CN111419831B - 二甲双胍靶向cox6b2在制备治疗胰腺癌药物中的应用 - Google Patents

二甲双胍靶向cox6b2在制备治疗胰腺癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌(PDAC)药物中的应用，二甲双胍通过线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平，导致PDAC能量代谢减弱，进而抑制PDCA细胞的侵袭和迁移。本发明通过构建不同的PDAC细胞模型，采用二甲双胍处理其PDAC细胞株，发现二甲双胍、COX6B2及氧化磷酸化与PDAC之间的作用机制，这一发现不仅能为PDAC的诊断提供有效的分子标记物，还将为PDAC治疗的药物靶点设计和药物选择提供理论指导，具有重要的临床意义和社会价值。

Description

二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用
技术领域
本发明涉及临床医学领域，特别是涉及一种二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
背景技术
胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤，诊断晚期和预后极差导致胰腺癌的死亡率很高。由 于肿瘤细胞转移，即使是接受过根治性切除术的患者也有很高的疾病复发风险。癌症睾丸抗原是睾丸特异性蛋白，只存在于睾丸组织中，但发现在多种肿瘤中高表达。线粒体 是细胞的能量供应中心，对细胞的生长、***、迁移、侵袭、能量代谢和细胞凋亡至关 重要。线粒体氧化磷酸化功能障碍会导致机体多个组织、器官、***出现功能障碍，从 而引起一些复杂的疾病，比如癌症，这些疾病的致死率和致残率都非常高。肿瘤生长需 要大量的能量，而线粒体作为细胞能量代谢中心，其功能的改变必然会参与肿瘤细胞能 量代谢的重编程过程中。OXPHOS对于肿瘤进程起着重要作用，该观点认为线粒体功 能改变的逆向信号分子(如ROS，ATP等)能逆向调控核基因表达下的信号转导通路 蛋白，从而促进肿瘤的发生。另一方面，OXPHOS是一种在线粒体中合成ATP的高 效方法，在肿瘤转移期间，能量活跃的线粒体需要从通常发现它们的核周区域重新定位 到细胞的前缘。这种重新定位有利于提供癌细胞侵入周围组织所需的局部能量，从而促 进肿瘤细胞的侵袭性和迁移性。
总而言之，OXPHOS影响肿瘤的增殖与转移。细胞色素c氧化酶蛋白(COX)作 为呼吸链中的最终电子供体起作用，驱动电子穿过线粒体内膜形成质子梯度，最终导致 ATP和水的产生，在线粒体OXPHOS中起关键作用。同时，细胞色素c氧化酶亚基 6B2(COX6B2)是COX复合体蛋白中的一个亚基，在睾丸中特异性表达，通常不在其他 正常组织中表达，并且发现在多种肿瘤中高表达，可能参与肿瘤增殖和转移的过程，而 值得注意的是，现有技术中二甲双胍除了是2型糖尿病(T2DM)患者的一线口服药物 以外，还没有对于癌症相关作用机制的研究，尤其是二甲双胍如何影响PDAC发生及 发展的作用机制至今尚无相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，通过构建不同的PDAC细胞模型，采用二甲双胍处理其PDAC细胞株，发现二甲双胍 可通过线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平，导致PDAC能量代谢减弱，进而 抑制PDCA细胞的侵袭和迁移，这不仅能为PDAC的诊断提供有效的分子标记物，还 将为PDAC治疗的药物靶点设计和药物选择提供理论指导，具有重要的临床意义和社 会价值。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，二甲双胍通过线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平，导致PDAC能量代 谢减弱，进而抑制PDCA细胞的侵袭和迁移。
优选的是，通过构建不同的PDAC细胞模型，在二甲双胍作用下检测线粒体 COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平。
优选的是，所述PDAC细胞模型的构建方法，具体包括以下步骤：
步骤1：利用COX6B2 shRNA序列，如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示， 合成目的DNA；
步骤2：将目的DNA***包装质粒pLKO.1-puro后，共转染到HEK 293T细胞中， 构建慢病毒质粒；
步骤3：将所得慢病毒质粒分别转染不同的胰腺癌细胞，经培养，筛选稳定表达的COX6B2细胞，以获取COX6B2蛋白敲低的不同PDAC细胞模型。
优选的是，步骤3中所述胰腺癌细胞为SW1900、Patu-8988或Panc-1细胞。
优选的是，步骤3中用含有嘌呤霉素或潮霉素的LB培养基进行培养。
优选的是，所述线粒体氧化磷酸化水平的评价指标包括细胞氧化呼吸能力、细胞OCR/ECAR水平、线粒体膜电位水平、ATP生成能力以及ROS水平。
优选的是，所述能量代谢的评价指标包括PDAC细胞中的ATP和ADP能量水平。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过选取其中三株胰腺癌细胞系SW1990，Patu-8988，Panc-1，成功构建COX6B2蛋白敲低细胞模型，结果发现当COX6B2蛋白敲低后，癌细胞在体外的迁移 和侵袭能力均显著下降，而细胞生长不受影响，说明COX6B2对促进胰腺癌转移具有 直接关系。
进一步的，通过氧耗能力检测技术、ATP及ROS生成实验、MMP检测技术对 COX6B2敲低蛋白胰腺癌模型细胞OXPHOS水平进行检测，发现COX6B2蛋白低表 达后，癌细胞氧呼吸能力下降，细胞内整体ATP水平和线粒体内ATP生成能力都下 降，线粒体膜电位下降，线粒体内ROS生成增高，但是细胞内ROS生成没有显著差 异，说明COX6B2蛋白对于维持线粒体OXPHOS功能起着重要作用。通过给予 Rotenone和叠氮化钠处理胰腺癌细胞(SW1990，Patu-8988，Panc-1)，发现癌细胞的迁 移和侵袭能力降低，说明抑制线粒体OXPHOS功能对于癌细胞的迁移和侵袭起抑制 作用。通过给予ATP处理COX6B2蛋白低表细胞，发现COX6B2 KD细胞的迁移和 侵袭能力提高，说明ATP有利于胰腺癌细胞的迁移和侵袭。通过对EMT相关蛋白进行检测，结果表明SW1990，Patu-8988，Panc-1细胞中COX6B2蛋白敲低后，E- Cadherin蛋白表达水平增高，N-Cadherin/Vimentin/SNAIL蛋白表达水平降低，表明 COX6B2能影响EMT相关蛋白的表达。
而发明人通过二甲双胍处理PDAC细胞后，同样发现在所有编码OXPHOS基因 中，COX6B2表达的变化位居首位，此外，通过Panc-1细胞中用α-amanitin抑制RNA 转录，发现含有二甲双胍的细胞中，COX6B2 mRNA的降解比对照细胞降解的快，说 明二甲双胍通过促进COX6B2 mRNA的降解抑制COX6B2的表达，并且呈现以时间依 赖性方式表现出降低COX6B2水平；而通过BN-PAGE分析不同PDAC细胞模型结果 显示：二甲双胍处理的PDAC细胞壁未处理的细胞表现出更低的OXPHOS复合物水 平；此外，还发现二甲双胍处理的Patu-8988细胞3天足以导致COX6B2水平显著降 低，可显著抑制PDAC细胞的迁移能力，而细胞的复制仍未受到影响。总而言之，本 发明验证了二甲双胍可以通过抑制COX6B2的表达来模拟COX6B2敲低对PDAC细 胞侵袭和迁移的影响，因此，二甲双胍可能在靶向高COX6B2胰腺癌的治疗方法中成为最具有潜力的药物，这一发现不仅能为PDAC的诊断提供有效的分子标记物，还将 为PDAC治疗的药物靶点设计和药物选择提供理论指导，具有重要的临床意义和社会 价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实 施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些 附图获得其他的附图。
图1为经/未经二甲双胍预处理PANC-1细胞的氧化磷酸化相关基因表达水平；其中，A为PDAC与对照组织之间的COX6B2表达差异；B为石蜡化PDAC中蛋白质分析结 果；C为新鲜组织样品中蛋白质分析结果；D为不同细胞系中蛋白质分析结果；E为高分 化PDAC细胞和低分化PDAC细胞中COX6B2 mRNA表达水平的差异；F为COX6B2 mRNA在转移和非转移的PDAC组织的差异表达情况；G为不同表达水平的COX6B2对 患者的总生存率的影响；H为不同表达水平的COX6B2对患者的无病生存率的影响；
图2为敲减COX6B2后对于不同细胞系的侵袭和迁移能力的影响；其中，A为敲减COX6B2后SW1990细胞增殖能力的变化；B为敲减COX6B2后Panc-1细胞增殖能力的 变化；C为敲减COX6B2后Patu-8988细胞增殖能力的变化；D为调节COX6B2的表达水 平对体外Panc-1和Patu-8988细胞中肿瘤形成的影响；E为调节COX6B2的表达水平对 体内Panc-1和Patu-8988细胞中肿瘤形成的影响；F为通过伤口愈合实验验证COX6B2 KD对SW1990细胞迁移的影响；G为通过伤口愈合实验验证COX6B2 KD对Panc-1细胞 迁移的影响；H为通过伤口愈合实验验证COX6B2 KD对Patu-8988细胞迁移的影响；I为 COX6B2的重新表达在COX6B2 KD癌细胞中恢复其迁移能力；
J为跨孔测定法验证COX6B2 KD对SW1990细胞侵袭和迁移能力的影响；K为跨孔 测定法验证COX6B2 KD对Panc-1细胞侵袭和迁移能力的影响；L为跨孔测定法验证 COX6B2 KD对Patu-8988细胞侵袭和迁移能力的影响；M为COX6B2的过表达对Patu- 8988细胞侵袭和迁移能力的影响；N为不同COX6B2表达水平对PDAC细胞系侵袭和迁 移的影响；O为COX6B2 KD细胞的丝状肌动蛋白的表达情况；P为体内转移实验验证 Panc-1细胞中COX6B2 KD与肺转移的能力的关系；Q为体内转移实验验证Panc-1细胞 中COX6B2 KD与肝转移的能力的关系；R为COX6B2 KD Panc-1细胞的小鼠的腹腔表 面结节数目的变化情况；
图3为不同细胞系中COX6B2的抑制对于单体组合物装配的影响；其中，A为 SW1990细胞中COX6B2的抑制对单体复合物IV装配的影响；B为Panc-1细胞中 COX6B2的抑制对单体复合物IV装配的影响；C为Patu-8988细胞中COX6B2的抑制对 单体复合物IV装配的影响；D为COX6B2的表达恢复对复合物IV形成的影响；E为 SW1990细胞中COX6B2的敲低对5种OXPHOS复合物的酶活性的影响；3F为Panc-1细 胞中COX6B2的敲低对5种OXPHOS复合物的酶活性的影响；G为Patu-8988细胞中 COX6B2的敲低对5种OXPHOS复合物的酶活性的影响；H为通过BN-PAGE分析不同 时间点收集的COX6B2 KD细胞中复合物IV降解情况；I为在抑制COX6B2对复合物IV 的组装的影响；
图4为COX6B2敲减后不同细胞系中能量变化情况；其中，A为COX6B2敲减后 SW-1990细胞的氧呼吸能力(OCR)检测；B为COX6B2敲减后Panc-1细胞的氧呼吸能 力(OCR)检测；C为COX6B2敲减后Patu-8988细胞的氧呼吸能力(OCR)检测；D为 COX6B2 KD的细胞系中总ATP产量的变化；E为COX6B2 KD的细胞系中MITO-ATP产 量的变化；F为受COX6B2抑制的Patu-8988细胞的COX6B2表达恢复对ATP的产生的影 响；G为在COX6B2 KD细胞中COX6B2表达恢复对于MMP表达的影响；H为COX6B2 KD的Patu-8988细胞的脂质表达水平；
图5为外源补充ATP对于PDAC细胞的侵袭和迁移能力的影响；其中，A为通过伤 口愈合实验验证不同胰腺癌细胞系中OXPHOS的抑制对PDAC细胞的侵袭和迁移能力 的影响；B为通过跨孔测定法验证不同胰腺癌细胞系中OXPHOS的抑制对PDAC细胞的 侵袭和迁移能力的影响；C为通过伤口愈合实验验证COX6B2 KD PDAC细胞中的外源 补充ATP对细胞的迁移能力的影响；D为通过跨孔测定法验证COX6B2 KD PDAC细胞 中的外源补充ATP对细胞的迁移能力的影响；E为COX6B2 KD PDAC细胞与补充ATP的 细胞相比，F-肌动蛋白水平的变化情况；F为腺苷三磷酸双磷酸酶对COX6B2 KD的Patu- 8988细胞的迁移能力的影响；G为补充双磷酸腺苷三磷酸酶对Patu-8988细胞细胞中的 F-肌动蛋白水平表达的影响；
图6为二甲双胍处理的PDAC细胞氧化磷酸化水平的变化情况；其中，A为用二甲 双胍处理的PDAC细胞的转录分析结果；B为用二甲双胍处理的PDAC细胞中mRNA表 达情况；C为含有二甲双胍的细胞中，COX6B2 mRNA的降解情况；D为用二甲双胍处 理的Panc-1细胞随时间变化COX6B2水平的变化情况；E为用二甲双胍处理的Patu-8988 细胞随时间变化COX6B2水平的变化情况；F为二甲双胍处理的Panc-1细胞中OXPHOS 复合物的表达水平；G为二甲双胍处理的Patu-8988细胞中OXPHOS复合物的表达水平； H为不同浓度二甲双胍处理Patu-8988细胞对COX6B2水平的影响；I为二甲双胍处理 Patu-8988细胞对细胞复制的影响；
图7为pLK0.1-PURO载体图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明所使用的胰腺癌细胞系SW1990、Patu-8988、Panc-1、Capan-2、MIA-PACA2均为温州医科大学实验室所有。COX6B2低表达细胞模型采用SW1990、Patu-8988和 Panc-1细胞系，共设计了两条位于COX6B2 mRNA编码区不同位置的shRNA进行基 因敲低。其他所用试剂和实验材料均为通过商业渠道能够直接购买得到的。
1、实验材料
胰腺癌及邻近正常胰腺石蜡组织和新鲜组织样本均来自杭州市第一人民医院病理 科。
正常胰腺导管细胞HPNE6c7、胰腺癌细胞系SW1990、Patu-8988、Panc-1均是从 中国科学院订购。SW1990细胞用含有10％FBS的DMEM高糖培养基培养，Patu-8988、 Panc-1用含有10％CS的DMEM高糖培养基培养，细胞培养箱温度为37℃，CO2浓度 为5％。
COX6B2低表达细胞模型采用SW1990、Patu-8988和Panc-1细胞系，共设计了两 条位于COX6B2 mRNA编码区不同位置的shRNA进行基因敲低。通过稳定转染含 COX6B2 shRNA慢病毒载体，挑选细胞克隆，确定敲低成功的细胞分别为KD1，KD2； 对照为转染了空载体的细胞。细胞培养过程中，需要使用含有嘌呤霉素(puromycin) 4μg/ml的DMEM去培养细胞，从而维持KD1，KD2细胞COX6B2低表达特性。
2、发明人在研究二甲双胍\COX6B2\线粒体OXPHOS与PDAC之间关系之前，先 对胰腺癌组织标本的免疫组织化学分析
从中国浙江省人民医院的患者中，获得了27对5微米厚的***固定石蜡包埋的PDAC标本切片以及相邻的正常胰腺组织配对。同样，从温州医科大学附属第一医 院(中国浙江省)的患者中获得成对的匹配的PDAC肿瘤和邻近的正常组织，并在手 术切除后立即在液氮中速冻。根据温州医科大学附属第一医院和杭州市人民医院伦理 委员会批准的方案，所有受试者均获得知情同意。所有实验方法均按照温州医科大学批 准的指南进行。
将组织切片固定在载玻片上，用二甲苯处理，在分级的一系列醇水溶液中再水化，然后在10mM柠檬酸(pH 6.0)中进行热处理。25min即可恢复抗原。使用0.3％H2O2溶液淬灭内源性过氧化物酶活性。在25℃下用10％山羊血清(Absin Bioscience Inc， 中国上海)封闭切片2h，然后与抗COX6B2一级抗体(1：50；#PA5-50213，Thermo Fisher Scientific，Waltham,MA,USA)一起孵育，4℃过夜。将切片用二氨基联苯胺 染色以观察信号，用苏木精复染，在乙醇中脱水，在二甲苯中澄清，然后用中性树脂密 封。使用Image-Pro Plus 6.0通过计算每个染色区域的积分光密度(IOD)来分析蛋白质 表达水平，并以IOD计算平均最佳密度(MOD)/区域。
为了验证OXPHOS亚基可能参与PDAC的发展，分别从癌症基因组图谱(TCGA) 和基因型组织表达(GTEx)数据库下载了患者和对照组受试者的mRNA表达数据，并 对OXPHOS进行了排名根据患者和对照之间观察到的表达差异编码基因。在81个核 编码基因中，有75个基因的mRNA水平发生了显着变化，与对照组织相比，其中大多 数基因在PDAC中上调。在所有研究的基因中，PDAC与对照组织之间的COX6B2表 达差异排名最高(图1A)。一致地，使用石蜡化PDAC(图1B)，新鲜组织样品(图1C) 和细胞系(图1D)进行的蛋白质分析证实，与正常细胞相比，癌细胞中COX6B2的蛋 白质水平显着升高。此外，还发现在TCGA数据库中，PDAC组织中COX6B2的mRNA 水平在所有30种研究的癌症类型中排名最高。同样，相对于来自癌细胞系百科全书 (CCLE)的任何其他癌细胞系，PDAC细胞系中COX6B2的mRNA水平要高10倍以上，几乎是肺癌细胞系中的2倍。所有这些发现表明COX6B2是PDAC的关键特征。 此外，对COX6B2表达水平与PDAC临床表现之间关联的联合分析表明，与高分化 PDAC细胞相比，低分化细胞中COX6B2 mRNA显著增加(图1E)，与远处转移相比， COX6B2 mRNA远处转移比非转移性PDAC组织显著增加(图1F)。结果表现，高水 平COX6B2的患者的总体生存率和无病生存率较低(图1G和H)。
实施例1
验证二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用
一、实验内容
1、COX6B2 knock down细胞株的构建
1.1互补DNA单链的退火及鉴定
1.1.1 DNA单链序列
COX6B2 shRNA(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)均为自己设计。序列送到科 生物科技公司合成。
SEQ ID NO：1如下所示：
5'-GCAGCCCTGCGAGTACTATTT-3'(ORF区)；
SEQ ID NO：2如下所示：
5'-GCCTTCGAGTTCCTTGTTTCC-3'(3'-UTR区)；
以上单链使用去离子水按照母液浓度为1μg/μL进行溶解。
shRNA退火，退火体系如表1所示。
表1 DNA单链退火反应体系
Figure BDA0002441996510000081
退火条件：90℃3min，37℃1h。
1.1.2鉴定
形成的退火产物DNA双链用20％SDS-PAGE鉴定，鉴定完成后使用GEL-RED 染色，观察凝胶成像仪显色的条带，从而判断DNA互补单链的退火情况。
1.2环状载体线性化
a.使用慢病毒载体pLK0.1-PURO质粒来构建模型载体，空载体线性化长度为7091bp，并携带氨苄西林(载体单克隆筛选)和嘌呤霉素(单克隆细胞筛选)抗性基 因，使用AgeI与EcoR I这两个酶来把目的DNA双链***位于U6逆转录启动子之后 (如图7所示)。
b.AgeI/EcoR I双酶切体系如表2所示。
表2双酶切体系
Figure BDA0002441996510000082
酶切条件：37℃酶切3h。
c.线性载体胶回收：酶切完后需要加入10×loading buffer，混匀后取5μL上 样，同时取3μL 15000bp DNA Marker上样，使用1％琼脂糖凝胶，在1×TAE缓冲 液中用110V恒压电泳，电泳大约20-30分钟。用紫外灯照射，观察并回收线性化载 体，使用小刀切下凝胶放入去酶的EP管中。
d.称重回收的凝胶，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒操作步骤，将线性化载体回收，最后使用已经预热的ddH2O溶解。
e.使用Nanodrop测定仪来检测回收载体DNA浓度，放在4℃冰箱备用，若长期 保存需要放在-20℃冰箱。
1.3载体构建
a.按照1:50稀释退火后的双链DNA，使其浓度为8ng/μL。
b.载体和目的DNA连接，按照线性化载体：DNA双链＝1：3进行连接。并设置 阴性对照，连接体系如表3所示。
表3线性化载体与DNA连接反应体系
Figure BDA0002441996510000091
配制好体系后，设置温度16℃，连接需要在PCR仪上过夜。
1.4shRNA载体筛选、鉴定以及纯化
将上述构建的载体20μL转入感受态细胞DH5α中，放于42℃热激90s，然后迅 速放在冰上冷5min。
取400μL无Amp+DMEM，在150rpm条件下，放在37℃培养40min。
从中取100μL菌液涂在含100μg/mL Amp+固体LB培养基上，放在37℃培养箱中 过夜培养。
第二天，每管5mL LB液体培养基(含Amp+100μg/ml)中挑取1个单克隆菌 落，共挑取3管进行增菌培养。
取4mL菌液来提取质粒DNA，送给秦科生物科技公司测序，验证载体是否构建 成功，引物为U6启动子。测序后，将构建成功的菌液再次增菌培养，并提取质粒， 测定质粒DNA浓度，标记好后放在-20℃冰箱中保存。
1.5构建COX6B2蛋白敲低稳转细胞株
1.5.1嘌呤霉素(puromycin)的有效浓度筛选方法
1)6孔板中每孔接种30％的SW1990、Patu-8988、Panc-1细胞。待其生长达到 60％以后，分别加入终浓度为0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL的嘌呤 霉素进行筛选。
2)每隔一天更换一次含有puromycin的DMEM培养基，这样连续培养一周，选择 培养大约3天时细胞开始大量死亡，且7天内全部死亡，这一puromycin浓度为最佳 的药物筛选浓度。
3)筛选得到SW1990、Patu-8988、Panc-1细胞的最佳药物浓度2μg/mL。
b.细胞转染获取病毒液
1)用6孔板接种293T细胞，约50万个细胞/孔(各两孔)，使用含10％小牛血清 (CS)且无抗生素的DMEM培养。
2)待细胞生长到60-70％时，按照lipofectamine 3000试剂盒的转染操作步骤进行 细胞转染，其中，所用质粒按PLKO.1:PMD2.G:psPAX2＝1:1:2的比例进行转染，三者 质粒总量2.5μg。设置PLKO.1空载体做对照。
3)转染6h后加入10％CS，24h后更换细胞培养基，加入含有10％CS的DMEM 培养基1.5mL。
4)48h后，收集上清培养液，用0.45μm滤器过滤，再次加入1.5mL完全培养基继 续培养。收集得到病毒液直接感染细胞，或放于-80℃冻存。
c.细胞感染
1)在6孔板中接种SW1990、Patu-8988、Panc-1细胞大约1万个，细胞生长达到 70％时进行病毒感染。
2)取1mL DMEM培养基，在里面加入200μL shRNA病毒液，最后还需要加入聚 凝胺polybrene(8μg/mL)。
3)大约24h后换培养基，再继续培养24h，然后将细胞消化到2个大皿中，并使 用终浓度为2μg/mL的Puromycin进行筛选。
4)3天换一次培养液，直到细胞长出单克隆，然后使用含有胰蛋白酶的枪头挑取单克隆细胞。
5)用含puromycin的培养液扩大培养单克隆细胞。
6)单克隆细胞敲低效果鉴定：使用western bolting去鉴定COX6B2蛋白敲低效果。
7)扩大培养鉴定成功的细胞克隆，然后进行冻存。
d.采用western bolting方法进行COX6B2敲低效果鉴定。
结果显示，用含有COX6B2 shRNA的慢病毒质粒对SW1990，Patu-8988，Panc-1 细胞进行基因干预，经过嘌呤霉素筛选得到2株细胞克隆(KD1，KD2)。将干扰后 的细胞克隆扩大培养，采用WB(Western Blot)检测方法，最后确定两条shRNA序 列均能将SW1990，Patu-8988，Panc-1细胞中的COX6B2蛋白成功稳定敲低。
2、二甲双胍与COX6B2 knock down细胞株之间的能量代谢和线粒体功能关系的鉴定
2.1 COX6B2 knock down细胞增殖能力检测
a.细胞长到80％时，吸去旧培养液，使用1mL PBS润洗细胞表面，吸去PBS 后再加1mL胰蛋白酶消化细胞大约1min。然后加入1mL新的DMEM培养基，吹打 细胞成单个游离状态。
b.将细胞充分混匀后，吸取10μL细胞混合液加到细胞计数板上，放大约1min， 开始细胞计数。
c.细胞计数原则：在计数格线上的细胞采取计左不计右，计上不计下。
d.将SW1990、Patu-8988、Panc-1(Ctrl、KD1、KD2)细胞等数量(1×105)的接 种在6孔细胞培养板中，各种细胞系9个孔，每个细胞3次重复，待细胞贴壁完全 后，给细胞换一次液，此后每24h进行一次细胞计数，连续计数4-6天，每隔3天换 液。
e.用Graphpad软件绘制细胞生长曲线。
2.2菌落形成实验的检测
将细胞接种到6孔板中(1×103细胞/孔)，每3d更换一次培养基。14天后，将 克隆用4％多聚甲醛固定30min，并用结晶紫(碧云天)染色30min。使用Image J v 2.4.1.7对直径超过0.5mm的细胞集落进行计数。
2.3动物移植实验的检测
所有动物实验均按照温州医科大学动物伦理委员会概述的《实验动物的护理和使用指南》进行。
六周大的裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，中国上海)在右肩下皮下注射5×106个Panc-1或Patu-8988细胞，按照每只小鼠注射0.2mL混合物[混合物由 PBS(磷酸盐缓冲盐水)和Matrigel(基质胶)按照体积比1：1混合制备]。直到实验 结束，使用卡尺测量周长3次的肿瘤体积(mm3)(长度×宽度2)×0.5236。在第8 周(8988)或第9周(PANC-1)后，处死所有小鼠以测量最终的肿瘤重量。
2.4动物体内转移试验的检测
将4×106个Panc-1细胞注射入裸鼠(尾组)(每组n＝5只小鼠)。11周后，处死 所有小鼠并解剖。对每只小鼠的肺，肝，肠，肠系膜，胰腺，腋窝***和胸膜中可 见的转移性肿瘤结节进行计数。收集所有固体器官并用4％多聚甲醛固定(24h)，然 后再依次用酒精-水和二甲苯溶液进行脱水，然后，将组织用石蜡包埋，并切成5μm 的切片并将其固定在载玻片上。之后，将切片在二甲苯和不同浓度的乙醇水溶液中重 新水化，并用苏木精复染，在乙醇中脱水，在二甲苯中澄清，然后用中性树脂密封。 捕获组织病理学图像(40×，比例尺50μm，100×，比例尺20μm)并用显微镜分 析。
2.5伤口愈合测定
将细胞接种在6孔板中，并以90％汇合度培养以形成单层细胞。用10μL移液器 吸头来回吹打形成创伤口，并用预热的PBS轻轻清洗，在0h、12h和24h对伤口拍 照。使用ImageJ软件(NIH)分析0h和24h的曝光面积。使用以下公式：(0h的暴 露面积-24h的暴露面积)/0h的暴露面积计算伤口愈合能力。实验设置三次重复，并 在显微镜下捕获至少5张图像/孔。
2.6 Transwell小室侵袭实验
a.包被基质胶(Matrigel)：基质胶放在4℃冰箱过夜融化。包被前将相关耗材 (24孔板、Transwell小室等)放在-20℃冰箱预冷。按1:9去配基质胶与基础 DMEM，混均匀后加40μL到Transwell上室中，快速轻晃小室，使基质胶均匀的铺 在上室的表面，小室放入37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
b.第二天取出小室，弃掉上室中的液体，使用100μL基础DMEM培养基水化 30min后可以开始接种细胞。
c.收集细胞并计数。取200μL基础DMEM培养液在上室，含2×104个细胞，下 室加入600μL含10％FBS的DMEM培养液，放在37℃、5％CO2培养箱内培养。
d.培养24h后，将小室中上室内和下室内的液体吸出，用4％的多聚甲醛去固定细胞大约20min，弃掉多聚甲醛，取600μL 0.1％的结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦拭 掉上室细胞，使用显微镜观察并拍照保存。
如果进行细胞迁移测定，则不使用包被基质胶，其他都一样。
2.7免疫荧光染色
对于IF染色，将2×104个细胞/孔接种到装有玻璃盖玻片的24孔板中。在盖玻 片上生长约24h后，将细胞在25℃下，用4％多聚甲醛固定10min，并用100mM洋 地黄皂苷透化10min。随后，将细胞用PBS中的10％山羊血清封闭30min，并与抗F- 肌动蛋白抗体(1：100；#ab205，Abcam，Cambridge，UK)在4℃孵育过夜。接下 来，将细胞与荧光标记的IgG-AlexaFluor 488二抗(1：500；#8878，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)在黑暗中于25℃孵育2h，并滴入一滴抗褪色剂使 用具有DAPI的固定介质固定盖玻片。最后，使用共聚焦激光显微镜拍摄每个盖玻片 的至少5个随机选择的视野。通过使用Image J软件(NIH)对荧光强度的定量分 析，计算每个染色区域的积分光密度(IOD)。
2.8线粒体的酶活性测定
2.8.1从培养的细胞中分离线粒体。通过胰蛋白酶消化收集来自10个单独的100mm培养皿的90％汇合的细胞，沉淀并用冷PBS洗涤两次。然后使用玻璃露布组 织研磨机将细胞匀浆30次，并通过差速离心法分离线粒体。
从培养的细胞中分离出的线粒体用于根据公开的规程测量OXPHOS复合物(复 合物IV)的活性。使用含有12.5mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)，5mM的缓冲液检测复 合物I(CI)的活性。NaN3(叠氮化钠)，10μM DB(癸基泛醌)，130μM NADH (烟酰胺-腺嘌呤-二核苷酸)和10μg/mL抗霉素A。使用含有25mM磷酸钾缓冲液 (pH 7.4)，8μg/mL抗霉素A，20mM琥珀酸酯和50μM DCPIP(2,6-二氯酚吲哚 酚)，12μM鱼藤酮(Sigma-Aldrich)和20μMDB。使用含有12.5mM磷酸钾缓冲液 (pH 7.4)，225μg/mL DDM(正十二烷基β-D-麦芽糖苷)，50μM氧化细胞色素c，200μMEDTA的缓冲液检测CⅢ的活性和50μM DBH2(还原的癸基泛醌)。使用包含 10nM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)，225μg/mL DDM和6mg/mL还原的细胞色素c的缓 冲液检测CIV的活性。使用含有0.6mM EGTA，0.03M Tris-HCl，0.31mM NADH，0.38mM PEP的缓冲液检测CV活性，3.85μg/mL抗霉素A，2.65mM MgCl2，0.15μg/ mL LDH(乳酸脱氢酶)，85μg/mL PK(丙酮酸激酶)和2.5mM ATP(三磷酸腺 苷)。使用VarioskanTMFlash Multimode Reader分别在37℃，340、600、550、550和 340nm下记录5min，以记录OXPHOS复合物活性的动力学曲线。柠檬酸合酶的活性 用作内部对照，并使用含有12.5mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)，225μg/mL DDM，1 mM DTNB(5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic)的缓冲液在412nm处检测酸，68μM乙酰辅 酶A(Sigma-Aldrich)和0.5mM OAA(草酰乙酸；Sigma-Aldrich)。
2.8.2BN-PAGE、SDS-PAGE和免疫印迹检测
使用RIPA裂解缓冲液(细胞信号技术)从细胞中提取总蛋白。从含2％DDM或 2％洋地黄皂苷的全细胞中分离线粒体膜蛋白。
通过BN-PAGE或SDS-PAGE分离的蛋白质被转移到0.22μm聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上。使用抗Grim19(1：1000；#ab110240，Abcam)，抗SDHA(1： 2000；#ab14715，Abcam)，抗UQCRC2(1：1000；#ab14745，Abcam)，抗MT-COI (1：1000；#ab14705，Abcam)，抗ATP5A(1：2000；#ab14748，Abcam)，抗 VDAC(1：1000；#4661，Cell Signaling Technology)，抗TOM70(1：1000；#4527- 1，Proteintech，wuhan，China)，抗COX6B2(1：1000；#ab134960，Abcam)，抗MYC(1：1000；#2272，Cell Signaling Technology)，抗β肌动蛋白(1：2000；#sc- 47778，Santa Cruz Biotechnology,Delaware,USA)和抗GAPDH(1：2000；sc- 47724，Santa CruzBiotechnology)抗体，然后与辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体 (1：2000；#7074，CellSignaling Technology)或抗小鼠IgG二抗(1：2000；# 7076，Cell SignalingTechnology)。使用Super Signal West Pico化学发光底物检测信 号。使用Gel-ProAnalyzer 4.0软件进行集成的光密度定量。
2.9耗氧量的测量
使用Seahorse Bioscience XF24细胞外通量分析仪对PDAC细胞的耗氧率 (OCR)进行了分析。
向每孔含有250μL培养基的24孔板中的3×104细胞，并培养过夜。在测量之 前，将细胞用测定培养基轻轻洗涤，在37℃的无二氧化碳培养箱中，以每孔675μL 测定培养基培养1h。分析仪校准后，基础呼吸，ATP产生(使用1μM寡霉素)，最大 呼吸(使用0.5μM FCCP；Sigma)和备用容量(使用测量了0.5μM抗霉素A和0.5 μM鱼藤酮。
3.0脂质的测量
将2×104个细胞/孔接种到含有玻璃盖玻片的24孔板中。24h后，将细胞用无血 清DMEM中的2μM BODIPY 581/591C11染色30min。将盖玻片用一滴含DAPI的 防褪色固定介质固定，并使用共聚焦激光显微镜对每个盖玻片的至少5个随机选择的 区域拍照。通过使用Image J软件(NIH)计算每个染色区域的IOD来分析荧光强度 的定量分析。
3.1ATP含量测定实验
a.细胞达到约70％时，加入预热的PBS洗2次，去掉PBS，用1mL胰蛋白酶去消 化细胞，再用1mL含10％CS的DMEM培养基终止消化，1000g离心3min后收集细 胞沉淀。
b.用100μL ATP提取液重悬细胞沉淀，混匀后吸10μL去测蛋白浓度或细胞计数。
c.在温度为100℃条件下煮沸细胞悬液90s，10000g离心3min，取上清。
d.按照Molecular Probe说明书去配制ATP检测液。
e.按100μL每孔的标准，将ATP检测液加到96孔板中。
f.加入2μL待测样本，需要避光。利用Biotek Synergy HT酶标仪去检测荧光强度。
3.2 ROS(过氧化物)含量测定
a.使用ddH2O溶解DCFH-DA(4Mm)，避光保存在-80度。
b.大皿中细胞长到80％时，使用已经预热好的PBS去润洗细胞表面2次，然后用1mL胰蛋白酶消化细胞，消化1min后再加1ml含有10％CS的DMEM培养基终止消 化，1000g离心5min，收集细胞沉淀，使用200ul基础DMEM培养基重悬细胞。
c.配制含有4μM DCFH-DA的DMEM混合液。
d.将200μL 4μM DCFH-DA的DMEM加入含有待测细胞的200μL DMEM悬液 中(按1:1配置)。
e.放入37℃培养箱中30min，细胞需要隔5min重悬一次，防止细胞贴壁。
f.取出细胞，1000g离心5min。
g.细胞经过预热好的HBSS重悬，1000g离心条件下离心5分钟，重复三次。再取 410μL HBSS重悬细胞。在黑色96孔荧光板每孔中加入100μL，4个复孔，再吸10μ L测蛋白浓度或细胞计数。
h.多功能酶标仪检测荧光强度(激发波长490nm，发射波长535nm)。
i.所测得的荧光强度值经过蛋白浓度或细胞数目校正后的值即为各样本的相对荧 光强度值。
3.3线粒体膜电位测定
a.6孔板中细胞达到约80％时，加TMRM(30nM)到培养基中，放在37℃、5％CO2培养箱中培养20min。
b.20min后取出，用PBS洗涤细胞三次后取1mL胰酶消化细胞，消化1min，再加 1mL含有10％CS的培养基终止消化，1000g离心5min，再收集细胞沉淀。
c.取430μL TD重悬沉淀，在96孔荧光板每孔中加入100μL细胞悬液，每个待 测样本4次重复(吸10μL去测细胞浓度或细胞计数)。
d.多功能酶标仪检测荧光强度(540nm激发波长，575nm发射波长)。
e.荧光强度值经过蛋白浓度或细胞数校正后的值即为各样本的相对荧光强度。
3.4线粒体钙的测量
在6孔板中生长约24h后，将细胞(约1×106细胞/孔)在无血清DMEM中用 5μMRhod-2 AM染色，在37℃下染色30min，然后洗涤3次，并用PBS重悬。使用 VarioskanTMFlashMultimode Reader测量荧光强度，激发波长为552nm，发射波长为 581nm。数据用蛋白质浓度标准化，结果表示为相对于对照细胞的荧光强度的平均值。
3、结果分析
1)为了揭示COX6B2对PDAC细胞的影响，在SW1990，Panc-1和Patu-8988细 胞中生成了COX6B2敲低(KD)稳定细胞系。
此外，在COX6B2 KD细胞中进行了COX6B2的重新表达。发现抑制COX6B2不 会影响所有3个研究的癌细胞系的癌细胞生长(图2A-C)。在Panc-1和Patu-8988细胞 中进行体外(图2D)和体内(图2E)肿瘤形成分析均进一步证实，调节COX6B2的 表达水平对肿瘤形成没有影响。由于难以形成克隆和肿瘤，所以未提出在SW1990细 胞中进行的肿瘤形成测定。尽管在进行的伤口愈合试验中，所有3个研究的癌细胞系 中的COX6B2 KD均抑制了PDAC细胞的迁移(图2F-H)，但COX6B2 KD细胞中 COX6B2的重新表达恢复了其迁移能力(图2I)。
使用跨孔测定Transwell小室侵袭和迁移实验时，显示COX6B2对PDAC细胞转 移潜力的影响更为显著；如图2J-L所示，所有3种COX6B2 KD PDAC细胞系均表现 出侵袭和迁移能力显著降低，而COX6B2的过表达导致它们的侵袭和迁移能力增加(图 2M)。同样的结果，与具有较低水平的COX6B2的细胞系(图2N)相比，具有较高水 平的COX6B2的PDAC细胞系(图1D)显示出增强其侵袭和迁移能力。
另外，COX6B2 KD细胞的丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)水平较低(图2O)。相同 的结果，体内转移实验表明，与裸鼠对照细胞相比，PANC-1细胞中COX6B2的KD与 产生肺和肝转移的能力显着较低(肺为0/5小鼠；肝为1/5小鼠)。小鼠(肺为5/5小 鼠；肝为5/5小鼠)(图2P和Q)。此外，具有COX6B2 KD PANC-1细胞的小鼠的腹腔 表面结节数目明显低于具有对照PANC-1细胞的小鼠(图2R)。
总而言之，上述结果表明COX6B2可以修饰PDAC细胞的转移潜力，而不会影响 癌细胞的生长和肿瘤的形成。
2)COX6B2首先被鉴定为位于睾丸中的功能未知的线粒体复合体IV的亚型 COX6B1的同工型。为了测定COX6B2对PDAC细胞转移潜能的调节是否涉及线粒体 特异性作用，发明人测试了COX6B2对3种PDAC细胞系线粒体复合物IV装配的影 响。
如图3A-C所示，SW1990，Panc-1和Patu-8988细胞中COX6B2的抑制导致单体 复合物IV减少33-55％，而COX6B2的过量表达恢复了复合物IV的稳态水平(图3D)。 对所有5种OXPHOS复合物的酶活性的分析表明，PDAC细胞系中COX6B2的敲低显 着降低了复合物IV的活性(图3E-G)。尽管与对照细胞相比，在某些COX6B2 KD细 胞中，复合物I和III的活性略有下降，但所有其他OXPHOS复合物均未受影响(图 3E-G)。这些结果表明，COX6B2的敲低与复合物IV特别相关。由于组装缺陷或复合 物IV稳定性的降低都可能导致复合物IV活性降低，因此，通过在COX6B2 KD细胞 中进行复合物IV的组装和降解动力学来区分这些情况。
为了探究线粒体复合物IV在PDAC细胞中的降解，首先用抑制剂氯霉素(CAP) 处理细胞，以阻止新合成的亚基组装OXPHOS复合物。用CAP培养细胞长达72h，并 在各个时间点进行收集以进行BN-PAGE分析。但是，在COX6B2 KD细胞和对照细胞 之间，复合物IV降解的动力学没有观察到差异(图3H)。然后，采取了另一种方法， 在去除CAP后的各个时间点收集了细胞，并通过BN-PAGE分析呼吸复合物，如图3I 所示，在抑制的COX6B2中，复合物IV的组装比对照细胞中的组装要慢。另外，为了 进一步了解COX6B2在复合物IV组装中的作用，还测定了耗尽COX6B2的293T细胞 系。类似地，与对照细胞相比，缺少COX6B2的293细胞具有较低水平的完全组装的 单体复合物IV。此外，使用高分辨率BN-PAGE分析，揭示了COX6B2空细胞中复合 物IV的积累情况，表明COX6B2有助于复杂IV组装后期的复杂组装。值得注意的是， 与对照细胞相比，在缺少COX6B2的293细胞中，所有包含复合物IV的超复合物，包 括复合物I+III+IV，复合物III+IV以及复合物IV的二聚形式都减少了。
综上所述，上述发现表明COX6B2促进了单体复合物IV的组装，而COX6B2的 减少导致了所有包含超复合物的复合物IV的组装不良。
3)通过测量线粒体呼吸来评估OXPHOS的线粒体功能，发现COX6B2 KD PDAC 细胞表现出减少的内源性线粒体呼吸(图4A-C)。此外，受COX6B2抑制的细胞和线 粒体来源的ATP产量均低于对照细胞(图4D和E)，而受COX6B2抑制的胰腺癌细胞 的COX6B2过量表达恢复了ATP的产生(图4F)。因此，与对照细胞相比，在COX6B2 KD PDAC细胞中检测到线粒体膜电位(MMP)降低，而在COX6B2 KD细胞中恢复 COX6B2表达则恢复了MMP(图4G)。值得注意的是，转录组分析显示，在带有COX6B2 的对照8988细胞和8988细胞之间，线粒体转录产物和线粒体生物能量学标记(包括 RXRA，PGC1α和NRF2)没有差异，表明COX6B2调节OXPHOS的功能而不影响线 粒体生物发生的调控机制。
4)据报道，线粒体呼吸障碍是通过诱导Warburg效应成为癌症发展的关键驱动力，这与本发明对PDAC细胞中COX6B2抑制的发现相反。虽然敲低COX6B2会导致线粒 体呼吸下调，但是在COX6B2 KD细胞中未观察到增强的Warburg效应，而通过抑制 COX6B2既未改变细胞也未改变肿瘤生长(图2A-E)，这一事实进一步得到证实，即细 胞外酸化率(ECAR)在具有COX6B2的KD的胰腺癌细胞中未发生变化。
此外，COX6B2 KD细胞的基因集富集分析(GSEA)未显示任何与代谢过程相关 的转录改变的显着富集，包括糖酵解和戊糖磷酸途径。同时，尽管具有不同表达水平的 COX6B2的胰腺癌细胞显示出不同的代谢特征，但代谢谱分析进一步表明，糖酵解和 脂质水平(图4H)都更可能被抑制而不是通过抑制OXPHOS复合物增强COX6B2 KD 细胞。此外，与对照细胞相比，在COX6B2抑制的胰腺癌细胞中，分别有14和6个嘧 啶和嘌呤代谢物被下调和上调，这表明至少合成代谢特征在COX6B2 KD细胞中是不 利的。同时，与对照细胞相比，大多数氨基酸代谢产物在COX6B2 KD癌细胞中被下 调。其中，天冬氨酸(一种对细胞生长至关重要的氨基酸)下调了40％。此外，COX6B2 癌细胞中柠檬酸循环(TCA)的抑制，也可能导致氨基酸水平降低。总体而言，上 述结果进一步表明，PDAC中高水平的COX6B2更有可能促进PDAC细胞的转移能力， 而对癌细胞的生长和肿瘤形成的影响很小。
5)为了研究COX6B2是否通过抑制OXPHOS活性促进了PDAC细胞的转移，分 别使用鱼藤酮和NaN3(OXPHOS复合物I和复合物IV的抑制剂)抑制了OXPHOS复 合物的功能。伤口愈合(图5A)和跨孔测定(图5B)均表明，OXPHOS的抑制导致 对PDAC细胞的侵袭和迁移能力的抑制。从机制上讲，线粒体OXPHOS功能的调节可 导致线粒体-核逆向信号介导物水平的变化介导的线粒体-核串扰改变，例如钙，活性氧 (ROS)，和AMP。尽管发现所有3种COX6B2 KDPDAC癌细胞系均显示出改变的线 粒体信号，包括ROS和AMP水平升高以及线粒体钙超载，出乎意料的是，消除ROS 和抑制AMP激活的蛋白激酶(AMPK)途径并没有增加，反而降低了PDAC细胞的转 移潜能。因此，可以推断出COX6B2调控PDAC细胞的转移和OXPHOS的功能，复 合物可能不是由经典的线粒体到核信号传导途径介导的。
6)伤口愈合(图5C)和跨孔测定(图5D)均显示COX6B2 KD PDAC细胞中的 外源ATP补充恢复了细胞的迁移能力。与迁移分析一致，COX6B2 KD PDAC细胞的 F-肌动蛋白水平低于补充ATP的细胞(图5E)。该结果表明，COX6B2可通过增加 OXPHOS支持癌细胞转移的功能来增强线粒体ATP的产生。值得注意的是，腺苷三磷 酸双磷酸酶对COX6B2 KD 8988细胞的迁移能力几乎没有影响(图5F)。类似地，补 充双磷酸腺苷三磷酸酶可降低对照胰腺癌细胞中的F-肌动蛋白水平，而COX6B2 KD 细胞则不受影响(图5G)。总的来说，上述结果表明COX6B2抑制减少了OXPHOS衍 生的ATP生成，以通过嘌呤能受体途径抑制PDAC细胞的转移。
7)用二甲双胍处理的PDAC细胞的转录分析表明，在所有核编码的OXPHOS基 因中，COX6B2表达的变化位居首位(图6A和B)。此外，通过在PANC-1细胞中用 α-amanitin抑制RNA转录，发现在含有二甲双胍的细胞中，COX6B2 mRNA的降解要 比对照细胞快(图6C)。该结果表明二甲双胍通过促进COX6B2 mRNA的降解来抑制 COX6B2的表达。相似的结果表明，用二甲双胍处理的Panc-1和Patu-8988细胞均以 时间依赖性方式显示出降低的COX6B2水平(图6D和E)。BN-PAGE分析显示，二甲 双胍处理的Panc-1和Patu-8988细胞比未处理的细胞表现出更低的多重OXPHOS复合 物水平(图6F和G)。此外，还发现用4mM二甲双胍处理Patu-8988细胞3天足以导 致COX6B2水平显着降低，并显着抑制其迁移能力(图6H)，而细胞复制仍然不受影 响(图6H，6I)。
结果表明，二甲双胍可以通过抑制COX6B2的表达来模拟COX6B2敲低对PDAC 细胞的作用。因此，二甲双胍可能在靶向高COX6B2癌细胞的治疗方法中成为有吸引 力的药物。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做 出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagccctgc gagtactatt t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccttcgagt tccttgtttc c 21

Claims (7)

1.一种二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，二甲双胍通过线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平，导致PDAC能量代谢减弱，进而抑制PDCA细胞的侵袭和迁移；所述胰腺癌选自胰腺癌细胞系SW1990。
2.如权利要求1所述的二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，通过构建不同的PDAC细胞模型，在二甲双胍作用下检测线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平。
3.如权利要求2所述的二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，所述PDAC细胞模型的构建方法，具体包括以下步骤：
步骤1：利用COX6B2 shRNA序列，如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，合成目的DNA；
步骤2：将目的DNA***包装质粒pLKO.1-puro后，共转染到HEK 293T细胞中，构建慢病毒质粒；
步骤3：将所得慢病毒质粒分别转染不同的胰腺癌细胞，经培养，筛选稳定表达的COX6B2细胞，以获取COX6B2蛋白敲低的不同PDAC细胞模型。
4.如权利要求3所述的二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，步骤3中所述胰腺癌细胞为SW1900。
5.如权利要求3所述的二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，步骤3中用含有嘌呤霉素或潮霉素的LB培养基进行培养。
6.如权利要求1所述的二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，所述线粒体氧化磷酸化水平的评价指标包括细胞氧化呼吸能力、细胞OCR/ECAR水平、线粒体膜电位水平、ATP生成能力以及ROS水平。
7.如权利要求1所述的二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，所述能量代谢的评价指标包括PDAC细胞中的ATP和ADP能量水平。
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