CN111406070A - 用于癌症诊断的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对位于CLDN6的C端部分内的表位的抗体，其可用于例如诊断癌症和/或确定癌细胞是否表达CLDN6。

Description

用于癌症诊断的抗体
背景技术
紧密连接蛋白(claudin)为位于上皮和内皮的紧密连接(tight junction)内的整合膜蛋白。据预测，紧密连接蛋白包含四个跨膜区段，两个胞外环，和位于细胞质中的N端和C端。跨膜蛋白紧密连接蛋白(CLDN)家族在上皮和内皮的紧密连接的维持中起着关键作用，并且也可能在细胞骨架的维持和细胞信号传导中起作用。
紧密连接蛋白-6(CLDN6)是癌胚基因(oncofetal gene)，在鼠和人的干细胞以及定型为上皮细胞命运的胚状体中表达(Turksen,K.et al.(2001)Dev Dyn 222,292-300；Anderson WJ.et al.(2008)Dev Dyn 237,504-12；Turksen K.et al.(2002)Development,129,1775-84；Assou S.et al.(2007)Stem Cells 25,961-73)。作为肿瘤相关抗原，由于其在表皮形态发生的早期表达，在表皮分化和屏障形成中至关重要，因此可归类为分化抗原(differentiation antigen)。另外在上皮组织或新生儿舌、皮肤、胃和***的正常上皮组织中观察到表达(Abuazza G.et al.(2006),Am J Physiol Renal Physiol 291,1132-1141；Troy T.C.et al.(2007),Molecular Biotechnology 36,166-74；Zhao L.et al.(2008),Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 294,1856-1862)。除此之外，自己的数据还揭示了CLDN6在人胎盘、膀胱、子宫内膜、***和周围神经中低表达或极低表达，以及在不同癌症中频繁过表达。已证明CLDN6在肿瘤中过表达，所述肿瘤包括小儿脑肿瘤、胃腺癌和生殖细胞肿瘤以及内脏癌(例如卵巢癌)。还已证明，CLDN6在胃癌细胞中的过表达导致侵袭、转移和增殖的增加，提示了CLDN6为预后不良的标志，并且可能在维持恶性表型中起潜在作用。另外，已表明CLDN6在乳腺癌细胞系中通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡而起到抑制癌症的作用。
图1B所示的CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9的序列比对表明，CLDN6对其他紧密连接蛋白高度保守。CLDN6与其他紧密连接蛋白的高度同源性，特别是与CLDN9和CLDN4的高度同源性，使得难以提供具有适于诊断目的特性(如特异性和亲和力)的CLDN6抗体。本发明人发现针对位于CLDN6的C端部分的某个表位的抗体满足抗体的诊断应用标准，特别是用于检测和鉴定表达CLDN6的细胞。
本发明的抗体可用于例如诊断癌症和/或确定癌细胞是否表达CLDN6。优选地，癌症疾病或癌细胞的特征在于CLDN6的表面表达。表达CLDN6的癌细胞为靶向CLDN6的疗法(例如抗CLDN6抗体的疗法)的合适靶标。在一实施方案中，癌细胞表达或异常表达CLDN6，而相应的正常细胞不表达CLDN6或CLDN6表达水平较低。
发明内容
在一方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其结合：
(i)具有氨基酸序列EYPTKNY(SEQ ID NO：38)的肽，和/或
(ii)紧密连接蛋白6(CLDN6)，其中所述抗体或其抗原结合片段通过至少与CLDN6内的表位结合来结合CLDN6，所述表位具有氨基酸序列EYPTKNY(SEQ ID NO：38)，和/或
(iii)具有氨基酸序列EYPTKNYV(SEQ ID NO：29)的肽，和/或
(iv)紧密连接蛋白6(CLDN6)，其中所述抗体或其抗原结合片段通过至少与CLDN6内的表位结合来结合CLDN6，所述表位具有氨基酸序列EYPTKNYV(SEQ ID NO：29)，和/或
(v)具有氨基酸序列AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：15)的肽，其中所述抗体或其抗原结合片段不结合具有氨基酸序列TSAPAISRGPSEYPT(SEQ ID NO：14)的肽，和/或
(vi)紧密连接蛋白6(CLDN6)，其中所述抗体或其抗原结合片段通过至少与CLDN6内的表位结合来结合CLDN6，所述表位具有氨基酸序列AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：15)，其中所述抗体或其抗原结合片段不结合具有氨基酸序列TSAPAISRGPSEYPT(SEQ ID NO：14)的肽。
在本文所述方面的实施方案中以及在其他方面，本发明涉及单克隆抗体或其抗原结合片段，其
(i)结合具有氨基酸序列AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：15)的肽和/或
(ii)结合紧密连接蛋白6(CLDN6)，其中所述抗体或其抗原结合片段通过至少与CLDN6内的表位结合来结合CLDN6，所述表位具有氨基酸序列AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：15)。
在本文所述方面的实施方案中以及在其他方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其结合以下肽中的一个或多个，优选全部：
PAISRGPSEYPTKNY(SEQ ID NO：22)、AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：15)、ISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：23)、SRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：24)、RGPSEYPTKNYV(SEQ IDNO：25)、GPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：26)、PSEYPTKNYV(SEQ ID NO：27)、SEYPTKNYV(SEQ IDNO：28)和EYPTKNYV(SEQ ID NO：29)，其中所述抗体或其抗原结合片段不结合具有氨基酸序列TSAPAISRGPSEYPT(SEQ ID NO：14)的肽。
在一实施方案中，所述抗体或抗原结合片段以最低亲和力与所述肽结合和以最高亲和力与所述肽结合的结合亲和力的差异为50％或更少、40％或更少、30％或更少、20％或更少或10％或更少。
本文所述的抗体或抗原结合片段优选不与这样的肽结合，其包含氨基酸序列EYPTK(SEQ ID NO：59)和/或氨基酸序列EYPTKN(SEQ ID NO：60)但不包含氨基酸序列EYPTKNY(SEQ ID NO：38)。换句话说，本文所述的抗体或抗原结合片段与具有氨基酸序列EYPTKNY(SEQ ID NO：38)的肽和/或具有氨基酸序列EYPTKNYV(SEQ ID NO：29)的肽的结合是由于第二个酪氨酸的存在，所述第二个酪氨酸在氨基酸序列EYPTK(SEQ ID NO：59)和/或氨基酸序列EYPTKN(SEQ ID NO：60)中缺失。如本文所示，优选的抗体或抗原结合片段不与这样的肽结合，其包含氨基酸序列YPTKNY(SEQ ID NO：61)和/或EYPTKN(SEQ ID NO：60)但不包含氨基酸序列EYPTKNY(SEQ ID NO：38)，表明可认为氨基酸序列EYPTKNY(SEQ ID NO：38)是结合这些抗体的最小表位序列。
在本文所述方面的实施方案中以及在其他方面，本发明涉及由杂交瘤产生或可从其获得的抗体，所述杂交瘤保藏于DSMZ(德国不伦瑞克38124因霍芬路7B)，并具有以下名称和保藏号之一：
1.58-4B-2，保藏号：DSM ACC3311，保藏日：2016年11月29日；
2.58-3A，保藏号：DSM ACC3312，保藏日：2016年11月29日；或
3.58-1B，保藏号：DSM ACC3313，保藏日：2016年11月29日。
本文通过引用抗体的名称和/或产生抗体的克隆来指定本发明的抗体。
本发明还涉及一种抗体，其与由上述杂交瘤产生并可从其获得的抗体竞争结合CLDN6，和/或具有由上述杂交瘤产生并可从其获得的抗体的对CLDN6的特异性。在这些和其他实施方案中，本发明还涉及一种抗体，其包含的抗原结合部分或抗原结合位点，特别是可变区，与由上述杂交瘤产生或可从其获得的抗体的抗原结合部分或抗原结合位点，特别是可变区，相同或高度同源。可以设想，优选的抗体是具有这样的CDR区的抗体，其与由上述杂交瘤产生或可从其获得的抗体的CDR区相同或高度同源。“高度同源”是指可以考虑在每个CDR区中进行1-5个取代，优选1-4个取代，例如1-3个或1个或2个取代。特别优选的抗体为由上述杂交瘤产生或可从其获得的抗体的嵌合和人源化形式。
因此，在本文所述方面的实施方案中以及在其他方面，本发明涉及一种抗体，其选自：
(i)抗体，其由保藏号为DSM ACC3313(58-1B)、DSM ACC3312(58-3A)或DSMACC3311(58-4B-2)的克隆产生或可从其获得，
(ii)抗体，其为(i)的抗体的嵌合或人源化形式，
(iii)抗体，其与(i)的抗体竞争结合CLDN6，
(iv)抗体，其具有(i)的抗体的特异性，以及
(v)抗体，其包含(i)的抗体的抗原结合部分或抗原结合位点，或
(i)至(v)中任一项所述抗体的抗原结合片段。
在一实施方案中，(i)的抗体的抗原结合部分或抗原结合位点包含(i)的抗体的可变区。
在本文所述方面的实施方案中以及在其他方面，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含：抗体重链，其包含：
(i)抗体重链序列，其包含SEQ ID NO：40、42或44的序列或其变体，
(ii)抗体重链序列的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，所述抗体重链序列包含SEQ ID NO：40、42或44的序列或其变体，或
(iii)SEQ ID NO：53的CDR3序列或其变体，并且优选进一步包含SEQ ID NO：51或57的CDR1序列或其变体，和/或SEQ ID NO：52或58的CDR2序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在本文所述方面的实施方案中以及在其他方面，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含：抗体轻链，其包含：
(i)抗体轻链序列，其包含SEQ ID NO：41、43或45的序列或其变体，
(ii)抗体轻链序列的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，所述抗体轻链序列包含SEQ ID NO：41、43或45的序列或其变体，或
(iii)SEQ ID NO：56的CDR3序列或其变体，并且优选进一步包含SEQ ID NO：54的CDR1序列或其变体，和/或SEQ ID NO：55的CDR2序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在本文所述方面的实施方案中以及在其他方面，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含：
(I)抗体重链，其包含：
(i)抗体重链序列，其包含SEQ ID NO：40、42或44的序列或其变体，
(ii)抗体重链序列的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，所述抗体重链序列包含SEQ ID NO：40、42或44的序列或其变体，或
(iii)SEQ ID NO：53的CDR3序列或其变体，并且优选进一步包含SEQ ID NO：51或57的CDR1序列或其变体，和/或SEQ ID NO：52或58的CDR2序列或其变体，和/或
(II)抗体轻链，其包含：
(i)抗体轻链序列，其包含SEQ ID NO：41、43或45的序列或其变体，
(ii)抗体轻链序列的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，所述抗体轻链序列包含SEQ ID NO：41、43或45的序列或其变体，或
(iii)SEQ ID NO：56的CDR3序列或其变体，并且优选进一步包含SEQ ID NO：54的CDR1序列或其变体，和/或SEQ ID NO：55的CDR2序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在某些优选的实施方案中，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含：
(I)抗体重链，其包含：
(i)抗体重链序列，其包含SEQ ID NO：40的序列或其变体，
(ii)抗体重链序列的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，所述抗体重链序列包含SEQ ID NO：40的序列或其变体，或
(iii)SEQ ID NO：53的CDR3序列或其变体，并且优选进一步包含SEQ ID NO：51的CDR1序列或其变体，和/或SEQ ID NO：52的CDR2序列或其变体，以及
(II)抗体轻链，其包含：
(i)抗体轻链序列，其包含SEQ ID NO：41的序列或其变体，
(ii)抗体轻链序列的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，所述抗体轻链序列包含SEQ ID NO：41的序列或其变体，或
(iii)SEQ ID NO：56的CDR3序列或其变体，并且优选进一步包含SEQ ID NO：54的CDR1序列或其变体，和/或SEQ ID NO：55的CDR2序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在某些优选的实施方案中，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含：
(I)抗体重链，其包含：
(i)抗体重链序列，其包含SEQ ID NO：42的序列或其变体，
(ii)抗体重链序列的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，所述抗体重链序列包含SEQ ID NO：42的序列或其变体，或
(iii)SEQ ID NO：53的CDR3序列或其变体，并且优选进一步包含SEQ ID NO：57的CDR1序列或其变体，和/或SEQ ID NO：58的CDR2序列或其变体，以及
(II)抗体轻链，其包含：
(i)抗体轻链序列，其包含SEQ ID NO：43的序列或其变体，
(ii)抗体轻链序列的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，所述抗体轻链序列包含SEQ ID NO：43的序列或其变体，或
(iii)SEQ ID NO：56的CDR3序列或其变体，并且优选进一步包含SEQ ID NO：54的CDR1序列或其变体，和/或SEQ ID NO：55的CDR2序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在某些优选的实施方案中，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含：
(I)抗体重链，其包含：
(i)抗体重链序列，其包含SEQ ID NO：44的序列或其变体，
(ii)抗体重链序列的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，所述抗体重链序列包含SEQ ID NO：44的序列或其变体，或
(iii)SEQ ID NO：53的CDR3序列或其变体，并且优选进一步包含SEQ ID NO：57的CDR1序列或其变体，和/或SEQ ID NO：58的CDR2序列或其变体，以及
(II)抗体轻链，其包含：
(i)抗体轻链序列，其包含SEQ ID NO：45的序列或其变体，
(ii)抗体轻链序列的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，所述抗体轻链序列包含SEQ ID NO：45的序列或其变体，或
(iii)SEQ ID NO：56的CDR3序列或其变体，并且优选进一步包含SEQ ID NO：54的CDR1序列或其变体，和/或SEQ ID NO：55的CDR2序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在某些优选的实施方案中，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含抗体重链和抗体轻链，所述抗体重链包含SEQ ID NO：53的CDR3序列或其变体，所述抗体轻链包含SEQ ID NO：56的CDR3序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在某些优选的实施方案中，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含抗体重链和抗体轻链，所述抗体重链包含SEQ ID NO：53的CDR3序列或其变体，并一步包含SEQ ID NO：51的CDR1序列或其变体，以及SEQ ID NO：52的CDR2序列或其变体，所述抗体轻链包含SEQ ID NO：56的CDR3序列或其变体，并一步包含SEQ IDNO：54的CDR1序列或其变体，以及SEQ ID NO：55的CDR2序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在某些优选的实施方案中，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含抗体重链和抗体轻链，所述抗体重链包含SEQ ID NO：53的CDR3序列或其变体，并一步包含SEQ ID NO：57的CDR1序列或其变体以及SEQ ID NO：58的CDR2序列或其变体，所述抗体轻链包含SEQ ID NO：56的CDR3序列或其变体，并一步包含SEQ ID NO：54的CDR1序列或其变体，以及SEQ ID NO：55的CDR2序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在某些优选的实施方案中，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含由SEQ ID NO：40代表的氨基酸序列或其变体，所述VL包含由SEQ ID NO：41代表的氨基酸序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在某些优选的实施方案中，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含由SEQ ID NO：42代表的氨基酸序列或其变体，所述VL包含由SEQ ID NO：43代表的氨基酸序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在某些优选的实施方案中，本发明涉及一种抗体，其选自：
(a)抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含由SEQ ID NO：44代表的氨基酸序列或其变体，所述VL包含由SEQ ID NO：45代表的氨基酸序列或其变体，以及
(b)抗体，其与(a)的抗体竞争结合CLDN6和/或具有(a)的抗体对CLDN6的特异性，
或所述抗体的抗原结合片段。
在优选的实施方案中，本发明的抗体包含抗体重链和/或抗体轻链，所述抗体重链包含γ-2a重链恒定区，优选人γ-2a重链恒定区，所述抗体轻链包含κ轻链恒定区。
本文所述的抗体或抗原结合片段结合CLDN6。本发明的抗体或抗原结合片段优选能够在其天然的，即天然存在的或未变性的状态下，或在其变性的状态下结合CLDN6。在一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段结合CLDN6但不结合CLDN9，并且优选不结合CLDN4和/或CLDN3。优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段基本上不结合CLDN6以外的CLDN蛋白。优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段对CLDN6具有特异性。
在一实施方案中，CLDN6为细胞表面膜结合的CLDN6。在一实施方案中，CLDN6存在于癌细胞上，其中所述癌细胞优选为表达CLDN6的癌细胞。在一实施方案中，所述癌细胞为选自以下癌的细胞：卵巢癌(尤其是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，尤其是鳞状细胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌(尤其是基底细胞癌和鳞状细胞癌)、恶性黑色素瘤、头颈癌(尤其是恶性多形性腺瘤)、肉瘤(尤其是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、胆管癌、膀胱癌(尤其是移行细胞癌和***状癌)、肾癌(尤其是肾细胞癌，其包括透明细胞肾细胞癌和***状肾细胞癌)、结肠癌、小肠癌(包括回肠癌，尤其是小肠腺癌和回肠腺癌)、睾丸胚胎癌、胎盘绒毛膜癌、***、睾丸癌(尤其是睾丸***瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌)、子宫癌、生殖细胞肿瘤(例如畸胎瘤或胚胎癌，尤其是睾丸生殖细胞肿瘤及其转移形式)。
在一实施方案中，本发明的抗体是嵌合的、人的或人源化的抗体。在一实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。
在一实施方案中，可通过包括免疫动物的步骤的方法获得本发明的抗体，所述免疫动物的步骤可用包含优选由SEQ ID NO：49的氨基酸序列组成的肽，或者在免疫学上等同的肽或者表达所述肽的核酸或宿主细胞。优选地，所述肽包含CLDN6的不超过110、100、90、80、70、60、50或40个连续氨基酸。
可将本发明的抗体或抗原结合片段与其他部分(例如可检测的标记)偶联，即共价或非共价连接。
在另一方面，本发明涉及缀合物，其包含与至少一个可检测标记偶联的本文所述的抗体或抗原结合片段。
本发明还涉及产生本文所述抗体的细胞，例如杂交瘤。
优选的杂交瘤为保藏于DSMZ(德国不伦瑞克38124因霍芬路7B)的杂交瘤，其具有以下名称和保藏号之一：
1.58-4B-2，保藏号：DSM ACC3311，保藏日：2016年11月29日；
2.58-3A，保藏号：DSM ACC3312，保藏日：2016年11月29日；或
3.58-1B，保藏号：DSM ACC3313，保藏日：2016年11月29日。
本发明还涉及一种肽，所述肽包含优选由SEQ ID NO：49的氨基酸序列组成的肽或在免疫学上等同的肽。优选地，所述肽包含CLDN6的不超过110、100、90、80、70、60、50或40个连续氨基酸。
本发明还涉及核酸，其编码抗体或其部分，例如本文所述的抗体链、抗原结合片段或肽。优选地，将本发明的核酸可操作地连接至一个或多个表达控制元件，从而允许在真核或原核细胞中表达。确保在真核或原核细胞中表达的控制元件是本领域技术人员众所周知的。
本发明的核酸可包含在载体中，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或例如通常在基因工程中使用的其他载体。所述载体可包含其他基因，例如标记基因，其允许在合适的宿主细胞中和合适的条件下选择载体。此外，所述载体可包含表达控制元件，其允许在合适的宿主中正确表达编码区。这样的控制元件是技术人员已知的，并且可包括启动子、剪接盒和翻译起始密码子。
用于构建核酸分子、用于构建包含核酸分子的载体、用于将载体导入适当选择的宿主细胞中或用于进行或实现核酸分子表达的方法在本领域中是众所周知的。
本发明的另一方面涉及一种宿主细胞，其包含本文公开的核酸或载体。
本发明的另一方面涉及使用本发明的抗体或抗原结合片段检测CLDN6或表达CLDN6的细胞或者确定CLDN6或表达CLDN6的细胞的量。通过检测或确定CLDN6与本发明的抗体或抗原结合片段之间的复合物的量，检测CLDN6或表达CLDN6的细胞或者确定CLDN6或表达CLDN6的细胞的量。复合物的形成表明存在CLDN6或表达CLDN6的细胞。可通过多种方式进行这种检测或量的确定，包括但不限于免疫检测，所述免疫检测使用本发明的抗体或抗原结合片段。使用抗体检测肽或蛋白的方法是众所周知的，包括ELISA、竞争性结合测定等。通常，此类测定法使用与靶肽或靶蛋白特异性结合的抗体或抗体片段，直接或间接结合至用于检测的标记，例如指示剂酶、放射性标记、荧光团或顺磁性颗粒。本发明的方法允许定量和/或定性评估(例如绝对和/或相对评估)CLDN6的水平或表达CLDN6的细胞的水平。
在一方面，本发明涉及一种用于检测样品中的CLDN6或确定样品中CLDN6的量的方法，其包括以下步骤：
(i)使样品与本发明的抗体或抗原结合片段或本发明的缀合物接触，以及
(ii)检测所述抗体、抗原结合片段或缀合物与CLDN6之间复合物的形成，或确定所述复合物的量。
在一实施方案中，所述样品为细胞样品，即包含细胞(例如癌细胞)的样品。在所述实施方案中，优选在所述抗体、抗原结合片段或缀合物与所述样品中的细胞表达的CLDN6之间形成复合物。
在一方面，本发明涉及一种用于确定细胞是否表达CLDN6的方法，其包括以下步骤：
(i)使细胞样品与本发明的抗体或抗原结合片段或本发明的缀合物接触，以及
(ii)检测所述抗体、抗原结合片段或缀合物与所述样品中的细胞表达的CLDN6之间复合物的形成。
在一实施方案中，所述样品中的细胞为癌细胞。优选在所述抗体、抗原结合片段或缀合物与所述样品中的细胞表达的CLDN6之间形成复合物。
本发明的另一方面涉及通过使用本发明的抗体或抗原结合片段靶向CLDN6来进行疾病诊断或分类的方法。这些方法提供了对表达CLDN6的细胞的选择性检测，从而将这些细胞与不表达CLDN6的正常细胞或不表达CLDN6的病变细胞区分开。可通过靶向CLDN6的疗法(例如用针对CLDN6的治疗性抗体的疗法)来治疗以表达CLDN6的病变细胞为特征的疾病。治疗或诊断的疾病优选为其中表达或异常表达CLDN6的疾病，特别是癌症疾病，例如本文所述的那些。
在一方面，本发明涉及一种方法，用于诊断、检测或监测癌症，即用于确定癌症疾病的消退、进展、病程和/或发作，包括使用本发明的抗体或抗原结合片段检测分离自患者的生物样品中的CLDN6或表达CLDN6的细胞，和/或确定CLDN6或表达CLDN6的细胞的量。此类方法可用于检测受试者是否患有癌症疾病或有罹患癌症疾病的风险(升高)，或例如检测治疗方案是否有效。
因此，在一方面，本发明涉及一种用于诊断、检测或监测癌症的方法，其包括以下步骤：
(i)使生物样品与本发明的抗体或抗原结合片段或本发明的缀合物接触，以及
(ii)检测所述抗体、抗原结合片段或缀合物与CLDN6之间复合物的形成，和/或确定所述复合物的量。
在一实施方案中，所述生物样品是细胞样品，即包含细胞(例如癌细胞)的样品。在这个实施方案中，优选在所述抗体、抗原结合片段或缀合物与所述样品中的细胞表达的CLDN6之间形成复合物。
本发明的监测方法优选包括在第一时间点在第一样品中和在第二时间点在另一样品中检测和/或确定CLDN6或表达CLDN6的细胞的量，其中肿瘤疾病的消退、进展、病程和/或发作可通过比较两个样品来确定。
通常，将生物样品中CLDN6的水平或表达CLDN6的细胞的水平与参考水平进行比较，其中与所述参考水平的偏差表示受试者中癌症疾病的存在和/或阶段。所述参考水平可以是在对照样品中确定的水平(例如，来自健康的组织或受试者，特别是没有癌症疾病的患者)或来自健康受试者的中值水平。与所述参考水平的“偏差”表示任何显著变化，例如增加至少10％、20％或30％，优选增加至少40％或50％，或甚至更多。
优选地，CLDN6或表达CLDN6的细胞的存在，和/或CLDN6或表达CLDN6的细胞的量相对于参考水平(即无癌症疾病的患者)增加，表示患者体内存在癌症疾病或存在患癌风险(即发展癌症的可能性)。
与较早时从患者身上采集的生物样品相比，CLDN6或表达CLDN6的细胞的量减少可能表明患者体内癌症疾病的消退、正向进程(例如治疗成功)或癌症发作的风险降低。
与较早时从患者身上采集的生物样品相比，CLDN6或表达CLDN6的细胞的量增加可能表明所述患者体内癌症的进展、负向进程(例如治疗失败)、复发或转移行为、癌症疾病发作或发作风险。
在一方面，本发明涉及一种用于确定是否可通过靶向CLDN6的癌症治疗方法来治疗癌症的方法，其包括以下步骤：
(i)使包含癌细胞的样品与本发明的抗体或抗原结合片段或本发明的缀合物接触，以及
(ii)检测所述抗体、抗原结合片段或缀合物与CLDN6之间复合物的形成。
优选在所述抗体、抗原结合片段或缀合物与所述样品中的癌细胞表达的CLDN6之间形成复合物。
此类方法可用于检测患者是否适合涉及靶向表达CLDN6的细胞的疗法，例如使用发挥一种或多种免疫效应功能的抗体，例如细胞毒性的CLDN6特异性抗体，例如用细胞毒性物质(例如毒素或放射性标记)标记的抗体或诱导细胞杀伤机制(例如CDC或ADCC)的抗体。可通过靶向CLDN6的疗法来治疗以表达CLDN6的病变细胞为特征的疾病，例如癌症，特别是本文所述的那些癌症。
在以上任一方面的一个实施方案中，所述样品、细胞样品或生物样品来自患有癌症、怀疑患有癌症或罹患癌症或者可能患有癌症的患者。在一实施方案中，所述样品、细胞样品或生物样品来自组织或器官，其中当所述组织或器官无癌症时，细胞基本上不表达CLDN6。优选地，所述组织为除胎盘组织以外的组织。优选地，所述组织已诊断出患有癌症，例如通过目视检查或对所述组织或器官的细胞进行培养测试。在这个实施方案中，CLDN6或表达CLDN6的细胞的存在和/或CLDN6或表达CLDN6的细胞的量相对于参考水平(例如无肿瘤疾病的患者)增加，可能表明这个患者适合涉及靶向表达CLDN6的细胞的疗法。
在一方面，本发明提供了组合物，例如诊断组合物或试剂盒，其包含本文所述的抗体或抗原结合片段或抗体和/或抗原结合片段的组合。这种诊断组合物或检测试剂盒可用于本发明的方法，例如本发明的用于诊断、检测或监测的方法。这些试剂盒可任选地包含可检测的标记，例如指示剂酶、放射性标记、荧光团或顺磁性颗粒。试剂盒可包含信息小册子，例如，告知如何使用试剂来实践本文公开的方法的小册子。
根据以下详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。
具体实施方式
尽管下面详述了本发明，但应当理解，因为本文所述的特定方法、方案和试剂可以变化，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂。还应理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限制。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
在下文中，将描述本发明的元素。这些元素与特定实施方案一起列出，但应当理解，可将它们以任何方式和任何数量组合以创建其他的实施方案。描述的各种实施例和优选实施方案不应当理解为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当理解为支持并涵盖组合实施方案，其是由明确描述的实施例与任何数量的公开和/或优选的元素组合得到的。此外，除非上下文另有说明，应当认为本发明中所有描述的元素的任何排列和组合被本申请的说明书公开。
优选地，本文使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,and H.
Figure BDA0002403375900000151
Eds.,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)所示定义。
除非另有说明，本发明的实施会采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，在所述领域的文献中对其进行了解释(参见，例如，MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。
在本说明书和随后的权利要求书的全文中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”及其变化例如“包括”和“含有”应当理解为意指包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，虽然在一些实施方案中，可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个(a)”和“一个(an)”和“这个”以及相似所指应当理解为涵盖单数和复数。本文中数值范围的列举仅意图用作分别指代这个范围内的每个单独数值的简便方法。除非本文另外指出，否则每个单独的数值都如同在本文中单独引用一样被并入说明书中。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅为了更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。本说明书中任何语言都不应解释为表示任何未声明的元素对实施本发明是必要的。
在本说明书的全文中引用了几个文件。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指引等)，无论是上文或下文，均整体援引加入本文。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无法享有在先申请的优先权。
在本发明的上下文中，术语“重组”表示“通过基因工程制备”。优选地，在本发明的上下文中，“重组物体”例如重组细胞，不是天然存在的。
如本文所用，术语“天然存在”是指物体可以在自然界中发现这一事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中且可以分离自自然来源并且尚未被人在实验室中有意改造的肽或核酸是天然存在的。
术语“抗原”涉及包含表位的物质，针对所述表位指导和/或产生免疫应答。优选地，本发明的上下文中的抗原是一种分子，任选地在加工之后，诱导免疫反应的，优选是抗原特异性的。术语“抗原”特别包括蛋白、肽、多糖、核酸，尤其是RNA和DNA，以及核苷酸。
术语“表位”是指分子(例如抗原)中的抗原决定簇，即，免疫***识别的分子的一部分或片段，例如抗体识别的分子的一部分或片段。例如，表位是免疫***识别的抗原上离散的三维位点。表位通常由分子的化学活性表面基团组成，所述分子例如氨基酸或糖侧链，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别在于前者的结合在变性溶剂的存在下丧失，而后者不会。蛋白(例如CLDN)的表位优选包含所述蛋白的连续或不连续部分，并且优选长度为5至100、优选5至50、更优选8至30、最优选10至25个氨基酸，例如，表位可以优选长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
如本文所用，术语“不连续表位”表示蛋白抗原上的构象表位，其由蛋白一级序列中的至少两个分开的区域形成。
抗原包括肿瘤相关抗原(例如CLDN6)，即癌细胞的成分，其可源自细胞质、细胞表面和细胞核，特别是那些在细胞内产生或作为癌细胞上的表面抗原产生的抗原，优选大量产生的那些抗原。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤相关抗原”或“肿瘤抗原”是指在正常状况下在有限数量的组织和/或器官中或在特定发育阶段特异性表达的蛋白，例如，肿瘤相关抗原可在正常条件下在胃组织中(优选在胃粘膜)、在生殖器官中(例如在睾丸中)、在滋养细胞组织中(例如在胎盘中)或在生殖系细胞中特异性表达，并在一个或多个肿瘤或癌组织中表达或异常表达。在本文中，“有限数量”优选表示不超过3个，更优选不超过2个。在本发明的上下文中，肿瘤相关抗原包括例如分化抗原(优选细胞类型特异性分化抗原，即在特定细胞类型中在特定分化阶段在特定条件下特异性表达的正常条件下的蛋白)、癌症/睾丸抗原(即在正常状况下在睾丸中有时在胎盘中特异性表达的蛋白)以及种系特异性抗原。在本发明的上下文中，肿瘤相关抗原优选与癌细胞的细胞表面相关，并且优选在正常组织中不表达或表达很少。优选地，可根据肿瘤相关抗原或肿瘤相关抗原的异常表达鉴别癌细胞。在本发明的上下文中，个体(例如癌症患者)中癌细胞表达的肿瘤相关抗原，优选是所述个体的自身蛋白。在优选的实施方案中，本发明上下文中的肿瘤相关抗原在正常状况下在非必需的组织或器官中特异性地表达，即当被免疫***破坏时不导致个体死亡的组织或器官，或者在免疫***无法到达或几乎无法到达的身体器官或结构中特异性地表达。优选地，在正常组织中表达的肿瘤相关抗原和在癌组织中表达的肿瘤相关抗原的氨基酸序列相同。
作为肿瘤免疫疗法中的靶结构，特别是肿瘤疫苗接种中的靶结构，理想地符合肿瘤相关抗原的条件的分化抗原的实例有紧密连接蛋白家族的细胞表面蛋白，例如CLDN6。紧密连接蛋白是一个蛋白家族，其为紧密连接的最重要组分，在这里它们建立了细胞旁屏障来控制上皮细胞之间细胞间隙中的分子流动。紧密连接蛋白为4次跨膜蛋白，其N端和C端均位于细胞质中。
术语“紧密连接蛋白6”或“CLDN6”优选涉及人CLDN6，并且，尤其涉及这样的蛋白，其包含序列表的SEQ ID NO：1的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。关于CLDN6，术语“变体”特别是指包含序列表的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白，其中第143位的Ile被Val代替。术语“CLDN6”包括任何CLDN6变体，例如翻译后修饰的变体和构象变体。
术语“CLDN9”优选地涉及人CLDN9，并且，尤其涉及这样的蛋白，其包含序列表的SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。
术语“CLDN4”优选地涉及人CLDN4，并且，尤其涉及这样的蛋白，其包含序列表的SEQ ID NO：4的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。
术语“CLDN3”优选地涉及人CLDN3，并且，尤其涉及这样的蛋白，其包含序列表的SEQ ID NO：3的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。
已经发现CLDN6在例如卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾细胞癌和膀胱癌中表达。在以下癌中可以检测到CLDN6并可以靶向CLDN6：卵巢癌(尤其是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，尤其是鳞状细胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌(特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌)、恶性黑色素瘤、头颈癌(特别是恶性多形性腺瘤)、肉瘤(尤其是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、胆管癌、膀胱癌(特别是移行细胞癌和***状癌)、肾癌(特别是肾细胞癌，其包括透明细胞肾细胞癌和***状肾细胞癌)、结肠癌、小肠癌(包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌)、睾丸胚胎癌、胎盘绒毛膜癌、***、睾丸癌(尤其是睾丸***瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌)、子宫癌、生殖细胞肿瘤(例如畸胎瘤或胚胎癌，尤其是睾丸生殖细胞瘤及其转移形式)。在一实施方案中，与CLDN6表达相关的癌症选自卵巢癌、肺癌、转移性卵巢癌和转移性肺癌。优选地，所述卵巢癌为癌或腺癌。优选地，所述肺癌为癌或腺癌，并且优选地为细支气管癌(bronchiolar cancer)，例如细支气管癌(bronchiolarcarcinoma)或细支气管腺癌。
根据本发明，表达CLDN6的细胞优选特征在于细胞表面膜结合的CLDN6，即CLDN6与细胞表面相互作用。此外，根据本发明，细胞CLDN6优选是细胞表面膜结合的CLDN6。优选地，表达CLDN6的细胞或表征为CLDN6与其细胞表面结合的细胞为癌细胞，优选为来自本文所述癌症的癌细胞。
术语“与细胞表面相互作用”表示肿瘤相关抗原(例如CLDN6)与细胞质膜相互作用并位于细胞质膜上，其中肿瘤相关抗原的至少一部分面向所述细胞的细胞外空间，并且是可以从所述细胞外可及的，例如通过位于细胞外的抗体。在本文中，一部分优选为至少4个，优选至少8个，优选至少12个，更优选至少20个氨基酸。所述相互作用可以是直接或间接的。例如，所述相互作用可以是通过一个或多个跨膜结构域、一个或多个脂质锚，或者是通过与可在细胞质膜外小叶上发现的任何其他蛋白、脂质、糖或其他结构的相互作用。例如，与细胞表面相互作用的肿瘤相关抗原可为具有胞外部分的跨膜蛋白，或者可为通过与另一蛋白相互作用而与细胞表面相互作用的蛋白，所述另一蛋白为跨膜蛋白。
根据其在本领域中的正常含义使用“细胞表面”或“细胞的表面”，因此其包括可被蛋白和其他分子结合的细胞外部。
根据本发明，如果表达水平低于胎盘细胞或胎盘组织中的表达，则CLDN6基本上不在细胞中表达。优选地，表达水平低于胎盘细胞或胎盘组织中表达水平的10％，优选低于胎盘细胞或胎盘组织中表达水平的5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％，或甚至更低。优选地，如果表达水平高于除胎盘以外的非癌性组织中的表达水平不超过2倍，优选1.5倍，并且优选不超过在所述非癌性组织中的表达水平，则CLDN6在细胞中基本不表达。优选地，如果表达水平低于检测极限和/或如果表达水平太低以至于不能被添加到细胞中的CLDN6特异性抗体结合，则CLDN6基本上不在细胞中表达。
根据本发明，如果表达水平高于除胎盘以外的非癌性组织中的表达水平优选超过2倍，优选10倍、100倍、1000倍或10000倍，则CLDN6在细胞中表达。优选地，如果表达水平高于检测极限和/或如果表达水平高到足以使得被添加到细胞的CLDN6特异性抗体结合，则CLDN6在细胞中表达。优选地，在细胞中表达的CLDN6在所述细胞的表面上表达或暴露。
术语“抗体”是指一种糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，并且包括包含其抗原结合部分的任何分子。术语“抗体”包括单克隆抗体和抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体，例如scFv抗体片段和抗原结合抗体片段，例如Fab和Fab’片段，还包括抗体的所有重组形式，例如在原核生物中表达的抗体、非糖基化的抗体以及本文所述的任何抗原结合抗体片段和衍生物。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称作互补决定区(CDR)，其穿插于被称作框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq)。
本文所述的抗体可为人抗体。如本文所用，术语“人抗体”意图包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机突变或定点诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。
术语“人源化抗体”是指具有基本上非人源的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子的剩余免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可以包含融合至恒定结构域的完整可变结构域，也可以仅包含移植至可变结构域中的适当框架区的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型也可以是通过一个或多个氨基酸取代修饰的，例如修饰以更接近人免疫球蛋白。一些形式的人源化抗体保留所有CDR序列(例如包含来自小鼠抗体的所有6个CDR的人源化小鼠抗体)。其他形式有一个或多个CDR相对于原始抗体发生改变。
术语“嵌合抗体”是指那些抗体，其中重链和轻链各自的氨基酸序列的一部分与源自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而链的其余部分与另一抗体中的相应序列同源。通常轻链和重链的可变区模拟源自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定区与源自另一种哺乳动物的抗体序列同源。这类嵌合形式的一个明显优势是可变区可以方便地源自目前已知的来源，利用来自非人宿主生物体的现成B细胞或杂交瘤，与源自例如人细胞制品的恒定区组合。可变区具有易于制备和特异性不受来源影响的优点，同时恒定区是人源的，当注射抗体时，与来自非人源的恒定区相比，不易引发来自人个体的免疫应答。但其定义并不限于这个特定实例。
术语抗体的“抗原结合部分”(或简单的“结合部分”)或抗体的“抗原结合片段”(或简单的“结合片段”)是指保留特异性结合抗原能力的一个或多个抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Wardet al.,(1989)Nature 341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)可以任选地通过合成连接子连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同基因编码，但可以使用重组方法通过合成连接子将它们连接，使它们成为单一蛋白链，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.(1988)Science 242:423-426；以及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这类单链抗体也意图涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内。进一步的实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)融合至免疫球蛋白铰链区多肽的结合结构域多肽，(ii)融合至铰链区的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)融合至CH2恒定区的免疫球蛋白重链CH3恒定区。结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。US2003/0118592和US 2003/0133939中进一步公开了结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。可通过本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式对这些片段的应用性进行筛选。
本文所述的抗体可为单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指分子组成单一的抗体分子制品。单克隆抗体显示单一结合特异性和亲和力。在一实施方案中，通过杂交瘤制备单克隆抗体，所述杂交瘤包括获得自非人动物例如小鼠的B细胞，其融合至永生细胞。
本文所述的抗体可为重组抗体。如本文所用，术语“重组抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，如(a)分离自动物(例如，小鼠)的抗体，相对于免疫球蛋白基因或由其制备的杂交瘤，所述动物是转基因或转染色体(transchromosomal)的，(b)分离自宿主细胞的抗体，转化所述宿主细胞以表达抗体，例如，分离自转染瘤，(c)分离自重组、组合抗体文库的抗体，以及(d)通过任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体，涉及剪接免疫球蛋白基因序列为其他DNA序列。
如本文所用，术语“转染瘤”包括表达抗体的重组真核宿主细胞，例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、植物细胞或包括酵母细胞的真菌。
如本文所用，“异源抗体”是相对于产生这种抗体的转基因生物定义的。这个术语是指具有这样的氨基酸序列或编码核酸序列的抗体，所述氨基酸序列或编码核酸序列与在不由所述转基因生物组成的生物体中发现的那些相对应，并且通常源自除所述转基因生物以外的物种。
如本文所用，“杂合抗体”是指具有不同生物来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链相关联的人重链的抗体是杂合抗体。
本发明包括本文所述的所有抗体和抗体衍生物，为了本发明的目的，也涵盖在术语“抗体”内。术语“抗体衍生物”是指抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一种试剂或抗体的缀合物或者抗体片段。
本文所述的抗体优选是分离的。如本文所用，“分离的抗体”意图是指这样的抗体，其基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
根据本发明，如果抗体对预定靶标具有显著亲和力并在标准测定中结合所述预定靶标，则所述抗体能够结合所述预定靶标。“亲和力”或“结合亲和力”常通过平衡解离常数(KD)测量。优选地，术语“显著亲和力”是指以10-5 M或更低、10-6 M或更低、10-7 M或更低、10-8 M或更低、10-9 M或更低、10-10M或更低、10-11M或更低或者10-12M或更低的解离常数(KD)结合预定靶标。
如果抗体对靶标没有显著亲和力且在标准测定中不显著结合所述靶标，特别是对靶标的结合不可检测，则抗体(基本上)不能结合所述靶标。优选地，如果在高达2，优选10，更优选20，特别是50或100μg/ml或更高的浓度下，则抗体对所述靶标的结合不可检测。优选地，与其结合能够结合的预定靶标相比，如果抗体以提高到至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍的KD结合靶标，则其对所述靶标没有显著亲和力。例如，如果抗体结合其能够结合的靶标的KD是10-7M，则其结合至没有显著亲和力的靶标的KD是至少10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M或10-1M。
如果抗体能够结合预定靶标同时其不能结合其他靶标，即对其他靶标没有显著亲和力且在标准测定中不显著结合其他靶标，则所述抗体是预定靶标特异性的。根据本发明，如果抗体能够结合CLDN6同时其(基本上)不能结合其他靶标，特别是不能结合其他CLDN蛋白(例如CLDN9、CLDN4和/或CLDN3)和/或紧密连接蛋白以外的蛋白，优选CLDN6以外的蛋白，则抗体是CLDN6特异性的。优选地，如果抗体对这类其他靶标的亲和力和结合不显著超过其对与紧密连接蛋白无关的蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、人血清白蛋白(HSA))或非紧密连接蛋白跨膜蛋白(例如MHC分子或转铁蛋白受体或任何其他指定的多肽)的亲和力或结合，则抗体是CLDN6特异性的。优选地，与其结合非特异性靶标相比，如果抗体以低至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍的KD结合预定靶标，则其是预定靶标特异性的。例如，如果抗体结合其特异性靶标的KD为10-7M，则其结合非特异性靶标的KD为至少10-6M、10- 5M、10-4M、10-3M、10-2M或10-1M。
可以利用任何合适的方法实验测定抗体对靶标的结合；参见，例如，Berzofsky etal.,"Antibody-Antigen Interactions"In Fundamental Immunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press New York,N Y(1984),Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and CompanyNew York,N Y(1992)，以及本文所述的方法。亲和力可以利用常规技术容易地测定，例如通过平衡透析；通过按照制造商概述的常规程序使用BIAcore 2000仪器；通过利用放射标记的靶抗原进行放射免疫测定；或通过技术人员已知的其他方法。可以通过例如Scatchardet al.,Ann N.Y.Acad.ScL,51:660(1949)的方法分析亲和力数据。如果在不同条件下测量，例如，盐浓度、pH，测量的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可以变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数例如KD、IC50的测量优选用抗体和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液进行。
术语“竞争”是指两种抗体之间竞争结合靶抗原。如果两种抗体不彼此阻断对靶抗原的结合，则它们是非竞争性的，这表明所述抗体不结合靶抗原的相同部分，即表位。本领域技术人员熟知如何测试抗体对靶抗原的竞争结合。这种方法的一个例子是所谓的交叉竞争测定法(cross-competition assay)，其可以例如以ELISA的形式或通过流式细胞仪进行。例如，可通过用一种此类抗体包被ELISA板孔来进行基于ELISA的测定；加入竞争性抗体和带有His标签的抗原/靶标，并检测添加的抗体是否抑制携带His标签的抗原结合至包被抗体，例如，通过添加生物素化的抗His抗体，然后添加链霉亲和素-聚-HRP，并进一步用ABTS使反应显色并测量在405nm的吸光度。例如，可通过将表达抗原/靶标的细胞与过量的未标记抗体一起孵育，将细胞与亚理想浓度的生物素标记的抗体一起孵育，然后与荧光标记的链霉亲和素一起孵育并用流式细胞仪分析。
如果两种抗体结合相同的抗原和相同的表位，则它们具有“相同的特异性”。可通过本领域技术人员已知的不同方法(例如基于抗体对相同表位的竞争)来测试待测试的抗体是否与某抗原结合抗体识别相同的表位，即这些抗体是否结合至相同的表位。抗体之间的竞争可以通过交叉阻断测定检测。例如，交叉阻断测定可使用竞争性ELISA测定。例如，可将靶抗原包被在微量滴定板的孔上，并可添加抗原结合抗体和候选竞争性测试抗体。孔中结合至抗原的抗原结合抗体的量和与之竞争结合相同表位的候选竞争性测试抗体的结合能力间接相关。具体地，候选竞争性测试抗体对相同表位的亲和力越大，结合至经抗原包被的孔上的抗原结合抗体的量越少。结合到孔上的抗原结合抗体的量可通过用可检测或可测量的标记物质对抗体进行标记来测量。
与另一抗体竞争结合抗原的抗体(例如，包含如本文所述的重链和轻链可变区的抗体)或具有另一抗体的抗原特异性的抗体(例如，包含如本文所述的重链和轻链可变区的抗体)，可以是包含如本文所述的重链和/或轻链可变区的变体的抗体，例如，包含如本文所述的CDR的修饰和/或一定程度的相同性。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。本发明的抗体包括多克隆和单克隆抗体，并且包括IgG2a(例如IgG2a、κ、λ)、IgG2b(例如IgG2b、κ、λ)、IgG3(例如IgG3、κ、λ)和IgM抗体。然而，本发明还涵盖其他的抗体同种型，包括IgG1、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗体。
如本文所用，“同种型转换”是指抗体的类别或同种型从一种Ig类别变为另一种Ig类别的现象。
如本文所用，术语“重排”是指免疫球蛋白重链或轻链基因座的构型，其中在分别编码基本上完整的VH或VL结构域的构象中，V区段的定位紧邻D-J或J区段。通过与种系DNA的比较，可确定重排的免疫球蛋白(抗体)基因座；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源性元件。
如本文针对V区段所使用的术语“未重排”或“种系构型”是指其中V区段不重新组合成紧邻D或J区段的构型。
根据本发明，抗体可以源自不同物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。抗体还包括嵌合分子，其中源自一物种(优选人)的抗体恒定区与源自另一物种的抗原结合位点组合。此外，抗体包括人源化分子，其中源自非人类物种的抗体的抗原结合位点与人类来源的恒定区和框架区组合。
抗体可以通过各种技术制备，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler andMilstein,Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交方法，原则上，也可以采用制备单克隆抗体的其他技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌性转化或者利用抗体基因文库的噬菌体展示技术。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选动物***是鼠类***。小鼠中的杂交瘤制备是非常成熟的方法。分离免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如鼠的骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的其他优选的动物***是大鼠和兔***(例如，Spieker-Polet et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:9348(1995)中描述的，还参见Rossi et al.,Am.J.Clin.Pathol.124:295(2005))。
在又一优选的实施方案中，可以用携带部分人免疫***而非小鼠***的转基因或转染色体小鼠来制备抗CLDN6的人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠分别包括HuMAb小鼠和KM小鼠，在本文中统称为“转基因小鼠”。可以如WO2004 035607中针对CD20所详细描述的那样在此类转基因小鼠中制备人抗体。
制备单克隆抗体的另一种策略是直接从淋巴细胞中分离编码抗体的基因，所述淋巴细胞产生具有确定特异性的抗体；参见例如Babcock et al.,1996；A novel strategyfor generating monoclonal antibodies from single,isolated lymphocytesproducing antibodies of defined specificities。有关重组抗体工程的详细信息，另请参阅Welschof and Kraus,Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8以及Benny K.C.Lo Antibody Engineering ISBN1-58829-092-1。
为了制备抗CLDN6的抗体，可以用与载体(carrier)缀合的肽、重组表达的CLDN6抗原或其片段的富集制备物和/或表达CLDN6或其片段的细胞免疫小鼠，所述与载体缀合的肽衍生自CLDN6序列。或者，可以用编码全长人CLDN6或其片段的DNA免疫小鼠。在利用纯化的抗原或CLDN6抗原的富集制备物免疫不产生抗体的情况下，还可以用表达CLDN6的细胞(例如细胞系)免疫小鼠，以便促进免疫应答。
在免疫方案的过程中，可通过尾静脉或眶后取血获得的血浆和血清样品监测免疫应答。具有足够效价的抗CLDN6免疫球蛋白的小鼠可用于融合。在处死或取脾前3-5天，可以用表达CLDN6的细胞腹膜内或静脉内对小鼠加强免疫，以增加分泌特异性抗体的杂交瘤的比率。
为了制备产生抗CLDN6单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自免疫小鼠的***、脾或骨髓的细胞，并融合至合适的永生化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。然后可以筛选所得的杂交瘤用于制备抗原特异性抗体。然后可通过ELISA筛选单个孔中分泌抗体的杂交瘤。用表达CLDN6的细胞进行免疫荧光和FACS分析，可鉴定对CLDN6具有特异性的抗体。可将分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，如果仍然是抗CLDN6单克隆抗体阳性的，可以通过有限稀释亚克隆。然后可以体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生抗体用于表征。
本发明的抗体还可如本领域中众所周知的那样，用例如重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中制备(Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。
例如，在一实施方案中，可以将目的基因(例如抗体基因)连接到表达载体中，例如真核表达质粒，例如WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338 841中公开的GS基因表达***或本领域众所周知的其他表达***所用的那些。可将含有克隆的抗体基因的纯化的质粒导入真核宿主细胞，例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞或HEK293细胞或者其他真核细胞，例如植物来源的细胞、真菌细胞或酵母细胞。用于导入这些基因的方法可为本领域中描述的方法，例如电穿孔、脂质体转染、lipofectamine或其他。将这些抗体基因导入宿主细胞后，可鉴定和选择表达抗体的细胞。这些细胞代表转染瘤，并且可以扩增以提高表达水平并扩大规模产生抗体。重组抗体可从这些培养物上清液和/或细胞中分离和纯化。
或者，克隆的抗体基因可在其他表达***中表达，包括原核细胞，例如微生物(例如大肠杆菌)。此外，抗体可以在转基因非人类动物制备，例如在绵羊和兔的乳汁或鸡蛋或转基因植物中制备；参见例如Verma,R.,et al.(1998)J.Immunol.Meth.216:165-181；Pollock,et al.(1999)J.Immunol.Meth.231:147-157；以及Fischer,R.,et al.(1999)Biol.Chem.380:825-839。
嵌合抗体是这样的抗体，其不同部分源自不同的动物物种，例如具有源自鼠抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区。通过连接鼠抗体重链和轻链的可变区与人重链和轻链的恒定区实现抗体的嵌合(例如，如Kraus et al.,in Methods in Molecular Biologyseries,Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8描述的)。在一优选实施方案中，通过连接人κ轻链恒定区至鼠轻链可变区产生嵌合抗体。在另一优选实施方案中，可通过连接人λ轻链恒定区至鼠轻链可变区产生嵌合抗体。用于产生嵌合抗体的优选的重链恒定区为IgG1、IgG3和IgG4。用于产生嵌合抗体的其他优选的重链恒定区为IgG2、IgA、IgD和IgM。
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，各个抗体之间CDR的氨基酸序列比CDR之外的序列差异更大。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此模拟特定天然存在抗体的特性的抗体可以通过构建表达载体表达，所述表达载体包括来自特定天然存在抗体的CDR序列，并将其嫁接至来自不同抗体具有不同特性的框架序列上(例如参见Riechmann,L.et al.(1998)Nature 332:323-327；Jones,P.et al.(1986)Nature 321:522-525；以及Queen,C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033)。这样的框架序列可以从包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。因其不包括完全组装的可变基因，这些种系序列不同于成熟的抗体基因序列，所述完全组装的可变基因由B细胞成熟过程中的V(D)J连接形成。在均匀分布于可变区的个别位置上，种系基因序列与高亲和力二级库抗体(secondary repertoireantibody)的序列也不同。例如，在框架1区的氨基端部分和框架4区的羧基端部分，体细胞突变相对不常见。此外，许多体细胞突变不会显著改变抗体的结合特性。因此，不必为了重现完整的重组抗体而获得某特定抗体的完整DNA序列，所述完整重组抗体具有与原始抗体相似的结合特性(参见WO 99/45962)。跨越CDR区的部分重链和轻链序列通常足以用于此目的。这些部分序列用于确定哪些种系可变基因区段和连接基因区段(joining genesegment)对重新组合的抗体可变基因有贡献。然后用种系序列来填充可变区的缺失部分。重链和轻链前导序列在蛋白成熟过程中被切割，并且不影响最终抗体的特性。为了添加缺失的序列，可通过连接(ligation)或PCR扩增将克隆的cDNA序列与合成寡核苷酸组合。或者，整个可变区可以作为一组短的、重叠的寡核苷酸合成，并通过PCR扩增组合以生成完全合成的可变区克隆。此方法具有某些优点，例如特定限制性位点的消除或引入，或特定密码子的优化。
来自杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列可用于设计重叠的合成寡核苷酸组，以产生合成V序列，其具有与天然序列相同的氨基酸编码能力。合成的重链和kappa链序列可在三个方面不同于天然序列：重复的核苷酸碱基串被打断以便促进寡核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak规则(Kozak,1991,J.Biol.Chem.266:19867-19870)纳入了最佳翻译起始位点；以及在翻译起始位点的上游设计了Hind III位点。
对于重链可变区和轻链可变区，优化的编码链序列及相应的非编码链序列在相应的非编码寡核苷酸的中点处大约被分解为30-50个核苷酸。因此，对于每条链，寡核苷酸可组装成跨越150-400个核苷酸的区段的重叠的双链组。然后用这些库作为模板产生150-400个核苷酸的PCR扩增产物。通常，单个可变区寡核苷酸组分解成两个库，将其分别扩增以产生两组重叠的PCR产物。然后通过PCR扩增将这些重叠的产物组合形成完整的可变区。可能还需要在PCR扩增中引入重链或轻链恒定区的重叠片段，以便产生可容易地克隆到表达载体构建体中的片段。
然后将重建的嵌合或人源化重链和轻链可变区与克隆的启动子序列、前导序列、翻译起始序列、恒定区序列、3’非翻译区序列、聚腺苷酸化序列和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。可将重链和轻链表达构建体组合成单一载体，共转染、连续转染或分别转染到宿主细胞中，然后将所述宿主细胞融合形成表达两条链的宿主细胞。描述了用于构建人IgGκ表达载体的质粒。可以构建质粒，使得PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列可用于重建完整的重链和轻链微基因(minigene)。这些质粒可用于表达完整的人或嵌合IgG1、Kappa或IgG4、Kappa抗体。可构建类似的质粒用于表达其他重链同种型，或表达包含λ轻链的抗体。
因此，在本发明的另一方面，本文所述的抗CLDN6抗体的结构特征用于产生在结构上相关的人源化抗CLDN6抗体，其保留本发明抗体的至少一个功能特性，例如结合CLDN6。更具体地，小鼠单克隆抗体的一个或多个CDR区可以与已知的人框架区和CDR重组组合，以产生另外的重组工程化的人源化抗CLDN6抗体。
抗体结合CLDN6的能力可以用标准结合测定法例如ELISA、蛋白质免疫印迹、免疫荧光和流式细胞术分析来确定。
ELISA可用于证明免疫小鼠血清中抗体的存在或单克隆抗体与CLDN6蛋白或肽的结合。用于免疫的肽或蛋白可用于确定杂交瘤上清液的特异性或分析血清效价。
可以用流式细胞仪证明免疫小鼠血清中抗体的存在或单克隆抗体与活细胞的结合。天然表达或在转染后表达抗原的细胞系和缺少抗原表达的阴性对照(在标准生长条件下生长)可以与杂交瘤上清液或含1％FBS的PBS中的各种浓度的单克隆抗体混合，并可以在4℃下孵育30分钟。洗涤后，APC或Alexa647标记的抗IgG抗体可以在与一抗染色相同的条件下与结合了抗原的单克隆抗体结合。样品可以用FACS仪器通过流式细胞术分析，利用光散射和侧向散射特性对单个活细胞进行门控。为了在单次测定中区分开抗原特异性单克隆抗体与非特异性结合物，可采用共转染的方法。用编码抗原和荧光标记的质粒瞬时转染的细胞可以如上述染色。转染的细胞可以在与抗体染色的细胞不同的荧光通道中检测。大多数转染细胞表达两种转基因，而抗原特异性单克隆抗体优先与表达荧光标记的细胞结合，尽管非特异性抗体与未转染细胞的结合率相当。可以用荧光显微镜作为可选的测定方法与流式细胞术共同使用或替代流式细胞术。细胞可以完全如上所述染色并在荧光显微镜下检查。
可以用免疫荧光显微镜分析证明免疫小鼠血清中抗CLDN6抗体的存在或单克隆抗体与表达CLDN6的活细胞的结合。例如，在添加了10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基中，在标准生长条件下在腔室载玻片中培养自发表达或转染后表达CLDN6的细胞系和缺少CLDN6表达的阴性对照。然后细胞可以用甲醇或多聚甲醛固定或不处理。然后细胞可以与抗CLDN6的单克隆抗体在25℃下反应30分钟。洗涤后，细胞可以在相同条件下与Alexa555标记的抗小鼠IgG二抗(MolecularProbes)反应。然后细胞可以用荧光显微镜检查。
当细胞用甲醇固定或多聚甲醛固定并用Triton X-100透化时，可观测到细胞中的总CLDN6水平。在活细胞和多聚甲醛固定的未经透化的细胞中，可检查CLDN6的表面定位。此外，可以通过共染色紧密连接标记(例如ZO-1)分析CLDN6对于紧密连接的靶向。另外，可以检测抗体结合的影响和CLDN6在细胞膜的定位。
可通过蛋白质免疫印迹进一步测试抗CLDN6 IgG与CLDN6抗原的反应性。简而言之，可从表达CLDN6的细胞和适当的阴性对照中制备细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离出的抗原转移到硝酸纤维素膜上，封闭并用待测试的单克隆抗体进行探测。IgG结合可以用抗小鼠IgG过氧化物酶检测，并用ECL底物显影。
可以用本领域技术人员熟知的方式，通过免疫组织化学进一步测试抗CLDN6小鼠IgG与CLDN6抗原的反应性，例如，使用非癌组织或癌组织样品的多聚甲醛或丙酮固定的冷冻切片或多聚甲醛固定的石蜡包埋的组织切片，所述样品获得自常规手术过程中的患者或者携带细胞系接种的异种移植肿瘤的小鼠，所述细胞系自发表达或转染后表达CLDN6。按照供应商的说明进行免疫染色，可以孵育对CLDN6具有反应性的抗体，然后孵育辣根-过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗体。
在本发明的方法中用于分析CLDN6的一种特别优选的方法是免疫组织化学或IHC。免疫组织化学或IHC是指检测组织切片的细胞(例如，本文提到的组织的细胞)中抗原(例如，蛋白)的过程。免疫组织化学染色广泛用于诊断异常细胞，例如在癌性肿瘤中发现的那些。可以用多种方式将抗体-抗原相互作用可视化。最常见的情况是，抗体与可催化生色反应的酶(例如过氧化物酶)缀合。或者，抗体也可以标记到荧光团上，例如荧光素或罗丹明。
样品的制备对于维持细胞形态、组织结构和靶表位的抗原性至关重要。这需要恰当的组织采集、固定和切片。多聚甲醛通常用于固定。根据实验样品的用途和厚度，从感兴趣的组织上切下薄切片(约4-40μm)，或者如果组织不是很厚且可穿透，则可以整体使用。常使用切片机完成切片，并将切片固定在载玻片上。
样品可能需要额外的步骤才能使表位可被抗体结合，包括脱蜡和抗原修复。诸如Triton X-100之类的去垢剂通常用于免疫组织化学中，以降低表面张力，从而用更少的试剂实现更好、更均匀的样品覆盖。
免疫组织化学染色的直接方法是使用一种标记的抗体，其直接结合要染色的抗原。免疫组织化学染色的间接方法更为普遍，它使用一种针对被测抗原的抗体，以及另一种针对第一种抗体的标记的抗体。
为了减少IHC中的背景染色，将样品与缓冲液一起孵育，所述缓冲液可封闭一抗或二抗原本可能结合的反应位点。一抗针对目的抗原产生，通常不缀合(不标记)，二抗针对一抗物种的免疫球蛋白产生。二抗通常与连接分子(例如生物素)缀合，然后再招募报告分子，或者二抗直接与报告分子本身结合。常见的封闭缓冲液包括正常血清、脱脂奶粉、BSA或明胶和市售封闭缓冲液。
报告分子根据检测方法的性质而有所不同，最流行的检测方法为分别由酶介导的和荧光团介导的生色检测和荧光检测。使用生色报告分子时，酶标记物会与底物发生反应，产生色彩鲜明的产物，可使用普通光学显微镜分析。虽然酶底物种类繁多，碱性磷酸酶(AP)和辣根过氧化物酶(HRP)是最广泛用作蛋白检测标记的两种酶。多种生色、发荧光和化学发光的底物，包括DAB或BCIP/NBT，可以与两酶中任一种一起使用。荧光报告分子是用于IHC检测的有机小分子。对于生色和荧光检测方法，信号的光密度分析可分别提供半定量和完全定量数据，使报告分子的信号水平与蛋白表达或定位的水平相关联。
在对靶抗原进行免疫组织化学染色后，通常会施加第二种染色剂以提供对比，帮助突出第一种染色剂。这些染色剂中许多都对离散的细胞区室或抗原显示出特异性，其他染色剂会对整个细胞染色。IHC可使用生色染料和荧光染料，以提供适合每种实验设计的各种试剂。常用的是苏木精、Hoechst染色和DAPI。
可以按照Glenn E.Morris的“Epitope Mapping Protocols(Methods inMolecular Biology)”ISBN-089603-375-9以及Olwyn M.R.Westwood，Frank C.Hay的“Epitope Mapping:A Practical Approach”Practical Approach Series,248中的具体描述对抗体识别的表位进行作图。
在本发明的上下文中，术语“免疫效应功能”包括免疫***的组分介导的任何功能，其造成抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤扩散和转移。优选地，免疫效应功能导致杀死癌细胞。优选地，在本发明的上下文中，免疫效应功能是抗体介导的效应功能。这类功能包括补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、在携带肿瘤相关抗原的细胞中诱导凋亡(例如，通过抗体对表面抗原的结合)、抑制CD40L介导的信号转导(例如，通过抗体对CD40受体或CD40配体(CD40L)的结合)和/或抑制携带肿瘤相关抗原的细胞的增殖，优选ADCC和/或CDC。因此，能够介导一种或多种免疫效应功能的抗体优选地能够通过诱导CDC介导的裂解、ADCC介导的裂解、凋亡、同型粘附和/或吞噬作用来介导对细胞的杀伤，优选地通过诱导CDC介导的裂解和/或ADCC介导的裂解来介导对细胞的杀伤。抗体也可简单地通过结合癌细胞表面的肿瘤相关抗原发挥作用。例如，抗体可以仅通过结合癌细胞表面上的肿瘤相关抗原来阻断肿瘤相关抗原的功能或诱导凋亡。
ADCC描述效应细胞的细胞杀伤能力，特别是淋巴细胞的细胞杀伤能力，其优选需要靶细胞被抗体标记。ADCC优选发生在抗体结合至癌细胞上的抗原并且抗体Fc结构域结合至免疫效应细胞表面上的Fc受体(FcR)时。已鉴定出几个Fc受体家族，并且特定的细胞群特征性地表达确定的Fc受体。ADCC可视为直接诱导程度可变的即时性肿瘤破坏的机制，还造成抗原的呈递和诱导肿瘤导向的T细胞应答。优选地，ADCC的体内诱导将导致肿瘤导向的T细胞应答以及进一步的宿主源性的抗体应答。
CDC是另一种可以由抗体引导的细胞杀伤方法。IgM是用于补体激活的最有效的同种型。IgG1和IgG3在通过经典补体激活途径指导CDC方面也都非常有效。优选地，在这种级联中，抗原-抗体复合物的形成导致参与的抗体分子(例如IgG分子)的CH2结构域上紧邻的多个C1q结合位点的解除遮蔽(uncloaking)(C1q是补体C1的三个亚组分之一)。优选地，这些解除遮蔽的C1q结合位点将先前的低亲和力C1q-IgG相互作用转化为高亲合力(avidity)的相互作用，触发涉及一系列其他补体蛋白的级联事件，并造成效应细胞趋化/活化剂C3a和C5a的水解释放。优选地，补体级联终止于膜攻击复合物(membrane attack complex)的形成，所述膜攻击复合物在细胞膜中打孔，促进水和溶质自由出入细胞并可能导致细胞凋亡。
在本发明的上下文中，术语“免疫效应细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应功能的细胞。例如，这类细胞分泌细胞因子和/或趋化因子、杀死微生物、分泌抗体、识别癌细胞，并任选地消除这类细胞。例如，免疫效应细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、肿瘤浸润性T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。
本发明的核酸优选为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，更优选为RNA，最优选为体外转录的RNA(IVT RNA)。本发明的核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组制备的和化学合成的分子。本发明的核酸的分子形式可为单链或双链，并且可为线性或共价封闭形成环。核酸可用于导入细胞，即转染细胞，例如以RNA的形式导入细胞，所述RNA可通过体外转录DNA模板制备。此外，在应用之前，RNA还可以通过稳定序列、加帽和聚腺苷酸化来修饰。
本文所述的核酸可包含在载体中。如本文所用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(例如λ噬菌体)、病毒载体(例如腺病毒或杆状病毒载体)或人工染色体载体(例如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC))。所述载体包括表达载体和克隆载体。表达载体包含质粒以及病毒载体，并且一般包含所需的编码序列以及在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或体外表达***中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当DNA序列。克隆载体一般用来工程化和扩增某个所需的DNA片段，并可能缺少表达所需DNA片段所需要的功能序列。
作为用来表达抗体的载体，可以使用抗体链存在于不同载体中的载体类型或抗体链存在于同一载体中的载体类型。
如本文所用，术语“RNA”表示包含核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖部分的2’位置具有羟基的核苷酸。这个术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸不同于天然RNA的改变的RNA。这类改变可以包括添加非核苷酸物质，例如添加在RNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸上。RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可被称作类似物或天然存在的RNA的类似物。
根据本发明，术语“RNA”包括并优选涉及“mRNA”，其意指“信使RNA”并涉及“转录物”，转录物可以利用DNA作为模板产生并编码肽或蛋白。mRNA通常包含5’非翻译区、蛋白或肽编码区和3’非翻译区。mRNA在细胞中和体外的半衰期有限。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及一个过程，其中DNA序列中的遗传密码转录为RNA。
本发明描述的核酸优选为已经分离的。根据本发明，术语“分离的核酸”表示所述核酸为(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链反应(PCR)；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)纯化的，例如通过切割和凝胶电泳分级分离；或(iv)合成的，例如通过化学合成。分离的核酸为可通过重组DNA技术操纵的核酸。
根据本发明，核酸可以单独存在或与其他核酸组合存在，所述其他核酸可以是同源或异源的。在优选的实施方案中，将核酸功能性连接至表达控制序列，所述表达控制序列可以与所述核酸同源或异源。术语“同源”表示核酸也天然地功能性连接，而术语“异源”表示核酸不是天然地功能性连接。
如果核酸和表达控制序列彼此共价连接的方式是使得所述核酸的表达或转录在所述表达控制序列的控制或影响下，则它们互相“功能性”连接。如果核酸翻译为功能性蛋白，则有了功能性连接至编码序列的表达控制序列，诱导所述表达控制序列导致所述核酸的转录，不会引起编码序列中的移码或所述编码序列不能翻译为期望的蛋白或肽。
根据本发明，术语“表达控制序列”或“表达控制元件”包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因的转录或mRNA的翻译的其他控制元件。在本发明的特定实施方案中，可以调节表达控制序列。表达控制序列的精确结构可以根据物种或细胞类型而变化，但是一般包括5’非转录以及5’和3’非翻译序列，其分别参与转录和翻译的起始，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具体地，5’非转录表达控制序列包含启动子区，其包括启动子序列，所述启动子序列用于对功能性连接的核酸的转录控制。表达控制序列还可以包含增强子序列或上游激活序列。
根据本发明，术语“启动子”或“启动子区”涉及一种核酸序列，其位于被表达核酸序列的上游(5’)，并且通过提供RNA聚合酶识别位点和结合位点来控制序列的表达。“启动子区”可包括与基因转录调控有关的其他因子的其他识别位点和结合位点。启动子可控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可为“诱导型”并可响应于诱导剂而启动转录，或者在转录不受诱导剂控制时则可为“组成型”。当诱导剂不存在时，受诱导型启动子控制的基因不表达或仅少量表达。当诱导剂存在时，所述受诱导型启动子控制的基因开启(switch on)或转录水平增加。通常，这是由特定转录因子的结合介导的。
本发明的启动子优选包括SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6 RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(例如CMV)，所述人工杂合启动子的一个或多个部分融合至其他细胞蛋白(例如人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶))的基因的启动子的一个或多个部分，并且包括或不包括其他的内含子。
术语“表达”在本文中以其最普遍的含义使用，包括产生RNA或RNA和蛋白或肽。至于RNA，术语“表达”或“翻译”特别涉及产生肽或蛋白。表达可以是瞬时的或稳定的。根据本发明，术语表达还包括“异常表达”或“不正常表达”。
根据本发明，“异常表达”或“不正常表达”表示与参比(例如个体未患有与某种蛋白(例如，肿瘤抗原)的异常或不正常表达相关的疾病的状态)相比，表达改变，优选增加。表达增加是指增加至少10％，特别是至少20％、至少50％或至少100％，或者更多。在一实施方案中，仅在病变组织中发现表达，而在健康的组织中的表达受到抑制。
术语“特异性地表达”表示蛋白基本上仅在特定的组织或器官中表达。例如，在胃粘膜中特异性表达的肿瘤相关抗原表示所述蛋白主要在胃粘膜中表达，并且不在其他组织中表达，或者在其他组织或器官类型中表达不显著。因此，仅在胃粘膜细胞中表达且在任何其他组织中的表达显著较少的蛋白在胃粘膜细胞中特异性地表达。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原还可以在正常状况下在一种以上的组织类型或器官中特异性地表达，例如在2种或3种组织类型或器官中，但优选在不超过3种不同的组织或器官类型中表达。在这种情况下，则肿瘤相关抗原在这些器官中特异性地表达。
根据本发明，术语“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过这个过程，信使RNA链指导氨基酸序列组装以产生蛋白或肽。
根据本发明，术语“核酸编码”表示如果存在于适当环境中，优选在细胞内，核酸可以表达以产生其编码的蛋白或肽。
术语“肽”包括寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键共价连接的2个或更多个，优选3个或更多个、优选4个或更多个、优选6个或更多个、优选8个或更多个、优选9个或更多个、优选10个或更多个、优选13个或更多个、优选16个或更多个、优选21个或更多个，并且优选多达8、10、20、30、40或50个，特别是100个氨基酸的物质。术语“蛋白”是指大肽，优选具有超过100个氨基酸残基的肽，但是一般而言，术语“肽”和“蛋白”是同义的，并且在本文中可交换使用。
优选地，本发明描述的蛋白和肽为已经分离的。术语“分离的蛋白”或“分离的肽”是指所述蛋白或肽已脱离其自然环境。分离的蛋白或肽可处于基本上纯化的状态。术语“基本上纯化的”表示蛋白或肽基本上不含与其在自然中或体内相关的其他物质。
本文给出关于特定氨基酸序列的教导，例如序列表中所示的那些，应当理解为也涉及所述特定序列的修饰(即变体)，造成与所述特定序列在功能上等价的序列，例如表现出与特定氨基酸序列相同或相似特性的氨基酸序列。一个重要的特性是保持抗体对其靶标的结合。优选地，当其在抗体中取代特定序列时，相对于特定序列修饰的序列保留所述抗体对靶标的结合。
本领域技术人员会理解，特别是，可以修饰CDR序列、高变区和可变区的序列而不会失去结合靶标的能力。例如，CDR序列与本文指定的CDR序列相同或高度同源。
“高度同源”，可以认为产生1至5个，优选1至4个，例如1至3个或1或2个取代。
根据本发明，术语“变体”还包括突变体、剪接变体、构象、同种型(isoform)、等位基因变体、物种变体和物种同源物(species homolog)，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因正常序列的改变，其意义通常不清楚。完整的基因测序通常会鉴定出给定基因的许多等位基因变体。物种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。
为了本发明的目的，氨基酸序列的“变体”包括氨基酸***变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。在蛋白的N端和/或C端包含缺失的氨基酸缺失变体还称作N端和/或C端截短变体。
氨基酸***变体包含在特定氨基酸序列中***单个或两个或更多个氨基酸。在具有***的氨基酸序列变体的情况下，将一个或多个氨基酸残基***氨基酸序列中的特定位点，虽然随机***并恰当筛选所得产物也是可行的。
氨基酸添加变体包含在氨基和/或羧基端融合一个或多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。
氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或多个氨基酸，例如去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白的任何位置。
氨基酸取代变体的特征在于去除序列中的至少一个残基并在其位置***另一残基。优选考虑修饰氨基酸序列中在同源蛋白或肽之间非保守的位置和/或用具有相似性质的其他氨基酸替代氨基酸。优选地，蛋白变体中的氨基酸改变是保守的氨基酸改变，即，带电荷相似或不带电荷的氨基酸的取代。保守的氨基酸改变涉及取代侧链相关的氨基酸家族的成员之一。天然存在的氨基酸一般分为4个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)以及不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香族氨基酸。
优选地，给定氨基酸序列和所述给定氨基酸序列变体的氨基酸序列之间的相似性，优选相同性的程度是至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选对参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出相似性或相同性程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，优选对至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸给出相似性或相同性程度，优选连续的氨基酸。在优选的实施方案中，对参考氨基酸序列的全长给出相似性或相同性程度。可以使用本领域已知的工具确定序列相似性，优选序列相同性的比对，优选利用最佳序列比对，例如，利用Align，利用标准设置，优选EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5。
“序列相似性”表示相同的或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列相同性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。
术语“相同性百分比(percentage identity)”意图表示经最佳比对之后获得的待比较的两个序列之间相同的氨基酸残基的百分比，这个百分比纯粹是统计的，并且两个序列之间的差异是随机分布的，并且分布在它们的全长上。两个氨基酸序列之间的序列比较通常通过在将其序列最佳比对之后比较这些序列来进行，所述比较通过分段或通过“比较窗口”进行，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。除了手动，用于比较的序列的最佳比对可以这样进行，通过Smith and Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法，通过Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法，通过Pearsonand Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85,2444的相似性检索方法，或者通过使用这些算法的计算机程序(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，威斯康星州麦迪逊市575科学大道)。
相同性百分比这样计算，通过确定待比较的两个序列之间相同位置的数量，将这个数量除以比较的位置数量，并将获得的结果乘以100以获得两个序列之间的相同性百分比。
根据本发明，同源氨基酸序列表现出至少40％、特别是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％且优选至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸残基的相同性。
技术人员可容易地通过例如重组DNA操纵来制备本文所述的氨基酸序列变体。例如，Sambrook等人(1989)详细描述了用于制备具有取代、添加、***或缺失的蛋白和肽的DNA序列操纵。此外，本文所述的肽和氨基酸变体可以借助已知的肽合成技术容易地制备，例如通过固相合成和类似方法。
本发明包括术语“肽”和“蛋白”所包含的本文所述的肽或蛋白的衍生物。根据本发明，蛋白和肽的“衍生物”是蛋白和肽的修饰形式。这类修饰包括任何化学修饰，并且包含与蛋白或肽相关的任何分子(例如碳水化合物、脂质和/或蛋白或肽)的单个或多个取代、缺失和/或添加。在一实施方案中，蛋白或肽的“衍生物”包括糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、肉豆蔻酰基化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、引入保护/封闭基团、蛋白水解切割或结合至抗体或其他细胞配体所致的那些修饰的类似物。术语“衍生物”还延伸至所述蛋白和肽的所有功能性化学等同物。优选地，修饰的肽稳定性增加和/或免疫原性增强或降低。
根据本发明，氨基酸序列、肽或蛋白的变体、衍生物、修饰形式、片段、部分(part)或部分(portion)优选分别具有其起源的氨基酸序列、肽或蛋白的功能特性，即其是功能等同的。在一实施方案中，氨基酸序列、肽或蛋白的变体、衍生物、修饰形式、片段、部分(part)或部分(portion)分别与其起源的氨基酸序列、肽或蛋白是在免疫学上等同的。在一实施方案中，功能特性是一种免疫学特性。
根据本发明，术语“起源”表示特定的实体，特别是特定序列，存在于其起源的物体中，特别是生物体或分子。在氨基酸序列的情况下，特别是特定序列区域，“起源”特别表示相关的氨基酸序列起源其存在的氨基酸序列。
术语“细胞”或“宿主细胞”优选是完整细胞，即具有完整膜的尚未释放其正常胞内组分例如酶、细胞器或遗传物质的细胞。完整细胞优选是活细胞，即能够进行其正常代谢功能的活细胞。根据本发明，术语“细胞”包括原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、HEK293细胞、HELA细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类的细胞。细胞可源自大量组织类型，并且包括原代细胞和细胞系。术语“细胞”包括非癌细胞和癌细胞，例如本文公开的癌症类型的细胞。
包含核酸分子的细胞优选表达所述核酸编码的肽或蛋白。
“靶细胞”是指作为免疫应答(例如抗体)的靶标的细胞。靶细胞包括任何不良细胞，例如本文所述的癌细胞。在优选的实施方案中，靶细胞是表达CLDN6的细胞。表达CLDN6的细胞通常包括癌细胞。
术语“转基因动物”是指具有包含一个或多个转基因的基因组的动物，并且优选能够表达转基因，所述一个或多个转基因优选抗体重链和/或轻链转基因或转染色体(整合或未整合到动物天然基因组DNA中)。例如，转基因小鼠可以具有人轻链转基因以及人重链转基因或人重链转染色体，以便当用CLDN6抗原和/或表达CLDN6的细胞免疫小鼠时，产生人抗CLDN6抗体。人重链转基因可以像转基因小鼠(例如HuMAb小鼠，例如HCo7或HCol2小鼠)中的那样整合到小鼠的染色体DNA中，也可以像WO 02/43478中所述的转染色体(例如KM)小鼠那样保持在染色体外。这样的转基因和转染色体小鼠可以通过利用V-D-J重组和同种型转换产生针对CLDN6的人单克隆抗体的多种同种型(例如IgG、IgA和/或IgE)。
术语“在免疫学上等同”表示在免疫学上等同的分子，例如免疫学上等同的氨基酸序列，表现出相同或基本相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本相同的免疫学效应，例如，在免疫学效应的类型方面，例如诱导体液免疫反应、诱导的免疫反应的强度和/或持续时间或者免疫反应的特异性。在本发明的上下文中，术语“在免疫学上等同”优选用于肽或肽的变体或者抗体的免疫作用或特性，其中所述肽或肽的变体用于免疫接种。特定的免疫学特性是结合抗体的能力以及在适当时产生免疫应答的能力，优选通过刺激抗体的产生。例如，当暴露于个体的免疫***时，如果氨基酸序列诱导免疫反应，优选抗体，所述抗体具有与参考氨基酸序列(例如组成CLDN6部分的参考氨基酸序列)反应的特异性，则所述氨基酸序列与所述参考氨基酸序列在免疫学上等同。
本发明提供了一种方法，用于检测样品中CLDN6抗原的存在或确定CLDN6抗原的量，包括在允许抗体和CLDN6之间形成复合物的条件下，使样品和任选的对照样品与本发明的结合CLDN6的抗体接触。然后检测复合物的形成，其中所述样品与对照样品相比形成复合物的差异指示样品中存在CLDN6抗原。
如上所述的方法尤其可用于诊断CLDN6相关疾病，例如癌症，例如本文所述的癌症。优选地，样品中CLDN6的量高于参考样品或对照样品中的CLDN6的量，指示在所述样品起源的个体(特别是人)中存在CLDN6相关的疾病。
当用于如上所述的方法中时，本文所述的抗体可带有标记，其功能为：(i)提供可检测的信号；(ii)与第二标记相互作用以修饰第一或第二标记提供的可检测信号，例如FRET(荧光共振能量转移)；(iii)影响迁移率，例如通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数影响电泳迁移率；或(iv)提供捕获部分，例如亲和力、抗体/抗原或离子络合。适合用作标记的结构为例如荧光标记、发光标记、生色团标记、放射性同位素标记、同位素标记(优选稳定的同位素标记)、同量异序标记(isobaric label)、酶标记、颗粒标记(特别是金属颗粒标记、磁性颗粒标记、聚合物颗粒标记)、小有机分子(例如生物素)、受体的配体或结合分子(例如细胞粘附蛋白或凝集素)、可以通过用结合物质(binding agent)检测的包含核酸和/或氨基酸残基的标记序列等。标记以非限制性的方式包括硫酸钡、碘西他酸(iocetamicacid)、碘番酸(iopanoic acid)、碘泊酸钙(calcium ipodate)、泛影酸钠(sodiumdiatrizoate)、泛影葡胺(meglumine diatrizoate)、甲泛葡胺(metrizamide)、酪泮酸钠(sodium tyropanoate)和放射诊断剂，放射诊断剂包括正电子发射体(例如氟-18和碳-11)、伽马射线发射体(例如碘-123、锝-99m、碘-131和铟-111)、用于核磁共振的核素(例如氟和钆)。
根据本发明，“参考物”(例如参考样品或参考生物体)可以用于关联和比较在本发明的方法中从测试样品或测试生物体获得的结果。通常，参考生物体是健康的生物体，特别是未患有例如癌症之类疾病的生物体。通过测量足够大量的参考物，可以根据经验从参考物确定“参考值”或“参考水平”。优选地，参考值通过测量至少2个、优选至少3个、优选至少5个、优选至少8个、优选至少12个、优选至少20个、优选至少30个、优选至少50个或优选至少100个参考物来确定。
如本文所用的“减少”或“抑制”表示引起水平总体减少的能力，优选5％或更大、10％或更大、20％或更大，更优选为50％或更大，最优选为75％或更大。术语“抑制”或相似短语包括完全或基本上完全抑制，即减少至0或基本上至0。
术语如“增加”或“增强”优选涉及增加或增强约至少10％，优选至少20％、优选至少30％，更优选至少40％、更优选至少50％，甚至更优选至少80％，并且最优选至少100％。
本文所述的物质、组合物和方法可以用来诊断患有疾病的个体。可以诊断的疾病包括表达CLDN6的所有疾病。特别优选的疾病是癌症，例如本文所述的癌症。
根据本发明，术语“疾病”是指任何病理状态，包括癌症，特别是本文所述的那些癌症形式。
如在术语“正常组织”或“正常状况”中使用的术语“正常”是指健康的组织或健康的个体的状况，即非病理状况，其中“健康的”优选表示非癌性的。
根据本发明，“涉及表达CLDN6的细胞的疾病”表示CLDN6在病变组织或器官的细胞中表达。在一实施方案中，与健康的组织或器官中的状态相比，CLDN6的表达增加。增加是指增加至少10％，特别是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。在一实施方案中，仅在病变组织中发现表达，在健康的组织中表达被抑制。根据本发明，涉及表达CLDN6的细胞或与表达CLDN6的细胞相关的疾病包括癌症，特别是本文所述的那些癌症形式。
根据本发明，术语“肿瘤(tumor)”或“肿瘤疾病(tumor disease)”是指由细胞(称作赘生性(neoplastic)细胞或肿瘤细胞)的异常生长形成的肿胀或病变。“肿瘤细胞”表示异常的细胞，其通过快速、不受控制的细胞增殖生长，并在引发新生长的刺激停止之后继续生长。肿瘤表现出部分或完全缺乏与正常组织的结构组织和功能性协调，并且通常形成可能是良性(benign)、恶变前(pre-malignant)或恶性(malignant)的明显的组织块。
良性肿瘤是缺乏癌症的所有三种恶性特性的肿瘤。因此，根据定义，良性肿瘤不会以无限制性、侵略性的方式生长，不会侵袭周围组织，也不会扩散到不相邻的组织(转移)。良性肿瘤的常见例子包括痣和子宫肌瘤。
术语“良性”表示轻度和非进行性疾病，实际上，许多类型的良性肿瘤对健康无害。但是，一些由于缺乏癌症的浸润特性被定义为“良性肿瘤”的赘生物(neoplasm)，仍可能对健康产生负面影响。这样的例子包括产生“肿块效应”(挤压重要器官，例如血管)的肿瘤，或内分泌组织的“功能性”肿瘤，这类肿瘤可能过量产生某些激素(实例包括甲状腺腺瘤、肾上腺皮质腺瘤和垂体腺瘤)。
良性肿瘤通常被抑制其恶性行为能力的外表面包裹。在某些情况下，某些“良性”肿瘤可能之后会导致恶性癌症，这是由于肿瘤的赘生细胞的亚群中其他遗传变化所致。这种现象的一个突出例子是管状腺瘤，它是作为结肠癌重要先兆的结肠息肉的一种常见类型。像大多数通常发展为癌症的肿瘤一样，管状腺瘤中的细胞表现出细胞成熟和外观上的某些异常，统称为异型增生(dysplasia)。这类细胞异常没有在很少或从不发展成癌症的良性肿瘤中发现，但是可见于不形成离散肿块的其他癌前组织异常，例如***前病变。一些权威人士倾向于将异型增生的肿瘤称为“恶变前”，而对很少或从不导致癌症的肿瘤保留“良性”一词。
赘生物是由于赘生(neoplasia)形成的组织异常肿块。赘生(希腊语中的新生长)是细胞的异常增殖。细胞的生长超过周围的正常组织，并且与周围的正常组织不协调。即使在停止刺激后，所述生长也以同样的过度方式持续存在。它通常会造成肿块或肿瘤。赘生物可能是良性、恶变前或恶性的。
根据本发明，“肿瘤的生长”或“肿瘤生长”涉及肿瘤增大其尺寸的趋势和/或肿瘤细胞增殖的趋势。
癌症(医学术语：恶性赘生物)是一类疾病，其中一组细胞表现出不受控制的生长(超出正常限度的***)、侵袭(侵入和破坏邻近组织)并有时发生转移(通过淋巴或血液扩散到身体的其他位置)。癌症的这三种恶性特性使它们与良性肿瘤区分开来，良性肿瘤是自限性的并且不会侵袭或转移。大多数癌症都会形成肿瘤，但某些癌症(例如白血病)不会。根据本发明，术语“癌症”和“肿瘤”或“癌症疾病”和“肿瘤疾病”在本文中通常可互换使用来表示这样的疾病，其中细胞表现出不受控制的生长以及任选地侵袭和/或转移。
优选地，根据本发明，“癌症”的特征在于表达CLDN6的细胞。表达CLDN6的细胞优选为癌细胞，优选为本文所述的肿瘤和癌症。优选地，这种细胞是除胎盘细胞以外的细胞。
癌症按照类似于肿瘤的细胞的类型以及由此推测的肿瘤起源组织来分类。这些分别是组织学和位置上的。
根据本发明，术语“癌症”包括白血病、***瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、***、肠癌(intestinal cancer)、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌(intestine cancer)、头颈癌、胃肠道癌、***癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、***癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移。其实例为肺癌、***癌、***癌、结肠癌、肾细胞癌、***或者上述癌症类型或肿瘤的转移。根据本发明，术语癌症还包括癌症转移。
肺癌的主要类型是小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞肺癌有三种主要的亚型：鳞状细胞癌、腺癌和大细胞肺癌。腺癌占肺癌的约10％。与小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌都倾向于位于中心位置相比，这种癌症通常在肺部周围可见。
根据本发明，“癌(carcinoma)”是源自上皮细胞的恶性肿瘤。这组代表最常见的癌症，包括乳腺癌、***癌、肺癌和结肠癌的常见形式。
“腺癌”是起源于腺组织的癌症。这类组织也是称作上皮组织的较大组织类别的一部分。上皮组织包括皮肤、腺体和衬在体腔和器官中的各种其他组织。上皮在胚胎学上来源于外胚层、内胚层和中胚层。要被归类为腺癌，细胞不必须是腺体的一部分，只要它们具有分泌特性即可。这种癌形式可发生在包括人类的某些高级哺乳动物中。分化良好的腺癌倾向于类似其起源的腺组织，而分化差的腺癌则可能并非如此。通过对活检组织中的细胞进行染色，病理学家将确定肿瘤是腺癌还是其他类型的癌症。由于腺体在体内无处不在，腺癌可以出现在体内的许多组织中。虽然每种腺体不一定分泌相同的物质，但只要细胞具有外分泌功能，那它就被认为是腺体，并且它的恶性形式就被称为腺癌。恶性腺癌会侵袭其他组织，并且如果有足够的时间转移通常会转移。卵巢腺癌是最常见的卵巢癌类型。它包括浆液性和粘液性腺癌、透明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。
“转移”是指癌细胞从其原始部位扩散到身体的另一部分。转移的形成是一个非常复杂的过程，并且依赖于恶性细胞脱离原发性肿瘤，侵袭细胞外基质，穿透内皮基底膜进入体腔和血管，然后经血液运输，渗透到靶器官。最后，新肿瘤即继发性肿瘤或转移性肿瘤在靶部位上的生长取决于血管生成。因为肿瘤细胞或组分可能残留并发展出转移潜能，即使在去除原发性肿瘤之后，肿瘤转移也经常发生。在一实施方案中，根据本发明，术语“转移”涉及“远处转移”，其涉及远离原发性肿瘤和区域******的转移。
继发性或转移性肿瘤的细胞类似于原始肿瘤中的细胞。这意味着，例如，如果卵巢癌转移到肝脏，则继发性肿瘤由异常的卵巢细胞而不是异常的肝细胞组成。肝脏中的这种肿瘤于是称作转移性卵巢癌，而不是肝癌。
当人再次受到过去影响他们的疾病的影响时，就会发生复发或再发。例如，如果患者已患有癌症，已接受所述疾病的成功治疗并且再次发展所述疾病，则所述新发展的疾病可被认为是复发或再发。但是，根据本发明，癌症的复发或再发可以但不必发生在原始癌症的部位。因此，例如，如果患者已患有卵巢肿瘤并且已接受成功治疗，则复发或再发可以是卵巢肿瘤的发生或在不同于卵巢的部位的肿瘤的发生。肿瘤的复发或再发还包括这样的情况，其中肿瘤发生在不同于原始肿瘤的部位的部位以及原始肿瘤的部位。优选地，患者已接受治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤，在与原始肿瘤部位的不同的部位的肿瘤是继发性或转移性肿瘤。
“治疗”是指向受试者给药化合物或组合物以预防或消除疾病，包括减少受试者中肿瘤大小或肿瘤数量；阻止或减慢受试者中的疾病；抑制或减缓受试者中新疾病的发展；降低当前或先前患有疾病的受试者中的症状和/或复发的频率或严重性；和/或延长，即增加受试者的寿命。
特别地，术语“疾病的治疗”包括治愈、缩短持续时间、改善、预防、减慢或抑制进展或恶化，或预防或延迟疾病或其症状的发作。
“有风险”表示个体，即患者，其与一般群体相比，被鉴定为发展疾病(特别是发展癌症)的机会比正常更高。此外，曾经患有或目前患有疾病(特别是癌症)的个体是发展疾病的风险增加的个体，因为这样的个体可能继续发展疾病。目前患有或以前患有癌症的个体的癌症转移的风险也增加。
术语“免疫疗法”涉及包括特异性免疫反应的治疗。
在本发明的上下文中，术语例如“保护”、“防止”、“预防”、“保护性”或“预防性”涉及个体中疾病的发生和/或传播的预防或治疗或两者，特别是最小化个体发展疾病的机会或延缓疾病的发展。例如，如上文所述，有肿瘤风险的人将成为预防肿瘤疗法的候选人。免疫疗法可以利用多种技术中的任何技术进行，其中试剂的作用是从患者中去除表达抗原的细胞。
在某些实施方案中，免疫疗法可以是主动免疫疗法，其中治疗依赖于通过给药免疫应答调节物质(例如免疫反应性肽和核酸)体内刺激内源宿主免疫***来对抗病变细胞。
在其他实施方案中，免疫疗法可以是被动免疫疗法，其中治疗涉及递送具有确定的肿瘤免疫反应性的物质(例如抗体)，其可直接或间接介导抗肿瘤作用并且不必依赖完整的宿主免疫***。
术语“体内”涉及个体中的情况。
术语“受试者”、“个体”、“生物体”或“患者”可互换使用，并且涉及脊椎动物，优选哺乳动物。例如，本发明上下文中的哺乳动物为人、非人灵长类动物、家养动物(例如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等)、实验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)以及人工饲养的动物(例如动物园的动物)。本文所用的术语“动物”还包括人类。术语“受试者”还可包括患者，即患有疾病的动物，优选患有疾病的人，所述疾病优选本文所述疾病。
根据本发明，“样品”可以是根据本发明任何有用的样品，特别是生物样品，例如包括体液的组织样品和/或细胞样品，并且可以以常规方式获得，例如通过组织活检(包括打孔活检)获得，以及通过采取血液、支气管抽出物、痰、尿液、粪便或其他体液获得。根据本发明，术语“样品”还包括加工过的样品，例如生物样品的级分或分离物，例如核酸和肽/蛋白分离物。优选地，样品包含要检查的器官的细胞或组织，例如将要进行癌症诊断的器官。例如，如果要诊断的癌症是肺癌，则样品可能包含从肺获得的细胞或组织。
根据本发明，样品可以是例如得自含有或预期含有肿瘤或癌细胞的患者的身体样品。身体样品可以是任何组织样品，例如血液、从原发性肿瘤或转移性肿瘤获得的组织样品或含有肿瘤或癌细胞的任何其他样品。
通过下文的附图和实施例详细描述本发明，其仅用于说明目的而不是表示限制。由于本说明书和这些实施例，本领域技术人员可以得到同样包括在本发明内的其他实施方案。
附图说明
图1A：紧密连接蛋白6和紧密连接蛋白9蛋白(人/鼠)的序列比对
序列比对显示人和小鼠紧密连接蛋白6与人紧密连接蛋白9之间的高度同源性。
图1B：紧密连接蛋白6和紧密连接蛋白3、4和9蛋白(人)的序列比对
序列比对显示紧密连接蛋白多基因家族的高度同源性
图2A和2B：用蛋白质免疫印记分析测试抗体的特异性
用经模拟、人CLDN3、4、6或9转染的HEK293细胞和CLDN6阳性肿瘤细胞(PA-1SC12和NEC-8)的细胞裂解物进行印迹实验，并通过缀合了过氧化物酶的二抗检测结合的抗体(兔抗CLDN3抗体(Invitrogen)0.5μg/mL、小鼠抗CLDN4抗体(Invitrogen)1μg/mL、兔抗CLDN6抗体(IBL)0.2μg/mL、山羊抗CLDN9抗体(Santa Cruz)0.4μg/mL或小鼠单克隆抗体(5μg/mL))。
图3：蛋白质免疫印记阳性抗体的组织学分析
与rb-抗CLDN6 IBL抗血清相比，先导mumAB 58-1B、58-3A和58-4B对卵巢癌的FFPE切片的结合。
图4A：使用合成重叠肽进行表位作图
将重叠的肽固定在微量滴定板上，并加入抗体。用适当的缀合了过氧化物酶的第二试剂使结合的抗体显影。
图4B：使用生物素化的合成重叠肽进行表位作图
合成了通过柔性亲水性连接子在N端进行生物素化的高度重叠的肽，并将其上样到StrepAvidin偶联的微量滴定板上。应用抗体(1μg/mL)并检测和分析结合的抗体。
为了比较mumAB 58-4B-2与rb-血清(IBL)的信号强度，将抗体与C端肽19的最大结合定义为100％。
相对于各测试***的最大结合，计算每种抗体与一种肽的结合强度。
在3个独立实验中一式三份分析了mumAB的结合
在2个独立实验中一式三份分析了IBL-血清的结合
图4C：单克隆先导58-4B-2和多克隆rb-抗CLDN6-血清(IBL)的结合位点。
图5：抗体58-1B、58-3A和58-4B的序列
图6：正常卵巢组织上不同抗体的背景信号
在正常卵巢组织上比较先导抗体mumAB 58-1B、58-3A和58-4B与市售IBL抗体(抗体浓度5μg/ml；类诊所的方案(clinic-like protocol))。
实施例
本文使用的技术和方法在本文中描述，或以本身已知的或如下描述的方式进行：Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y。除非另有说明，所有方法(包括试剂盒和试剂的使用)均根据制造商的信息进行。
实施例1：材料和方法
抗体结合位点的作图(图4A)
可按照Glenn E.Morris的“Epitope Mapping Protocols(Methods in MolecularBiology)”ISBN-089603-375-9与Olwyn M.R.Westwood、Frank C.Hay的“Epitope Mapping:A Practical Approach”Practical Approach Series,248的详细描述对抗体识别的表位进行作图。
用生物素化的肽进行表位作图(图4B)
进行了肽ELISA，以鉴定单克隆鼠先导抗体和IBL的多克隆rb-血清的抗体结合位点。将覆盖CLDN6的C端序列的生物素化重叠肽与SA包被的板偶联。将纯化的mumAB(1μg/ml)或IBL rb-血清(1μg/ml)应用于抗原包被的ELISA板上，并洗去未结合的抗体。用相应的酶标记的二抗(碱性磷酸酶山羊抗小鼠IgG(1+2a+2b+3)或碱性磷酸酶山羊抗兔IgG F(ab)2)和ABTS酶底物检测结合的抗体，并分析信号强度。
为了比较mumAB 58-4B-2与rb-血清(IBL)的信号强度，将抗体与C端肽19的最大结合定义为100％。
相对于各测试***(小鼠或兔)的最大结合，独立计算每种抗体与一种肽的结合强度。
在3个独立实验中一式三份分析了mumAB的结合
在2个独立实验中一式三份分析了IBL-血清的结合
同种型测定
按照制造商的说明使用IsoStrip小鼠单克隆抗体分型试剂盒(Roche，目录号1493027)来确定纯化抗体的同种型。
蛋白质免疫印迹
新产生的抗CLDN6 IgG对CLDN6抗原的特异性结合可以通过蛋白质免疫印迹进一步检测。简而言之，可以从表达CLDN3、4、6或9的细胞和适当的阴性对照制备细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离出的抗原转移到硝酸纤维素膜上，封闭并用待测试的单克隆抗体进行探测。可以用抗小鼠IgG过氧化物酶检测IgG结合，并用ECL底物显影。
组织学
免疫组织化学(IHC)在4％***固定的石蜡包埋的组织样品切片上进行。石蜡包埋根据标准方案进行。
脱蜡和水化后，通过在添加有15mM叠氮化钠(pH 9.0)的0.1M Tris/0.01M EDTA缓冲液中于95-98℃煮沸30分钟，对所有切片进行抗原修复，然后通过加入添加有15mM NaN3的3％H2O2淬灭内源性过氧化物酶。用添加有0.05％(w/v)Tween-20和0.005％(w/v)Proclin的150mM氯化钠缓冲液(pH 7.6)洗涤后，将切片与1.0或5.0μg/ml诊断性单克隆小鼠抗CLDN6抗体58-4B在室温下孵育1小时。抗体结合可视化利用含有基于聚合物的辣根过氧化物酶标记的二抗(Histofine MAX PO(M)/UIO MAX PO(M)，Nichirei，日本)的即用溶液进行。随后用Mayer苏木精(Carl Roth GmbH，德国卡尔斯鲁厄)对切片进行复染，并由评估者评估。
组织学评估
对于所有样品，分析每个切片上阳性染色肿瘤细胞相对于所有可见肿瘤细胞的比例。染色强度分为阴性(-)、弱阳性(1+)、中度阳性(2+)和强阳性(3+)。只有膜染色被认为是阳性的。卵巢癌组织用作每种染色的阳性对照。另外，在妊娠期第29天发现新西兰白兔的胚胎肾脏组织显示出较强的阳性染色强度。它被用作染色阳性(2+至3+)的染色强度的内部参考物。
实施例2：单克隆抗体的制备
此课题的目的是制备CLDN6特异性的鼠单克隆抗体，所述抗体能够检测卵巢癌或任何组织学类型的任何其他癌组织(包括原发性腹膜肿瘤或输卵管肿瘤FFPE组织)中表达CLDN6的肿瘤细胞。
为了制备高特异性、高亲和力的诊断性CLDN6抗体，用多种不同的免疫原(表1)和佐剂开始免疫方案至关重要。在课题期间，约130只小鼠(C57BL/6和BALB/c)接受了多种免疫策略以触发CLDN6免疫应答(表2)。
为了触发小鼠免疫***并克服免疫耐受，我们使用了肽缀合物和编码人CLDN6的不同部分的重组蛋白，其表达为具有不同表位的重组融合蛋白以便促进亲和纯化(聚组氨酸-(HIS)-标签和谷胱甘肽-S-转移酶-(GST)-标签)(表1)。
在20种不同的免疫策略中，用GST标记的CLDN6 C端重组蛋白(表2)与各种佐剂(表2)组合处理小鼠得到最佳结果。
在融合当天，分离小鼠脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653(ATCC)融合。对于小鼠细胞与骨髓瘤细胞系的融合，我们遵循
Figure BDA0002403375900000501
和Milstein 1975年发布的标准方案。经次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)选择后，用ELISA测试上清液分泌的抗体，所述抗体识别用于免疫的抗原。
进行了69次融合，筛选了超过25,000个杂交瘤细胞克隆。对ELISA阳性的上清液(402)的杂交瘤细胞进行亚克隆以产生单克隆杂交瘤。用ELISA重新筛选亚克隆杂交瘤细胞的上清液与紧密连接蛋白6抗原的结合。扩增了88个阳性克隆(结合抗原但不结合主链(backbone)或标签)的杂交瘤细胞，并用蛋白质免疫印记进一步分析上清液的特异性。
三个先导候选抗体(58-4B、58-1B和58-3A)得自11步免疫策略(免疫#10达123天)。脾切除术前三天，对小鼠加强免疫以激活靶向的B细胞，然后融合58(表3)。
实施例3：单克隆抗体的蛋白质免疫印记筛选
为了测试上清液中ELISA阳性的抗体是否能够特异性结合重组紧密连接蛋白6，用蛋白质免疫印记对其进行了分析。纯化结合CLDN6但不结合任何其他标记的蛋白的抗体，并扩增与冷冻保存细胞。利用MABselect Protein A亲和树脂通过FPLC纯化抗体。用蛋白质免疫印记重新分析通过蛋白质免疫印记筛选所选择的纯化抗体，以评估其对CLDN6阳性肿瘤细胞系(PA-1、NEC-8)以及CLDN3、4、6或9转染的HEK293细胞的结合(图2)。此外，通过免疫组织化学评估抗体在***固定的石蜡包埋的组织(FFPE)中结合抗原的能力。纯化了特异性结合紧密连接蛋白6的33种杂交瘤的上清液，进一步进行免疫组织化学分析。
实施例4：蛋白质免疫印迹阳性的抗体的组织学分析
这个实验的目的是测试抗体的CLDN6特异性和灵敏度。这是通过利用表达CLDN6的FFPE卵巢癌组织完成的(图3)。
在第一个实验中，在卵巢癌FFPE切片上以1μg/ml和5μg/ml的浓度分析在第一次蛋白质免疫印迹筛选中检测为阳性的纯化抗体。用实验室标准的和既有的过夜染色方案，用柠檬酸抗原修复缓冲液和120℃抗原修复温度。将显示组织特异性CLDN6染色但不产生高水平的非特异性背景染色的抗体在各种卵巢癌组织上进一步滴定至0.2、1、2和5μg/ml，以进一步评估这些抗体的灵敏度和特异性。因为在0.2μg/ml的浓度下无法清楚地评估不同抗体的染色强度差异，在接下来的开发阶段，直接在1和5μg/ml的较高浓度下测试新产生的抗体。选择在所选组织的卵巢肿瘤组织的细胞膜上产生强信号且在相邻健康组织上几乎无背景的抗体用于进一步的滴定实验和特异性分析。以下三种抗体符合这些标准，并被选作先导候选抗体进行进一步研究：58-1B、58-3A和58-4B。
实施例5：mumAb的表位作图(图4)
进行肽ELISA以鉴定CLDN6上的抗体结合表位。利用覆盖CLDN6的C端序列的重叠11个aa的肽测试每种纯化的抗体。抗体46-5A、58-1B、58-3A、58-4B和58-9B对肽AISRGPSEYPTKNYV(肽7；图4A)所覆盖的表位表现出特异性结合。利用15个aa中14个重叠的生物素化的肽对这些抗体的结合位点进一步表征。
令人惊讶的是，结合序列EYPTKNY的抗体58-1B、58-3A和58-4B以及亚克隆58-4B-2(图4B)能够以较低的背景显著地特异性结合FFPE癌组织中的CLDN6。相反，抗体46-5A能够结合不包含序列EYPTKNY但包含其一部分即序列EYPTK的肽(图4B)。市售的rb-抗CLDN6多克隆抗血清(IBL)结合包含序列RGPS的肽(图4C)。
实施例6：用正常组织小组分析抗体特异性
用实验室标准的和既有的染色方案，在各种相关的正常的(即健康的)供体组织(例如肺、睾丸、子宫和卵巢)上进一步分析在测试的卵巢癌组织上产生较强信号的抗体(58-1B、58-3A和58-4B)，以确保较高的CLDN6靶标特异性。用实验室标准的和既有的染色方案(过夜；120℃抗原修复温度，柠檬酸抗原修复缓冲液)对这些选取的组织进行染色。
除了在一个卵巢组织样品的单个***区域出现微弱的非特异性信号外，所选择的三种抗体均未在测试的正常组织小组上产生非特异性染色信号。这种微弱的信号仅在两种测试浓度(1和5μg/ml)中的较高浓度下可见，不代表卵巢的亚结构。
实施例7：用卵巢癌和正常组织小组样品比较抗体的灵敏度
在先前的实验中，抗体58-3A、58-1B和58-4B的染色模式和染色强度未见显著差别。因此，用抗体进行更加临床导向的染色实验，意味着更省时的染色方案。为了模拟在标准病理实验室中应用的染色过程，建立具有一抗孵育1小时的步骤和水浴(98℃)抗原修复步骤的“一日方案”。此外，比较了两种不同的抗原修复缓冲液，以测试不同的抗原修复条件是否会影响被测抗体检测CLDN6的灵敏度。
对于所有抗体，与标准柠檬酸抗原修复缓冲液相比，用Tris缓冲液修复抗原的改良“一日方案”产生更强烈的信号和更高数量的阳性染色肿瘤细胞。58-4B产生最强的染色信号，3+染色肿瘤细胞的高达80％，而候选抗体58-1B的染色强度最低，占3+染色肿瘤细胞的仅30％。
随后将产生最灵敏的染色信号的用Tris缓冲液修复抗原的染色方案应用于正常组织小组的染色，以在常规临床实验室条件下测试所选抗体的特异性。
用58-4B诊断抗体候选物在FFPE组织中获得了最佳的CLDN6特异性和灵敏度。在正常组织上未检测到信号。所有其他抗体在睾丸样品的Reinke晶体上产生信号。另外，58-3A抗体在血管上产生弱染色。58-1B抗体在睾丸和卵巢正常组织上显示出更强的信号(1+)。
在所有分析的样品中，mumAb 58-4B在相关肿瘤组织上呈现出无背景染色且染色强烈，表现更佳，而mumAb 58-3A和58-1B候选抗体在相关肿瘤组织上均显示强烈染色，但背景信号较高。特别是mumAb 58-1B产生高信号强度，但缺点是背景染色高。
为了以后在临床中的用途，将用于产生诊断抗体候选物的相应杂交瘤适配于无血清培养基。不幸的是，克隆58-3A无法适应无血清条件。因此，抗体候选物58-3A也被排除在进一步的组织学研究之外，剩下58-4B作为最终的先导候选抗体。
实施例8：组织学深度分析和抗体表征
第一步，使用正常组织小组TMA(MNO961)比较在无血清条件下产生的58-4B抗体批次与在血清条件下产生的抗体批次，以检测这两个批次间靶标灵敏度和特异性的差异。使用成分公开(royalty-free components)的类诊所“一日方案”(水浴修复抗原、用Tris缓冲液修复抗原)进行染色。两个抗体批次在一些正常组织样品中均检测到淡淡的染色(参见表4)。与在血清条件下产生的抗体相比，无血清抗体批次更干净，在分析的样品上的假点(artificial spot)更少。在睾丸上，两个抗体批次在Reinke晶体上均可见染色信号。
第二步，在卵巢癌TMA图板上测试无血清条件下产生的抗体，并将其与市售的IBL抗体进行比较。这个市售的抗体已用于先前的染色研究中。多克隆IBL抗体用于研究方案(过夜，120℃抗原修复温度，用柠檬酸缓冲液修复抗原)。58-4B抗体用于常规类诊所方案(“一日方案”，水浴修复抗原，用Tris缓冲液修复抗原)。
在测试的72例TMA卵巢癌病例中，使用IBL抗体时只有一个样品呈阳性。相反，使用58-4B抗体染色时，测试的72例样品中14例呈CLDN6阳性。
不幸的是，商业卵巢癌TMA样品的质量低下，导致阳性肿瘤样品上的染色信号较弱。因此，使用Dhaene博士的肿瘤切除标本重复比较，所述标本代表肺、子宫和睾丸的较大肿瘤区域，肿瘤标本保存质量较高。
与用多克隆IBL抗体进行的染色相比，58-4B染色对肿瘤样品中CLDN6的检测更加灵敏与特异，这意味着更多的肿瘤细胞为阳性，并且检测到的染色肿瘤细胞强度更强。
实施例9：先导抗体的序列分析
抗体58-1B、58-3A和58-4B的序列分析示于图5与下文。
58-4B-2先导抗体的氨基酸序列分析
Figure BDA0002403375900000541
58-1B抗体的氨基酸序列分析
Figure BDA0002403375900000551
58-3A抗体的氨基酸序列分析
Figure BDA0002403375900000552
表1：免疫原总览
Figure BDA0002403375900000553
表2：产生抗体的免疫方案
Figure BDA0002403375900000561
表3：先导抗体的免疫方案
小鼠569免疫#10–融合58
Figure BDA0002403375900000571
表4：在正常组织小组上测试的两个批次
Figure BDA0002403375900000581
Figure BDA0002403375900000591
Figure BDA0002403375900000601
生物材料的附加页
其他保藏事项的说明:
1)保藏单位名称和地址:
莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物菌种保藏中心
德国38124不伦瑞克，因霍芬路7B
Figure BDA0002403375900000611
对上述所有保藏的补充说明:
-小鼠(Mus musculus)骨髓瘤A8.653与小鼠(Mus musculus)脾细胞融合
-分泌抗人CLDN6抗体的杂交瘤
2)保***：
上述所有保藏均由以下做出:
加尼梅德药物有限公司(Ganymed Pharmaceuticals AG)
德国55131美因茨，金矿路12号
序列表
<110> 加尼梅德药物有限公司
<120> 用于癌症诊断的抗体
<130> 342-99 PCT2
<150> PCT/EP2017/072386
<151> 2017-09-06
<160> 61
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
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Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val
20 25 30
Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu
35 40 45
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
50 55 60
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Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu
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<213> Homo sapiens
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Gly Trp Leu Gly Thr Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Leu Trp Lys Val
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Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Leu Leu
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Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Met Leu
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val
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Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Gly Trp Leu Ala Val Met Leu Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val
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Gly Ala Ser Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu
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Val
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Asp Ala Gln Lys Arg Glu Leu
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Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu
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Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Ala Cys Ser Ser Gly Gly Thr Gln Gly
180 185 190
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<223> Peptide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Peptide
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Leu Leu Cys Cys Ala Cys Ser Ser Gly Gly Thr Gln Gly Pro Arg His
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<220>
<223> Peptide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Peptide
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<213> Artificial Sequence
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Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser
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20 25 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antibody chain
<400> 44
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85 90 95
Thr Arg Glu Phe Tyr Ala Thr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antibody chain
<400> 45
Asp Ile Val Leu Thr Gln Asn Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Thr Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Met Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ser
100 105 110
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide
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Cys Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu
1 5 10 15
Leu
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<220>
<223> Peptide
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Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly
1 5 10 15
Pro Ser His Tyr
20
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide
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Cys Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser
1 5 10 15
Glu Tyr Pro Thr Lys
20
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<212> PRT
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<220>
<223> Peptide
<400> 49
Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly Pro Ser His Tyr Met
1 5 10 15
Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu
20 25 30
Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val
35
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide
<400> 50
Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp Ser Lys Ala Arg Leu
1 5 10 15
Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser Gly Val Leu Thr Leu
20 25 30
Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile Arg Asp Phe Tyr Asn
35 40 45
Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu Gly Ala
50 55 60
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Gly Tyr Ile Phe Thr Thr Tyr Trp
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Ile Phe Pro Gly Asn Ser Asp Thr
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<220>
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Thr Arg Glu Phe Tyr Ala Thr
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Gln Asn Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
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Leu Met Ser
1
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Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr
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1 5
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Glu Tyr Pro Thr Lys
1 5
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1 5
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<211> 6
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<220>
<223> Peptide
<400> 61
Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr
1 5

Claims (23)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其结合：
(i)具有氨基酸序列EYPTKNY(SEQ ID NO：38)的肽，和/或
(ii)紧密连接蛋白6(CLDN6)，其中所述抗体或其抗原结合片段通过至少与CLDN6内的表位结合来结合CLDN6，所述表位具有氨基酸序列EYPTKNY(SEQ ID NO：38)，和/或
(iii)具有氨基酸序列EYPTKNYV(SEQ ID NO：29)的肽，和/或
(iv)紧密连接蛋白6(CLDN6)，其中所述抗体或其抗原结合片段通过至少与CLDN6内的表位结合来结合CLDN6，所述表位具有氨基酸序列EYPTKNYV(SEQ ID NO：29)，和/或
(v)具有氨基酸序列AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：15)的肽，其中所述抗体或其抗原结合片段不结合具有氨基酸序列TSAPAISRGPSEYPT(SEQ ID NO：14)的肽，和/或
(vi)紧密连接蛋白6(CLDN6)，其中所述抗体或其抗原结合片段通过至少与CLDN6内的表位结合来结合CLDN6，所述表位具有氨基酸序列AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：15)，其中所述抗体或其抗原结合片段不结合具有氨基酸序列TSAPAISRGPSEYPT(SEQ ID NO：14)的肽。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述CLDN6为细胞表面膜结合的CLDN6。
3.权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段，其中所述CLDN6存在于癌细胞上。
4.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中所述癌细胞为表达CLDN6的癌细胞。
5.权利要求3或4的抗体或其抗原结合片段，其中所述癌细胞选自卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、子宫癌细胞和膀胱癌细胞。
6.权利要求3或4的抗体或其抗原结合片段，其中所述癌细胞是转移癌细胞。
7.权利要求1-5中任一项的抗体，其为嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
8.权利要求1-7中任一项的抗体，其为单克隆抗体。
9.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其
(i)结合具有氨基酸序列AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：15)的肽，和/或
(ii)结合紧密连接蛋白6(CLDN6)，其中所述抗体或其抗原结合片段通过至少与CLDN6内的表位结合来结合CLDN6，所述表位具有氨基酸序列AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：15)。
10.一种抗体或其抗原结合片段，其与以下肽中的一个或多个结合，优选与所有的肽结合：
PAISRGPSEYPTKNY(SEQ ID NO：22)、AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：15)、ISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：23)、SRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：24)、RGPSEYPTKNYV(SEQ IDNO：25)、GPSEYPTKNYV(SEQ ID NO：26)、PSEYPTKNYV(SEQ ID NO：27)、SEYPTKNYV(SEQ IDNO：28)以及EYPTKNYV(SEQ ID NO：29)，其中所述抗体或其抗原结合片段不结合具有氨基酸序列TSAPAISRGPSEYPT(SEQ ID NO：14)的肽。
11.权利要求10的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以最低亲和力与所述肽结合和以最高亲和力与所述肽结合的结合亲和力的差异为50％或更少。
12.一种抗体，其选自：
(i)抗体，其由保藏号为DSM ACC3313(58-1B)、DSM ACC3312(58-3A)或DSM ACC3311(58-4B-2)的克隆产生或者可从其获得，
(ii)抗体，其为(i)的抗体的嵌合或人源化形式，
(iii)抗体，其与(i)的抗体竞争结合CLDN6，
(iv)抗体，其具有(i)的抗体的特异性，以及
(v)抗体，其包含(i)的抗体的抗原结合部分或抗原结合位点，或
(i)至(v)中任一项的抗体的抗原结合片段。
13.权利要求12的抗体，其中(i)的抗体的抗原结合部分或抗原结合位点包含(i)的抗体的可变区。
14.一种缀合物，其包含与至少一个可检测的标记偶联的权利要求1-13中任一项的抗体或抗原结合片段。
15.一种杂交瘤，其能够产生权利要求1-13中任一项的抗体。
16.一种杂交瘤，其以保藏号DSM ACC3313(58-1B)、DSM ACC3312(58-3A)或DSMACC3311(58-4B)保藏。
17.一种用于检测样品中的CLDN6或确定样品中的CLDN6的量的方法，其包括以下步骤：
(i)使样品与权利要求1-13中任一项的抗体或抗原结合片段或者权利要求14的缀合物接触，以及
(ii)检测所述抗体、抗原结合片段或缀合物与CLDN6之间复合物的形成，或确定所述复合物的量。
18.一种用于确定细胞是否表达CLDN6的方法，其包括以下步骤：
(i)使细胞样品与权利要求1-13中任一项的抗体或抗原结合片段或者权利要求14的缀合物接触，以及
(ii)检测所述抗体、抗原结合片段或缀合物与所述样品中的细胞表达的CLDN6之间复合物的形成。
19.一种用于诊断、检测或监测癌症的方法，其包括以下步骤：
(i)使生物样品与权利要求1-13中任一项的抗体或抗原结合片段或者权利要求14的缀合物接触，以及
(ii)检测所述抗体、抗原结合片段或缀合物与CLDN6之间复合物的形成，和/或确定所述复合物的量。
20.一种用于确定癌症是否可以通过靶向CLDN6的癌症疗法来治疗的方法，其包括以下步骤：
(i)使包含癌细胞的样品与权利要求1-13中任一项的抗体或抗原结合片段或者权利要求14的缀合物接触，以及
(ii)检测所述抗体、抗原结合片段或缀合物与CLDN6之间复合物的形成。
21.一种用于确定癌症患者的预后的方法，其包括以下步骤：
(i)使包含癌细胞的样品与权利要求1-13中任一项的抗体或抗原结合片段或者权利要求14的缀合物接触，以及
(ii)检测所述抗体、抗原结合片段或缀合物与CLDN6之间复合物的形成。
22.权利要求1-13中任一项的抗体或抗原结合片段、权利要求14的缀合物、权利要求15或16的杂交瘤或者权利要求17-21中任一项的方法，其中所述CLDN6包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。
23.一种诊断试剂盒，其包含权利要求1-13中任一项的抗体或抗原结合片段或者权利要求14的缀合物。
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