CN111410688A - 一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,包括以下步骤:分别配置澄清过滤平衡缓冲液、EDTA‑2Na母液;串联压力表,采用硅胶管将MD0HC过滤器、MX0HC过滤器以及0.22μm除菌过滤器依次连接;分别采用注射用水和澄清过滤缓冲液依次清洗MD0HC过滤器、冲洗MX0HC过滤器;将转染表达的双特异性抗体在生物反应器中进行培养,培养结束后将生物反应器的温度调整为20±5℃,向培养上清液加入EDTA‑2Na母液;将上述培养上清液过滤,滤液收集至收集容器;过滤时同时向培养上清液、滤液中通入氧气;最后对滤液进行蛋白纯度进行检测。该方法操作简单,在过滤收集过程中双特异性抗体稳定性好,可有效减少轻链与重链结合的二硫键被破坏,从而获得纯度更高的双特异性抗体。
Description
技术领域:
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法。
背景技术:
双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体,能在靶细胞和功能分子之间架起桥梁应,激发具有导向性的免疫反应,是基因工程抗体的一种,现已成为抗体工程领域的热点,在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。
双特异性抗体目前多采用中华仓鼠卵巢细胞进行表达和大规模培养制备,采取的收获方法基本是培养结束时,使用澄清过滤膜包进行澄清收获,并将澄清收集液储存在密闭容器中。常规过滤收获方法在操作时,由于双特异性抗体处于暂停通气状态,游离在反应器以及过滤液中的酶容易发挥还原作用。而且由于双特异性抗体分子结构不稳定,容易被还原而产生碎片,因此,该方法会导致双特异性抗体中的二硫键被还原,抗体上的轻链掉落,从而产生抗体碎片,导致目标产品纯度降低。
发明内容:
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,该方法操作简单,在过滤收集过程中双特异性抗体稳定性好,可有效减少轻链与重链结合的二硫键被破坏,从而获得纯度更高的双特异性抗体。
为更好的解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,包括以下步骤:
(1)分别配置澄清过滤平衡缓冲液、EDTA-2Na母液;
(2)串联压力表,采用硅胶管将MD0HC过滤器、MX0HC过滤器以及0.22μm除菌过滤器依次连接;调整蠕动泵,首次采用注射用水清洗MD0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2,采用注射用水冲洗MX0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2;调整蠕动泵,用澄清过滤缓冲液分别对MD0HC过滤器、MX0HC过滤器进行冲洗,澄清过滤缓冲液的用量为过滤器体积的1~2倍;
(3)将转染表达的双特异性抗体在生物反应器中进行培养,培养结束后将生物反应器的温度调整为20±5℃,保持生物反应器的通气和搅拌参数设置不变,向生物反应器中的培养上清液加入EDTA-2Na母液;
(4)调整蠕动泵,调整通量≤100L/m2·h,将上述培养上清液过滤,过滤压力≤1.5bar;滤液收集至收集容器;在过滤过程中保持向生物反应器的培养上清液中通入氧气,也同时向收集容器中通入氧气;最后对滤液进行蛋白纯度进行检测。
作为上述技术方案的优选,步骤(1)中,所述澄清过滤平衡缓冲液包括20mmol/LTris、150mmol/L氯化钠,其pH为7.2。
作为上述技术方案的优选,步骤(1)中,所述EDTA-2Na母液包括20mmol/LTris,150mmol/L氯化钠,10.0g/L EDTA-2Na,其pH为7.2。
作为上述技术方案的优选,步骤(2)中,采用注射用水清洗MD0HC过滤器和MX0HC过滤器时的通量为100~600L/m2·h。
作为上述技术方案的优选,步骤(2)中,采用澄清过滤缓冲液冲洗过滤器时的通量为100~600L/m2·h。
作为上述技术方案的优选,步骤(3)中,向生物反应器中的培养上清液加入EDTA-2Na母液,调整培养上清液中EDTA的浓度为0.01~0.3g/L。
作为上述技术方案的优选,步骤(4)中,培养上清液中通氧时,氧气的通气量为0.2~0.4ml/min·L。
作为上述技术方案的优选,步骤(4)中,收集容器中通氧时,氧气的通气量为0.01~0.5ml/min·L。
由于采用上述技术方案,本发明具有以下有益效果:
一方面,本发明在培养结束后对生物反应器进行降温,并向生物反应器重大额培养上清液中加入一定量的加入EDTA;EDTA能螯合溶液中的金属离子,从而通过降温和减少金属离子来降低溶液环境中酶活性,从而降低双特异性抗体被酶降解的几率。
另一方面,在对培养上清液过滤时,本发明同时向培养上清液以及滤液中进行通入氧气并搅拌,可以提供细胞培养溶液的氧化环境,避免二硫键被还原,有效提高了双特异性抗体的稳定性;能够显著改善双特异性抗体在过滤分离时的纯度,减少抗体蛋白片段的产生。
具体实施方式:
下面通过实施例对本发明进一步说明,实施例只用于解释本发明,不会对本发明构成任何的限定。
实施例1
一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,包括以下步骤:
(1)分别配置澄清过滤平衡缓冲液、EDTA-2Na母液;所述澄清过滤平衡缓冲液包括20mmol/L Tris、150mmol/L氯化钠,其pH为7.2;所述EDTA-2Na母液包括20mmol/L Tris,150mmol/L氯化钠,10.0g/L EDTA-2Na,其pH为7.2;
(2)串联压力表,采用硅胶管将MD0HC过滤器、MX0HC过滤器以及0.22μm除菌过滤器依次连接;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,首次采用注射用水清洗MD0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2,采用注射用水冲洗MX0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,用澄清过滤缓冲液分别对MD0HC过滤器、MX0HC过滤器进行冲洗,澄清过滤缓冲液的用量为过滤器体积的1~2倍;
(3)将转染表达的双特异性抗体在生物反应器中进行培养,培养结束后将生物反应器的温度调整为20℃,保持生物反应器的通气和搅拌参数设置不变,向生物反应器中的培养上清液加入EDTA-2Na母液,调整培养上清液中EDTA的浓度为0.1g/L;
(4)调整蠕动泵,调整通量≤100L/m2·h,将上述培养上清液过滤,过滤压力≤1.5bar;滤液收集至收集容器;过滤过程中生物反应器仍然保持通氧和搅拌,直至生物反应器内溶液没法没过搅拌桨时,停止搅拌;氧气的通气量为0.3ml/min·L;同时收集容器中也通入氧气,氧气的通气量为0.3ml/min·L;最后对滤液进行蛋白纯度进行检测。
实施例2
一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,包括以下步骤:
(1)分别配置澄清过滤平衡缓冲液、EDTA-2Na母液;所述澄清过滤平衡缓冲液包括20mmol/L Tris、150mmol/L氯化钠,其pH为7.2;所述EDTA-2Na母液包括20mmol/L Tris,150mmol/L氯化钠,10.0g/L EDTA-2Na,其pH为7.2;
(2)串联压力表,采用硅胶管将MD0HC过滤器、MX0HC过滤器以及0.22μm除菌过滤器依次连接;调整蠕动泵,调整通量为300L/m2·h,首次采用注射用水清洗MD0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2,采用注射用水冲洗MX0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2;调整蠕动泵,调整通量为300L/m2·h,用澄清过滤缓冲液分别对MD0HC过滤器、MX0HC过滤器进行冲洗,澄清过滤缓冲液的用量为过滤器体积的1~2倍;
(3)将转染表达的双特异性抗体在生物反应器中进行培养,培养结束后将生物反应器的温度调整为20℃,保持生物反应器的通气和搅拌参数设置不变,向生物反应器中的培养上清液加入EDTA-2Na母液,调整培养上清液中EDTA的浓度为0.15g/L;
(4)调整蠕动泵,调整通量≤100L/m2·h,将上述培养上清液过滤,过滤压力≤1.5bar;滤液收集至收集容器;过滤过程中生物反应器仍然保持通氧和搅拌,直至生物反应器内溶液没法没过搅拌桨时,停止搅拌;氧气的通气量为0.2ml/min·L;同时收集容器中也通入氧气,氧气的通气量为0.2ml/min·L;最后对滤液进行蛋白纯度进行检测。
实施例3
一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,包括以下步骤:
(1)分别配置澄清过滤平衡缓冲液、EDTA-2Na母液;所述澄清过滤平衡缓冲液包括20mmol/L Tris、150mmol/L氯化钠,其pH为7.2;所述EDTA-2Na母液包括20mmol/L Tris,150mmol/L氯化钠,10.0g/L EDTA-2Na,其pH为7.2;
(2)串联压力表,采用硅胶管将MD0HC过滤器、MX0HC过滤器以及0.22μm除菌过滤器依次连接;调整蠕动泵,调整通量为500L/m2·h,首次采用注射用水清洗MD0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2,采用注射用水冲洗MX0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2;调整蠕动泵,调整通量为500L/m2·h,用澄清过滤缓冲液分别对MD0HC过滤器、MX0HC过滤器进行冲洗,澄清过滤缓冲液的用量为过滤器体积的1~2倍;
(3)将转染表达的双特异性抗体在生物反应器中进行培养,培养结束后将生物反应器的温度调整为20℃,保持生物反应器的通气和搅拌参数设置不变,向生物反应器中的培养上清液加入EDTA-2Na母液,调整培养上清液中EDTA的浓度为0.15g/L;
(4)调整蠕动泵,调整通量≤100L/m2·h,将上述培养上清液过滤,过滤压力≤1.5bar;滤液收集至收集容器;过滤过程中生物反应器仍然保持通氧和搅拌,直至生物反应器内溶液没法没过搅拌桨时,停止搅拌;氧气的通气量为0.25ml/min·L;同时收集容器中也通入氧气,氧气的通气量为0.25ml/min·L;最后对滤液进行蛋白纯度进行检测。
对比例1
一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,包括以下步骤:
(1)配置澄清过滤平衡缓冲液;所述澄清过滤平衡缓冲液包括20mmol/L Tris、150mmol/L氯化钠,其pH为7.2;
(2)串联压力表,采用硅胶管将MD0HC过滤器、MX0HC过滤器以及0.22μm除菌过滤器依次连接;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,首次采用注射用水清洗MD0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2,采用注射用水冲洗MX0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,用澄清过滤缓冲液分别对MD0HC过滤器、MX0HC过滤器进行冲洗,澄清过滤缓冲液的用量为过滤器体积的1~2倍;
(3)将转染表达的双特异性抗体在生物反应器中进行培养,培养结束后将生物反应器的温度调整为20℃,保持生物反应器搅拌参数设置不变;
(4)调整蠕动泵,调整通量≤100L/m2·h,将上述培养上清液过滤,过滤压力≤1.5bar;滤液收集至收集容器;最后对滤液进行蛋白纯度进行检测。
对比例2
一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,包括以下步骤:
(1)分别配置澄清过滤平衡缓冲液、EDTA-2Na母液;所述澄清过滤平衡缓冲液包括20mmol/L Tris、150mmol/L氯化钠,其pH为7.2;所述EDTA-2Na母液包括20mmol/L Tris,150mmol/L氯化钠,10.0g/L EDTA-2Na,其pH为7.2;
(2)串联压力表,采用硅胶管将MD0HC过滤器、MX0HC过滤器以及0.22μm除菌过滤器依次连接;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,首次采用注射用水清洗MD0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2,采用注射用水冲洗MX0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,用澄清过滤缓冲液分别对MD0HC过滤器、MX0HC过滤器进行冲洗,澄清过滤缓冲液的用量为过滤器体积的1~2倍;
(3)将转染表达的双特异性抗体在生物反应器中进行培养,培养结束后不降温;保持生物反应器的搅拌参数设置不变,向生物反应器中的培养上清液加入EDTA-2Na母液,调整培养上清液中EDTA的浓度为0.1g/L;
(4)调整蠕动泵,调整通量≤100L/m2·h,将上述培养上清液过滤,过滤压力≤1.5bar;滤液收集至收集容器;过滤过程中生物反应器保持搅拌,直至生物反应器内溶液没法没过搅拌桨时,停止搅拌;最后对滤液进行蛋白纯度进行检测。
对比例3
一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,包括以下步骤:
(1)分别配置澄清过滤平衡缓冲液、EDTA-2Na母液;所述澄清过滤平衡缓冲液包括20mmol/LTris、150mmol/L氯化钠,其pH为7.2;
(2)串联压力表,采用硅胶管将MD0HC过滤器、MX0HC过滤器以及0.22μm除菌过滤器依次连接;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,首次采用注射用水清洗MD0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2,采用注射用水冲洗MX0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,用澄清过滤缓冲液分别对MD0HC过滤器、MX0HC过滤器进行冲洗,澄清过滤缓冲液的用量为过滤器体积的1~2倍;
(3)将转染表达的双特异性抗体在生物反应器中进行培养,培养结束后不降温,保持生物反应器搅拌参数设置不变;
(4)调整蠕动泵,调整通量≤100L/m2·h,将上述培养上清液过滤,过滤压力≤1.5bar;滤液收集至收集容器;过滤过程中生物反应器仍然保持通氧和搅拌,直至生物反应器内溶液没法没过搅拌桨时,停止搅拌;氧气的通气量为0.3ml/min·L;最后对滤液进行蛋白纯度进行检测。
对比例4
一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,包括以下步骤:
(1)分别配置澄清过滤平衡缓冲液、EDTA-2Na母液;所述澄清过滤平衡缓冲液包括20mmol/LTris、150mmol/L氯化钠,其pH为7.2;
(2)串联压力表,采用硅胶管将MD0HC过滤器、MX0HC过滤器以及0.22μm除菌过滤器依次连接;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,首次采用注射用水清洗MD0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2,采用注射用水冲洗MX0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,用澄清过滤缓冲液分别对MD0HC过滤器、MX0HC过滤器进行冲洗,澄清过滤缓冲液的用量为过滤器体积的1~2倍;
(3)将转染表达的双特异性抗体在生物反应器中进行培养,培养结束后不降温,保持生物反应器的搅拌参数设置不变;
(4)调整蠕动泵,调整通量≤100L/m2·h,将上述培养上清液过滤,过滤压力≤1.5bar;滤液收集至收集容器;过滤过程中生物反应器仍然保持搅拌,直至生物反应器内溶液没法没过搅拌桨时,停止搅拌;过滤时向收集容器中通入氧气,氧气的通气量为0.3ml/min·L;最后对滤液进行蛋白纯度进行检测。
对比例5
一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,包括以下步骤:
(1)分别配置澄清过滤平衡缓冲液、EDTA-2Na母液;所述澄清过滤平衡缓冲液包括20mmol/LTris、150mmol/L氯化钠,其pH为7.2;
(2)串联压力表,采用硅胶管将MD0HC过滤器、MX0HC过滤器以及0.22μm除菌过滤器依次连接;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,首次采用注射用水清洗MD0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2,采用注射用水冲洗MX0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2;调整蠕动泵,调整通量为450L/m2·h,用澄清过滤缓冲液分别对MD0HC过滤器、MX0HC过滤器进行冲洗,澄清过滤缓冲液的用量为过滤器体积的1~2倍;
(3)将转染表达的双特异性抗体在生物反应器中进行培养,培养结束后将不降温,保持生物反应器的搅拌参数设置不变;
(4)调整蠕动泵,调整通量≤100L/m2·h,将上述培养上清液过滤,过滤压力≤1.5bar;滤液收集至收集容器;过滤过程中生物反应器仍然保持搅拌,直至生物反应器内溶液没法没过搅拌桨时,停止搅拌;最后对滤液进行蛋白纯度进行检测。
滤液蛋白纯度检测方法:
(1)配置液相流动相:所述液相流动相包括20mmol/L磷酸缓冲液、200mmol/LNaCl、200mmol/L精氨酸,pH 6.8
用超纯水冲洗过滤中所用管路及***至少30分钟,换上液相流动相后应充满相应的管路。接上色谱柱,调用仪器方法并核对色谱条件,流速:0.5ml/min;采集时间:30min;进样量:50μl;柱温:25℃;检测波长:280nm,计算主峰面积比例,即为蛋白纯度,蛋白纯度用来表征滤液中双特异性抗体的纯度。测试结果如表1所示:
表1
蛋白纯度,% | |
实施例1 | 95.8% |
实施例2 | 96.3% |
实施例3 | 96.2% |
对比例1 | 92.5% |
对比例2 | 92.9% |
对比例3 | 91.2% |
对比例4 | 91.6% |
对比例5 | 86.7% |
从表1测试结果可以看出,培养结束后对生物反应器进行降温,在对培养上清液进行过滤时,同时对培养上清液以及收集的滤液进行通入氧气,可有效提高双特异性抗体的纯度。
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述,但是本发明的许多其他形式和改变对本领域技术人员而言是显而易见的。应理解所附权利要求和本发明通常涵盖本发明真实精神和范围内的所有这些明显的形式和改变。
Claims (8)
1.一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)分别配置澄清过滤平衡缓冲液、EDTA-2Na母液;
(2)串联压力表,采用硅胶管将MD0HC过滤器、MX0HC过滤器以及0.22μm除菌过滤器依次连接;调整蠕动泵,首次采用注射用水清洗MD0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2,采用注射用水冲洗MX0HC过滤器,冲洗量≥100L/m2;调整蠕动泵,用澄清过滤缓冲液分别对MD0HC过滤器、MX0HC过滤器进行冲洗,澄清过滤缓冲液的用量为过滤器体积的1~2倍;
(3)将转染表达的双特异性抗体在生物反应器中进行培养,培养结束后将生物反应器的温度调整为20±5℃,保持生物反应器的通气和搅拌参数设置不变,向生物反应器中的培养上清液加入EDTA-2Na母液;
(4)调整蠕动泵,调整通量≤100L/m2·h,将上述培养上清液过滤,过滤压力≤1.5bar;滤液收集至收集容器;在过滤过程中保持向生物反应器的培养上清液中通入氧气,也同时向收集容器中通入氧气;最后对滤液进行蛋白纯度进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,其特征在于,步骤(1)中,所述澄清过滤平衡缓冲液包括20mmol/LTris、150mmol/L氯化钠,其pH为7.2。
3.根据权利要求1所述的一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,其特征在于,步骤(1)中,所述EDTA-2Na母液包括20mmol/LTris,150mmol/L氯化钠,10.0g/LEDTA-2Na,其pH为7.2。
4.根据权利要求1所述的一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,其特征在于,步骤(2)中,采用注射用水清洗MD0HC过滤器和MX0HC过滤器时的通量为100~600L/m2·h。
5.根据权利要求1所述的一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,其特征在于,步骤(2)中,采用澄清过滤缓冲液冲洗过滤器时的通量为100~600L/m2·h。
6.根据权利要求1所述的一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,其特征在于,步骤(3)中,向生物反应器中的培养上清液加入EDTA-2Na母液,调整培养上清液中EDTA的浓度为0.01~0.3g/L。
7.根据权利要求1所述的一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,其特征在于,步骤(4)中,培养上清液中通氧时,氧气的通气量为0.2~0.4ml/min·L。
8.根据权利要求1所述的一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法,其特征在于,步骤(4)中,收集容器中通氧时,氧气的通气量为0.01~0.5ml/min·L。
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