CN111419822B - 一种丁酸钙微胶囊及其制备方法和应用 - Google Patents
一种丁酸钙微胶囊及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种丁酸钙微胶囊及其制备方法和应用,涉及微胶囊技术领域;以丁酸钠发酵过程中的菌体作为囊材,在丁酸梭菌发酵结束后,对菌体进行破壁,使丁酸再次吸附进入细胞内,通过菌体对丁酸的重新包埋,避免丁酸脂臭味的挥发。本发明所述丁酸钙微胶囊制备工艺简单,不添加额外的化学试剂,基本不需要引入有毒有害化学试剂,没有溶剂残留的危险;利用自身的菌体作为囊材掩味效果更佳,而且一定程度上能够实现药物缓慢释放;菌体中的菌体蛋白、糖类、维生素以及营养因子等可以作为动物利用的营养成分。
Description
技术领域
本发明属于微胶囊技术领域,具体涉及一种丁酸钙微胶囊及其制备方法和应用。
背景技术
丁酸梭菌是1933年由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告的,因此又名宫入菌,分类归属于梭菌属,为革兰氏阳性厌氧杆菌。1935年,俄罗斯微生物研究所Kingimiyairi博士从人的粪便和土壤中分离出丁酸梭菌,随后发现其厌氧培养的过滤物中含有较少的脂肪酸,具有极强的整肠作用,它可抑制肠道中的致病菌,促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长,1992年黑龙江省科学院微生物研究所在俄罗斯微生物研究所引进丁酸梭菌,并在中国定植,为中国微生物有益菌起到重大贡献。
丁酸梭菌的主要代谢产物为丁酸,通过丁酸梭菌工业化发酵培养可以获得丁酸盐产品。丁酸盐在我国是允许使用的饲料添加剂品种之一,于2006年被农业部列入《饲料添加剂品种目录》。在动物生产上的应用方式主要是在动物饲料中添加丁酸盐产品,起到肠黏膜营养剂、电解质平衡调节剂、胃肠道微生态调节剂、复合酸化剂、香味剂、诱食剂等作用。
正常情况下,丁酸钠具有浓烈的脂臭味。在正产的生产过程中,浓烈的脂臭味给生产工业以及生产环境造成了很大的干扰,而且添加进饲料之后,饲料厂在加工过程中仍然散发出脂臭味,不管是生产厂家还是使用厂家都经受着强大的环保压力。
微胶囊技术是利用天然高分子材料(明胶、***胶、虫胶、紫胶、淀粉、糊精、蜡、松脂、海藻酸钠、壳聚糖等)或者半/全合成高分子材料(羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丁二烯等)作为囊材将药物包埋起来形成的一种毫米级到微米级的制剂产品。通过微胶囊技术将药物包埋可以掩盖药物的难闻气味,但是传统的微胶囊技术需要额外使用多种化学试剂,造成产品化学试剂残留,而且工艺复杂、掩味效果不佳。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种丁酸钙微胶囊及其制备方法和应用,工艺简单,无需额外添加化学试剂,且掩味效果佳。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种丁酸钙微胶囊的制备方法,包括以下步骤:(1)将丁酸梭菌接种到种子培养基中进行培养,收集培养液中的菌体,清洗后得菌泥;
(2)向所述菌泥中加入NaCl溶液和蛋白酶K,在55~60℃搅拌1~3h后进行破壁处理,收集破壁后的菌体沉淀,冷冻干燥得丁酸梭菌细胞囊材;
(3)将丁酸与Ca(OH)2反应生成丁酸钙溶液,将所述丁酸钙溶液与蛋白酶K混合后破壁,得破壁液;
(4)将所述破壁液与步骤(2)得到的丁酸梭菌细胞囊材混合后搅拌,干燥得丁酸钙微胶囊;
步骤(1)、(2)和(3)之间不存在时间上的先后顺序。
优选的,步骤(1)所述培养包括两级放大培养,其中一级放大培养的培养基包括以下质量百分含量的成分:葡萄糖2%、酵母膏1%、金枪鱼膏1%、蛋白胨1%、可溶性淀粉0.5%、氯化钠0.5%、甘油0.05%和余量的水;
二级放大培养的培养基包括以下质量百分含量的成分:葡萄糖2.5%、玉米浆2.0%、酵母抽提物3.5%、牛肉膏1%、硫酸铵0.2%、菌体蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.2%、氯化钙0.2%、氯化铵0.1%、硫酸镁0.07%、硫酸锰0.02%和余量的水。
优选的,步骤(2)所述菌泥与所述NaCl溶液的体积比为1:20~30;所述NaCl溶液中NaCl的质量百分含量为3~5%;
所述菌泥与蛋白酶K的体积比为1:10-4~10-3,所述蛋白酶K的酶活为40U/mg。
优选的,步骤(3)Ca(OH)2为经高速剪切后的悬浮乳浊液;所述悬浮乳浊液中Ca(OH)2的质量百分含量为20%;
步骤(3)所述反应时丁酸与所述悬浮乳浊液的体积比为1:10~30;
所述丁酸钙溶液与蛋白酶K的体积比为1:10-3~10-2。
优选的,所述丁酸包括利用丁酸梭菌厌氧发酵后得到的丁酸;所述厌氧发酵所用的发酵培养基中包括以下质量百分含量的成分:葡萄糖3%、玉米浸渍液干粉2.5%、花生饼粉3.5%、黄豆饼粉1.5%、硫酸铵0.2%、菌体蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.2%、氯化钙0.2%、氯化铵0.1%、硫酸镁0.07%、硫酸锰0.02%、消泡剂0.05%和余量的水
优选的,步骤(4)所述搅拌的时间为2~3h。
优选的,步骤(4)所述干燥包括喷雾干燥,所述喷雾干燥时塔进风温度为170~270℃,出风温度为70~170℃。
本发明还提供了一种丁酸钙微胶囊,所述丁酸钙微胶囊的囊材为丁酸梭菌的菌体,所述囊材与丁酸钙的质量比为5~60:40~95。
本发明还提供了所述丁酸钙微胶囊在制备掩味饲料添加剂中的应用。
本发明还提供了所述丁酸钙微胶囊在制备缓释药物中的应用。
本发明提供了一种丁酸钙微胶囊的制备方法,在丁酸梭菌发酵结束后,通过对菌体破壁处理,使丁酸再次吸附进入细胞内,通过菌体对丁酸的重新包埋,避免丁酸脂臭味的挥发。本发明以丁酸钠发酵过程中的菌体作为囊材,并非传统的高分子材料,工艺简单,不用添加额外的化学试剂,基本不需要引入有毒有害化学试剂,没有溶剂残留的危险;利用自身的菌体作为囊材掩味效果更佳,而且一定程度上能够实现药物缓慢释放;菌体中的菌体蛋白、糖类、维生素以及营养因子等可以作为动物利用的营养成分。
丁酸梭菌本身作为天然材料,相比传统合成的水溶性材料,柔韧度,韧性与稳定性更强,制成的丁酸梭菌微胶囊既保留了药物的功能等特性,也具有丁酸梭菌本身的丰富营养物质,且该丁酸钙的丁酸梭菌微胶囊无毒性,生物相容性高,在水中分散性优良,能够实现药物缓慢释放,药物生物活性稳定;微胶囊的大小均在几十微米级,冻干后成粉末状,方便应用,易保存;制取条件温和、制取设备简单、操作方便,基本不需要引入有毒有害化学试剂,没有溶剂残留的危险,非常适合药物和食品添加剂的包埋。
具体实施方式
本发明提供了一种丁酸钙微胶囊的制备方法,包括以下步骤:(1)将丁酸梭菌接种到种子培养基中进行培养,收集培养液中的菌体,清洗后得菌泥;
(2)向所述菌泥中加入NaCl溶液和蛋白酶K,在55~60℃搅拌1~3h后进行破壁处理,收集破壁后的菌体沉淀,冷冻干燥得丁酸梭菌细胞囊材;
(3)将丁酸与Ca(OH)2反应生成丁酸钙溶液,将所述丁酸钙溶液与蛋白酶K混合后破壁,得破壁液;
(4)将所述破壁液与步骤(2)得到的丁酸梭菌细胞囊材混合搅拌,干燥得丁酸钙微胶囊;
步骤(1)、(2)和(3)之间不存在时间上的先后顺序。
本发明将丁酸梭菌接种到种子培养基中进行培养,收集培养液中的菌体,清洗后得菌泥。本发明所述培养优选包括两级放大培养,其中一级放大培养的培养基优选包括以下质量百分含量的成分:葡萄糖2%、酵母膏1%、金枪鱼膏1%、蛋白胨1%、可溶性淀粉0.5%、氯化钠0.5%、甘油0.05%和余量的水;其中二级放大培养的培养基优选包括以下质量百分含量的成分:葡萄糖2.5%、玉米浆2.0%、酵母抽提物3.5%、牛肉膏1%、硫酸铵0.2%、菌体蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.2%、氯化钙0.2%、氯化铵0.1%、硫酸镁0.07%、硫酸锰0.02%和余量的水。本发明对所述可溶性淀粉的来源并没有特殊限定,利用本领域的常规可溶性淀粉即可。本发明对所述接种以及放大培养的方案并没有特殊限定,利用本领域的常规方案即可。本发明优选对培养液进行离心、絮凝或者膜过滤,得到所述菌体,所述离心优选为在6000rpm的转速下离心15min,所述絮凝优选包括利用质量百分含量为0.15%的聚丙烯酰胺进行絮凝,所述膜过滤优选包括利用50nm的陶瓷膜进行低压(0.1MP)过滤。本发明清洗所述菌体,得所述菌泥,所述清洗的方法优选包括陶瓷膜低压过滤清洗,清洗用水量根据实际过滤情况酌情添加,所述陶瓷膜优选包括50nm陶瓷膜。
得菌泥后,本发明向所述菌泥中加入NaCl溶液和蛋白酶K,在55~60℃搅拌1~3h后进行破壁处理,收集破壁后的菌体沉淀,冷冻干燥得丁酸梭菌细胞囊材。本发明向所述菌泥中加入NaCl溶液和蛋白酶K时,优选的首先加入所述NaCl溶液,然后调节pH值至6.0,最后加入所述蛋白酶K。本发明所述菌泥与所述NaCl溶液的体积比优选为1:20~30。本发明所述NaCl溶液中NaCl的质量百分含量优选为3~5%。本发明所述菌泥与蛋白酶K的体积比优选为1:10-4~10-3,所述蛋白酶K的酶活优选为40U/mg。本发明对所述NaCl溶液和蛋白酶K的来源并没有特殊限定,利用本领域的常规市售产品即可。本发明优选对经过破壁处理后的液体冷却至室温后,再经过离心和3次水洗,收集菌体沉淀。本发明优选在50L玻璃反应釜中进行所述破壁处理,所述破壁处理时,优选设置温度为37℃,转速200rpm,常压搅拌60min。本发明所述离心的转速优选为6000r/min,时间优选为15min。本发明收集破壁后的菌体沉淀进行冷冻干燥,所述冷冻干燥优选为真空冷冻干燥,所述真空冷冻干燥的温度优选为-50℃,真空度优选为-0.1MP,干燥时间优选为1.5h。
本发明将丁酸与Ca(OH)2溶液混合,进行中和反应生成丁酸钙溶液,将所述丁酸钙溶液与蛋白酶K混合后破壁,得破壁液。本发明所述丁酸优选为利用丁酸梭菌厌氧发酵后得到的丁酸,本发明对丁酸梭菌厌氧发酵生产得到丁酸的方法并没有特殊限定,优选包括将丁酸梭菌接种到所述种子培养基中进行培养,得种子液,对所述种子液进行厌氧发酵,得丁酸。本发明所述培养的方法优选与步骤(1)相同,在此不再赘述。本发明优选将所述种子液接种至发酵培养基中进行所述厌氧发酵,所述发酵培养基中优选包括以下质量百分含量的成分:葡萄糖3%、玉米浸渍液干粉2.5%、花生饼粉3.5%、黄豆饼粉1.5%、硫酸铵0.2%、菌体蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.2%、氯化钙0.2%、氯化铵0.1%、硫酸镁0.07%、硫酸锰0.02%、消泡剂0.05%和余量的水。本发明所述厌氧发酵的时间优选为45h,温度优选为37℃。本发明对所述消泡剂的种类和来源并没有特殊限定,优选为本领域的常规市售消泡剂,在本发明实施例中使用泡敌作为消泡剂。
本发明利用丁酸与Ca(OH)2发生中和反应,从而生成丁酸钙,所述Ca(OH)2优选为经高速剪切后的悬浮乳浊液;所述悬浮乳浊液中Ca(OH)2的质量百分含量为20%。本发明进行所述中和反应时,所述丁酸与所述悬浮乳浊液的体积比优选为1:10~30。本发明得所述丁酸钙溶液后,与蛋白酶K混合后破壁,所述丁酸钙溶液与蛋白酶K的体积比优选为1:10-3~10-2,所述蛋白酶K的酶活优选为40U/mg。本发明所述破壁优选为混合后搅拌处理1~3h,所述搅拌时的温度优选为55~60℃。
得破壁液后,本发明将所述破壁液与步骤(2)得到的丁酸梭菌细胞囊材混合后搅拌,干燥得丁酸钙微胶囊。本发明在所述混合后,优选还包括调节pH至5.5~8.0,利用丁酸梭菌细胞囊材吸附破壁液中的丁酸钙,边吸附边搅拌2~3h。本发明所述干燥优选为喷雾干燥,所述喷雾干燥时塔进风温度优选为170~270℃,出风温度优选为70~170℃。
本发明提供了一种丁酸钙微胶囊,所述丁酸钙微胶囊的囊材为丁酸梭菌的菌体,所述囊材与丁酸钙的质量比为5~60:40~95。本发明所述丁酸钙微胶囊中,所述囊材与丁酸钙的质量比优选为45~55:65~75。本发明所述丁酸钙微胶囊的粒径优选为6μm。
本发明还提供了所述丁酸钙微胶囊在制备掩味饲料添加剂中的应用。本发明利用自身的菌体作为囊材掩味效果更佳。本发明将所述丁酸钙微胶囊作为掩味饲料添加剂时,优选的根据动物种类不同,在不同阶段添加不同量的所述掩味饲料添加剂,更优选为500~1000g/吨。
本发明还提供了所述丁酸钙微胶囊在制备缓释药物中的应用。本发明所述丁酸钙微胶囊一定程度上能够实现药物缓慢释放,可将其应用于制备缓释药物。本发明利用所述丁酸钙微胶囊制备缓释药物时,将所述丁酸钙微胶囊作为缓释骨架材料,添加量优选为5~10%(质量百分含量)。
下面结合实施例对本发明提供的丁酸钙微胶囊及其制备方法和应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
第一步,将丁酸梭菌接种到种子培养基中进行逐级放大培养,获得的培养液离心后清洗,得到菌泥;
其中,一级培养基组成成分(重量百分比):葡萄糖2%,酵母膏1%,金枪鱼膏1%,蛋白胨1%,可溶性淀粉0.5%,氯化钠0.5%,甘油0.05%,余量为水。二级培养基组成成分(重量百分比):葡萄糖2.5%,玉米浆2.0%,酵母抽提物3.5%,牛肉膏1%,硫酸铵0.2%,菌体蛋白0.5%,磷酸二氢钾0.2%,氯化钙0.2%,氯化铵0.1%,硫酸镁0.07%,硫酸锰0.02%,余量为水。
第二步,在制备的菌泥加入NaCl溶液,调至pH6.0,同时加入蛋白酶K,于55℃搅拌3h进行破壁处理;破壁后的菌体冷却至室温,离心,水洗3次,收集菌体沉淀,冷冻干燥得到丁酸梭菌细胞囊材备用;
其中,NaCl溶液的浓度为5%,加入比例为1:24;蛋白酶K的加入比例为1:10-3(V/V),蛋白酶的酶活为40U/mg;
第三步,将丁酸梭菌接种到种子培养基中进行逐级放大培养,制备种子液;
第四步,将种子液接种发酵培养基进行厌氧发酵生成丁酸;
其中,发酵培养基组成成分(重量百分比):葡萄糖3%,玉米浸渍液干粉2.5%,花生饼粉3.5%,黄豆饼粉1.5%,硫酸铵0.2%,菌体蛋白0.5%,,磷酸二氢钾0.2%,氯化钙0.2%,氯化铵0.1%,硫酸镁0.07%,硫酸锰0.02%,消泡剂0.05%,余量为水。
第五步,向发酵产物中按1:20加入20%的Ca(OH)2进行中和反应生成丁酸钙;
第六步,向步骤五丁酸钙中加入蛋白酶K,于55℃搅拌3h进行丁酸梭菌破壁处理,破壁结束后,加入步骤2中准备好的丁酸梭菌细胞囊材,调节pH为7.0,利用丁酸梭菌细胞囊材吸附破壁液中的丁酸钙,边吸附边搅拌3h。
其中,蛋白酶K的加入比例为1:10-2(V/V),蛋白酶的酶活为40U/mg;
第七步,对步骤六得到的溶液进行喷雾干燥,即得含35%发酵丁酸梭菌和65%丁酸钙微胶囊。
其中,喷雾干燥塔进风温度180℃~220℃、出风温度70℃~90℃。
对制备得到的丁酸钙微胶囊进行掩味效果测定:取等量的本方案产品(A样)和市售普通丁酸钙产品(B样)分别置于密闭的容器内(样品装量量不少于容器的2/3),按此制备10份待测样品。选择10名健康志愿者,每名志愿者随机挑选一份待测样,测试每名志愿者对产品的测试感受,通过剧臭、臭、微臭、无臭作为评价指标来评价掩味效果。本发明所述产品主要表现为微臭(40%)和无臭(60%),市售普通产品表现为剧臭(60%)、臭(30%)、微臭(10%)。
按中华人民共和国药典2005年版二部附录XC第一法,对制备得到的丁酸钙微胶囊进行释放度测定。本发明所制得的产品2h内人工胃液释放量约为5.0%;在人工肠液中2h内释放量为30%左右,而12h内释放量达86%,且人工肠液中4h释放量约为40%~45%,达到肠溶缓释的效果,体外释放特性良好在此条件下所制得的产品能够达到中国药典关于缓释制剂的质量要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种丁酸钙微胶囊的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将丁酸梭菌接种到种子培养基中进行培养,收集培养液中的菌体,清洗后得菌泥;
(2)向所述菌泥中加入NaCl溶液和蛋白酶K,在55~60℃搅拌1~3h后进行破壁处理,收集破壁后的菌体沉淀,冷冻干燥得丁酸梭菌细胞囊材;所述菌泥与所述NaCl溶液的体积比为1:20~30;所述NaCl溶液中NaCl的质量百分含量为3~5%;
所述菌泥与蛋白酶K的体积比为1:10-4~10-3,所述蛋白酶K的酶活为40U/mg;
(3)将利用丁酸梭菌厌氧发酵后得到的丁酸与Ca(OH)2反应后生成丁酸钙溶液,将所述丁酸钙溶液与蛋白酶K混合后破壁,得破壁液;所述破壁为将所述丁酸钙溶液与蛋白酶K混合后搅拌处理1~3h,所述搅拌时的温度为55~60℃;
所述Ca(OH)2为经高速剪切后的悬浮乳浊液;所述悬浮乳浊液中Ca(OH)2的质量百分含量为20%;
步骤(3)反应时丁酸与所述悬浮乳浊液的体积比为1:10~30;
所述丁酸钙溶液与蛋白酶K的体积比为1:10-3~10-2;
(4)将所述破壁液与步骤(2)得到的丁酸梭菌细胞囊材混合后搅拌,干燥得丁酸钙微胶囊;
步骤(1)和(3)之间不存在时间上的先后顺序。
2.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,步骤(1)所述培养包括两级放大培养,其中一级放大培养的培养基包括以下质量百分含量的成分:葡萄糖2%、酵母膏1%、金枪鱼膏1%、蛋白胨1%、可溶性淀粉0.5%、氯化钠0.5%、甘油0.05%和余量的水;
二级放大培养的培养基包括以下质量百分含量的成分:葡萄糖 2.5%、玉米浆2.0%、酵母抽提物3.5%、牛肉膏1%、硫酸铵0.2%、菌体蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.2%、氯化钙0.2%、氯化铵0.1%、硫酸镁0.07%、硫酸锰0.02%和余量的水。
3.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,所述丁酸包括利用丁酸梭菌厌氧发酵后得到的丁酸;所述厌氧发酵所用的发酵培养基中包括以下质量百分含量的成分:葡萄糖3%、玉米浸渍液干粉2.5%、花生饼粉3.5%、黄豆饼粉1.5%、硫酸铵0.2%、菌体蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.2%、氯化钙0.2%、氯化铵0.1%、硫酸镁0.07%、硫酸锰0.02%、消泡剂0.05%和余量的水。
4.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,步骤(4)所述搅拌的时间为2~3h。
5.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,步骤(4)所述干燥包括喷雾干燥,所述喷雾干燥时塔进风温度为170~270℃,出风温度为70~170℃。
6.一种丁酸钙微胶囊,其特征在于,所述丁酸钙微胶囊的囊材为丁酸梭菌的菌体,所述囊材与丁酸钙的质量比为5~60:40~95。
7.权利要求6所述丁酸钙微胶囊在制备掩味饲料添加剂中的应用。
8.权利要求6所述丁酸钙微胶囊在制备缓释药物中的应用。
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- 2020-04-26 CN CN202010338469.1A patent/CN111419822B/zh active Active
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