CN111410652A - 一种具有聚集诱导发光效应的线粒体靶向型近红外荧光探针的制备 - Google Patents

一种具有聚集诱导发光效应的线粒体靶向型近红外荧光探针的制备 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有聚集诱导发光效应的线粒体靶向近红外荧光探针的制备，该荧光探针由具有近红外激发及发射的半花菁部分与具有聚集诱导发光分子TPE部分构成。该探针在良性溶剂中有微弱的近红外荧光，且随着不良溶剂水的加入，荧光逐渐增强，显示明显的AIE效应；并且随着pH的增加，荧光也逐渐加强，显示出较强的pH依赖性。该探针制备简单，具有很好的光稳定性与生物相容性，在近红外区进行激发与发射，生物光损伤性小且背景干扰小，为开发具有聚集诱导发光的近红外荧光探针及应用开辟了一条新思路。

Description

一种具有聚集诱导发光效应的线粒体靶向型近红外荧光探针 的制备
技术领域
本发明属于荧光生物传感器技术领域，具体涉及一类具有聚集诱导发光效应的线粒体靶向型近红外荧光探针的制备。
背景技术
线粒体是细胞氧化磷酸化的场所，拥有自身的遗传物质和遗传体系，属于半自主细胞器。除为细胞供能外，还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等生命过程，并拥有调控细胞生长的能力。线粒体的形态变化及pH的变化与某些疾病相关,比如：帕金森氏病，阿尔茨海默氏病和癌症。因此，对线粒体的可视化对线粒体的研究及疾病的诊断至关重要。
生物光学成像由于检测仪器发展成熟、灵敏度高、对比度高、分辨率高、成像直观、成像速度快和无损检测等优点被广泛应用于医学生物研究。荧光成像(FluorescentImaging) 技术是生物医学领域研究的重要手段，可用于研究目标分子的所在位置及浓度等，且这种方法具有无损伤、高特异性和灵敏度，以及能在细胞水平获得更高的分辨率等优势。荧光探针分子由于其合成简单、灵敏度高、选择性好、响应时间短、可直接观察等优点，在分子、离子检测和细胞成像技术中得到广泛的研究和应用。而近红外（near-infrared,NIR）荧光染料标记技术由于较低的组织自发荧光和较强的组织穿透能力等特点,通过荧光染料标记可以对目标细胞进行实时、连续检测，在小动物活体成像方面具有广阔的应用前景,目前正逐步应用于细胞标记示踪研究。
传统小分子染料由于ACQ效应，光稳定性较差，光漂白性较强，不利于长程跟踪。2001年，唐本忠等人发现噻略衍生物这类化合物在溶液状态下不发光，但在聚集时发出强烈的荧光，这类现象称为聚集诱导发光（AIE）效应。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种具有聚集诱导发光特性的荧光探针，该探针能够定位于细胞线粒体，并在近红外区激发与发射，对细胞损伤小，背景干扰小。本发明提供了一种具有聚集诱导发光特性的线粒体靶向型近红外荧光探针，其结构式如附图1所示。
本发明的荧光探针由具有线粒体靶向和近红外特征的半花菁与聚集诱导发光分子构成，由于羟基及TPE的作用，随着碱性的增加，聚集效果及荧光越来越强。
本发明提供的荧光探针合成步骤见附图1。
本发明提供了的荧光探针的制备方法，包括步骤如下：
1)氮气保护下，以无水DMF为溶剂，IR-780与5-溴间二苯酚在三乙胺作用下，80°C反应4小时，制备得到中间产物mCy-Br。
2)氮气保护下，以THF/H2O为溶剂，mCy-Br与4-（1,2,2-三苯乙烯基）-苯硼酸频那醇酯在K2CO3作用下，回流反应24小时，制备得终产物荧光探针。
本发明还提供了所述荧光探针细胞线粒体定位中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的线粒体定位荧光探针具有如下特点：（1）具有AIE效应，有良好的光稳定性及抗光漂白性；（2）该探针在近红外区激发与发射，对细胞损伤小，背景干扰小；（3）该探针靶向线粒体，并可检测线粒体处的pH响应；（4）该探针可对线粒体长程跟踪。该探针的良好特性预示着其在线粒体研究方面有着巨大的应用价值。
附图说明
图1为本发明荧光探针的合成路线
图2为本发明的荧光探针在不同pH溶液下的紫外吸收图
图3为本发明的荧光探针在不同pH溶液下的荧光发射图，Ex=660nm
图4为本发明的荧光探针在pH 4溶液中不同的THF/PBS的荧光发射图，Ex=660nm
图5为本发明的荧光探针在pH 5溶液中不同的THF/PBS的荧光发射图，Ex=660nm
图6为本发明的荧光探针在pH 6溶液中不同的THF/PBS的荧光发射图，Ex=660nm
图7为本发明的荧光探针在pH 7溶液中不同的THF/PBS的荧光发射图，Ex=660nm
图8为本发明的荧光探针在Hela细胞中线粒体的定位图
具体说明方式
下面结合附图和实例，对本发明荧光探针及其制备方法和应用的具体实现作进一步说明。
实施例1：
中间体mCy-Br的合成
合成方法如附图1所示。
具体步骤：取配有磁子且干燥的10 mL两口瓶，加入IR-780（50 mg, 0.0775mmol）和5-溴邻苯二酚(27.0 mg, 0.143 mmol)，真空-氮气置换3次，氮气保护的条件下，向反应瓶中加入2ml无水DMF和0.1ml无水三乙胺，加热至80°C反应4h，减压抽干，得到粗产物。将粗品经快速层析柱（二氯甲烷：甲醇 = 20/1，v/v）分离纯化，得到蓝色固体化合物（产率约62.9%）。经过核磁、质谱进行表征。1H NMR (400 MHz, 298 K, CDCl3): δ 8.53 (d, 1H),7.46−7.25 (m, 6H), 7.15(s, 1H), 6.26 (d, 1H), 4.22 (t, 2H), 2.73 (t, 2H),2.67 (t, 2H), 1.96−1.91 (m, 4H), 1.25 (s, 6H), 1.09 (t, 3H). 13C NMR (400MHz, 298 K, CD3OD): δ 177.3, 162.6, 154.5, 141.6, 144.0, 133.4, 128.9, 127.1,126.6, 122.8, 121.9, 119.5, 115.5, 114.0, 112.0, 102.9, 50.8,47.2, 30.0,29.0, 28.5, 21.2, 11.7. HRMS (ESI): 计算值 for C28H29BrNO2+ [M]+, 490.1376;实际值 490.1376。
实施例2：
探针的合成
合成方法如附图1所示。
具体步骤：反应瓶中加入中间体1 (30 mg, 0.048 mmol)， 4-（1,2,2-三苯乙烯基）-苯硼酸频那醇酯(40 mg, 0.087 mmol)，K2CO3(0.338 g, 2.45 mmol)，真空-氮气置换3次，氮气保护下加入，加入4ml THF， Pd(PPh3)4 (5 mg, 0.004 mmol)，1ml H2O，加热至回流，24小时后加入二氯甲烷提取4次，有机相合并浓缩得到粗品。将粗品经快速层析柱（二氯甲烷:甲醇 = 20/1，v/v）分离纯化，得到蓝色固体化合物（产率约24%）。经过核磁、质谱进行表征。1H NMR (400 MHz, 298 K, CDCl3)：δ8.58 (d, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.37(d, 2H),7.26 (s, 1H),7.16−7.06 (m,22H), 6.96(s, 1H), 6.08 (d, 1H), 4.06 (t, 2H),2.60-2.63 (t, 2H), 1.89−1.91 (m, 4H), 1.29 (s, 6H), 1.07 (t, 3H). 13C NMR(400 MHz, 298 K, CDCl3): δ 175.7, 162.9, 162.7, 158.5, 155.4, 144.7,143.7,143.4, 143.2, 141.9, 141.7, 141.5, 140.3,135.5, 131.4, 128.9, 127.8, 127.7,126.6, 126.3, 122.7, 122.1, 117.1, 114.4,113.1, 111.2, 110.4, 102.5, 100.9,50.6, 50.1,31.9, 30.0, 28.4, 22.7, 20.9, 14.1,11.7. HRMS (ESI): 计算值C54H48NO2+ [M]+, 742.3680; 实际值742.3681。
实施例3：
制备探针10μM 70%的不同pH值的PBS/THF溶液，在可见紫外分光光度计上测量，结果如附图2。
实施例4：
制备探针10μM 70%的不同pH值的PBS/THF溶液，在荧光分光光度计上测量，结果如附图3。
实施例5：
制备探针10μM pH =4 的不同THF/PBS 比例的溶液，PBS分别占10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，测量荧光，结果如附图4。
实施例6：
制备探针10μM pH =5 的不同THF/PBS 比例的溶液，PBS分别占10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，测量荧光，结果如附图5。
实施例7：
制备探针10μM pH =6 的不同THF/PBS 比例的溶液，PBS分别占10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，测量荧光，结果如附图6。
实施例8：
制备探针10μM pH =7 的不同THF/PBS 比例的溶液，PBS分别占10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，测量荧光，结果如附图7。
实施例9：
将Hela细胞接种于35mm共聚焦培养皿中（2*105），培养24h后，加入探针浓度为2.5μM的培养液，孵育30min后，再加入MitoTracker green (0.05 μM)共孵育30min，用PBS洗去培养液后共聚焦成像。

Claims (5)

1.一种基于聚集诱导发光的线粒体靶向型近红外荧光探针，其特征在于，由具有线粒体靶向和近红外特征的半花菁与聚集诱导发光分子构成。
2.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述聚集诱导发光分子包含一个四苯乙烯分子构成的基本骨架。
3.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述聚集诱导发光分子包含一个线粒体靶向及近红外特征的半花菁基本骨架。
4.如权利要求1~4任一所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，实验步骤如下：
1) 氮气保护下，以无水DMF为溶剂，IR-780与5-溴间二苯酚在三乙胺作用下，80°C反应4小时，制备得到中间产物mCy-Br。
2) 氮气保护下，以THF/H2O为溶剂，mCy-Br与4-（1,2,2-三苯乙烯基）-苯硼酸频那醇酯在K2CO3及Pd(PPh3)4作用下，回流反应24小时，制备得终产物荧光探针。
5.如权利要求1~4任一所述荧光探针能够靶向线粒体。
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