TIR结构域的截短的MyD88多肽区；
c.缺少所述TIR结构域的截短的MyD88多肽区和共刺激多肽细胞质信号传导区；或
d.缺少所述TIR结构域的截短的MyD88多肽区和缺少CD40胞外结构域的CD40细胞质多肽区。
8.根据权利要求7所述的经修饰的细胞群，其中所述核酸以5'至3'的顺序包含所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的经修饰的细胞群，其中所述第一多核苷酸以5'至3'的顺序编码抗原识别部分、跨膜区和T细胞活化分子，并且所述第二多核苷酸是编码所述T细胞活化分子的所述多核苷酸序列的3'。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的经修饰的细胞群，其中所述核酸包含第三多核苷酸，所述第三多核苷酸编码所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸之间的接头多肽。
11.根据权利要求10所述的经修饰的细胞群，其中所述接头多肽包含2A多肽。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的经修饰的细胞群，其中所述核酸包含编码诱导型嵌合促凋亡多肽的第四多核苷酸。
13.根据权利要求2至12中任一项所述的经修饰的细胞群，其中所述共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10，或激活由MyD88、CD40、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10激活的所述信号传导途径的信号传导区。
14.根据权利要求2至3中任一项所述的经修饰的细胞群，其中所述嵌合抗原受体包含两个共刺激多肽细胞质信号传导区，所述两个共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10，或激活由CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10激活的所述信号传导路径的信号传导区，或激活由MyD88、CD40、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10激活的所述信号传导途径的信号传导区。
15.根据权利要求4至12中任一项所述的经修饰的细胞群，其中所述嵌合信号传导多肽包含两个共刺激多肽细胞质信号传导区，所述两个共刺激多肽细胞质信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10，或激活由MyD88、CD40、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE和DAP10激活的所述信号传导途径的信号传导区。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的经修饰的细胞群，其中80％或更多的所述经修饰的细胞为CD8+T细胞。
17.一种用于刺激针对受试者的靶细胞或组织的细胞介导免疫应答的方法，包括施用根据权利要求1至16中任一项所述的经修饰的细胞群。
18.一种用于治疗患有与靶抗原的表达升高相关联的疾病或病症的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的经修饰的细胞群。
19.一种用于减小受试者的肿瘤的大小的方法，包括向所述受试者施用根据权利要求1至16中任一项所述的经修饰的细胞群，其中所述抗原识别部分与所述肿瘤上的抗原结合。
20.一种用于制备根据权利要求1至16中任一项所述的经修饰的细胞群的方法，包括在将包含编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸的核酸掺入到T细胞中的条件下使具有所述核酸的所述细胞与细胞群接触，并且富集所述T细胞以获得经修饰的细胞群，其中所述细胞群中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率为3:2或更大。
21.根据权利要求20所述的方法，包括向受试者施用所述经修饰的细胞群的步骤。
22.根据权利要求17至19所述的方法，还包括施用细胞因子中和剂。
23.根据权利要求23所述的方法，其中所述中和剂为抗体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述中和剂为抗TNFα抗体。
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