CN111405911A

CN111405911A - 用于治疗中枢神经***(cns)肿瘤的il-4融合制剂

Info

Publication number: CN111405911A
Application number: CN201880072429.8A
Authority: CN
Inventors: 法赫尔·麦钱特
Original assignee: Medicenna Therapeutics Pte Ltd
Current assignee: Medicenna Therapeutics Pte Ltd
Priority date: 2017-10-10
Filing date: 2018-10-10
Publication date: 2020-07-10
Also published as: US20200390861A1; EP3694558A1; EP3694558A4; CA3078434A1; AU2018347796A1; WO2019073299A1; EP3694558B1

Abstract

本发明提供了用于治疗受试者中的中枢神经***(CNS)肿瘤的方法，所述方法包括施用在人工脑脊液制剂中配制的IL‑4靶向的货物蛋白。本发明还提供了用于施用的制剂和方法以及用于监测的替代示踪剂。

Description

用于治疗中枢神经***(CNS)肿瘤的IL-4融合制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年10月10日提交的标题为“IL-4-FUSION FORMULATIONS FORTREATMENT OF CENTRAL NERVOUS SYSTEM(CNS)TUMORS”的美国临时申请号62/570,578的优先权，其据此以引用的方式整体并入。

背景技术

原发性GB的一线治疗包括块状肿瘤的手术切除以达到最大可能地与神经保留保持一致的程度，然后进行Stupp方案，该方案已被确定为新诊断的GB的护理标准(Stupp等人,2005)。在Stupp方案中，患者与放射疗法同步接受替莫唑胺

然后在放射疗法完成之后再次接受替莫唑胺。替莫唑胺已被批准用于新诊断的GB的治疗，它与放射疗法伴随施用，然后用作维持治疗(新药申请号021029；批准日期：08/11/1999)。

新诊断的GB患者也可以用替代性化学疗法(诸如亚硝基脲方案或卡莫斯汀干胶片

的***)进行治疗。

是用卡莫斯汀饱和的可生物降解的聚合物干胶片。通常与细胞毒性治疗相关的全身毒性可以通过颅内局部移植来降低(Westphal等人,2006)。

已显示出可作为手术和放射的辅助剂用于新诊断的高度恶性神经胶质瘤的治疗，并且可作为手术的辅助剂用于复发性GB的治疗(新药申请号020637；批准日期：02/25/2003)。在完成肿瘤切除后，其被移植到手术后腔中。Gliadel使存活期递增大约4-8周(Westphal等人,2003)。

使用当前治疗范例，大多数GB患者在标准一线治疗后会经历肿瘤复发/进展。复发性GB患者的治疗选择非常有限，并且结果通常不能令人满意。具体而言，针对复发性或进行性GB的化疗方案并不成功，从而产生毒性并且无益处(Weller等人,2013)。这主要是由于缺乏组织特异性，并且产生对正常组织的毒性，因此治疗指数较窄。由于总体存活期仍然不理想，因此需要具有更大的肿瘤特异性、更稳健的细胞毒性机制的新型抗癌方式以及新型递送技术来治疗复发性GB。

复发性或进行性GB患者的治疗选择非常有限，并且长期阳性结果是罕见的。目前在美国已获批准用于治疗复发性GB的药物是

(如上文所述用于一线治疗)和贝伐单抗

在一项3期研究中，在肿瘤的手术切除后，将Gliadel植入物直接置于肿瘤腔内，56％的接受复发性GB治疗的受试者存活6个月，并且中位数存活期为26周(Brem等人,1995)。然而，大多数患有复发性GB的患者不是进行另外的手术的受试者，从而对于该患者群体，这会产生大量未满足的需求(Weller等人,2013)。

是靶向血管内皮生长因子受体(VEGF)的抗血管发生抗体。它显示出可作为针对患有复发性GB的成人患者的单一药剂(新药申请号125085；批准日期：02/26/2004)，但尚未显示出可改善疾病相关症状或存活期。

基于客观响应率(ORR为26％)终点而获得批准(Genentech 2016；Cohen等人,2009；Freidman等人,2009)。在2013年，

在新诊断的GB患者中完成了证实性试验，但是未达到其总体存活期的主要终点。根据该试验的结果，针对新诊断的GB，Genentech在欧盟(EU)未获得批准；然而，

在美国和日本仍适用于复发性GB。此后有几项研究对

的功效进行了比较或对组合方法进行了评估。

PRX 321是一种由经生物工程化的环状排列型式的白介素-4(cpIL-4)、融合至有效细菌毒素(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素(PE)A)的截短型式的结合结构域、催化结构域组成的靶向免疫毒素(Kreitman等人,1994)。PRX 321结合至细胞表面上表达的白介素-4受体(IL-4R)，随后整个复合物被内吞。在通过以高浓度存在于癌细胞的胞内体中的弗林蛋白酶样蛋白酶切割和活化后，截短的PE的催化结构域释放至胞质溶胶中，在该处经由延伸因子-2的ADP-核糖基化和通过半胱天冬酶活化进行的细胞凋亡诱导来诱导细胞死亡(Wedekind等人,2001)。不表达IL-4R靶标的细胞不结合至PRX321，并因此不受PE介导的细胞死亡的影响。PE部分被工程化为保留催化结构域，但是不保留细胞结合结构域。

胶质母细胞瘤是一种快速进展和几乎普遍致命的癌症，它对患者是具有毁灭性的。这种侵袭型脑癌与大量发病(通常呈认知和心理运动功能的迅速恶化的形式)以及一线治疗失败后大约25％的1年存活率相关联(Lamborn等人，2008)。目前没有有效的治疗方法。PRX 321代表潜在的治疗进展。PRX 321是一种合理设计的靶向疗法，具有延长GB患者的存活期的潜力。与PRX 321的施用和输注相关联的不良事件(在严重时)与疾病进展本身的作用类似。

PRX 321是一种提供靶向治疗方法的新型治疗剂，借此肿瘤细胞对药物的毒性作用比正常细胞更为敏感。靶标(IL-4R)是针对癌症疗法开发的理想的、但未得到充分利用的靶标，因为它在多种人类癌症中频繁和强烈表达。IL-4R的表达水平在健康和正常细胞的表面上较低，但是在癌细胞上则增加数倍。来自成人和儿童中枢神经***(CNS)肿瘤的大多数癌症活检和尸检样品(包括复发性GB活检样品)已显示出过表达IL-4R。在正常成人和儿童脑组织中几乎不表达或不表达IL-4R(Joshi等人,2001；参见参考文献的表2)。IL-4R的这种差异表达为PRX 321提供了宽广的治疗窗口(关于IC₅₀数据，参见参考文献的表4)。仅此特征就使PRX 321成为用于治疗过表达IL-4R的复发性GB和其他CNS肿瘤的理想候选物。不表达IL-4R靶标的细胞不结合至PRX 321，并因此不受PE介导的作用的影响。

由于本领域仍然需要对复发性和/或进行性胶质母细胞瘤(GB)进行治疗，因此本发明的PRX 321制剂满足该需求。

发明内容

本发明提供一种治疗受试者中的中枢神经***(CNS)肿瘤的方法，所述方法包括将包含以下组分的制剂施用于受试者：

i.于人工脑脊液(CSF)溶液中的IL-4靶向的货物蛋白，和

ii.白蛋白，

其中所述制剂与替代示踪剂一起共施用于有需要的受试者。

在方法的一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白包含一个或多个货物部分。

在方法的一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白包括毒素。

在方法的一些实施方案中，毒素包括细菌毒素、动物毒素或植物毒素。在方法的一些实施方案中，毒素包括成孔毒素。在方法的一些实施方案中，成孔毒素包括气单胞菌溶素或气单胞菌溶素原。

在方法的一些实施方案中，植物毒素包括布加宁(bouganin)或蓖麻毒素。

在方法的一些实施方案中，细菌毒素包括选自由假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素组成的组的毒素。

在方法的一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白包括BCL-2家族的促凋亡成员，所述成员选自由BAX、BAD、BAT、BAK、BIK、BOK、BID BIM、BMF和BOK组成的组。

在方法的一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白包括PRX 321(SEQ ID NO：1)或其衍生物或变体。

在方法的一些实施方案中，替代示踪剂是磁共振成像(MRI)造影剂。在方法的一些实施方案中，替代示踪剂是钆结合的示踪剂。在方法的一些实施方案中，替代示踪剂选自由钆-二亚乙基三胺五乙酸(Gd-DTPA)和钆结合的白蛋白(Gd-白蛋白)组成的组。

在方法的一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白。

在方法的一些实施方案中，人工CSF溶液是Elliotts

溶液。

在方法的一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白作为靶向部分包含在IL-4R抗体中。在方法的一些实施方案中，IL-4R抗体是人源化抗体。

在方法的一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白包含人类货物部分，所述人类货物部分选自由RNA酶A和穿孔素组成的组。

在方法的一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白包括融合蛋白。

在方法的一些实施方案中，受试者患有复发性CNS肿瘤或新诊断的CNS肿瘤。在方法的一些实施方案中，受试者患有复发性或难治性CNS肿瘤。在方法的一些实施方案中，受试者是难治性的。

在方法的一些实施方案中，受试者患有IL-4R阳性CNS肿瘤。

在方法的一些实施方案中，受试者患有O6-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶(MGMT)阳性CNS肿瘤。

在方法的一些实施方案中，受试者患有弗林蛋白酶阳性CNS肿瘤。

在方法的一些实施方案中，所述方法还包括确定受试者是否为放射或化学疗法难治性的；其中如果受试者是难治性的，则表明他们将受益于IL-4靶向的货物蛋白的施用。

在方法的一些实施方案中，所述方法还包括在施用IL-4靶向的货物蛋白之后将化学疗法或放射疗法施用于受试者，和/或在施用IL-4靶向的货物蛋白之后手术摘除肿瘤的至少一部分。

在方法的一些实施方案中，所述方法还包括在施用IL-4靶向的货物蛋白之前将化学疗法或放射疗法施用于受试者，和/或在施用IL-4靶向的货物蛋白之前手术摘除肿瘤的至少一部分。

在方法的一些实施方案中，所述方法还包括在用IL-4靶向的货物蛋白治疗期间将化学疗法或放射疗法施用于受试者，和/或在手术摘除受试者中的肿瘤的至少一部分期间施用IL-4靶向的货物蛋白，任选地其中在施用IL-4靶向的货物蛋白的施用后1周、2周、3周或4周进行手术切除。

在方法的一些实施方案中，还包括在施用IL-4靶向的货物蛋白之前将使癌症干细胞敏化的激动剂施用于受试者。

在方法的一些实施方案中，瘤内施用IL-4靶向的货物蛋白。

在方法的一些实施方案中，瘤内施用包括颅内施用。

在方法的一些实施方案中，经由颅内导管来施用IL-4靶向的货物蛋白。

在方法的一些实施方案中，通过对流增强递送(CED)来施用IL-4靶向的货物蛋白。

在方法的一些实施方案中，经由对流增强递送(CED)以单剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。

在方法的一些实施方案中，以单剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。在方法的一些实施方案中，以约90μg(1.5μg/mL于60mL中)、约240μg(6μg/mL于40mL中)或约300μg(3μg/mL于100mL中)的单剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。在方法的一些实施方案中，以1.5μg/mL于60mL中的剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。在方法的一些实施方案中，以6μg/mL于40mL中的剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。在方法的一些实施方案中，以3μg/mL于100mL中的剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。在方法的一些实施方案中，以约1.5μg/mL至约3μg/mL的单剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。

在方法的一些实施方案中，以单剂量施用IL-4靶向的货物蛋白持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。

在方法的一些实施方案中，以1次、2次、3次、4次或5次输注来施用IL-4靶向的货物蛋白。

在方法的一些实施方案中，根据前述权利要求中的任一项施用IL-4靶向的货物蛋白，然后停止施用约1天至约8天，任选地停止施用1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天，然后根据前述权利要求中的任一项施用，并且重复这种施用和停止施用模式持续CNS肿瘤治疗所需的时间。

在方法的一些实施方案中，CNS肿瘤选自由神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤组成的组。在方法的一些实施方案中，CNS肿瘤是胶质母细胞瘤。在方法的一些实施方案中，CNS肿瘤是复发性或难治性胶质母细胞瘤。

在方法的一些实施方案中，经由一个或多个颅内导管来施用IL-4靶向的货物蛋白。在方法的一些实施方案中，通过导管以约5μL/min/导管至约20μL/min/导管的流速施用IL-4靶向的货物蛋白。在方法的一些实施方案中，通过导管以约15μL/min/导管的流速施用IL-4靶向的货物蛋白。在方法的一些实施方案中，通过导管以1.5μg/mL的浓度和约15μL/min/导管的流速施用IL-4靶向的货物蛋白。在方法的一些实施方案中，将1个至3个导管用于施用。

在方法的一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白是PRX 321。

本发明还提供用于CNS肿瘤的治疗的单位剂量制剂，所述单位剂量制剂包含：

i.于人工脑脊液(CSF)溶液中的IL-4靶向的货物蛋白；

ii.白蛋白；以及

iii.替代示踪剂，

其中所述单位剂量制剂被配制成通过一个或多个颅内导管来颅内施用于CNS肿瘤。

在单位剂量制剂的一些实施方案中，以约90μg(以1.5μg/mL溶于60mL中)、约240μg(6μg/mL于40mL中)或约300μg(3μg/mL于100mL中)的单剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。在单位剂量制剂的一些实施方案中，以1.5μg/mL于60mL中的剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。在单位剂量制剂的一些实施方案中，以6μg/mL于40mL中的剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。在单位剂量制剂的一些实施方案中，以3μg/mL于100mL中的剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。在单位剂量制剂的一些实施方案中，以约1.5μg/mL至约3μg/mL的单剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。在单位剂量制剂的一些实施方案中，通过导管经由约5μL/min/导管至约20μL/min/导管的流速施用IL-4靶向的货物蛋白。在单位剂量制剂的一些实施方案中，通过导管以约15μL/min/导管的流速施用IL-4靶向的货物蛋白。在单位剂量制剂的一些实施方案中，通过导管以1.5μg/mL的浓度和约15μL/min/导管的流速施用IL-4靶向的货物蛋白。在单位剂量制剂的一些实施方案中，将1个至3个导管用于施用。

在单位剂量制剂的一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白的单位剂量制剂被配制成根据前述权利要求中的任一项施用，然后停止施用约1天至约8天，任选地停止施用1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天，然后根据前述权利要求中的任一项施用，并且重复这种施用和停止施用模式持续CNS肿瘤治疗所需的时间。

在一些实施方案中，本发明提供了用于中枢神经***(CNS)肿瘤治疗的制剂，所述制剂包含溶于人工脑脊液(CSF)溶液的IL-4靶向的货物蛋白、白蛋白和替代示踪剂。

在一些实施方案中，本发明提供了用于神经胶质瘤治疗的制剂，所述制剂包含溶于人工脑脊液(CSF)溶液的PRX 321、白蛋白和替代示踪剂。

在一些实施方案中，本发明提供了用于中枢神经***(CNS)肿瘤治疗的制剂，所述制剂包含溶于人血清白蛋白的PRX 321和替代示踪剂。

在一些实施方案中，本发明提供了用于中枢神经***(CNS)肿瘤(例如神经胶质瘤)治疗的制剂，所述制剂包含溶于人工脑脊液(CSF)溶液的IL-4靶向的货物蛋白、白蛋白和钆结合的示踪剂。

在一些实施方案中，本发明提供了用于中枢神经***(CNS)肿瘤(例如神经胶质瘤)治疗的制剂，所述制剂包含溶于人血清白蛋白的PRX 321和钆结合的示踪剂。

在制剂的一些实施方案中，使用根据本文引用的方法来进行。

附图说明

图1：PRX 321作用机制的示意图。

图2：PRX 321序列SEQ ID NO：1以及示例性IL-4靶向的货物蛋白(即环状排列的IL-4假单胞菌毒素PRX 321(SEQ ID NO：1))的结构(A)和氨基酸序列(B)的示意图。图上标示了二硫键。

图3：优化的CED技术改善了药物分布。

图4：rGB程序中的高流速CED的2期研究的示意图。

图5：PRX 321的计划和输注体积。中期结果的汇总。对前6名患者进行分析。

图6：PRX 321相关TEAE和SAE的结果–CNS作用。

图7：PRX 321-05的安全性–AE≥Gd3。

图8：针对74岁男性的案例研究1的概述。

图9：案例研究1。A)肿瘤定位MRI图。B)肿瘤与药物的最终分布MRI图。C)输注结束时的药物分布计算(通过Gad提供)MRI图。D)覆盖率的估算MRI图。肿瘤体积–1.5cm³；肿瘤直径-1.8cm；Vi-15cm³；Gad的Vd–30cm³；VD/Vi比–2；Vd/肿瘤体积–20；以及肿瘤覆盖率*–70％(*初始估算)。

图10：针对58岁男性的案例研究1的概述。

图11：案例研究2肿瘤定位MRI图。

图12：案例研究2输注的评估MRI图。

图13：案例研究2输注的评估MRI图。

图14：案例研究2A)输注结束时的覆盖率MRI图。B)覆盖率的估算MRI图。肿瘤体积–1.9cm³；肿瘤直径–2.9cm；Vi-17cm³；Gad的Vd–30cm³；VD/Vi比–1.8；Vd/肿瘤体积–20；以及肿瘤覆盖率*–90％(*初始估算)。

图15：靶向区域的覆盖率。结果汇总：对前6名患者进行分析。

具体实施方式

I.定义

缩写和术语：

PA	气单胞菌溶素原
		BAD	BCL2相关细胞死亡激动剂
BAX	BCL2相关X蛋白
		EGF	表皮生长因子
EpCAM	上皮蛋白细胞粘附分子
		GMCSF	粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
IL-4	白介素-4
		IL-13	白介素-13
PSMA	***特异性膜抗原

提供以下术语和方法说明，以便更好地描述本公开并且在本公开的实践中指导本领域的普通技术人员。除非上下文另外明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”是指一个或多于一个。例如，术语“包含一个IL-4靶向的货物蛋白”包括单数个或复数个IL-4靶向的货物蛋白，并且被认为相当于短语“包含至少约一个IL-4靶向的货物蛋白”。除非上下文另外明确指明，否则术语“或”是指所述替代要素中的单个要素或者两个或更多个要素的组合。如本文所用，“包含”意指“包括”。因此，“包含A或B”意指“包括A、B或者A和B”，而不排除另外的要素。

除非另外解释，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

登录号：美国国立卫生研究院维护的NCBI数据库(美国国家生物技术信息中心)中分配给各种核酸和氨基酸序列的参考号。截至本申请提交日，本说明书中列出的登录号如数据库中所提供以引用的方式并入本文。

施用：将药剂(诸如包含IL-4靶向的货物蛋白的组合物)提供于或给予受试者。施用的示例性途径包括但不限于：口服、注射(诸如皮下注射、肌肉内注射、真皮内注射、腹膜内注射、瘤内注射和静脉内注射)、舌下、直肠或经直肠、透皮、鼻内、***、宫颈和吸入途径。在具体实例中，瘤内包括局部、区域性、局灶性或对流增强递送。在其他具体实例中，施用包括经尿道或经***施用。在一个实例中，替代磁共振成像示踪剂(例如，钆结合的白蛋白(Gd-白蛋白))可以与IL-4靶向的货物蛋白组合施用，以确定IL-4靶向的货物蛋白是否以治疗剂量安全地递送至肿瘤(诸如脑肿瘤)，同时监测该蛋白的实时分布(参见例如，Murad等人,Clin.Cancer Res.12(10):3145-51 2006)。

抗体：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点特异性结合表位(与表位发生免疫响应)，诸如癌细胞和/或癌症干细胞展示的表位。抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、以及人源化抗体。抗体还包括亲和体。亲和体在功能上模拟单克隆抗体，但是基于蛋白A。亲和体可以被工程化为用于结合至靶向部分的高亲和力配体。

天然存在的抗体(例如，IgG、IgM、IgD)包含四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。然而，已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过天然存在的抗体的片段来进行。因此，还旨在以术语“抗体”称呼这些抗原结合片段。术语抗体中涵盖的结合片段的具体非限制性实例包括：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由抗体(scFv)的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，并且scFv分子彼此连接以形成二价二聚体(双体)或三价三聚体(三体)；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)；(v)分离的互补决定区(CDR)；以及(vi)F(ab′)2片段，即包含两个Fab片段的二价片段，这两个Fab片段在铰链区通过二硫桥连接。

产生多克隆和单克隆抗体的方法是本领域的普通技术人员已知的，并且很多抗体是可获得的。参见例如,Coligan,Current Protocols in Immunology Wiley/Greene,N.Y.,1991；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring HarborPress,NY,1989；Stites等人,(编)Basic and Clinical Immunology(第4版)LangeMedical Publications,Los Altos,Calif.，以及其中引用的参考文献；Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)Academic Press,New York,N.Y.,1986；以及Kohler和Milstein,Nature 256:495-497,1975。用于抗体制备的其他合适的技术包括噬菌体或类似的载体中的重组抗体文库的选择。参见Huse等人,Science 246:1275-1281,1989；以及Ward等人,Nature 341:544-546,1989。

免疫球蛋白以及它们的某些变体是已知的，并且很多已经在重组细胞培养物中进行了制备(例如，参见美国专利号4,745,055；美国专利号4,444,487；WO 88/03565；EP 256,654；EP 120,694；EP 125,023；Faoulkner等人,Nature 298:286,1982；Morrison,J.Immunol.123:793,1979；Morrison等人,Ann Rev.Immunol 2:239，1984)。用于制备嵌合(人源化)抗体的详细方法可见于美国专利号5，482，856。关于人源化和其他抗体产生和工程化技术的另外的细节可见于Borrebaeck(编)，Antibody Engineering，第2版，Freemanand Company，NY，1995；McCafferty等人，Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL at Oxford Press,Oxford,England,1996，以及Paul Antibody EngineeringProtocols Humana Press，Towata，N.J.，1995。

在一些实例中，抗体以比样品中的其他分子的结合常数大至少10³M^-1、10⁴M^-1或10⁵M^-1的结合常数特异性结合至靶蛋白(例如，细胞表面受体，诸如IL4受体)。在一些实例中，特异性结合试剂(诸如抗体(例如，单克隆抗体)或它们的片段)具有1nM或更小的平衡常数(K_d)。例如，特异性结合药剂可以以至少约0.1×10^-8M、至少约0.3×10^-8M、至少约0.5×10^-8M、至少约0.75×10^-8M、至少约1.0×10^-8M、至少约1.3×10^-8M、至少约1.5×10^-8M或至少约2.0×10^-8M的结合亲和力结合至靶蛋白。Kd值可以例如通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)或使用表面等离子共振装置(诸如Biacore T100，得自Biacore,Inc.,Piscataway,N.J.)来测定。

结合(binds或binding)：两个或更多个分子之间的缔合，其中两个或更多个分子在物理上彼此紧密靠近，诸如形成复合物。示例性复合物是受体-配体对或抗体-抗原对。通常，复合物中分子的结合越强，它们的解离速率就越慢。特异性结合是指试剂和特定靶标之间的优先结合。例如，特异性结合是指当包含对癌症干细胞抗原具有特异性的靶向部分的IL-4靶向的货物蛋白结合至癌症干细胞时，但是不显著结合至不展示出密切靠近癌症干细胞的靶标的其他细胞。这种结合可以是配体和受体之间的特异性非共价分子相互作用。在一个特定实例中，在IL-4靶向的货物蛋白接触癌症干细胞后，通过使用本文所述的方法之一检测癌症干细胞生长抑制来评估结合。

这种相互作用通过结合配偶体之间(或通常每个结合配偶体的特定区域或部分之间)的一个或典型地更多个非共价键来介导。与非特异性结合位点相反，特异性结合位点是可饱和的。因此，表征特异性结合的一种示例性方式是通过特异性结合曲线。特异性结合曲线显示，例如，一种结合配偶体(第一结合配偶体)与固定量的另一种结合配偶体结合的量是第一结合配偶体浓度的函数。在这些条件下，随着第一结合配偶体浓度的增加，所结合的第一结合配偶体的量将饱和。另外与非特异性结合位点相反，涉及彼此直接缔合(例如，蛋白质-蛋白质相互作用)的特异性结合配偶体可以通过过量的任一种特异性结合配偶体从这种缔合(例如，蛋白质复合物)竞争性地除去(或置换)。这种竞争测定法(或置换测定法)是本领域非常熟知的。

癌症：已经历特征性退行发育，分化丧失、生长速率增加、浸润周围组织，并且能够转移的恶性赘生物。残留癌是在将任何形式的治疗给予受试者以减少或根除癌症后仍保留在受试者中的癌症，复发癌是在这种治疗后复发的癌症。转移性癌症是除衍生出转移性癌症的原始(原发性)癌症的起源部位之外的体内一个或多个部位的癌症。就来源于实体瘤的转移性癌症而言，一个或多个(例如，很多个)另外的肿瘤块可以存在于靠近或远离原始肿瘤部位的部位。短语“播散性转移性结节”或“播散性转移性肿瘤”是指分散至一个或多个解剖部位的多个(典型地很多个)转移性肿瘤。例如，腹膜内的播散性转移性结节(即，播散性腹膜内癌症)可以来源于驻留在腹膜内部或外部的器官的肿瘤，并且可以定位于腹膜内的许多部位。这种转移性肿瘤本身可以离散地定位于器官的表面，或者可以入侵下层组织。

货物部分：可以发挥显著减少或抑制癌症干细胞的生长的功能的肽(例如，蛋白质片段或全长蛋白质)或其他分子。在一些实例中，货物部分可以触发细胞死亡(例如，细胞凋亡)。示例性货物部分包括毒素，诸如来源于植物、微生物和动物的毒素。在其他实例中，货物部分是通常有助于控制细胞生命周期的蛋白质，例如货物部分可以是触发细胞死亡(诸如经由细胞凋亡或非细胞凋亡通路)的任何蛋白质。在一些实例中，货物部分不是蛋白质，而是可以发挥显著减少或抑制癌症干细胞的生长的功能的另一种分子，诸如毒胡萝卜素。在一些实例中，货物部分被肿瘤相关蛋白酶(诸如PSA)活化。下表1提供了示例性货物部分和示例性GenBank登录号。除天然货物序列之外，还可以使用变体序列，诸如具有比天然序列更大的生物学活性的突变体序列。

表1：示例性货物部分序列

*GenBank编号及其对应的核酸序列以引用的方式并入本文。

接触(contact或contacting)：是指一个物体与另一物体在物理上相对紧密靠近。通常，接触涉及将两个或更多个物体放置于在物理上彼此紧密靠近的位置，以使物体相互作用和给予物体相互作用的机会。例如，使IL-4靶向的货物蛋白接触癌症干细胞可以通过将IL-4靶向的货物蛋白(它可以溶于溶液中)放置于细胞附近，例如通过将IL-4靶向的货物蛋白注射至患有癌症的受试者中来实现。类似地，例如通过将IL-4靶向的货物蛋白添加至细胞生长的培养基，可以使IL-4靶向的货物蛋白在体外接触细胞。

减少(减小)：减少某物的质量、量或强度。在一个实例中，疗法(诸如使用IL-4靶向的货物蛋白进行的治疗)减小癌症干细胞群(诸如通过减小肿瘤的大小、肿瘤的体积、肿瘤的转移、癌细胞和/或癌症干细胞的数量或者它们的组合)，或者与癌症相关的一种或多种症状，例如与在不进行疗法的情况下的响应相比。在一个特定实例中，在治疗后，疗法减小肿瘤的大小、肿瘤的体积、癌细胞和/或癌症干细胞的数量、或癌症的转移或者它们的组合，诸如减小至少约10％、至少约20％、至少约50％或甚至至少约90％。可以使用本文公开的方法来测量这种减少(减小)。

诊断：例如从一个或多个诊断程序的结果鉴定医学疾患或疾病的过程。在特定实例中，包括确定受试者的预后(例如，在一段时间内存活的可能性，诸如在6个月、1年或5年内存活的可能性)。在一个具体实例中，通过使用癌症干细胞表面上的一个或多个靶标检测样品中的癌症干细胞的存在来诊断癌症。例如，诊断可以包括确定癌症的特定分期或转移部位的存在。

接头：用于将一个或多个药剂连接至一个或多个另外的药剂的分子。例如，接头可以用于将一个或多个货物部分连接至一个或多个靶向部分。接头的特定非限制性实例包括树枝状聚合物，诸如合成聚合物、肽、蛋白质和碳水化合物。接头可以另外含有一个或多个蛋白酶切割位点，或者对经由氧化和/或还原的切割是敏感的。

药学上可接受的载剂：术语“药学上可接受的载剂”是指本公开中所用的药学上可接受的载剂(媒介物)是常规的。Remington′s Pharmaceutical Sciences,E.W.Martin著，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.,第15版(1975)描述了适用于一种或多种治疗或诊断剂(诸如一种或多种本文提供的IL-4靶向的货物蛋白分子)的药物递送的组合物和制剂。

通常，载剂的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂可以包括注射用流体，所述注射用流体包括药学上和生理学上可接受的流体，诸如作为媒介物的水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等等。除生物中性载剂之外，待施用的药物组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和油酸三乙醇胺。

药剂或药物：这样的化学化合物或组合物：当所述化学化合物或组合物单独或与另外一种或多治疗剂或药学上可接受的载剂组合施用于受试者时，能够诱导所期望的治疗效果。在一个特定实例中，药剂(例如，包含IL-4靶向的货物蛋白的药剂)例如通过减小肿瘤的大小(诸如体积或减少癌细胞和/或癌症干细胞的数量)，减少癌症的转移或它们的组合来治疗癌症。

重组：重组分子(诸如重组核酸分子或蛋白质)具有非天然存在的序列，或具有通过两个另外单独的序列区段的人工组合制成的序列。通常通过化学合成或更常见地通过分离的核酸区段的人工操纵(例如通过遗传工程化技术)来实现这种人工组合。重组蛋白是通过编码蛋白质的重组核酸的表达来产生的蛋白质。本公开的IL-4靶向的货物蛋白通常是重组的。

样品：生物学样本，诸如含有生物分子(诸如核酸分子、蛋白质或它们二者)的样品。示例性样品是含有来自受试者的细胞或细胞裂解物的那些样品，诸如存在于外周血(或其级分，诸如血清)、尿液、唾液、组织活检物、颊拭子、手术样本、细针抽吸物、宫颈样品和尸检材料中的那些样品。在一个具体实例中，样品从肿瘤(例如活检组织切片)获得，所述样品可以包括作为非癌细胞和/或癌症干细胞以及癌细胞和/或癌症干细胞的肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤样品来自中枢神经***(CNS)肿瘤。

序列同一性：两个或更多个核酸序列、或两个或更多个氨基酸序列之间的同一性/相似性以序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以用同一性百分比来测量。百分比越高，序列同一性越高。序列相似性可以用相似性百分比(这考虑了保守氨基酸置换)来测量；百分比越高，序列相似性越高。当使用标准方法来比对时，核酸或氨基酸序列的同源物和直系同源物具有较高程度的序列同一性/相似性。

用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法在以下文献中有所描述：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins和Sharp,Gene,73:237-44,1988；Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet等人,Nuc.Acids Res.16:10881-90,1988；Huang等人Computer Appls.in theBiosciences 8,155-65,1992；和Pearson等人,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994。Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990提供了序列比对方法和同源性计算的详细考虑因素。

NCBI基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool(BLAST))(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990)可以从若干来源获得，包括美国国家生物信息中心(National Center for Biological Information(NCBI，National Library ofMedicine，Building 38A，Room8N805,Bethesda，Md.20894))，并且可以在互联网上获取，以便与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。另外的信息可见于NCBI网站。

BLASTN可以用于比较核酸序列，BLASTP可以用于比较氨基酸序列。为了比较两个核酸序列，可以如下设置选项：-i被设置为含有待比较的第一核酸序列的文件(诸如C:\seq1.txt)；--j被设置为含有待比较的第二核酸序列的文件(诸如C:\seq2.txt)；--p被设置为blastn；--o被设置为任何所需的文件名(诸如C:\output.txt)；--q被设置为--1；--r被设置为2；所有其他选项均保留默认设置。例如，以下命令可以用于生成含有两个序列之间的比较的输出文件：C:\B12seq--i c:\seq1.txt--j c:\seq2.txt--p blastn--o c:\output.txt--q--1--r 2。

为了比较两个氨基酸序列，可以如下设置B12seq的选项：-i被设置为含有待比较的第一氨基酸序列的文件(诸如C:\seq1.txt)；--j被设置为含有待比较的第二氨基酸序列的文件(诸如C:\seq2.txt)；--p被设置为blastp；--o被设置为任何所需的文件名(诸如C:\output.txt)；所有其他选项均保留默认设置。例如，以下命令可以用于生成含有两个氨基酸序列之间的比较的输出文件：C:\B12seq--i c:\seq1.txt--j c:\seq2.txt--pblastp--o c:\output.txt。如果两个比较序列共有同源性，则指定的输出文件以对齐的序列表示这些同源性区域。如果两个比较序列不共有同源性，则指定的输出文件不以对齐的序列表示。

一旦对齐，即可通过计算相同的核苷酸或氨基酸残基同时存在于两个序列中的位置数来确定匹配数。序列同一性百分比通过以下方法来确定：用匹配数除以已确定的序列中提供的序列的长度，或除以铰接的长度(诸如来自已确定的序列中提供的序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后用所得的值乘以100。例如，当与具有1154个核苷酸的测试序列对齐时，具有1166个匹配的核酸序列与测试序列具有75.0％的同一性(1166/1554*100＝75.0)。序列同一性百分比值四舍五入到最接近的十分位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14四舍五入为75.1，75.15、75.16、75.17、75.18和75.19四舍五入为75.2。长度值将始终是整数。

为了比较多于约30个氨基酸的氨基酸序列，可采用Blast 2序列函数，该函数使用被设置为默认参数(空位存在罚分为11，并且每个残基空位罚分为1)的默认BLOSUM62矩阵。同源物的典型特征在于具有至少70％的序列同一性，所述序列同一性使用NCBI BasicBlast 2.0与氨基酸序列的全长比对，并使用数据库(诸如nr或swissprot数据库)进行加空位的blastp来进行计算。使用DUST过滤通过blastn程序搜索的查询(Hancock和Armstrong,1994,Comput.Appl.Biosci.10:67-70)。其他程序使用SEG。此外，可以进行手动比对。当通过这种方法进行评估时，具有较高相似性的蛋白质将显示出同一性百分比增加，诸如与本文提供的货物蛋白或靶向部分具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。

当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，使用Blast 2序列函数进行比对，该函数采用被设置为默认参数(开放空位罚分为9，并且延伸空位罚分为1)的PAM30矩阵。当通过这种方法进行评估时，与参考序列具有较高相似性的蛋白质将显示出同一性百分比增加，诸如与本文提供的货物部分或靶向部分具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性。当比较少于整个序列的序列同一性时，在10-20个氨基酸的短窗口上，同源物通常具有至少75％的序列同一性，并且根据它们与参考序列的同一性，可以具有至少85％、90％、95％或98％的序列同一性。NCBI网站上描述了用于在这种短窗口上确定序列同一性的方法。

受试者：活的多细胞脊椎动物，包括人类和非人类哺乳动物的种类(诸如实验室或兽医受试者)。

IL-4靶向的货物蛋白：特异性结合至癌症干细胞并且减少或抑制癌症干细胞生长或者杀伤癌细胞和/或癌症干细胞的任何蛋白质。在一些实例中，IL-4靶向的货物蛋白可以靶向癌细胞和/或癌症干细胞以及不是癌细胞和/或癌症干细胞的肿瘤(例如，癌症)细胞二者。IL-4靶向的货物蛋白包含靶向部分和货物部分，所述靶向部分特异性结合癌症干细胞，并且所述货物部分显著减少或抑制癌症干细胞的生长或杀伤癌症干细胞。在一些实例中，货物部分引起与其相关的癌症干细胞的死亡。因为在一些实例中，货物部分不是蛋白质，诸如化学治疗剂，并且在一些实例中，靶向部分不是蛋白质，所以在一些实例中，IL-4靶向的货物蛋白实际上不是蛋白质。

靶向部分：结合至由癌症干细胞展示的分子(本文称为靶标)的任何化合物，例如靶向部分可以是结合至靶标(例如，受体)的抗体、结合至受体的配体(例如，细胞因子或生长因子)、结合至受体的排列配体、或对通过肿瘤相关蛋白酶的切割敏感的肽序列。在一些实例中，靶向部分被肿瘤相关蛋白酶(诸如PSA)活化。通常，靶向部分与展示出靶标的一种类型的细胞的选择性结合至比它们与不展示出靶标的其他类型的细胞的结合更有效。可以选择靶向部分以选择性结合至肿瘤细胞的亚群，诸如癌细胞和/或癌症干细胞。靶向部分包括特异性结合剂，诸如抗体、干细胞上的靶标的天然配体(诸如IL-4)、此类天然配体的衍生物和免疫球蛋白A。在一些实例中，靶向部分不具有生物活性(例如，不能活化受体)，但是保留了结合至靶标的能力，因此可以将IL-4靶向的货物蛋白引导至适当的细胞。

表2提供了关于示例性天然配体以及可以用作靶向部分的其他抗原的序列的信息。在一些实例中，环状排列的配体(诸如环状排列的IL-4)可以用于结合癌细胞和/或癌症干细胞。随着其他研究的进行，将鉴定出新型癌症干细胞特异性靶标。这些另外的标志物可以用作结合至靶向部分的靶标，并且可以制备IL-4靶向的货物蛋白以抑制(或杀伤)展示出此类配体的癌细胞和/或癌症干细胞的生长。本领域的普通技术人员将理解，一旦知道标志物，即可使用制备所鉴定的标志物的抗体的标准方法来制备对癌症干细胞标志物具有特异性的靶向部分，从而允许开发特异性IL-4靶向的货物蛋白。

表2：示例性靶向部分序列

*GenBank编号及其对应的核酸序列以引用的方式并入本文。

癌细胞上的靶标和/或癌细胞和/或癌症干细胞包括在癌细胞和/或癌症干细胞的表面上展示的小分子。针对此类靶标的抗体可以用作靶向部分以及靶标及其衍生物的天然配体。

治疗有效量：单独或与药学上可接受的载剂或一种或多种另外的治疗剂一起诱导所期望的响应的量。治疗剂(诸如IL-4靶向的货物蛋白)以刺激所期望的响应的治疗有效量施用，例如在已知患有包含癌细胞和/或癌症干细胞的癌症的受试者中减轻癌症的症状。

治疗剂的有效量可以以多种不同方式确定，诸如测定患有癌症的受试者的生理状况的改善。有效量也可以通过各种体外、体内或原位测定法来确定。

在治疗过程中，治疗剂可以以单剂量或以若干剂量施用，例如每周、每月或每两月施用。然而，有效量可以取决于所施加的来源、所治疗的受试者、所治疗的疾患的严重性和类型以及施用方式。

在一个实例中，有效量是足以部分或完全减轻受试者的癌症症状的量。治疗可以只涉及暂时减缓癌症的进展，但是还可以包括永久停止或逆转癌症的进展。例如，药物制备物可以减少癌症的一个或多个症状(诸如肿瘤的大小或者肿瘤的数量或者癌细胞和/或癌症干细胞的数量)，例如与在不存在治疗性制备物的情况下的量相比，减少症状至少约20％、至少约50％、至少约70％、至少约90％、至少约98％或甚至至少约100％。

治疗疾病：改善疾病或病理状况的征象或症状(诸如癌症的征象或症状)的治疗干预。治疗还可以诱导疾患(诸如癌症，尤其是中枢神经***(CNS)癌症或肿瘤)的缓解或治愈。在特定实例中，治疗包括预防疾病，例如抑制疾病的全面发展，诸如预防肿瘤转移的发展。疾病的预防并不要求完全不出现发育异常或癌症。例如，减少至少约50％即可。

肿瘤：是非炎性赘生物或异常组织块，它由预先存在的组织的细胞产生。肿瘤可以是良性的(非癌性)或恶性的(癌性)。血液肿瘤的实例包括但不限于：中枢神经***(CNS)癌症或肿瘤。实体瘤(诸如肉瘤和癌)的实例包括但不限于脑肿瘤和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。肿瘤包括复发性和/或难治性CNS肿瘤。

难治性：对尝试治疗形式无响应的疾病或疾患，例如对标准治疗方法无响应的肿瘤。

在足够的条件下：用于描述允许所期望的活性的任何环境的短语。在一个实例中，包括在允许IL-4靶向的货物蛋白特异性结合至样品中的癌症干细胞的条件下，使IL-4靶向的货物蛋白与肿瘤干细胞一起温育。在另一个实例中，包括在足以允许所期望的活性的条件下，使一种或多种IL-4靶向的货物蛋白与受试者中的一种或多种癌细胞和/或癌症干细胞接触。在特定实例中，所期望的活性是减少此类癌细胞和/或癌症干细胞的生长或增殖或者杀伤癌细胞和/或癌症干细胞。

单位剂量：含有经计算可单独或共同产生所期望的效果(诸如治疗效果)的预定数量的活性物质(诸如IL-4靶向的货物蛋白)的物理离散单位。可以使用单个单位剂量或多个单位剂量来提供所期望的效果，诸如治疗效果。

II.引言

根据本发明，已经将PRX 321开发为用于治疗复发性和/或进行性胶质母细胞瘤(GB)的肿瘤内输注产品。本发明提供的制剂允许有效治疗复发性和/或进行性胶质母细胞瘤(GB)。

本发明提供一种用于治疗受试者中的中枢神经***(CNS)肿瘤的方法，其中所述方法包括将制剂施用于所述受试者，所述制剂包含：i)溶于人工脑脊液制剂的IL-4靶向的货物蛋白，ii)白蛋白，其中所述制剂与替代示踪剂一起共施用于有需要的受试者。

III.背景

已经使用对流增强递送(CED)来将PRX 321与示踪剂(MRI造影剂)一起共施用，从而允许实时监测肿瘤中和周围的药物分布。PRX 321是一种由经生物工程化的环状排列型式的白介素-4(cpIL-4)、融合至有效细菌毒素(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素(PE)A)的截短型式的结合结构域、催化结构域组成的靶向免疫毒素(Kreitman等人，1994)。PRX 321结合至细胞表面上表达的白介素-4受体(IL-4R)，随后整个复合物被内吞至所述细胞中。在通过以高浓度存在于癌细胞的胞内体中的弗林蛋白酶样蛋白酶切割和活化后，截短的PE的催化结构域释放至胞质溶胶中，在该处经由延伸因子-2的ADP-核糖基化和通过半胱天冬酶活化进行的细胞凋亡诱导来诱导细胞死亡(Wedekind等人,2001)。不表达IL-4R靶标的细胞不结合PRX 321，因此不受PE介导的细胞死亡的影响。作用机制如图1所描绘。值得注意的是，PE部分被工程化为保留催化结构域，但是不保留细胞结合结构域；这种方法的基本原理是建立一种内置的安全机制，如果PE被意外地从IL-4切割下来，由于PE的结合结构域被除去，因此不具有毒性，从而不能内化至细胞中并且抑制蛋白质合成。

IV.IL-4融合体

本文描述了靶向癌细胞和/或癌症干细胞、以及抑制癌细胞和/或癌症干细胞的生长、和/或杀伤癌细胞和/或癌症干细胞的IL-4和/或IL-13融合蛋白，包括例如PRX 321。这些分子(在下文统称为IL-4靶向的货物蛋白)包含结合至癌症干细胞展示的靶标(例如，在一些实施方案中IL-4R)的靶向部分以及提供细胞生长抑制(或细胞杀伤)活性的货物部分。靶向部分可以直接或通过本文另外描述的许多接头中的一种或多种来结合至货物部分。癌细胞和/或癌症干细胞通常具有自我更新的能力，因此可以产生具有与自身相似的性质的子代。在一些实例中，所公开的IL-4靶向的货物蛋白可以靶向癌细胞和/或癌症干细胞以及不是癌细胞和/或癌症干细胞的肿瘤(例如，癌症)细胞二者。所以，在一些实例中，IL-4靶向的货物蛋白可以杀伤或抑制癌细胞和/或癌症干细胞以及不是癌细胞和/或癌症干细胞的肿瘤(例如，癌症)细胞的生长。在其他实例中，例如具有针对CD 133的靶向部分，IL-4靶向的货物蛋白杀伤或抑制肿瘤中的癌细胞和/或癌症干细胞的生长，但是不杀伤或抑制不是癌细胞和/或癌症干细胞的肿瘤细胞的生长。

靶向部分包括蛋白质和其他试剂，这些蛋白质和其他试剂可以发挥特异性结合至癌症干细胞上的靶标的功能(但是在一些实例中，靶标还可以存在于其他癌细胞上)。靶向部分包括特异性结合剂，诸如抗体、亲和体或受体配体。在一些实例中，靶向部分来源于癌症干细胞展示的靶标(例如，细胞表面受体)的天然配体。来源于天然配体的靶向部分可以包括配体的完整氨基酸序列(例如，在从自然界分离的情况下配体所具有的相同的序列)，或者靶向部分的氨基酸序列可以与天然配体共有至少约95％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％或至少约40％的序列同一性(例如，与表2中列出的GenBank登录号具有至少约所述量的序列同一性)，只要变体保留或具有增强的天然配体的生物学活性即可。在一些实例中，相对于天然配体而言，此类变体对它们的靶标具有增加的结合亲和力。来源于天然配体的靶向部分也可以是能够结合至癌症干细胞展示的靶标的天然序列的片段。在一些实例中，配体是天然配体的环状排列型式(例如，参见美国专利号6,011,002)。环状排列的分子包括线性分子(例如，配体)的末端直接或经由接头连接在一起以产生环状分子的那些，然后所述环状分子在另一个位置打开，以产生具有与原始分子中的末端不同的末端的新线性分子。在一些实例中，靶向部分具有一个或多个氨基酸突变(相对于天然序列)，所述氨基酸突变改变与靶标的结合，诸如增加配体与其靶标的结合的突变。

货物部分可以减少、抑制癌细胞和/或癌症干细胞的生长，和/或杀伤癌细胞和/或癌症干细胞，并且在一些实例中，还可以抑制大量癌细胞(例如，非癌症干细胞)的生长和/或杀伤大量癌细胞。这些分子可以是天然蛋白质，或经工程化的蛋白质，以及抑制癌细胞和/或癌症干细胞的生长，和/或杀伤癌细胞和/或癌症干细胞，并且在一些实例中，还可以抑制大量癌细胞(例如，非癌症干细胞)的生长和/或杀伤大量癌细胞的其他分子。这种分子的一个实例是化学治疗剂，诸如毒胡萝卜素。货物部分可以连接至结合癌细胞和/或癌症干细胞的靶向部分(连接的货物部分和靶向部分在本文中称为IL-4靶向的货物蛋白)。因此，连接至靶向部分的货物部分将结合至癌症干细胞并且抑制(或杀伤)癌症干细胞的生长。在一些实例中，货物部分可以引起癌症干细胞死亡，并且在一些实例中，癌症干细胞死亡由细胞凋亡引起。在一些实例中，货物部分是毒素(包括植物或微生物源性毒素)、毒素的活性片段或毒素的衍生物，它们与天然毒素共有至少约95％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％或至少约40％的序列同一性，并且保留或具有增强的天然毒素的生物学活性，例如具有表1中提供的货物部分。在其他实例中，货物部分来源于调节细胞生命周期，或者作为动物中的天然免疫应答的一部分的蛋白质。例如，一些货物部分来源于已知可诱导细胞凋亡的蛋白质。在一些实例中，货物部分来源于促凋亡蛋白、此类蛋白质的活性片段或此类蛋白质的衍生物，它们与天然部分(参见表1的序列登录号)共有至少约95％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％或至少约40％的序列同一性，只要变体保留或具有增强的天然部分的生物学活性即可。在另外的实例中，当作为IL-4靶向的货物蛋白的一部分施用时，货物部分可以是无活性的，然后在接触受试者中的另一种分子时变得有活性。本文提供了货物部分的更详细描述。

所述描述还包括用IL-4靶向的货物蛋白来治疗患有(或过去患有)癌症的受试者的方法。例如，所述方法可以包括将一种或多种所公开的IL-4靶向的货物蛋白施用于受试者，从而治疗受试者中的癌细胞和/或癌症干细胞(例如，减少干细胞的数量或体积)。例如，IL-4靶向的货物蛋白可以用于治疗患有复发性癌症或难治性癌症的受试者。在此类实例中，用传统的抗癌疗法(例如放射、手术或化学疗法)来治疗受试者，然后对受试者进行测试以确定治疗的有效性。如果传统疗法不能以期望的方式改变癌症，则可以用靶向IL-4的货运蛋白来治疗受试者。

在一些实例中，可以将包括IL-4靶向的货物蛋白和另外的抗癌疗法的治疗方案施用于受试者。IL-4靶向的货物蛋白和另外的抗癌疗法将根据靶向的癌症干细胞的类型而有所不同。

在具体实例中，将以下具体IL-4靶向的货物蛋白中的一者或多者施用于受试者，以治疗癌细胞和/或癌症干细胞：环状排列的IL-4假单胞菌外毒素(参见美国专利号6,011，002)、IL-4-BAD以及PRX 321。

A.IL-4靶向的货物蛋白

IL-4靶向的货物蛋白是包含连接至货物部分的靶向部分的蛋白质。IL-4靶向的货物蛋白发挥特异性结合至癌细胞和/或癌症干细胞并且减少或抑制癌症干细胞生长，以及靶向肿瘤微环境(TME)中的免疫抑制细胞的功能。在一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白包含IL-4R靶向部分。在一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白包含IL-4R靶向部分，所述IL-4R靶向部分包含如本文所述的IL-4或其变体。在一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白包含IL-4R靶向部分，所述IL-4R靶向部分包含如本文所述的IL-13或其变体。在一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白包括PRX 321(SEQ ID NO：1)或其变体。在一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白是PRX 321(SEQ ID NO：1)。

B.货物部分

货物部分减少或抑制癌症干细胞的生长，或者杀伤癌细胞和/或癌症干细胞。在一些实例中，货物部分不是蛋白质，而是减少或抑制癌症干细胞的生长或者杀伤癌细胞和/或癌症干细胞的其他分子，诸如化学治疗剂。在一些实例中，货物部分还减少或抑制大量癌细胞生长，或杀伤癌细胞。发挥减少或抑制癌症干细胞生长或者杀伤此类细胞的功能的任何蛋白质或其他药剂，都可以用作货物部分。例如，发挥控制细胞生命周期功能的毒素和蛋白质可以用作货物部分。可以用作货物部分的毒素包括由微生物、植物或动物产生的毒素，以及由人类细胞产生的毒素。类似地，任何天然的细胞生长控制蛋白都可以用作货物部分。例如，在生物体的正常生命周期期间触发细胞死亡的蛋白质可以用作货物部分。在一些实例中，溶瘤病毒(例如，参见Allen等人,Mol.Ther.16:1556-64,2008)或携带细胞毒性剂的脂质体(例如，参见Madhankumar等人,Mol.Cancer.Ther.5:3162-9,2006)被用作货物蛋白。

在一个实例中，货物部分是毒素。可以使用的示例性毒素包括成孔毒素，以及在内化时抑制细胞生长的毒素。在其他实例中，货物部分是作为细胞凋亡触发蛋白和细胞生长抑制蛋白的蛋白质。在一些实例中，毒素是经修饰的细菌毒素，以使得所得的毒素的免疫原性低于天然毒素。此类经修饰的毒素(诸如经修饰的假单胞菌外毒素A)可以减少患者的免疫原性响应，从而允许重复施用。

成孔毒素是在细胞膜中形成孔从而经由细胞裂解来杀伤细胞的毒素。示例性成孔毒素包括但不限于人类毒素(诸如穿孔素)或细菌毒素(诸如气单胞菌溶素)以及经修饰的成孔蛋白毒素，所述经修饰的成孔蛋白毒素来源于天然存在的成孔蛋白毒素(nPPT)(诸如气单胞菌溶素或气单胞菌溶素相关多肽)。合适的气单胞菌溶素相关nPPT具有以下特征：经由蛋白酶切割除去抑制性结构域来活化的成孔活性，以及通过一个或多个结合结构域结合至细胞膜上存在的受体的能力。在一些实例中，接头可以被工程化为对蛋白酶敏感的或易受化学影响的。可以用作货物部分的成孔毒素的另外的实例包括但不限于来自嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、易损气单胞菌(Aeromonas trota)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的气单胞菌溶素原、来自腐败梭菌(Clostridium septicum)的α毒素、炭疽保护性抗原、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)VCC毒素、来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的ε毒素和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)δ毒素。气单胞菌溶素原的工程化的详细描述可见于美国专利号7,282,476，该专利以引用的方式并入本文。

可以用作货物部分的另外的毒素包括在细胞内发挥作用的毒素。例如，炭疽、白喉、霍乱和肉毒杆菌毒素包含在细胞质中发挥作用的部分，以及发挥结合至细胞表面作用的部分。这些毒素或它们的部分可以连接至靶向部分并且用于抑制癌症干细胞生长。核糖核酸酶A(RNA酶A)超家族的选定成员是有效的细胞毒素。这些细胞毒性核糖核酸酶进入胞质溶胶，它们在胞质溶胶中降解细胞RNA并导致细胞死亡。

在一些实例中，核糖体失活蛋白可以用作毒素。在这些实例中，货物部分是具有核糖体失活活性的多肽，包括但不限于白树毒素、布加宁、皂草素、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、异株泻根毒蛋白、局限曲菌素以及它们的变体。白喉毒素和假单胞菌外毒素A经由延伸因子2的ADP-核糖基化来抑制蛋白质合成。当货物部分是核糖体失活蛋白或者经由延伸因子2的ADP-核糖基化来抑制蛋白质合成时，IL-4靶向的货物蛋白可以在结合至癌症干细胞时被内化。诱导细胞凋亡的货物部分也可以用于靶向癌细胞和/或癌症干细胞。诱导细胞凋亡的货物部分的实例包括半胱天冬酶、粒酶和BCL-2促凋亡相关蛋白，诸如BAX(例如，登录号：CAE52910)、BAD(例如，登录号：CAG46757)、BAT(例如，登录号：AA107425)、BAK(例如，登录号：AAA74466)、BIK(例如，登录号：CAG30276)、BOK(例如，登录号：AAH06203)、BID(例如，登录号：CAG28531)、BIM(例如，登录号：NP_619527)和BMF(例如，登录号：AAH69328)。这些货物部分可以单独或组合用于减少或抑制癌症干细胞生长。

气单胞菌溶素是一种作为无活性原毒素(称为气单胞菌溶素原(PA))而产生的通道形成毒素。表1提供了可以用于IL-4靶向的货物蛋白的示例性气单胞菌溶素和PA序列。PA蛋白含有很多离散的官能团，包括结合结构域、毒素结构域和C端抑制性肽结构域(含有蛋白酶活化位点)。结合结构域识别和结合至糖磷脂酰肌醇(GPI)膜锚(诸如存在于T淋巴细胞上的Thy-1中)、红细胞膜中存在的PIGA基因产物和***干细胞抗原(PSCA)。气单胞菌溶素原内的活化或蛋白水解位点是一个六氨基酸序列，它被蛋白酶的弗林蛋白酶家族识别为蛋白水解底物。PA在弗林蛋白酶水解C-末端抑制性区段时被活化。活化的气单胞菌溶素结合至细胞膜中的GPI锚定蛋白并且形成七聚体，所述七聚体被***膜中，产生约17埃的明确限定的通道。通道形成导致细胞快速死亡。野生型气单胞菌溶素对哺乳动物细胞(包括红细胞)有毒，例如在1纳摩尔/升或更低的浓度下。

在一些实例中，靶标货物蛋白是天然弗林蛋白酶位点被不同的切割位点(诸如***特异性蛋白酶切割位点(例如，PSA特异性切割位点，它允许变体PA在存在***特异性蛋白酶(诸如PSA、PMSA或HK2)的情况下活化))替换的PA分子。在一个实例中，***特异性蛋白酶切割位点被***PA的天然弗林蛋白酶切割位点中，以使得PA在存在***特异性蛋白酶、但不存在弗林蛋白酶的情况下被活化。在另一个实例中，变体PA分子还包含功能缺失的结合结构域(例如，天然PA蛋白序列的约氨基酸1-83)。可以使用本领域已知的任何方法来产生功能性缺失，诸如缺失、***、突变或置换。在一些实例中，IL-4靶向的货物蛋白包括天然结合结构域被功能性缺失并且被***组织或其他组织特异性结合结构域替换的变体PA分子。在其他实例中，变体PA分子包含弗林蛋白酶切割位点和功能缺失的结合结构域，所述结合结构域被***组织特异性结合结构域替换。此类变体PA分子经由***组织特异性结合结构域靶向***细胞，并且在存在弗林蛋白酶的情况下被活化。

布加宁是一种最初从毛叶子花(Bougainvillea speotabilis)分离的核糖体结合蛋白(参见美国专利号6,680，296)。示例性经修饰的布加宁在WO 2005/090579和美国专利号7,339，031中有所描述。布加宁破坏核糖体并且导致蛋白质合成停止和细胞死亡。可以用于本公开的IL-4靶向的货物蛋白的示例性布加宁蛋白包括GenBank登录号AAL35962中的那些，以及美国专利号6,680,296、7,339,031和PCT公开WO 2005/090579中提供的那些天然的和经修饰的布加宁序列(布加宁序列以引用的方式并入本文)，以及与这些序列具有至少60％序列同一性、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性的序列。BAD(BCL2相关细胞死亡激动剂)是程序性细胞死亡(细胞凋亡)的调节物。BAD通过与BCL-xL和BCL-2形成异源二聚体并且逆转它们的死亡阻遏物活性来对细胞凋亡进行正调节。BAD的促凋亡活性通过它的磷酸化来调节。可以用于本公开的IL-4靶向的货物蛋白的示例性BAD蛋白包括GenBank登录号CAG46757、AAH01901.1和CAG46733.1中的那些，以及美国专利号6,737,511中提供的那些序列(序列以引用的方式并入本文)，以及与这些序列具有至少60％的序列同一性、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性的序列，只要变体保留或具有增强的天然BAD蛋白的生物学活性即可。

BAX(BCL2相关X蛋白)是程序性细胞死亡(细胞凋亡)的调节物。该蛋白与BCL2形成异源二聚体，并且发挥细胞凋亡活化物的功能。BAX与线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC)相互作用并且增加该通道的开口，从而导致膜电势的丧失和细胞色素c的释放。可以用于本公开的IL-4靶向的货物蛋白的示例性BAX蛋白包括GenBank登录号CAE52909.1、AA022992.1、EAW52418.1、美国专利号6,645,490提供的那些(IL2-Bax构建体中的Bax是可以用于本公开的Bax-α变体)，以及与这些序列具有至少60％的序列同一性、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性的序列，只要变体保留或具有增强的天然BAX蛋白的生物学活性即可。

在一些实例中，可以修饰IL-4靶向的货物蛋白的BAX蛋白，以使得C-末端锚定结构域被缺失和被CaaX序列替换。CaaX是具有半胱氨酸-a-a-X序列的肽，其中“X”是任何氨基酸，“a”是脂族氨基酸。因为BAX的膜缔合对于最佳细胞凋亡活性是必需的，所以膜结合结构域(诸如CaaX)的添加可以增强它们的促凋亡活性。具有CaaX序列的蛋白质是法呢基化的。法呢基化的蛋白质靶向膜(例如，参见Wright和Philip,J.Lipid Res.,2006,47(5):883-91)。含有CaaX序列的潜在BAX变体可以含有或可以不含有C-末端锚定结构域。

假单胞菌外毒素(PE)是由假单胞菌分泌的毒素。天然PE对哺乳动物细胞具有细胞毒性，因为它具有通过受体介导的内吞进入细胞的能力，然后在一系列胞内加工步骤后，易位至细胞胞质溶胶并且使延伸因子2发生ADP-核糖基化。这导致蛋白质合成的抑制和细胞死亡。PE具有三个功能结构域：氨基末端受体结合结构域、中间易位结构域和羧基末端ADP-核糖基化结构域。经修饰的PE分子可以包含结构域Ia的消除，以及结构域II和结构域III的缺失。可以用于本公开的IL-4靶向的货物蛋白的示例性PE蛋白包括表1中提供的那些，以及与这些序列具有至少60％的序列同一性、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性的序列，只要变体保留或具有增强的天然PE蛋白的生物学活性即可。

毒胡萝卜素是肌质网/内质网Ca2+ATP酶的抑制物。毒胡萝卜素被分类为倍半萜内酯，并且通过阻断细胞将钙泵入肌质网和内质网的能力来提高胞质钙浓度，从而导致这些库耗竭。库耗竭可以继而活化质膜钙通道，使钙流入胞质溶胶。

核糖核酸酶A(RNA酶A)是一种切割单链RNA的核酸内切酶。RNA酶A毒素可以从哺乳动物和爬行动物获得。可以用于本公开的IL-4靶向的货物蛋白的示例性RNA酶A蛋白包括表1中提供的那些，以及与这些序列具有至少60％的序列同一性、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性的序列，只要变体保留或具有增强的天然RNA酶A毒素的生物学活性即可。

所用的货物部分可以包含天然序列(诸如表1中引用和上文列出的专利中存在的GenBank登录号和序列)以及它们的变体，诸如与天然货物部分具有至少98％、至少95％、至少90％、至少80％、至少70％或至少60％的序列同一性的变体，只要变体保留或具有增强的天然货物部分的生物学活性即可(例如，与表1列出和上文列出的GenBank登录号具有至少约所述量的序列同一性)。在一些实例中，变体序列基本上保留相同量(或甚至更多)的货物部分的天然生物学功能，诸如杀伤或抑制癌症干细胞的生长的能力。货物部分也可以是天然序列的片段，所述片段保留大量的蛋白质的天然生物学功能。

通过将货物部分连接至靶向部分来将它们工程化为靶向癌细胞和/或癌症干细胞。靶向部分包含可以结合至癌症干细胞表面靶标的药剂。

C.癌症干细胞靶向部分

靶向部分是IL-4靶向的货物蛋白的部分，所述部分使IL-4靶向的货物蛋白靶向癌细胞，包括癌细胞和/或癌症干细胞以及大量癌细胞。靶向部分发挥特异性结合至癌症干细胞的功能。然而，应当理解，不需要靶向部分保留天然生物学活性(例如，活化受体的能力或防止配体结合至其受体的能力)，只要允许IL-4靶向的货物蛋白以高特异性结合至癌细胞和/或癌症干细胞(在一些实例中还有癌细胞)即可。在某些实例中，靶向部分是癌症干细胞展示的靶标的天然配体或天然配体的衍生物。在其他实例中，靶向部分是抗体，诸如人源化抗体或抗体片段，它们特异性结合至癌症干细胞表面上展示的靶标(例如，靶标受体)。可以使用本领域已知的任何方法(例如经由化学或重组技术)来将靶向部分连接至货物部分。

可以用于靶向癌细胞和/或癌症干细胞的化合物的非限制性列表包括结合至一种或多种癌细胞和/或癌症干细胞的抗体、天然配体、工程化配体以及它们的组合。示例性配体包括细胞因子和生长因子。癌细胞和/或癌症干细胞上的示例性靶标包括例如IL-4R。

特别关注的是分子形式的靶向部分，所述分子是癌细胞和/或癌症干细胞上的靶标的天然配体或天然配体的衍生物。例如，如果癌症干细胞表达IL-4受体(IL-4R)，则IL-4配体可以用作靶向部分。IL-4可以化学或重组连接至本文所述的一个或多个货物部分。天然配体的衍生物的实例包括授予Pastan等人的美国专利号6,011,002中所述的环化的细胞因子配体，该专利以引用的方式并入本文。除IL-4配体之外，IL-13还可以用作配体靶向部分，因为IL-4和IL-13受体共有一些序列和生物学功能。IL-4靶向的货物蛋白包括包含IL-4和IL-13配体以及它们的变体的那些货物蛋白。

在一些实例中，靶向IL-4R的抗体(包括如上文所述的片段、人源化抗体等等)。抗体可从多家公司(诸如Millipore、Bedford、Mass)商购获得。或者定制抗体可从诸如Cambridge Research Biochemicals,Billingham,Cleveland的公司订购。如果需要，可以使用本领域的常规方法来产生此类抗体。此类抗体将特异性结合至癌细胞和/或癌症干细胞(并且还可以结合至大量癌细胞)，并且发挥使货物部分与癌症干细胞接触的功能。

IL-4是由活化的T细胞产生的多效性细胞因子，并且是IL-4受体的配体。IL-4受体还结合至IL-13。因此，IL-13也可以用作靶向IL-4受体的靶向部分。IL-4、IL-3、IL-5、IL-13和CSF2在人染色体5q上形成细胞因子基因簇，该基因特别接近IL-13。可以用于本公开的IL-4靶向的货物蛋白的示例性IL-4和IL-13蛋白包括表2中提供的那些，以及与这些序列具有至少60％的序列同一性、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性的序列，只要变体保留结合IL-4受体的能力即可。

所用的靶向部分可以包含天然序列(诸如表2中引用和上文列出的专利中存在的GenBank登录号和序列)以及它们的变体，诸如与天然靶向部分蛋白具有至少98％、至少95％、至少90％、至少80％、至少70％或至少60％的序列同一性的变体(例如，与表2列出和上文列出的GenBank登录号具有至少约所述量的序列同一性)。在一些实例中，变体序列基本上保留相同量(或甚至更多)的靶向部分蛋白的天然生物学功能蛋白质，诸如活化胞内信号级联的能力。然而，在一些实例中，变体靶向部分分子可以保留很少的或不保留天然生物学活性，但是保留以高特异性结合适当的靶标的能力(例如，结合至适当的细胞表面受体或蛋白质)。

D.接头

货物部分与靶向部分的连接可以是直接的，这意味着所述货物部分的一部分直接附接至所述靶向部分的一部分。例如，货物蛋白的氨基酸序列的一个末端可以直接附接至靶向部分的氨基酸序列的一个末端。例如，货物蛋白的C-末端可以连接至靶向部分的N-末端，或者靶向部分的C-末端可以连接至货物蛋白的N-末端。产生此类融合蛋白的方法是本领域的常规方法，例如使用重组分子生物学方法。

在另一个实例中，货物部分通过接头间接连接至靶向部分。接头可以例如简单地用作连接两个实体的简便方式，用作在空间上分离两个实体的手段，以为IL-4靶向的货物蛋白或它们的组合提供另外的官能团。

通常，连接靶向部分和货物部分的接头可以被设计为(1)允许两个分子折叠并且彼此独立地发挥作用，(2)不具有形成有序二级结构的倾向，所述二级结构可以干扰两个部分的功能结构域，(3)具有最小的疏水性或带电特征部，所述特征部可以与功能性蛋白质结构域相互作用，和/或(4)提供两个区域的空间分离。例如，在一些情况下，在空间上分离靶向部分和货物部分，以防止靶向部分干扰靶向货物部分的抑制活性和/或货物部分干扰靶向部分的靶向活性，可以是所期望的。接头还可以用于例如为靶向部分和货物部分之间的连接、酶切割位点(例如蛋白酶的切割位点)、稳定性序列、分子标签、可检测标记或它们的各种组合提供不稳定性。

接头可以是双官能的或多官能的，例如在接头的第一末端之处或附近含有至少约第一反应性官能团，所述第一反应性官能团能够键合或被修饰为键合靶向部分，并且在接头的相对末端之处或附近含有第二反应性官能团，所述第二反应性官能团能够键合或被修饰为键合被修饰的货物部分。两个或更多个反应性官能团可以是相同的(即，接头是同双官能的)，或者它们可以是不同的(即，接头是异双功能的)。适合用作接头的很多双官能或多官能交联剂是本领域已知的(例如，从Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.商购获得的那些)，诸如亲和素和生物素。或者，这些试剂可以用于将接头添加至靶向部分和/或货物部分。

接头的长度和组成可以具有相当大的变化，只要它可以实现作为分子桥的目的即可。通常在考虑接头的预期功能和任选地其他因素(诸如合成的容易性、稳定性、对某些化学和/或温度参数的抗性和生物相容性)的情况下选择接头的长度和组成。例如，接头不应显著干扰靶向部分使IL-4靶向的货物蛋白靶向癌症干细胞的能力，或涉及激活、成孔能力或毒素活性的IL-4靶向的货物蛋白活性。

适用的接头可以是支链、直链、饱和或不饱和烃链，以及如上所述的肽。此外，如果接头是肽，则可以使用重组DNA技术来将接头附接至靶向部分和/或货物部分。此类方法是本领域熟知的，并且该技术的细节可见于例如Sambrook等人，出处同上。

在一个实例中，接头是具有1至100个碳原子的支链或直链、饱和或不饱和烃链，其中一个或多个碳原子任选地被--O--或--NR--(其中R为H或C1-C6烷基)取代，并且其中所述链任选地在碳上被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、酰胺、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代(.dbd.O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基组成的组。

合适的接头的实例包括但不限于具有1个至500个氨基酸残基(诸如1个至100个、1个至50个、6个至30个，诸如少于30个氨基酸)的链长的肽。通常，柔性蛋白质区域中的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser。其他中性氨基酸(诸如Thr和Ala)也可以用于接头序列。另外的氨基酸也可以包含在接头中，以在接头序列中提供独特的限制性位点，从而有利于融合体的构建。其他示例性接头包括来源于以下基团的那些，所述基团诸如乙醇胺、乙二醇、具有6个至100个碳原子的链长的聚乙烯、具有3个至30个重复单元的聚乙二醇、苯氧乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基以及乙基、丙基、己基、甾醇基、十六烷基和棕榈酰基烷基链。

在一个实例中，接头是具有1至50个碳原子的支链或直链、饱和或不饱和烃链，其中一个或多个碳原子任选地被--O--或--NR--(其中R如上文所定义)取代，并且其中所述链任选地在碳上被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、酰胺、羟基、氧代(O)、羧基、芳基和芳氧基组成的组。

在一个具体实例中，接头是具有1个至50个氨基酸残基，诸如1个至40个、1个至20个或5个至10个氨基酸残基的链长的肽。

在一个实例中，可以使用易于被补体***的酶、尿激酶、组织纤溶酶原活化物、胰蛋白酶、纤溶酶或另一种具有蛋白水解活性的酶切割的肽接头。根据另一个实例，IL-4靶向的货物蛋白包含经由易于被具有蛋白水解活性的酶(诸如尿激酶、组织纤溶酶原活化物、纤溶酶、凝血酶或胰蛋白酶)切割的接头附接的靶向部分。此外，靶向部分可以经由二硫键(例如，半胱氨酸分子上的二硫键)附接至货物部分。由于很多肿瘤自然释放高水平的谷胱甘肽(还原剂)，因此这可以还原二硫键，随后在递送部位释放货物部分。

在一个实例中，IL-4靶向的货物蛋白包含通过可切割的接头区连接的靶向部分。在另一个实例中，可切割的接头区是蛋白酶可切割的接头，但是可以使用例如可被小分子切割的其他接头。蛋白酶切割位点的实例是被因子Xa、凝血酶和胶原蛋白酶切割的那些。在一个实例中，蛋白酶切割位点是被与疾病相关的蛋白酶切割的位点。在另一个实例中，蛋白酶切割位点是通常被癌症上调或与癌症相关的蛋白酶切割的位点。此类蛋白酶的实例是uPA、基质金属蛋白酶(MMP)家族、半胱天冬酶、弹性蛋白酶、***特异性抗原(PSA，丝氨酸蛋白酶)和纤溶酶原活化物家族以及成纤维细胞活化蛋白。在又一个实例中，切割位点被癌症相关细胞分泌的蛋白酶切割。这些蛋白酶的实例包括基质金属蛋白酶、弹性蛋白酶、纤溶酶、凝血酶和uPA。在另一个实例中，蛋白酶切割位点是被癌症上调或与具体癌症相关的位点。精确的序列在本领域中是可获得的，并且技术人员在选择合适的切割位点时将没有困难。例如，因子Xa靶向的蛋白酶切割区是I E G R。肠激酶靶向的蛋白酶切割区是D D D DK。凝血酶靶向的蛋白酶切割区是L V P R G。在一个实例中，可切割的接头区是被胞内蛋白酶靶向的接头区。

如本领域所已知的，接头与货物部分的附接(或接头元件与可切割的元件，或可切割的元件与另一个货物部分的附接)不必是特定的附接或反应模式。

E.示例性货物部分/靶向部分组合

1.PRX 321

已经将PRX 321开发为用于治疗复发性/进行性胶质母细胞瘤(GB)。使用当前治疗范例，大多数GB患者在标准一线治疗后会经历肿瘤复发/进展。复发性GB患者的治疗选择非常有限，并且结果通常不能令人满意。具体而言，针对复发性或进行性GB的化疗方案并不成功，这些化疗方案会产生毒性并且无益处(Weller等人,2013)。这主要是由于缺乏组织特异性，并且产生对正常组织的毒性，因此治疗指数非常狭窄。由于总体存活期仍然不理想，因此需要具有更大的肿瘤特异性、更稳健的细胞毒性机制的新型抗癌方式以及新型递送技术来治疗复发性GB。

PRX 321是一种提供靶向治疗方法的新型治疗剂，借助于这种靶向治疗方法，肿瘤细胞对药物的毒性作用比正常细胞更为敏感。靶标(IL-4R)是针对癌症疗法开发的理想的、但未得到充分利用的靶标，因为它在多种人类癌症中频繁和强烈表达。IL-4R的表达水平在健康和正常细胞的表面上较低，但是在癌细胞上则增加数倍。来自成人和儿童中枢神经***(CNS)肿瘤的大多数癌症活检和尸检样品(包括复发性GB活检样品)已显示出过表达IL-4R。在正常成人和儿童脑组织中很少表达或不表达IL-4R(Joshi等人,2001；参考文献的表2)。IL-4R的这种差异表达为PRX 321提供了宽广的治疗窗口(关于IC50数据，参见参考文献的表4)。仅此特征就使PRX 321成为用于治疗过表达IL-4R的复发性GB和其他CNS肿瘤的理想候选物。不表达IL-4R靶标的细胞不结合PRX 321，因此不受PE介导的作用的影响。

2.其他组合

根据本发明，可以采用货物部分和基于IL-4的靶向部分的任何组合。在本部分中，提供了靶向部分和货物部分的示例性组合。在所有实例中，靶向部分可以是特异性结合靶标的抗体，诸如完全人源化抗体。

IL-4(包括IL-4环状排列的配体和其他IL-4受体结合蛋白，诸如IL-13)是可以连接至BCL-2家族蛋白(诸如BAX、BAD、BAT、BAK、BIK、BOK、BID BIM、BMF和BOK)或毒素(诸如气单胞菌溶素、气单胞菌溶素原、假单胞菌外毒素或它们的组合)的另一个靶向部分。IL-4的任何形式或衍生物都可以用作靶向部分。例如，可以使用结合至IL-4受体的IL-4或IL-4的片段。另外，多个货物部分可以连接至IL-4，或者多个IL-4蛋白可以连接至货物部分。

IL-4的任何形式或衍生物都可以用作靶向部分。例如，可以使用结合至IL-4受体的IL-4或IL-4的片段。另外，多个货物部分可以连接至IL-4，或者多个IL-2蛋白可以连接至货物部分。

环状排列的配体，例如来源于IL-4的环状排列的配体可以被用作靶向部分。假单胞菌外毒素可以被用作货物部分。环状排列的IL-4配体的任何形式或衍生物都可以用作靶向部分。另外，多个货物部分可以连接至环状排列的配体，或者多个环状排列的配体蛋白可以连接至货物部分。

V.制剂/组合物

药物组合物可以包含一种或多种IL-4靶向的货物蛋白和一种或多种无毒的药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。如果需要，其他活性成分可以包含在组合物中。如上文所述，此类组合物适用于癌症的治疗。术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰活性成分的生物学活性的有效性并且对宿主或患者无毒的载剂介质。下文提供了代表性实例。

药物组合物可以包含例如约1％至约95％的IL-4靶向的货物蛋白。被配制成用于以单剂量形式施用的组合物可以包含例如约20％至约90％的IL-4靶向的货物蛋白，而不为单剂量形式的组合物可以包含例如约5％至约20％的IL-4靶向的货物蛋白。最终制剂中的IL-4靶向的货物蛋白的浓度可以为至少1ng/mL，诸如至少1pg/mL或至少1mg/mL。例如，最终制剂中的浓度可以在约0.01μg/mL和约1,000μg/mL之间。在一个实例中，最终制剂中的浓度在约0.01mg/mL和约100mg/mL之间。

组合物可以是液态溶液、悬浮液、乳液、持续释放制剂或粉末。组合物可以与传统粘合剂和载剂(诸如甘油三酸酯)一起配制成栓剂。

IL-4靶向的货物蛋白可以与药学上可接受的媒介物一起递送。在一个实例中，媒介物可以增强稳定性和/或递送性质。因此，本公开还提供IL-4靶向的货物蛋白与合适的媒介物(诸如人工膜囊泡(包括脂质体、类脂质体、纳米体等等)、微粒或微胶囊)的制剂，或作为包含药学上可接受的聚合物的胶体制剂。此类媒介物/聚合物的使用对于实现IL-4靶向的货物蛋白的持续释放可以是有利的。或者或此外，IL-4靶向的货物蛋白制剂可以包含在体内稳定蛋白质的添加剂，诸如人血清白蛋白，或本领域已知的用于蛋白质疗法的其他稳定剂。IL-4靶向的货物蛋白制剂还可以包含一种或多种增粘剂，当例如通过注射或经由导管施用时，所述增粘剂可以发挥防止制剂回流的作用。此类增粘剂包括但不限于生物相容性二醇和蔗糖。

被配制成水性悬浮液的药物组合物包含与一种或多种合适的赋形剂，例如，与助悬剂(诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基-β-环糊精、黄蓍胶和***胶)；分散剂或润湿剂(诸如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如，十七亚乙氧基十六醇)、或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)、或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯))混合的一种或多种活性化合物。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，或者一种或多种着色剂。

通过将一种或多种活性化合物悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或者悬浮于矿物油(诸如，液体石蜡)中，可以将药物组合物配制成油性悬浮液。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。组合物可以通过添加抗氧化剂(诸如抗坏血酸)来保存。

可以将药物组合物配制成可分散的粉末或颗粒，所述粉末或颗粒随后可以用于通过添加水来制备水性悬浮液。此类可分散的粉末或颗粒提供与一种或多种分散剂或润湿剂、助悬剂和/或防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂和助悬剂的示例为上文已经提及的那些。

药物组合物也可以被配制成水包油乳液。油相可以是植物油(例如，橄榄油或花生油)或矿物油(例如，液体石蜡)，或者可以是这些油的混合物。包含在这些组合物中的合适的乳化剂包括天然存在的树胶，例如***胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂；或者来源于脂肪酸和己糖醇的酯或偏酯、酸酐，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。

可以根据本领域已知的方法，并且使用合适的一种或多种分散剂或润湿剂和/或助悬剂(诸如上文提及的那些)，将含有一种或多种IL-4靶向的货物蛋白的药物组合物配制成无菌注射用水性或油性悬浮液。无菌注射用制备物可以是溶于无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂的无菌注射用溶液或悬浮液，例如溶于1,3-丁二醇的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括但不限于水、林格氏(Ringer)溶液、乳酸林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。其他实例包括无菌不挥发性油(它们通常被用作溶剂或悬浮介质)以及多种温和的不挥发性油(包括例如合成的甘油单酯或甘油二酯)。脂肪酸(诸如油酸)也可以用于制备注射剂。

在一个实例中，使IL-4靶向的货物蛋白缀合至水溶性聚合物，例如以增加稳定性或循环半衰期或降低免疫原性。临床上可接受的水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇丙醛、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙二醇均聚物(PPG)、聚氧乙基化多元醇(POG)(例如，甘油)和其他聚氧乙基化多元醇、聚氧乙基化山梨糖醇、或聚氧乙基化葡萄糖以及其他碳水化合物聚合物。用于将多肽缀合至水溶性聚合物(诸如PEG)的方法在美国专利公开号20050106148和其中引用的参考文献中有所描述。在一个实例中，聚合物是被设计为增强药物从酸性胞内体区室至细胞质的释放的pH敏感性聚合物(参见例如，Henry等人,Biomacromolecules 7(8):2407-14,2006)。

IL-4靶向的货物蛋白还可以以治疗有效量与一种或多种抗癌疗法一起施用。一种或多种化合物可以在使用抗癌疗法治疗之前、期间或之后施用。

“抗癌疗法”是预防或延迟癌细胞的生长和/或转移的化合物、组合物或治疗(例如，手术)。此类抗癌疗法包括但不限于手术(例如，切除全部或部分肿瘤)、化疗药物治疗、放射、基因疗法、激素操纵、免疫疗法(例如，治疗性抗体和癌症疫苗)和反义或RNAi寡核苷酸疗法。有用的化疗药物的实例包括但不限于羟基脲、白消安、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、异环磷酰胺、道诺霉素、多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、长春新碱、长春花碱、Navelbine.RTM.(长春瑞滨)、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、胞嘧啶、***糖苷、博来霉素、新抑癌素、苏拉明、紫杉醇、丝裂霉素C、Avastin、Herceptin.RTM.、氟尿嘧啶和替莫唑胺等等。化合物也适合于与采用两种或更多种化学治疗剂的标准组合疗法一起使用。应当理解，抗癌疗法包括未来开发的新型化合物或治疗。

上文所述的药物组合物包含一种或多种能够有效实现预期目的的量的IL-4靶向的货物蛋白。因此，术语“治疗有效剂量”是指改善癌症症状的IL-4靶向的货物蛋白的量。确定化合物的治疗有效剂量完全在本领域的技术人员的能力范围内。例如，最初可以在细胞培养测定法中或在动物模型(诸如本文所述的那些)中估算治疗有效剂量。动物模型也可以用于确定适当的浓度范围和施用途径。然后，使用本领域的普通技术人员已知的标准方法，可以将这种信息用于确定在其他动物(包括人)中的有用剂量和施用途径。

治疗功效和毒性也可以通过标准药物程序，例如通过测定中位数有效剂量或ED₅₀(即对50％的群体治疗有效的剂量)和中位数致死剂量或LD₅₀(即对50％的群体致死的剂量)来确定。治疗效果和毒性效果之间的剂量比称为“治疗指数”，它可以以比率LD₅₀/ED₅₀表示。从细胞培养测定法和动物研究获得的数据可以用于配制用于人和动物的一系列剂量。此类组合物中含有的剂量通常在包括ED₅₀并且很少展示出毒性或不展示出毒性的浓度范围内。剂量取决于所采用的剂型、受试者的敏感性和施用途径等等，在该范围内变化。可以使用的示例性剂量范围包括至少1ng/g肿瘤、至少1μg/g肿瘤或至少1mg/g肿瘤，诸如约0.01μg/g肿瘤至约50μg/g肿瘤、约0.02μg/g肿瘤至约40μg/g肿瘤、约0.02μg/g肿瘤至约35μg/g肿瘤、0.03μg/g肿瘤至约25μg/g肿瘤、约0.04μg/g肿瘤至约20μg/g肿瘤、约0.04μg/g肿瘤至约10μg/g肿瘤、约0.5μg/g肿瘤至约2μg/g肿瘤的剂量范围。

本领域的普通技术人员将理解，剂量将特别取决于所使用的IL-4靶向的货物蛋白的类型和所治疗的癌症干细胞的类型。

在一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白是SEQ ID NO：1的PRX 321：

PRX 321也在美国专利公开号2016/0271231中有所描述，该专利公开以引用的方式整体并入本文用于所有目的。

在一些实施方案中，在人工CSF中稀释IL-4靶向的货物蛋白。在一些实施方案中，在人工脑脊液(人工CSF)中稀释PRX 321。在一些实施方案中，人工CSF包含氯化钙、葡萄糖、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠，并且在水中稀释。在一些实施方案中，人工CSF是Elliotts

溶液。在一些实施方案中，使用人工CSF来产生具有3μg/mL的PRX 321的最终组成的输注液。在一些实施方案中，使用人工CSF来产生具有3μg/mL的PRX 321的最终组成的输注液。在一些实施方案中，使用人工CSF来产生具有3μg/mL的PRX 321、0.02％的人血清白蛋白和7mM的钆-二亚乙基三胺五乙酸(Gd-DTPA,

)的最终组成的输注液。

在一些实施方案中，本文所述的制剂和施用途径允许成功覆盖约80％、约85％、约90％、约95％或约100％的肿瘤及其周围1cm边缘(有肿瘤扩散的风险)。在一些实施方案中，本文所述的制剂和施用途径允许成功覆盖约80％至约100％的肿瘤及其周围1cm边缘(有肿瘤扩散的风险)。在一些实施方案中，本文所述的制剂和施用途径允许成功覆盖约85％至约100％的肿瘤及其周围1cm边缘(有肿瘤扩散的风险)。在一些实施方案中，本文所述的制剂和施用途径允许成功覆盖约90％至约100％的肿瘤及其周围1cm边缘(有肿瘤扩散的风险)。在一些实施方案中，本文所述的制剂和施用途径允许成功覆盖约95％至约100％的肿瘤及其周围1cm边缘(有肿瘤扩散的风险)。在一些实施方案中，本文所述的制剂和施用途径允许成功覆盖约100％的肿瘤及其周围1cm边缘(有肿瘤扩散的风险)。

表3：用于制备输注液的试剂

缩写：CGMP，现行良好生产规范；NDC，国家药品代码；USP，美国药典

PRX 321制剂实施方案

PRX 321的组成：药品以浓度为500μg/mL的包含在0.5mL磷酸盐缓冲盐水(10mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH7.4±0.1)中的PRX 321的无菌冷冻溶液形式提供，其填充在用具有13mm特氟龙表面的塞子密封并且如下所示进行标记的无菌、一次性2mL 1型USP脱氢透明玻璃小瓶中：

PRX 321小瓶：PRX-321含有0.5mL PRX 321(500μg/m)，应储存在≤70℃下。小瓶的标签为“用于经由立体定向放置的导管进行的瘤内施用的无菌单剂量小瓶”。

储存：药品在二次包装中在-70℃+/-10℃下储存，直到需要制备输注液为止。必须提供一个或多个药品小瓶储存全程期间的医院药房温度监测记录，以供研究监测员检查。

处理：通过无菌技术使用预先消毒的生物安全(垂直流)柜来制备输注液。在输注液制备后，应根据医院药房的标准操作程序丢弃用过的药品小瓶。

赋形剂

在收到货物时，医院药剂师将打开运输容器，药剂师必须检查内容物的状况，并确保赋形剂试剂盒完好无损。药剂师必须按照货物中包含的说明，下载临时监测数据并填写/返回货物随附的收货证明文件，由此记录收货状况。医院药剂师必须使用“赋形剂试剂盒库存表”(附录3)来记录货物的库存。如果在赋形剂试剂盒收货过程中发现问题，医院药房应立即通知本手册第3.0节中指定的联系人。

在一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白以试剂盒提供。在一些实施方案中，PRX321以试剂盒提供。在一些实施方案中，试剂盒含有4个组件：

●人血清白蛋白(HSA)

●Elliotts B溶液

●Magnevist(Gd-DTPA)

●空静脉内输注袋

容器在开口端具有防揭密封件以确保封闭。一个赋形剂试剂盒将用于一次输注液制备。

赋形剂试剂盒组件：

●1×250mL瓶装HSA 5％(水)溶液

●1×单位Elliotts B溶液(10×10mL安瓿瓶)

●1×5mL小瓶装Gd-DTPA

●1×空(150mL大小)静脉内输注袋

如本实例所述，将赋形剂试剂盒组件用于PRX 321输注液制备。试剂盒提供了用于单次(1×)PRX 321输注液制备的材料。

储存：赋形剂试剂盒储存在控制的室温下，直到需要制备输注液为止。

处理：赋形剂试剂盒应小心处理，并且正面朝上储存(试剂盒标签在上)。

人血清白蛋白

在一些实施方案中，将人血清白蛋白(HSA)以0.02％的终浓度添加至输注液，以防止PRX 321吸附至输注组装件中所用的注射器、管和导管的内表面。

供应：1×250mL瓶装(Octapharma HSA 5％(水)溶液，NCT#68982-0623-02)

储存：按照制造商的建议储存在控制的室温下。

处理：HSA应在预先消毒的生物安全柜中使用无菌技术进行处理。一旦打开和/或使用，则应根据医院药房的标准操作程序丢弃剩余的HSA。

鞘内电解质/葡萄糖注射缓冲液(Elliotts

溶液)

在Elliotts

溶液中稀释PRX 321药品。

表4：组成/成分信息：

具体化学标识	CAS号	化学式	每毫升数量
				氯化钙	10035-04-8	CaC1<sub>2</sub>	0.2mg
葡萄糖	50-99-7	C<sub>6</sub>H<sub>12</sub>O<sub>6</sub>	0.8mg
				硫酸镁	10034-99-8	MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O	0.3mg
氯化钾	7447-40-7	KCl	0.3mg
				碳酸氢钠	144-55-8	NaHCO<sub>3</sub>	1.9mg
氯化钠	7647-14-5	NaCl	7.3mg
				磷酸氢二钠	7782-85-6	Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O	0.2mg
注射用水	7732-18-5	H<sub>2</sub>O	1mL

关于Elliott’s B溶液的更多信息。Elliotts

溶液是不含有抑菌性防腐剂的无菌、无热原、等渗溶液。

Elliotts B溶液是用于氨甲蝶呤钠和阿糖胞苷的鞘内施用的稀释剂。每10毫升Elliotts B溶液含有：

表5：每10mL的组成

具体化学标识	每10毫升数量
		氯化钠，USP	73mg
碳酸氢钠，USP	19mg
		葡萄糖，USP	8mg
硫酸镁·7H2O，USP	3mg
		氯化钾，USP	3mg
氯化钙·2H2O，USP	2mg
		磷酸氢二钠·7H2O，USP	2mg
注射用水，USP适量至10mL	至10mL

表6：电解质的浓度：

钠	149毫当量/升	碳酸氢盐	22.6毫当量/升
				钾	4.0毫当量/升	氯化物	132毫当量/升
钙	2.7毫当量/升	硫酸盐	2.4毫当量/升
				镁	2.4毫当量/升	磷酸盐	1.5毫当量/升

表7：成分的分子式和分子量：

成分	分子式	分子量
			氯化钠	NaCl	58.44
碳酸氢钠	NaHCO3	84.01
			葡萄糖	C6H12O6	180.16
硫酸镁·7H2O	Mg2SO4·7H2O	246.48
			氯化钾	KCl	74.55
氯化钙·2H2O	CaCl2·2H2O	147.01
			磷酸氢二钠·7H2O	Na2HPO4·7H2O	268.07

Elliotts B溶液的pH为6.0-7.5，渗透压体积摩尔浓度为288mOsmol/L(计算值)。

Elliotts B溶液提供可用作氨甲蝶呤钠和阿糖胞苷的鞘内施用的稀释剂的缓冲盐溶液。已经表明，Elliotts B溶液在pH、电解质组成、葡萄糖含量和渗透压体积摩尔浓度方面相当于脑脊液：

表8：Elliotts B溶液和CSF的电解质组成、pH和非电解质成分的比较：

当激发溶液为0.01N HCl时，Elliotts B溶液的近似缓冲容量为1.1×10^-2当量，当激发溶液为0.01N NaOH时，近似缓冲容量为7.8X10^-3当量。与氨甲蝶呤钠和阿糖胞苷的相容性研究表明，这些药物与Elliotts B溶液物理相容。

Elliott’s B溶液是用于制备输注液的稀释剂；它在pH、电解质组成、葡萄糖含量、渗透压体积摩尔浓度和缓冲容量方面相当于脑脊液。

钆-二亚乙基三胺五乙酸(Gd-DTPA)

在一些实施方案中，Gd-DTPA(稀释至～1:70)作为造影剂添加至输注液中，因为在输注期间该替代示踪剂的共输注允许实时监测PRX 321输注液分布。

供应：1×5mL一次性小瓶Gd-DTPA(Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc.

469.1mg/mL,NDC#50419-188-05)。

储存：根据制造商的说明储存。

处理：Gd-DTPA

应在预先消毒的生物安全柜中使用无菌技术进行处理。一旦打开或使用，则应根据关于处理此类材料的规则并且根据医院药房的标准操作程序丢弃剩余物。

VI.制备IL-4靶向的货物蛋白

IL-4靶向的货物蛋白可以通过本领域已知的很多常规方法来制备。可以例如通过使用重组DNA技术工程化编码IL-4靶向的货物蛋白的核酸或通过肽合成来制备IL-4靶向的货物蛋白及其修饰物。可以例如通过使用化学修饰和/或有限的蛋白水解来修饰IL-4靶向的货物蛋白多肽本身从而制备IL-4靶向的货物蛋白的修饰。这些方法的组合也可以用于制备IL-4靶向的货物蛋白。

克隆和表达蛋白质的方法是本领域熟知的，用于表达重组蛋白的技术和***的详细描述可见于例如Current Protocols in Protein Science(Coligan,J.E.等人，Wiley&Sons，New York)。本领域的技术人员将理解，很多表达***可以用于提供重组蛋白。因此，IL-4靶向的货物蛋白可以在原核宿主(例如，大肠杆菌(E.coli)、杀鲑气单胞菌或枯草芽孢杆菌(B.subtilis))中或在真核宿主(例如，酵母或毕赤酵母；哺乳动物细胞，例如，COS、NIH3T3、CHO、BHK、293或HeLa细胞；或昆虫细胞)中产生。可以通过本领域已知的标准技术从宿主细胞纯化IL-4靶向的货物蛋白。

表1和表2提供了各种示例性货物部分和靶向部分的序列。如果需要替代序列，可以使用标准技术来克隆这些序列的变体和同源物[参见，例如，Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley&Sons，NY(1997和后续版本)；Sambrook等人，出处同上]。例如，可以通过提取mRNA然后从mRNA模板合成cDNA(例如通过RT-PCR)或通过从基因组DNA PCR扩增基因来从合适的生物体(诸如，嗜水气单胞菌)直接获得核酸序列。或者，可以通过标准程序从适当的cDNA文库获得编码靶向部分或货物部分的核酸序列。然后将分离的cDNA***合适的载体，例如克隆载体或表达载体。

可以通过本领域熟知的体外定点诱变技术来将突变(如果需要的话)引入具体的、预先选择的位置。可以通过构成编码序列的一个或多个适当核苷酸的缺失、***、置换、倒位或它们的组合来引入突变。

表达载体还可以包含IL-4靶向的货物蛋白编码序列的有效转录所需的调控元件(诸如转录元件)。可以掺入载体的调控元件的实例包括但不限于启动子、增强子、终止子和多腺苷酸化信号。包含可操作地连接至编码遗传工程化的IL-4靶向的货物蛋白的核酸序列的调控元件的载体可以用于产生IL-4靶向的货物蛋白。

表达载体可以另外含有有利于表达的IL-4靶向的货物蛋白的纯化的异源性核酸序列，诸如亲和标签(例如，金属-亲和标签、组氨酸标签、亲和素/链霉亲和素编码序列、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码的序列和生物素编码序列)。在一个实例中，此类标签附接至IL-4靶向的货物蛋白的N-末端或C-末端，或可以定位于IL-4靶向的货物蛋白内。标签可以在使用之前根据本领域已知的方法从表达的IL-4靶向的货物蛋白除去。或者，标签可以保留在IL-4靶向的货物蛋白上，前提条件是它们不干扰IL-4靶向的货物蛋白靶向和杀伤癌细胞和/或癌症干细胞(或减少它们的生长)的能力。

作为将突变引入天然存在的成孔蛋白的定向方法的替代方法，可以通过本领域已知的技术对表达成孔蛋白的克隆基因进行随机诱变。这样产生的蛋白质的突变形式的后续表达和筛选将允许鉴定和分离靶向的货物部分。

还可以将IL-4靶向的货物蛋白制备为片段或融合蛋白。融合蛋白是包含连接至其他氨基酸序列的IL-4靶向的货物蛋白的融合蛋白，所述其他氨基酸序列不抑制IL-4靶向的货物蛋白选择性靶向和抑制癌症干细胞生长或杀伤癌细胞和/或癌症干细胞的能力。在一个替代实例中，其他氨基酸序列是长度为例如最多约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约20个、约30个、约50个或约100个氨基酸残基的短序列。这些短序列可以是如上文所述的接头序列。

用于制备融合蛋白的方法是本领域的技术人员熟知的。例如美国专利号6，057,133公开了用于制备融合分子的方法，所述融合分子由在功能上连接至第二集落刺激因子、细胞因子、淋巴因子、白介素、造血生长因子或IL-3变体的人白介素-3(hIL-3)变体或突变蛋白组成。授予Davis等人的美国专利号6，072，041公开了融合蛋白的产生，所述融合蛋白包含针对共价连接至治疗性蛋白质的胞移受体的单链Fv分子。

根据需要，IL-4靶向的货物蛋白可以包含一个或多个接头，以及其他部分。这些可包含可用于融合蛋白的纯化和加工的结合区，诸如亲和素或表位，或者标签(诸如多组氨酸标签)。此外，可检测的标记可以附接至融合蛋白，以使得可以方便地监测融合蛋白通过身体或细胞的运输。此类标记包括放射性核素、酶、荧光团、发色团等等。

本领域的普通技术人员将理解，可以以多种方式改变DNA而不影响编码蛋白的生物学活性。例如，PCR可以用于产生编码IL-4靶向的货物蛋白的DNA序列的变异体。这些编码IL-4靶向的货物蛋白的DNA序列的变异体可以用于优化用于表达蛋白质的宿主细胞中的密码子偏爱性，或可以含有有利于表达的其他序列变化。

靶向部分与货物部分的直接或经由接头的共价连接可以采取本领域已知的各种形式。例如，共价连接可以是二硫键的形式。编码一种组分的DNA可以被工程化为含有独特的半胱氨酸密码子。第二组分可以通过与第一组分的半胱氨酸反应的巯基基团来衍生化。或者，可以使用固相多肽技术将巯基基团本身或作为半胱氨酸残基的一部分引入。例如，Hiskey描述了巯基基团至肽的引入(Peptides 3:137，1981)。

蛋白质也可以通过标准技术来进行化学修饰以添加巯基基团。例如，可以使用特劳特(Traut)试剂(2-亚氨基硫烷-HCl)(Pierce Chemicals,Rockford,Ill.)来将巯基基团引入伯胺，诸如赖氨酸残基或N-末端胺。然后可以将用特劳特试剂改性的蛋白质或肽与已经用试剂(诸如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)或4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC))改性的蛋白质或肽反应(Pierce Chemicals,Rockford,Ill.)。

还可以使用聚合物(单甲氧基-聚乙二醇(mPEG))来连接组分，如Maiti等人，Int.J.Cancer Suppl.，3:17-22，1988所述。

还可以通过使用本领域已知的标准缀合化学(诸如碳二亚胺介导的偶联(例如，DCC、EDC或活化的EDC))，以及使用2-亚氨基硫烷将ε氨基基团转化为用于交联的硫醇，并且将间马来酰亚胺基苯甲酸-n-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)作为交联剂来缀合靶向部分和货物部分。

VII.测试IL-4靶向的货物蛋白

IL-4靶向的货物蛋白可以使用本领域已知的标准技术来测试。在下文和本文包括的实施例中提供了测试候选IL-4靶向的货物蛋白的示例性方法。本领域的普通技术人员将理解，测试IL-4靶向的货物蛋白的其他方法是本领域已知的，并且也适用于测试候选IL-4靶向的货物蛋白。例如，可以使用本领域已知的用于测试抗肿瘤活性的方法。最初可以针对一组癌细胞系或癌症干细胞系筛选IL-4靶向的货物蛋白。可以使用细胞增殖测定法，诸如Roche销售的WST-1试剂盒。可以在存在或不存在抑制癌细胞或使癌细胞和/或癌症干细胞敏化的药剂的情况下使用不同的药物浓度来评估效力。从初始癌症干细胞筛选选择的候选药物可以通过另外的体外测定法和在相关异种移植模型中进一步表征，以检查抗肿瘤活性。

A.体外

可以使用已知的方法来测试IL-4靶向的货物蛋白杀伤癌症干细胞或显著减少或抑制癌细胞和/或癌症干细胞生长的能力。例如，可以使用合适的细胞(典型地表达靶标的细胞系或癌症干细胞)在体外测定IL-4靶向的货物蛋白杀伤或抑制细胞生长的能力。通常，使所选的测试细胞系的细胞生长至适当的密度，并且添加候选IL-4靶向的货物蛋白。IL-4靶向的货物蛋白可以以约至少1ng/mL、至少1μg/mL或至少1mg/mL，诸如约0.01μg/mL至约1mg/mL、约0.10μg/mL至约0.5mg/mL、约1μg/mL至约0.4mg/mL添加至培养物中。在一些实例中，测试连续稀释。在适当的温育时间(例如，约48小时至72小时)后，评估细胞存活或生长。测定细胞存活的方法是本领域熟知的，并且包括但不限于刃天青还原测试(参见Fields和Lancaster Am.Biotechnol.Lab.,11:48-50,1993；O′Brien等人,Eur.J.Biochem.,267:5421-5426,2000和美国专利号5,501,959)、磺酰罗丹明测定法(Rubinstein等人,J.Natl.Cancer Inst.,82:113-118,1999)或中性红色染料测试(Kitano等人,Euro.J.Clin.Investg.,21:53-58,1991；West等人,J.Investigative Derm.,99:95-100,1992)或台盼蓝测定法。还可以使用很多商购获得的试剂盒，例如CellTiter96.RTM.AQueous One溶液细胞增殖测定法(Promega)。通过将经处理的培养物中的细胞存活与一种或多种对照培养物(例如未经处理的培养物和/或用对照化合物(典型地已知的疗法)或其他适当的对照预处理的培养物)中的细胞存活进行比较来确定细胞毒性。被认为能够有效杀伤或减少癌细胞和/或癌症干细胞生长的IL-4靶向的货物蛋白能够减少细胞存活或生长，例如减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。

在一些实例中，IL-4靶向的货物蛋白可以对非癌细胞和/或非癌症干细胞无显著毒性。例如，当IL-4靶向的货物蛋白以约至少1ng/mL、至少1μg/mL或至少1mg/mL，诸如约0.01μg/mL至约1mg/mL、约0.10μg/mL至约0.5mg/mL、约1μg/mL至约0.4mg/mL在细胞培养物中与不展示出靶标(例如，不表达IL-2R)的细胞一起温育时，将杀伤小于50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％的非癌细胞和/或非癌症干细胞。在一些实例中，当IL-4靶向的货物蛋白以约至少1ng/mL、至少1μg/mL或至少1mg/mL，诸如约0.01μg/mL至约1mg/mL、约0.10μg/mL至约0.5mg/mL、约1μg/mL至约0.4mg/mL在细胞培养物中与不展示出靶标(例如，不表达IL-2R)的细胞一起温育时，将具有比非癌细胞和/或非癌症干细胞大至少10倍的LD₅₀，诸如比非癌细胞和/或非癌症干细胞大至少20倍、大至少50倍或大至少100倍的LD₅₀。

在一些实例中，IL-4靶向的货物蛋白包含含有活化序列的一个或多个修饰的毒素。可以根据本领域已知的方法测试这些可活化的IL-4靶向的货物蛋白被适当的活化剂切割的能力。例如，如果一个或多个修饰导致一个或多个蛋白酶切割位点的添加，则可以将IL-4靶向的货物蛋白与一种或多种不同浓度的适当的蛋白酶一起温育。可以在SDS-PAGE凝胶上电泳温育产物，并且可以通过检查凝胶上的多肽的大小来评估IL-4靶向的货物蛋白的切割。

为了确定已经与蛋白酶一起温育的可活化的IL-4靶向的货物蛋白是否保留成孔活性，从而确定在与蛋白酶一起温育后杀伤细胞的能力，可以以本领域已知的溶血测定法测试反应产物。合适的测定法的实例在Howard和Buckley,J.Bacteriol.,163:336-40,1985中有所描述，该文献以引用的方式并入本文。

可以测试赋予针对特定癌症类型的选择性的IL-4靶向的货物蛋白靶向特定癌细胞类型的能力。例如，可以通过将IL-4靶向的货物蛋白杀伤癌细胞和/或癌症干细胞的能力与其杀伤正常细胞或不同类型的癌细胞(例如，不表达IL-4R的癌细胞)的能力进行比较，来评估包含靶向展示出IL-4R的癌细胞和/或癌症干细胞的IL-4的IL-4靶向的货物蛋白选择性靶向癌细胞和/或癌症干细胞的能力。或者，可以使用本领域已知的流式细胞法来确定包含IL-4靶向部分的IL-4靶向的货物蛋白是否能够选择性靶向特定类型的癌症干细胞。标记抗体与结合的IL-4靶向的货物蛋白的结合将表示IL-4靶向的货物蛋白与靶标的结合。

适用于测试候选IL-4靶向的货物蛋白的多种癌细胞系是本领域已知的，并且很多是可商购获得的(例如，来自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection,Manassas,Va.))。在一个实例中，在人类癌细胞系中进行候选化合物的体外测试。在另一个实例中，如授予Stassi等人的美国专利申请号2007/0292389所述分离和培养癌细胞和/或癌症干细胞。将培养的干细胞用于测试IL-4靶向的货物蛋白的活性。可以通过以下步骤来进行靶向部分的初始测试：将靶向部分连接至可检测的标记(诸如荧光标记)，使已知含有适当的癌细胞和/或癌症干细胞的样品接触靶向部分，以及观察结合至癌症干细胞的缔合的荧光标记。

IL-4靶向的货物蛋白的另外的体外测试可以使用已工程化为表达所期望的靶标的细胞系来完成。对靶标具有特异性的抗体可以用于确保靶标的表达。在结合至表达靶标的细胞时，IL-4靶向的货物蛋白可以引起细胞裂解，所述细胞裂解可以使用本领域已知的方法来检测。

B.体内

可以使用本领域已知的标准技术在适当的动物模型中确定IL-4靶向的货物蛋白在体内杀伤肿瘤细胞的能力(参见，例如Enna等人，Current Protocols in Pharmacology,J.Wiley&Sons,Inc.,New York,N.Y.)。

目前用于筛选抗肿瘤化合物的动物模型包括异种移植模型，其中人类肿瘤已植入动物体内。使用这些技术，可以移植癌细胞和/或癌症干细胞，并且可以评估所得的肿瘤的存在、大小和形态。人类癌症的异种移植模型的实例包括但不限于：人类实体瘤异种移植物，它通过皮下注射或移植来进行移植并且被用于肿瘤生长测定；人类实体瘤同种异体移植物，它通过脂肪垫注射来移植并且被用于肿瘤生长测定；人类实体瘤原位异种移植物，它被直接移植到相关组织中并且被用于肿瘤生长测定；用于存活测定的小鼠淋巴瘤和白血病实验模型，以及小鼠肺转移实验模型。除移植的人类肿瘤细胞之外，异种移植模型还可以包含移植的人类外周血白细胞，所述人类外周血白细胞允许对抗癌免疫应答进行评估。

或者，可以将鼠科动物癌症模型用于筛选抗肿瘤化合物。适当的鼠科动物癌症模型的实例是本领域已知的，并且包括但不限于通过静脉内、皮下、脂肪垫或原位注射来移植鼠科动物癌细胞的移植模型；鼠科动物转移模型；转基因小鼠模型；以及敲除小鼠模型。

例如，可以在第0天使用30mg至60mg肿瘤片段双侧皮下植入的小鼠，或适当数量的癌细胞和/或癌症干细胞(例如，至少10³个、至少10⁴个或至少10⁶个癌细胞和/或癌症干细胞，诸如约10个至约10⁵个、约50个至约10⁴个或约75个至约10³个)移植的小鼠在实体瘤上体内测试IL-4靶向的货物蛋白。将荷瘤动物随机分组，然后接受各种治疗和对照。就晚期肿瘤的治疗而言，允许肿瘤发展到所期望的大小，除去肿瘤发展不充分的动物。随机分配所选的动物以进行治疗和对照。不荷瘤动物也可以接受与荷瘤动物相同的治疗，以便能够将毒性作用与对肿瘤的特定作用区分开。根据肿瘤的类型，化学疗法通常从植入后3至22天开始，并且每天观察动物。可以将IL-4靶向的货物蛋白例如通过腹腔内注射、静脉内注射、向肿瘤直接注射(或注射至具有肿瘤的器官中)或弹丸输注施用于动物。可以使用上文所述的体外测试结果来确定注射的IL-4靶向的货物蛋白的量。例如，至少约1ng/kg体重、至少1μg/kg体重、或至少1mg/kg体重，诸如约0.01μg/kg体重至约1mg/kg体重、约0.10μg/kg体重至约1.0g/kg体重、约1mg/kg体重至约4mg/kg体重。每周给不同的动物组称重约3次或4次，直到达到最大体重减轻，此后每周给各组称重至少约一次，直到试验结束。

在预定时间期后测量肿瘤，或者可以通过每周测量约2次或3次来连续监测肿瘤，直到肿瘤达到预定大小和/或重量，或直到动物死亡(如果在肿瘤达到预定大小/重量前发生死亡)。然后处死动物并且评估肿瘤的组织学、大小和/或增殖。原位异种移植模型是皮下模型的替代模型，并且可以更准确地反映癌症发展过程。在该模型中，将肿瘤细胞移植到起源器官的部位并且在内部发育。因此，与皮下模型相比，肿瘤大小的每日评估更加困难。最近开发的在非侵入性全身成像中使用绿色荧光蛋白(GFP)表达肿瘤的技术可以有助于解决此问题(Yang等人,Proc.Nat.Aca.Sci.,1206-1211,2000)。该技术采用稳定表达非常高水平的绿色荧光蛋白(GFP)的人类或鼠科动物肿瘤。GFP表达肿瘤可以借助于外部放置的视频检测器来显示，以允许监测肿瘤生长、血管发生和转移扩散的细节。可以通过监测一个或多个肿瘤内的血管密度来测量随时间推移的血管发生。因此，该模型的使用允许同时监测与肿瘤进展相关的若干特征部，并且具有较高的临床前和临床相关性。

对于组合物对白血病的作用研究，将特定数量的细胞植入动物中，并且通过相对于对照的经治疗的小鼠的存活时间增加来确定抗肿瘤活性。

为了研究特定的IL-4靶向的货物蛋白对肿瘤转移的作用，通常用组合物来对肿瘤细胞进行离体处理，然后将肿瘤细胞注射至合适的测试动物中。然后在合适的时间期内监测肿瘤细胞从注射部位的扩散。

可以选择足以有效抑制癌症干细胞生长的IL-4靶向的货物蛋白(如通过体外细胞存活测定法、转移抑制测定法和/或xenograph模型***所证实)以用于人类。还可以根据测定法指示的潜在治疗剂量范围内的相对毒性来选择IL-4靶向的货物蛋白以在人体中进行试验和最终治疗。治疗剂量和毒性在下文进一步描述。

VIII.治疗用途

本文所述的IL-4靶向的货物蛋白可以用于多种治疗目的。在出于治疗目的施用之前，可能需要出于特定目的而对IL-4靶向的货物蛋白进行修饰或改变，例如全身施用所需的IL-4靶向的货物蛋白的浓度可以不同于局部施用所用的浓度。类似地，治疗剂的毒性可以根据施用方式和所用的总体组合物(例如，缓冲液、稀释剂、另外的化学治疗剂等)而改变。

A.毒性

当治疗性蛋白质施用于受试者时，可以引起一定水平的抗体响应，这在一些情况下可以导致不期望的副作用。因此，如果需要，可以如本领域所已知和下文所述评估IL-4靶向的货物蛋白的抗原性。此外，还描述了减少潜在抗原性的方法。

可以通过测量IL-4靶向的货物蛋白在治疗过程中对动物体重的影响以及通过在处死动物后进行血液谱分析和肝酶分析来评估IL-4靶向的货物蛋白的体内毒性作用。可以根据本领域已知的方法来测试IL-4靶向的货物蛋白的一般毒性。例如，可以通过确定单次静脉内注射后杀伤100％的小鼠的剂量(即LD100)来测试IL-4靶向的货物蛋白的总体全身毒性。可以选择比LD100或LD50小至少约2倍、5倍或10倍的剂量，以便施用于其他哺乳动物，诸如人。

可以例如在免疫健全小鼠中确定针对本文所述的IL-4靶向的货物蛋白的抗体响应的动力学和程度，并且所述动力学和程度可以用于促进可用于免疫健全的人的给药方案的开发。将IL-4靶向的货物蛋白以静脉内剂量施用于免疫健全小鼠，诸如C57-BL6品系。在不同的间隔处死小鼠(例如，在单剂量后、在多剂量后)并且获得血清。基于ELISA的测定法可以用于检测抗IL-4靶向的货物蛋白抗体的存在。

为了降低IL-4靶向的货物蛋白的抗原性，可以对用作货物部分的毒素的天然结合结构域进行功能性缺失和替换，例如使用靶向部分来制备IL-4靶向的货物蛋白。可以在暴露于不同时间表的IL-4靶向的货物蛋白(缺乏天然结合结构域的部分)后使用上文所述的方法来确定此类IL-4靶向的货物蛋白的抗原性。采用完全人源化抗体的IL-4靶向的货物蛋白也可以用于使抗原性最小化。

可以用于进行使用IL-4靶向的货物蛋白的连续治疗的另一种方法是使用按顺序施用的替代性IL-4靶向的货物蛋白，所述替代性IL-4靶向的货物蛋白来源于具有非重叠抗原性的其他货物蛋白。例如，可以将来源于气单胞菌溶素原的IL-4靶向的货物蛋白与来源于腐败梭菌α毒素或苏云金芽孢杆菌δ-毒素的IL-4靶向的货物蛋白一起替代性地使用。所有这些IL-4靶向的货物蛋白都将靶向癌细胞和/或癌症干细胞，但是不会被相同的抗体识别或中和。

如本领域所已知，可以评估来自这些小鼠的血清样品中抗IL-4靶向的货物蛋白抗体的存在。又如，表位作图也可以用于确定蛋白质的抗原性，如Stickler等人,J.Immunotherapy,23:654-660,2000所述。简而言之，从未暴露于所关注的蛋白质的团体供体的血液分离称为树突细胞和CD4+T细胞的免疫细胞。然后将跨越蛋白质长度的小合成肽添加至培养的细胞中。响应于特定肽的存在的增殖表明T细胞表位涵盖在序列中。随后可以在IL-4靶向的货物蛋白中缺失或修饰该肽序列，从而降低其抗原性。

B.胶质母细胞瘤的治疗

在一些实施方案中，将IL-4靶向的货物蛋白用于脑肿瘤的治疗。在一些实施方案中，脑肿瘤是胶质母细胞瘤(GB)。胶质母细胞瘤(GB)是一种特征在于未分化的细胞的快速增殖、广泛浸润和高度复发倾向的侵袭性脑肿瘤(Hamstra等人,2005)。它是一种快速进展和普遍致命的癌症。对于用同步替莫唑胺

和放射疗法治疗的成人，中位数存活期为14.6个月，两年存活率为大约30％，五年存活率为大约10％。临床影响由快速神经恶化来定义，所述神经恶化会影响执行日常功能(诸如进食、行走和说话)的能力。还可能产生人格和身份扭曲，诸如情绪、记忆、情感和智力。GB通常不会在CNS之外转移，并且由于颅内压力增加和骨包埋的脑腔内的不受控制的肿瘤生长所导致的突出症，通常会导致死亡。在资源丰富的国家中，原发性GB的每年全球发病率为大约27,500人(Decision Recourses,2013)。

C.患者群体

本发明的IL-4靶向的货物蛋白(包括例如PRX 321)可用于治疗特定患者群体中的复发性GB。

在一些实施方案中，癌症活检和尸检样品来自成人和儿童CNS肿瘤(例如，脑肿瘤)。在一些实施方案中，患者患有胶质母细胞瘤(GB)。在一些实施方案中，患者患有复发性GB。在一些实施方案中，与正常成人和儿童脑组织中很少表达或不表达IL-4R相比，患者肿瘤样品显示出过表达IL-4R(Puri等人,1994a；Kawakami等人,2002a；Joshi等人,2001；Konanbash等人,2013)。虽然不受理论的束缚，但是不表达IL-4R靶标的细胞不结合PRX321，因此不受PE介导的作用的影响(Kawakami等人,2002)。

在一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白(包括例如PRX 321)诱导不依赖于生长速率的肿瘤生长杀伤(Li和Hall,2010)。在一些实施方案中，肿瘤微环境(TME)的静息癌细胞和/或癌症干细胞和生长较慢的非恶性细胞可以与快速***的肿瘤细胞一样对PRX 321敏感。

在一些实施方案中，癌细胞是O⁶-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶(MGMT)阳性的。在一些实施方案中，O⁶-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶(MGMT)阳性癌细胞(具有未甲基化的MGMT启动子，所以对替莫唑胺具有抗性)对PRX 321敏感。示例性敏感的CNS癌细胞系包括T98G(胶质母细胞瘤)，并已显示出过表达MGMT。此类细胞系对烷基化剂(诸如替莫唑胺)具有抗性(Huang等人，2012；Kuo等人，2007；Kokkinakis等人，2003)，但是可以对PRX 321敏感。在一些实施方案中，IL-4R表达细胞系显示出对PRX 321具有皮摩尔敏感性。参见，例如Puri等人,1996b；Kreitman等人,1995；Shimamura等人,2007。在一些实施方案中，IL-4R表达肿瘤表现出对本发明的IL-4靶向的货物蛋白的皮摩尔敏感性。在一些实施方案中，IL-4R表达肿瘤表现出对PRX 321的皮摩尔敏感性。在一些实施方案中，MGMT表达肿瘤表现出对本发明的IL-4靶向的货物蛋白的敏感性。在一些实施方案中，IL-4R表达胶质母细胞瘤表现出对PRX 321的敏感性。在一些实施方案中，MGMT表达肿瘤表现出对PRX 321的敏感性。在一些实施方案中，MGMT表达胶质母细胞瘤表现出对PRX 321的敏感性。

弗林蛋白酶样蛋白酶切割PRX 321并且导致PE毒素活化(Chironi等人,1997；Shapira和Benhar,2010)，胶质母细胞瘤通常表达弗林蛋白酶(Mercapide等人,2002；Wick等人,2004)。与正常细胞相比，神经胶质瘤细胞中的弗林蛋白酶的较高表达水平提供了另外的肿瘤特异性，并且还有助于将癌细胞对PRX 321的异常皮摩尔敏感性列为因素。在一些实施方案中，肿瘤表达弗林蛋白酶。在一些实施方案中，表达弗林蛋白酶的肿瘤比正常的非肿瘤细胞对IL-4靶向的货物蛋白(诸如PRX 321)更敏感。

不仅CNS肿瘤过表达IL-4R，而且免疫抑制性TME的非恶性细胞(MDSC和TAM)也过表达IL-4R。在一些实施方案中，IL-4R IL-4靶向的货物蛋白(包括PRX 321)可用于治疗患有侵袭性形式的原发性和转移性脑癌的成人和儿童患者。

GB具有稳健的免疫抑制性TME，可以占肿瘤质量的最多40％(Kennedy等人，2013)。最近，研究显示恶性神经胶质瘤具有2型T辅助细胞(Th2)偏差，被骨髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)大量浸润，并且IL4/IL-4R偏差介导它们的免疫抑制功能(Harshyne等人，2016)。此外，IL-4R在神经胶质瘤浸润的骨髓细胞中上调，但是在外周或正常脑中则不上调(Kohanbash等人,2013)。在一些实施方案中，使用本发明的IL-4靶向的货物蛋白(包括PRX 321)清除Th2细胞、MDSC和TAM可以减轻与癌症相关的免疫阻断。在一些实施方案中，免疫阻断的减轻促进抗肿瘤免疫力并且有助于长期疾病控制和/或疾病治疗。

D.施用和给药

IL-4靶向的货物蛋白可以用于治疗、稳定或预防CNS癌症，包括例如IL-4靶向的货物蛋白PRX 321。IL-4靶向的货物蛋白也可以用于治疗无痛性癌症、复发性癌症，包括局部复发性、远处复发性和/或难治性癌症(即，对其他抗癌治疗无响应的癌症)、转移性癌症、局部晚期癌症和侵袭性癌症。在这些背景中，IL-4靶向的货物蛋白可以发挥细胞毒性或细胞抑制效果，从而导致例如癌细胞和/或癌症干细胞的数量或生长减少、肿瘤大小减小、减慢或防止肿瘤大小增加、肿瘤消失或移除和重现之间的无病存活时间增加、预防肿瘤的初始或后续发生(例如转移)、进展时间增加、与肿瘤相关的一种或多种不良症状的减少、或患有癌症的患者的总体存活时间增加。

通常，在癌症的治疗中，例如通过弹丸注射或连续输注至患者的血液，从而将IL-4靶向的货物蛋白全身施用于患者。或者，IL-4靶向的货物蛋白可以在肿瘤的部位(瘤内)局部施用。当IL-4靶向的货物蛋白瘤内施用时，施用可以经由任何途径进行，例如局部、区域性、局灶性、全身、对流增强递送或它们的组合。

当化合物与一种或多种已知的化学治疗剂联合使用时，所述化合物可以在化学治疗剂施用之前或之后施用，或者它们可以伴随施用。一种或多种化学治疗剂可以例如通过弹丸注射或连续输注全身施用，或者它们可以口服施用。

对于向动物的施用，药物组合物可以配制成通过多种途径施用。例如，组合物可以配制成局部、直肠或肠胃外施用或通过吸入或喷雾施用。如本文所用，术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、鞘内、胸骨内注射或输注技术。还设想了直接注射或输注至肿瘤中。对流增强递送也可以用于施用IL-4靶向的货物蛋白。

在一个实例中，可以使用类似于近距离治疗的多次注射方法的施用方法来将IL-4靶向的货物蛋白注射至患有癌症的受试者。例如，可以使用针来注射药物组合物或制剂形式和适当的剂量单位的纯化的IL-4靶向的货物蛋白的多个等分试样。IL-4靶向的货物蛋白的替代性施用方法对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。此类方法包括例如导管或植入式泵的使用，从而为需要治疗的受试者提供IL-4靶向的货物蛋白的连续输注。

如本领域所已知，软件计划程序可以与近距离治疗处置和超声组合使用，例如用于导管的放置，以输注IL-4靶向的货物蛋白，从而治疗例如脑肿瘤或其他局部肿瘤。例如，通常可以在超声引导下实现针的定位和放置。可以例如根据待治疗的器官的体积或面积来调整总体积，从而调整施用于患者的注射和沉积的数量。合适的软件计划程序的一个实例是近距离治疗处置计划程序Variseed 7.1(Varian Medical Systems，Palo Alto，Calif.)。此类方法已成功用于***癌等的治疗。

如果必须减少针对IL-4靶向的货物蛋白的全身免疫应答，则可以将免疫抑制疗法与IL-4靶向的货物蛋白组合使用。免疫抑制疗法的实例包括但不限于全身或局部皮质类固醇(Suga等人,Ann.Thorac.Surg.,73:1092-7,2002)、环孢菌素A(Fang等人,Hum.GeneTher.,6:1039-44,1995)、环磷酰胺(Smith等人,Gene Ther.,3:496-502,1996)、脱氧精胍菌素(Kaplan等人,Hum.Gene Ther.,8:1095-1104,1997)以及T细胞和/或B细胞的抗体[例如抗CD40配体、抗CD4抗体、抗CD20抗体(利妥昔单抗)](Manning等人，Hum.Gene Ther.，9:477-85，1998)。可以在IL-4靶向的货物蛋白的施用之前、期间或之后施用此类药剂。可以以约10毫克/周至约1000毫克/周、约40毫克/周至约700毫克/周、或约200毫克/周至约500毫克/周施用此类药剂持续2周、3周、4周、5周、6周或7周。如果受试者仍然有响应(例如，癌症的症状是静态的或减轻的)，则可以根据需要重复治疗过程。

IL-4靶向的货物蛋白也可以与敏化剂(诸如放射敏化剂)组合施用(参见例如Diehn等人，J.Natl.Cancer Inst.98:1755-7,2006)。通常，敏化剂是增加IL-4靶向的货物蛋白的活性的任何药剂。例如，敏化剂将增加IL-4靶向的货物蛋白抑制癌症干细胞生长或杀伤癌细胞和/或癌症干细胞的能力。示例性敏化剂包括IL-10的抗体、骨形态发生蛋白和HDAC抑制剂(参见例如Sakariassen等人，Neoplasia 9(11):882-92，2007)。这些敏化剂可以在用IL-4靶向的货物蛋白治疗之前或期间施用。此类敏化剂的示例性剂量包括至少1μg/mL，诸如至少10μg/mL、至少100μg/mL，例如5-100μg/mL或10-90μg/mL。可以每日、每周三次、每周两次、每周一次或每两周一次施用敏化剂。还可以在用IL-4靶向的货物蛋白治疗完成后施用敏化剂。

IL-4靶向的货物蛋白可以用作新辅助疗法(针对主要疗法)的一部分，也可以用作辅助疗法方案的一部分，目的是治愈受试者中的癌症。IL-4靶向的货物蛋白也可以在肿瘤发展和进展的不同分期施用，包括在晚期和/或侵袭性瘤形成(例如，不适合通过局部治疗方式(诸如手术或放射疗法)治愈的受试者中的明显疾病)、转移性疾病、局部晚期疾病和/或难治性肿瘤(例如，对治疗无响应的癌症或肿瘤)的治疗中施用。

“主要疗法”是指在受试者的癌症的初步诊断时的一线治疗。示例性主要疗法可以涉及手术、广泛的化学疗法和放射疗法。“辅助疗法”是指在主要疗法后和施用于有复发风险的受试者的疗法。辅助全身疗法在主要疗法后不久开始，例如在最后一次主要疗法处置后2周、3周、4周、5周或6周开始，以延迟复发、延长存活期或治愈受试者。如上所述，可以设想的是，作为辅助疗法的一部分的IL-4靶向的货物蛋白可以单独或与一种或多种其他化学治疗剂组合使用。IL-4靶向的货物蛋白和标准化学治疗剂的组合可以发挥改善化学治疗剂的功效的作用，所以可以用于改善标准癌症疗法。本申请在对标准治疗无响应的耐药性癌症的治疗方面是特别重要的。待施用的剂量不受限制，但是通常是有效量。组合物可以以单位剂型配制。术语“单位剂型”是指适合作为人类受试者和其他哺乳动物的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有经计算与合适的药物赋形剂缔合可产生所期望的治疗效果的预定数量的活性材料。单位剂型可以施用一次，或者可以例如在整个器官或实体瘤中施用多个单位剂量。每个剂量单位中的一种或多种IL-4靶向的货物蛋白的范围的实例为约0.0005至约100mg，或更通常地约1.0至约1000mg。在单剂量或分剂量中，IL-4靶向的货物蛋白的每日剂量通常为至少1ng/kg体重、至少1μg/kg体重、至少1mg/kg体重，例如在约0.01至约100mg/kg体重的范围内。然而，应该理解，一种或多种待施用的化合物的实际量将由内科医生根据相关情况(包括将治疗的疾患、所选的施用途径、所施用的实际化合物、个体患者的年龄、体重和响应以及患者症状的严重度)来确定。上述剂量范围仅以举例的方式给出，并且不旨在以任何方式限制范围。在一些情况下，低于前述范围的下限的剂量水平可以绰绰有余，而在其他情况下，仍然可以采用更大的剂量而不导致有害的副作用，例如首先将较大的剂量分为若干较小的剂量，以便全天施用。

IL-4靶向的货物蛋白可以用于治疗和/或控制癌症，方法包括将预防或治疗有效方案施用于有需要的受试者，所述方案包括将一种或多种疗法施用于受试者，其中所述方案的结果是癌症干细胞群的稳定或减少，并且不导致循环的内皮细胞群和/或循环的内皮祖细胞群的减少或者仅导致这些群体的少量减少。在一个实例中，方案实现了癌症干细胞群减少5％-40％、10％-60％或20％至99％和/或循环的内皮细胞群减少小于25％、小于15％或小于10％。在另一个实例中，方案实现了癌症干细胞群减少5％-40％、10％-60％或20％至99％和/或循环的内皮祖细胞群减少小于25％、小于15％或小于10％。在另一个实例中，方案实现了癌症干细胞群减少5％-40％、10％-60％或20％至99％和/或循环的内皮细胞群和循环的内皮祖细胞群减少小于25％、小于15％或小于10％。在一个具体实例中，在一种或多种疗法施用两周、一个月、两个月、三个月、四个月、六个月、九个月、1年、2年、3年、4年或更长时间后实现癌症干细胞群的稳定或减少。在一个特定实例中，可以使用本领域已知的任何方法来确定癌症干细胞群的稳定或减少。在某些实例中，根据方案，定期监测循环的癌症干细胞群、循环的内皮细胞群和/或循环的内皮祖细胞群(例如，在2个、5个、10个、20个、30个或更多个剂量的一种或多种疗法后，或在接受一种或多种疗法2周、1个月、2个月、6个月、1年或更长时间后)。

在一些实施方案中，IL-4靶向的货物蛋白(例如PRX 321)的单次输注以1.5μg/mL(最多3μg/mL)的浓度施用(参见，例如实施例1和实施例2)。在一些实施方案中，可以为每个受试者/患者个性化输注体积和参数，以便最大程度地实现靶标覆盖。在一些实施方案中，输注体积将在大约7mL(最小的肿瘤)至60mL(最大的肿瘤)的范围内。在一些实施方案中，根据肿瘤体积、流速和导管的数量，输注的持续时间将为大约6小时至32小时。在一些实施方案中，最大递送剂量将为90μg。在一些实施方案中，颅内施用所述剂量。在一些实施方案中，以约90μg(1.5μg/mL于60mL中)、约240μg(6μg/mL于40mL中)或约300μg(3μg/mL于100mL中)的单剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。在一些实施方案中，以约1.5μg/mL至约3μg/mL的单剂量施用IL-4靶向的货物蛋白。

在一些实施方案中，剂量为每名受试者180μg或3μg/mL×60mL PRX 321。在一些实施方案中，剂量为约1.5μg/mL至约3.0μg/mL。在一些实施方案中，剂量为约1.5μg/m、2μg/mL、2.5约3.0μg/mL或约3.5μg/mL。在一些实施方案中，剂量是针对本文所述的任何IL-4靶向的货物蛋白的。mL。在一些实施方案中，剂量是针对PRX 321的。

在一些实施方案中，给药流速为约5μL/min/导管至约20μL/min/导管。在一些实施方案中，给药流速为约10μL/min/导管至约15μL/min/导管。在一些实施方案中，给药流速为约15μL/min/导管。在一些实施方案中，采用1个-4个导管。在一些实施方案中，采用1个-3个导管。在一些实施方案中，采用1个-3个导管，并且流速为最多15μL/min/导管。在一些实施方案中，经由1个-3个导管施用1.5μg/mL，并且流速为最多15μL/min/导管。在一些实施方案中，经由1个-3个导管施用1.5μg/mL，并且流速为最多15μL/min/导管，总剂量为90μg PRX321。

E.对流增强递送(CED)

本发明设想了CED的使用，以便将治疗剂直接递送至肿瘤。CED已在Patel等人,Neurosurgery 56:1243-52,2005(以引用的方式整体并入本文)中有所描述。这可以在限制全身毒性的同时实现药物的局部高浓度。所述程序已用于治疗复发性GB和其他CNS疾病，从早期临床发展至3期临床试验，并且具有良好的安全性特征。在一些实施方案中，PRX 321通过对流增强递送(CED)瘤内递送。在一些实施方案中，CED在恒定压力下通过颅内导管(1个或更多个，取决于肿瘤的大小)的直接输注来进行。在一些实施方案中，这持续1天至7天的时间期。PRX 321的总剂量为约90-100μg。在一些实施方案中，剂量可以在5μg至1mg的范围内调整。在一些实施方案中，将输注之前、期间和之后的MRI成像用于监测药物分布和肿瘤响应。在一些实施方案中，在治疗后通过临床评估和MRI持续监测受试者/患者。

在一些实施方案中，将采用CED来将IL-4靶向的货物蛋白施用于CNS肿瘤。在一些实施方案中，将采用CED来施用PRX 321以治疗CNS肿瘤。在一些实施方案中，将采用CED来施用PRX 321以治疗GB。在一些实施方案中，将采用CED来施用PRX 321以治疗进行性和/或复发性GB。

在一些实施方案中，CED过程将采用高精度计划软件(例如，

FlowInfusion 3.0.6版,Brainlab AG)来确定导管放置。在一些实施方案中，CED过程将采用专门设计用于脑部使用的导管。在一些实施方案中，CED过程将不采用大直径脑室导管，所述导管易于从预期递送部位产生药物泄漏(参见，例如实施例3)。

在一些实施方案中，CED过程将包括替代示踪剂(例如磁共振成像(MRI)造影剂)的共输注，将允许PRX 321分布的实时监测，以确保肿瘤和浸润边缘的适当覆盖。

在一些实施方案中，替代示踪剂分子可以包括但不限于任何磁共振成像示踪剂。在一些实施方案中，替代示踪剂是钆结合的示踪剂。在一些实施方案中，替代示踪剂选自由钆-二亚乙基三胺五乙酸

[Gd-DTPA]组成的组。(从Bayer HealthcarePharmaceuticals,Inc.商购获得)和钆结合的白蛋白(Gd-白蛋白)。在一些实施方案中，在CED期间使用的替代示踪剂将能够有效实时监测药物分布。在一些实施方案中，实时监测允许确保IL-4靶向的货物蛋白(包括例如PRX 321)的肿瘤和瘤周浸润边缘的适当覆盖。在一些实施方案中，替代示踪剂可以与靶向的货物蛋白组合施用，以确定靶向的货物蛋白是否以治疗剂量安全地递送至肿瘤(诸如脑肿瘤)，同时监测该蛋白的实时分布。

关于CED和替代示踪剂的更多信息，参见例如Chittiboina等人,2014；Jahangiri等人,2016；和Murad等人,Clin.Cancer Res.12(10):3145-51,2006，这些文献的全部内容以引用的方式整体并入本文。

F.监测治疗

可以检测和/或定量癌细胞和/或癌症干细胞的本领域的普通技术人员已知的任何体外或体内(离体)测定法可以用于监测癌细胞和/或癌症干细胞，以评估采用IL-4靶向的货物蛋白进行的治疗的影响。这些方法可以用于评估在研究环境中以及在临床环境中的影响。然后可以将这些测定法的结果用于改变靶向部分、货物蛋白或改变受试者的治疗。授予Stassi等人的美国专利申请号2007/0292389(以引用的方式并入本文)提供了用于鉴定癌细胞和/或癌症干细胞的测定法。

癌细胞和/或癌症干细胞通常是肿瘤细胞的亚群。癌细胞和/或癌症干细胞可以存在于来源于细胞培养物或来源于受试者的生物学样品(诸如肿瘤样品)中。可以将各种化合物(诸如水、盐、甘油、葡萄糖、抗微生物剂、石蜡、化学稳定剂、肝素、抗凝剂或缓冲剂)添加至样品中。样品可以包括血液、血清、尿液、骨髓或间隙液。在另一个实例中，样品是组织样品。在一个特定实例中，组织样品是乳腺、脑、皮肤、结肠、肺、肝、卵巢、胰腺、***、肾、骨或皮肤组织。在一个具体实例中，组织样品是正常或肿瘤组织的活检样品。从受试者采集的生物学样品的量将根据生物学样品的类型和所采用的检测方法而变化。在一个特定实例中，生物学样品是血液、血清、尿液或骨髓，并且从受试者采集的血液、血清、尿液或骨髓的量为0.1mL、0.5mL、1mL、5mL、8mL、10mL或更多。在另一个实例中，生物学样品是组织，并且从受试者采集的组织的量小于10毫克、小于25毫克、小于50毫克、小于1克、小于5克、小于10克、少于50克或少于100克。

测试样品可以是来源于已用IL-4靶向的货物蛋白治疗的受试者的样品。测试样品也可以包括对照样品。在一些实例中，对照样品来自用IL-4靶向的货物蛋白治疗之前的受试者，在其他实例中，测试样品可以从已用IL-4靶向的货物蛋白治疗的受试者中的不同位置采集。对照样品也可以来源于已经人工培养的细胞。在检测和/或测量样品中的癌症干细胞群之前，可以对样品进行一个或多个预处理步骤。在某些实例中，通过离心、过滤、沉淀、透析或色谱，或者通过这些预处理步骤的组合来预处理生物流体。在其他实例中，通过冷冻、化学固定、石蜡包埋、脱水、透化或匀浆，然后通过离心、过滤、沉淀、透析或色谱，或者通过这些预处理步骤的组合来预处理组织样品。在某些实例中，通过从样品中除去除干细胞或癌细胞和/或癌症干细胞之外的细胞，或者在测定样品中的癌细胞和/或癌症干细胞的量之前从样品中除去碎片来预处理样品。

在某些实例中，在建立基线的疗法或方案之前评估受试者中或来自受试者的样品中的癌细胞和/或癌症干细胞的量。在其他实例中，样品来源于使用IL-4靶向的货物蛋白治疗的受试者。在一些实例中，在受试者开始或终止治疗后至少约1天、2天、4天、6天、7天、8天、10天、12天、14天、15天、16天、18天、20天、30天、60天、90天、6个月、9个月、12个月或＞12个月从受试者采集样品。在某些实例中，在一定数量的剂量后(例如，在2个、5个、10个、20个、30个或更多个剂量的治疗后)评估癌细胞和/或癌症干细胞的量。在其他实例中，在接受一种或多种疗法后1周、2周、1个月、2个月、1年、2年、3年、4年或更长时间之后评估癌细胞和/或癌症干细胞的量。

癌细胞和/或癌症干细胞上的靶标也在正常的非癌细胞上表达。所以，在一些实例中，癌细胞和/或癌症干细胞的鉴定可以通过比较对照样品中靶标结合产生的信号的相对量，并且将所述对照样品与用于确定癌细胞和/或癌症干细胞的存在或不存在的测试样品进行比较来进行。在此类实例中，样品中的癌细胞和/或癌症干细胞的数目、数量、量或相对量可以表示为例如样品中的总细胞、总癌细胞或总干细胞的百分比。

样品中的癌细胞和/或癌症干细胞的存在和/或癌细胞和/或癌症干细胞的存在量的测试结果可以用于改变治疗方案，包括改变所用的IL-4靶向的货物蛋白的种类。例如，如果在治疗之前和之后的测试显示癌细胞和/或癌症干细胞群增加和/或不减少，则可以改变治疗。例如，治疗剂的剂量可以改变和/或被设计为靶向独特靶标的IL-4靶向的货物蛋白可以被替代或添加至治疗方案中。

可以使用本领域的普通技术人员已知的标准技术来监测/评估癌细胞和/或癌症干细胞的量。可以通过获得样品并检测样品中的癌细胞和/或癌症干细胞来监测癌细胞和/或癌症干细胞。样品中的癌细胞和/或癌症干细胞的量(它可以表示为例如总细胞或总癌细胞的百分比)可以通过检测癌细胞和/或癌症干细胞上的抗原表达来评估。本领域的技术人员已知的任何技术都可以用于评估癌细胞和/或癌症干细胞群。抗原表达可以例如通过免疫测定法来测定，所述免疫测定法包括但不限于蛋白质印迹、免疫组织化学、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体固定测定法、免疫放射量测定法、荧光免疫测定法、免疫荧光、蛋白A免疫测定法、流式细胞术和FACS分析。在这些情况下，可以通过将结果与参考样品(例如，来自无可检测癌症的受试者的样品)中的干细胞的量、或与预定参考范围、或与在较早的时间点(例如，在治疗之前或期间)的患者本人进行比较来确定来自受试者的测试样品中的癌细胞和/或癌症干细胞的量。出于免疫测定法的目的，可以将癌症干细胞展示的一个或多个靶标用作免疫测定法的靶标。

例如，可以使用CD133+靶标以及已知在脑癌细胞和/或癌症干细胞上表达的其他靶标来鉴定脑癌细胞和/或癌症干细胞。另外的示例性标志物可见于Sakariassen等人,Neoplasia 9(11):882-92,2007和Vermeulen等人,Cell.Death Differ.15(6):947-58,2008和美国专利申请2008/0118518，这些文献以引用的方式并入本文。

G.治疗变异体

本领域的普通技术人员将理解，癌细胞和/或癌症干细胞上的靶标也可以在正常健康细胞上表达。例如，CD133最初显示出在原始造血干细胞和祖细胞以及视网膜母细胞瘤上表达，随后显示出在癌细胞和/或癌症干细胞上表达。所以，在一类非癌细胞上表达癌症干细胞靶标的一些实例中，疗法可以涉及除去非癌细胞群，然后进行涉及所关注的癌症干细胞的IL-4靶向的货物蛋白治疗，然后重新引入表达靶标的非癌细胞。

在另一个实例中，通过使用两种或更多种IL-4靶向的货物蛋白来保护表达与癌症干细胞群相同的靶标的健康细胞群。第一IL-4靶向的货物蛋白被工程化为靶向第一癌症干细胞靶标(例如，CD133)。第一IL-4靶向的货物蛋白中包含的货物蛋白可以是无活性形式的毒素。第二IL-4靶向的货物蛋白被工程化为靶向癌症干细胞上的第二靶标(例如，CD24)。该第二IL-4靶向的货物蛋白包含能够活化第一IL-4靶向的货物蛋白的蛋白质序列。因此，只有表达针对第一IL-4靶向的货物蛋白和第二货物蛋白二者的靶标的癌症干细胞才接受货物部分的治疗活性。

在另一个治疗变化中，用癌症干细胞上展示的靶标的激动剂来治疗受试者。然后癌细胞和/或癌症干细胞展示出增加的靶标水平。然后可以在IL-4靶向的货物蛋白的施用之前、期间或之后施用激动剂治疗。本领域的普通技术人员将理解，施用的确切时间排程将取决于所选的具体激动剂和具体IL-4靶向的货物蛋白。

实施例

实施例1：用PRX 321来治疗复发性或进行性胶质母细胞瘤

患有复发性或进行性胶质母细胞瘤的成人中的PRX 321的对流增强递送(CED)的开放标签、非随机、多中心2期研究

基本原理：

PRX 321是一种包含融合至铜绿假单胞菌外毒素A(PE)的修饰型式的遗传工程化的环状排列的白介素-4(cpIL-4)的融合毒素。PRX 321结合至肿瘤微环境(TME)的癌细胞和非恶性免疫抑制细胞过表达的IL-4受体(IL-4R)，并且递送强效的细胞杀伤剂PE。大百分比的胶质母细胞瘤(GB)及其TME表达相对较高量的IL-4R，这使IL-4R成为PRX 321的相关靶标。瘤内和瘤周输注使对融合毒素的全身暴露最小化，而图像引导的CED技术增强了整个靶标区的活性药物暴露。PRX 321与免疫疗法(诸如免疫检查点抑制剂)共有很多性质，包括在长期(＞3个月)假性进展后响应的可能性。在这项研究中，标准的神经肿瘤响应评估(RANO)标准将被用于在预期患者资格评估中评价先前疗法后的复发/进展，而修改的RANO标准将被用于治疗后随访以评估响应和进展。

研究目的：

主要

在使用CED进行PRX 321的瘤内和瘤周输注后根据修改的RANO标准来确定相对于术前计划MRI(基线)的客观响应率(ORR)

次要

评估CED后PRX 321的安全性

评估总体存活期(OS)

评估无进展存活期(PFS；使用修改的RANO标准)

探索性

评估外周血浆中PRX 321的药代动力学(PK)

评估血清抗PRX 321抗体滴度，并且如果升高，则测定中和抗体滴度

根据本研究中获得的数据，根据需要进行另外的特设功效和安全性分析。

关键招募标准：

为了满足参与本研究的资格，年龄≥18岁的男性和女性受试者必须患有已复发或已进展的原发性(新发)GB(根据标准的RANO标准)，预期寿命＞12周，和卡诺夫斯基(Karnofsky)行为状态(KPS)≥70。受试者必须具有通过干预前磁共振成像(MRI)显示的在任何方向上的≥1cm×≥1cm(最小)至4cm的肿瘤直径；(在计划治疗的14天内)并且没有使肿瘤成为较差的CED靶标的特征(例如显著液化或不利于CED的几何特征)。

研究设计：

这是一项在大约52名患有已复发的或进展的GB的成人中进行的单臂、开放标签、多中心研究(根据标准的RANO标准)。在机构审查委员会批准和填写知情同意书后，研究将在最多12个临床中心进行。

合格受试者将接受与研究药物施用相关的手术。施用PRX 321输注液，目的是最大程度地实现肿瘤和瘤周边缘的覆盖，如通过MRI观察到的共输注的钆示踪剂的分布所示。进行治疗前导管轨迹计划，目的是尽可能多地放置4个导管，但是在增强的肿瘤组织中通常最少放置2个导管，但是不可放置导管的最小肿瘤除外。任何其余的一个或多个导管都应放置在增强的肿瘤的外部，在T2 flair信号区域内，并且距离肿瘤的增强边缘≤2cm。预期输注体积(Vi)为60mL，导致总剂量为180μg PRX 321(3μg/mL×60mL)。

经由每个导管的输注将以3μL/min/导管的速度开始，并以逐步的方式逐渐增加。在输注的至少前3个小时期间，根据研究者的判断调整输注流速，在此期间通过实时MRI监测输注液的时间分布(受试者维持麻醉)。所有功能性导管的总流速不应超过50μL/min，并且所有功能性导管应以相似的流速对流。在实时MRI输注监测期结束后，其余的输注液将在受试者清醒时继续进行。MRI将在输注完成后进行，作为PRX 321输注液分布的最终评价。

在对前6名受试者进行研究时治疗后，安全审查委员会(SRC)进行安全性和输注液分布数据审查。建议对治疗参数进行调整，以增强药物递送，同时使所述参数较佳保持在已确立的安全性特征内，然而根据该修订剂量方案，在对6名受试者进行治疗后30天，将完成另外的安全性审查。在此修订后，对方案的更改将在实施之前提交给相应的监管机构和IRB批准。根据方案1.0、2.0和3.0版，所有受试者都将包括在功效和安全性分析中。根据具有增强的药物递送方案3.0版，扩大招募范围，从而用另外的受试者补充队列，以能够进行亚群和敏感性分析。

在输注后14天将进行安全性的治疗后随访评估。其后，在输注后30天、60天、90天、120天、180天、240天和360天将进行功效和安全性评估。在第360天的访视之前中止的受试者将在中止时接受为第360天访视安排的所有程序。

在无疾病进展的情况下完成第360天研究随访或在无疾病进展的情况下提前中止的受试者将持续进行疾病状态随访，直到产生进展(在可能的情况下)。在进展后(在研究时或在研究后随访期间)，将继续随访受试者的存活，和GB的一种或多种研究后治疗，以及GB成像(在可能的情况下)，直到死亡(或发起者终止数据收集或受试者同意退出)。

药物和施用途径：

PRX 321药品以浓度为500μg/mL的于0.5mL磷酸盐缓冲盐水中的无菌冷冻溶液形式提供，其填充在用具有13mm特氟龙表面的塞子密封并且根据国家特定的监管要求标记的无菌、一次性2mL 1型USP无热原透明玻璃小瓶中：

对于临床用途，PRX 321药品将在Elliotts

溶液中稀释，以产生具有PRX 321(3μg/mL)、0.02％的人血清白蛋白和钆-二亚乙基三胺五乙酸(Gd-DTPA,

)(7mM)的最终组成的输注液。输注液在医院药房制备，并且其制备说明提供于《药房手册(Pharmacy Manual)》中。

PRX 321使用CED经由瘤内和瘤周输注来施用，所述CED具有输注液分布的精确计划和实时MRI监测。

剂量和频率：

每名受试者将接受固定浓度为3.0μg/mL的PRX 321的单次施用，其输注体积为60mL，经由最多4个手术放置的导管来施用。

预期输注的持续时间在24小时至36小时的范围内；然而，如果需要完成输注，则可以持续最多48小时。

功效点：

主要

ORR通过独立中心审查(成像核心实验室)根据修改的RANO标准来确定，如在输注后大约30天、60天、90天、120天、180天、240天和360天相对于治疗前基线MRI通过钆增强的MRI来评估(在导管放置之前针对治疗计划而获取)。

次要

OS，定义为从治疗直到死亡的时间。

PFS，定义为从治疗直到疾病进展(根据修改的RANO标准并且通过独立中心审查来确定)或死亡的时间。

其他

响应的持续时间(DOR)，定义为在实现治疗的完全响应(CR)或部分响应(PR)的受试者中，从第一次响应直到疾病进展(根据修改的RANO标准，并且由独立中心审查来确定)或死亡的时间。

临床益处的持续时间(DOCB)，定义为在实现完全响应(CR)、部分响应(PR)或稳定疾病(SD)的受试者中，从第一次响应或疾病稳定直到疾病进展(根据修改的RANO标准并且通过独立中心审查来确定)或死亡的时间。

另外的探索性功效分析可以包括基于研究者对响应的评估、其他事件发生时间终点(例如，GB的研究后治疗的时间)以及根据生物标志物状态进行的响应探索的ORR和PFS。

安全性点：

包括：严重不良事件(SAE)和治疗出现的不良事件(AE)；临床实验室结果；身体和神经检查；KPS；和心电图(ECG)。

另外的探索性安全性分析可以包括所关注的特定AE，和安全性与血浆PRX 321药代动力学(PK)参数的关系和/或免疫参数的评价。

其他终点

这些终点包括：外周血浆中的PRX 321PK参数；血清中的抗PRX 321抗体滴度；以及中和抗体滴度(如果观察到抗PRX 321滴度升高)。

统计学分析：

受试者群体：

IL-4R分析群体

IL-4R分析群体将与mITT群体相同，并且将被用于按IL-4R水平分层的功效分析。

安全性群体

安全性群体将包括在研究时治疗的所有受试者。安全性分析将针对该群体而提供。

分析：

对mITT群体进行的主要功效分析将包括来自所有方案版本的可研究评估的所有患者，并且将根据具有主要假设检验的单臂、单阶段二项式设计进行评估，所述检验在单侧α＝0.10时将6％的无效响应率与18％的替代(需要进一步研究)率进行比较。

使用相同的假设和α进行的主要终点的次要分析，将对根据方案3.0版及更高版本招募的受试者(包括根据此前方案版本类似地治疗的患者)进行。

这些主要和次要分析将以固定的顺序进行，首先进行主要分析。仅在主要分析不能达到统计学显著性的情况下，次要分析才具有说明性。这可以将总体试验假阳性率控制在10％(单侧)。

对于36名mITT受试者，针对次要测试的功效为大约80％，对于超过36名合并的mITT受试者，针对主要测试的功效超过80％；大约占不可评价者的10％至15％，计划在试验中招募总共52名受试者，包括根据方案3.0版的大约35名受试者。

OS和PFS将经由卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)估算来确定，并且报告中位数、四分位数和95％置信区间(CI)。在治疗后6个月、9个月和12个月的OS和PFS的描述性分析将基于在那些时间点存活(并且无进展)的受试者的原始比例以及卡普兰-梅尔估算。还通过IL-4R层进行分析，包括层内ORR的95％置信区间估算值，并且通过IL-4R水平来检查治疗效果。

功效分析还可以研究受试者亚群(例如，IL-4R水平、肿瘤大小、KPS、性别、年龄、类固醇使用)和按其他适用标准计的响应。

描述性统计将提供受试者人口统计学和处置、安全性和暴露数据，并且将包括观察数、平均值、标准偏差、中位数和连续变量范围以及类别变量的数量和百分比；在适当情况下还将提供95％CI。

引言

研究药物PRX 321是一种由连接至促凋亡细胞杀伤有效负载的靶向结构域组成的融合蛋白。它由Raj Puri博士(美国[US]食品和药品监督管理局(Food and DrugAdministration[FDA]))和Ira Pastan博士(美国国家癌症研究所(National CancerInstitute，“NCI”))发现和开发，并且已经由很多研究者在超过50种出版物中有所描述。它是一种选择性靶向过表达白介素-4受体(IL-4R)的癌细胞的治疗剂。

靶向结构域是遗传融合至强效的有效负载的白介素-4(cpIL 4)的工程化的环状排列型式，所述有效负载由细菌毒素铜绿假单胞菌外毒素(PE)A的截短型式组成(Kreitman等人，1994)。它被开发用于治疗胶质母细胞瘤(GB)以及其他成人和儿童中枢神经***(CNS)癌症，包括胶质母细胞瘤肿瘤微环境(TME)的免疫抑制细胞，这些免疫抑制细胞通常过表达IL-4受体(IL-4R；Puri等人,1994；Kohanbash等人，2013)。

PRX 321的作用机制已有充分记载(Kreitman等人，1994；Rand等人，2000；Puri等人，2009)，并且如图1所描绘。PRX 321结合至在肿瘤细胞的表面上过表达的IL-4R，并且整个复合物被内吞。在通过以高浓度存在于癌细胞的胞内体中的弗林蛋白酶样蛋白酶切割和活化后，将截短的PE的催化结构域释放至胞质溶胶中，在该处其经由延伸因子-2的腺苷二磷酸(ADP)-核糖基化和通过半胱天冬酶活化进行的细胞凋亡诱导来诱导细胞死亡(Shapira和Benhar，2010)。

PRX 321的很多特征使其成为治疗GB和CNS中的其他原发性和转移性肿瘤的合理选择：

来自成人和儿童CNS肿瘤的大多数癌症活检和尸检样品(包括复发性GB活检样品)已显示出在正常成人和儿童脑组织中过表达IL-4R，而且几乎不表达或不表达IL-4R(Puri等人,1996；Kawakami等人,2002；Joshi等人,2001；Konanbash等人,2013)。不表达IL-4R靶标的细胞不结合至PRX 321，并因此不受PE介导的作用的影响(Kawakami等人,2002；Puri等人,2005)。

与化学治疗剂和放射不同，PRX 321的细胞杀伤能力不依赖于生长速率(Li和Hall,2010)。由于作用机制，TME的静息癌细胞和/或癌症干细胞和生长较慢的非恶性细胞可以与快速***的肿瘤细胞一样对PRX 321敏感。

O6-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶(MGMT)阳性癌细胞(具有未甲基化的MGMT启动子，并因此对替莫唑胺具有抗性)对PRX 321敏感。已知CNS和非CNS癌细胞系(诸如T98G(胶质母细胞瘤)、HT-29(结肠癌)和Mia-Paca-2(胰腺癌))过表达MGMT，并且对烷基化剂(诸如替莫唑胺)具有抗性(Huang等人，2012；Kuo等人，2007；Kokkinakis等人，2003)。然而，这些IL-4R表达细胞系显示出对PRX 321的皮摩尔敏感性(Puri等人，1996；Kreitman等人，1995；Shimamura等人，2007)，这表明PRX 321可以为MGMT阳性GB患者提供治疗选择。

弗林蛋白酶样蛋白酶是PRX 321的切割和PE毒素的活化所需的(Chironi等人，1997；Shapira和Benhar，2010)。与正常细胞相反，靶向的神经胶质瘤细胞中的弗林蛋白酶的高表达水平(Mercapide等人,2002；Wick等人,2004)提供了另外的肿瘤特异性，并且也是癌细胞对PRX 321的异常皮摩尔敏感性的贡献因素。

PRX 321的促凋亡结构域(即，PE)远比化学治疗剂强效(Li和Hall,2010)。它通过阻止蛋白质合成来杀伤癌细胞(Shapira和Benhar,2010)，这是其他抗癌剂未采用的机制。

PRX 321至靶细胞中的内化经由不依赖于p-糖蛋白(P-gp)的机制来进行，p-糖蛋白是一种通常用于运输化疗药物的膜相关蛋白。P-gp中的突变通常会导致癌细胞对传统化疗药物产生抗性，这是PRX 321的无法预料的问题，因为它进入细胞不依赖于P-gp(Strome等人,2002；de Jong等人,2003)。

GB具有稳健的免疫抑制性TME，并且可以占肿瘤质量的最多40％(Kennedy等人,2013)。最近，研究显示恶性神经胶质瘤具有2型T辅助细胞(Th2)偏差，并且被骨髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)大量浸润，并且IL4/IL-4R偏差介导它们的免疫抑制功能(Harshyne等人,2016)。此外，IL-4R在神经胶质瘤浸润的骨髓细胞上上调，但是在外周或正常脑中则不上调(Kohanbash等人,2013)。因此，使用PRX 321清除Th2细胞、MDSC和TAM可以减轻与癌症相关的免疫阻断(以类似于免疫调节剂(诸如伊匹木单抗(ipilumimab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)或纳武单抗(nivolumab)的方式)，从而促进抗肿瘤免疫力并且有助于长期疾病控制。

PRX 321的安全性在非临床研究中已有充分表征。此外，在三项先前临床研究中，已对总共72名患有高度恶性复发性神经胶质瘤的成人(包括66名患有复发性GB的成人)进行了PRX 321的安全性和功效评价，所述PRX 321经由对流增强递送(CED)通过局部瘤内和瘤周输注以单剂量施用。迄今为止进行的所有非临床和临床研究汇总于《研究者手册(Investigator’s Brochure)》(第10版)中。

虽然不是针对功效而设计，但是用PRX 321治疗的患有复发性GB的成人的1/2期临床研究在研究期间和研究后生成了充分的数据，以确保进行肿瘤响应、存活以及肿瘤响应对存活结果的影响的补充分析。

通过实施CED的最新进展，在大约52名患有复发的或进展的GB的患者中进行多中心、单臂、开放标签研究，这些患者将使用CED经由瘤内和瘤周输注来接受PRX 321。将对具有在任何方向上的≥1cm×≥1cm(最小)至4cm的肿瘤直径、复发不超过2次并且卡诺夫斯基评分≥70(这与针对复发性GB的最近临床试验所用的招募标准一致)的受试者进行PRX 321的功效研究。值得注意的是，在先前临床研究中，未确定用PRX 321治疗的受试者的IL-4R肿瘤表达谱。在这项研究中，将对在GB的首次诊断时获得的存档组织进行IL-4R表达的回溯性分析，以确定IL-4R生物标志物对治疗响应和患者结果的作用。另外，将采用计划软件来优化导管放置(Rosenbluth等人,2012)，并且将使用分阶段设计的小直径导管来显著减少沿导管道的回流(Jahangiri等人,2016；Krauze等人,2005b)，以改善PRX 321的瘤内和瘤周分布。此外，在CED期间替代示踪剂(钆-二亚乙基三胺五乙酸

[Gd-DTPA])的共输注将能够有效实时监测药物分布，从而优化PRX 321的肿瘤和瘤周浸润边缘的覆盖(Chittiboina等人，2014；Jahangiri等人，2016)。

最新的CED技术和实时成像的使用具有改善PRX 321分布、其安全性以及患者结果的潜力。

复发性或进行性GB的治疗

原发性GB的标准一线治疗包括块状肿瘤的手术切除以达到最大可能地与神经保留保持一致的程度，然后进行通常与替莫唑胺组合的放射疗法(Stupp方案；Stupp等人，2005)。当接受Stupp方案的患者中出现复发或进展时，不幸的是治疗选择受到限制并且通常是无效的。

可在少数具有从质量效应产生的症状的疾病的复发患者中表明需要手术，但是只能导致有限的存活期延长(Keles等人，2004)。通过将手术与

(卡莫司汀)移植结合可以改善存活。然而，大多数患有复发性疾病的患者不是进行另外的手术的候选者(Weller等人，2013)。因此，Gliadel的使用受到限制，因为需要手术来进行Gliadel施用。

在患有复发性GB的患者中，已发现

(贝伐单抗)使6个月无进展存活率(PFS)改善至42.6％，并且使中位数总体存活期增加至9.3个月。在一线化学疗法失败的患有复发性GB的患者中，基于28％的总体响应率，Genentech获得了美国FDA对Avastin的加速批准(Friedman等人，2009)。

尽管存在这些药剂，但是仍然迫切需要更有效的靶向疗法来治疗复发性GB。经由靶向融合毒素(诸如PRX 321)的CED的瘤内和瘤周输注是一种用于治疗该疾病的有前景的新型肿瘤特异性治疗剂。

PRX 321功效优于Gliadel和Avastin的公开数据(Brem等人，1995，Cohen等人，2009)，尽管存在以下事实：在此前的临床试验中，与五分之一的Avastin队列相比，近一半的用PRX 321治疗的患者在招募之前已多次复发(参见《研究者手册》第10版的细节)。表9比较了PRX 321的客观肿瘤响应率对比Avastin的公开报告(Freidman等人，2009)。值得注意的是，在PRX 321治疗的患者中，完全响应率为20％，并且在Avastin治疗组中，完全响应率为1.2％。

表9：用PRX 321治疗的未切除的复发性GB患者的客观响应率

*公开数据(Avastin数据：Freidman等人，2009)；**单次治疗(《研究者手册》第10版)

靶向的瘤内疗法

融合毒素

融合毒素属于靶向疗法的类别，并且通常由融合至肿瘤特异性配体(靶向结构域)的高度强效的细菌或植物毒素部分(有效负载)组成。它们代表一种新型抗癌方式，其与常规疗法相比可以具有多个优点。一种正在开发的这种新型融合毒素是PRX 321。融合毒素(诸如PRX 321)利用了肿瘤细胞、癌细胞和/或癌症干细胞(CSC)以及肿瘤微环境(TME)上受体(例如，IL-4R)的选择性表达(安全性和耐受性)以及强效毒素的有效性(抗肿瘤功效)。PRX 321的靶向结构域(即，IL-4)的功能是将毒素特异性“引导”至肿瘤细胞，而不引导至正常细胞。因此，与常规化学治疗剂相比时，针对肿瘤特异性靶标的融合毒素(诸如PRX 321)表现出相对宽泛的治疗指数。

PRX 321具有以下独特的特征：

诱导不依赖于生长速率的肿瘤收缩。静息CSC、TME的生长缓慢的细胞以及快速***的癌细胞在皮摩尔范围下同样敏感(Hall等人,1992)

使用多元化方法来治疗癌症。PRX 321能够同时靶向块状肿瘤，耗竭CSC(Merchant等人,2015)，并且还可以清除TME的关键组分TAM和MDSC(Bankaitis和Fingleton,2015)。

对TME在保护癌症中发挥的作用的新理解表明，仅靶向癌细胞不会显著改变存活结果。因此，通过多元化方法，PRX 321可以在过表达IL-4R的CNS肿瘤中提供总体有意义和持久的长期响应。

作为GB的药物靶标的白介素-4受体

已经开发了针对复发性GB的治疗的研究药物PRX 321，因为已知各种类型的CNS肿瘤常常过表达IL-4R，并且可用的数据表明，大百分比的GB以相对较高的水平表达IL-4R(Puri等人,1994；Puri等人,1996；Joshi等人,2001；Joshi等人,2002)。《研究者手册》(第10版)提供了关于作为GB的药物靶标的IL-4R的详细信息，包括评价从同一患者获得的新诊断的和复发性GB的匹配活检样品中的IL-4R表达的最新研究。这些数据表明，GB患者在复发时和在一些情况下以高得多的水平继续表达IL-4R。

对流增强递送

PRX 321是一种大型融合蛋白(53kDa)，并因此不能跨过血脑屏障(BBB)。为了绕过BBB，针对CNS疾病的局部递送技术(诸如对流增强递送(CED))正在被广泛开发。CED通过采用总体流动或流体对流来在脑实质内改善向脑肿瘤的药物递送，所述总体流动或流体对流作为压力梯度而不是浓度梯度的结果而建立(Yin等人,2011)。因此，与直接注射或经由药物洗脱聚合物相比，CED提供了显著改善的CNS内输注的治疗剂的分布，这二者都依赖于实质分布的扩散。另外，CED消除了全身性药剂跨过BBB的挑战，同时使全身暴露和毒性最小化。(Fiandaca等人,2008；Yin等人,2011；Vogelbaum和Aghi,2015)。与基于扩散的递送相比，CED的优点包括：

●分布体积扩大(Vd)；分布体积大于输注体积(Vi)；

●在靶标体积内输注的治疗剂的浓度均匀；以及

●在靶标体积内绝大部分输注的治疗剂的递送。

脑血管周隙内的动脉搏动增强了CED分布(Hadaczek等人,2006)。另外，对胞外基质的复杂性及其对对流的影响的更好的理解已产生改善的分布(Hamilton等人,2001；Neeves等人,2007；Nguyen等人,2001)。例如，已经定义和完善了技术输注参数(诸如套管大小和形状、输注速率、输注液浓度和组织密封时间)，以改善研究药物的分布，同时限制了潜在的毒性和发病(Morrison等人,1999；Chen等人,1999；Wein等人,2002；Krauze等人,2005b；Healy和Vogelbaum,2015；Lewis等人,2016)。

对流递送的实时成像

在神经外科学中，CED的安全和潜在有效的使用的一项重大进展是对流递送的实时成像(RCD)的开发，所述RCD采用MRI在共对流造影剂的帮助下可视化CED过程(Krauze等人,2005a；Fiandaca等人,2009；Nguyen等人,2003；Krauze等人,2005b；Murad等人,2006；Lonser等人,2007；Chittiboina等人,2014；Lonser,等人,2015)。RCD的使用允许内科医生直接监测脑中治疗剂的分布。因此，可以监测沿CED导管的回流或靶区域外部的泄漏，尤其是在较高流速下，并且可以采取校正步骤，诸如重新靶向导管或改变输注的速率(Fiandaca等人,2008；Varenika等人,2008)。

RCD技术将用于该研究中，并且代表脑中药物递送和分布的重要进展。不采用RCD的早期临床试验不能实现研究药物的充分分布，这可以导致研究无法达到它们的临床终点(Gill等人,2003；Marks等人,2010；Sampson等人,2010)。该试验中RCD的使用将能够直接可视化研究药物的分布，实现肿瘤的均匀覆盖以及靶细胞(GB和TME)和PRX 321之间的增强接触。

在很多使用RCD的研究中，所选的替代示踪剂是钆。Gd-DTPA

是Bayer Healthcare Pharmaceuticals,Inc.制造的造影剂，并且已经在临床上使用了很多年。

先前体外和体内研究(Mardor等人,2009；Ding等人,2010)已显示，当Gd-DTPA与PRX 321共施用时，具有生物相容性并且是安全的(参见《研究者手册》第10版)。在使用CED的多项临床研究中，还将Gd-DTPA与融合毒素组合安全地脑内施用于患者(Lonser等人,2007；Weber等人,2003a；Weber等人,2003b；Sampson等人,2011；Chittiboina等人,2014)。虽然基于钆的造影剂未获批准用于脑内施用，但是这些研究支持Gd-DTPA可以经由与局部施用的治疗剂(诸如PRX 321)组合的输注来安全地施用。

PRX 321的临床经验

迄今为止，总共有86名成人接受了PRX 321，包括72名患有高度神经胶质瘤的成人。

PRX 321已被美国FDA和欧洲药品管理局授予孤儿药状态，用于治疗神经胶质瘤，并且获得美国FDA的快速通道认定，用于治疗复发性GB和AA。

研究基本原理

本研究被设计为检验以下假设：与目前可用的复发性/进行性GB的治疗相比，PRX321可将ORR改善至临床上显著的程度。关于对目前治疗的响应的假设基于在患有复发性/进行性胶质母细胞瘤的患者中进行的此前临床试验的ORR数据。Levin等人(2015)汇编和报告了评价细胞毒性剂(21个临床试验，N＝1,745名患者)和非细胞毒性/非抗血管发生药物(18个临床试验，N＝1,239)的临床研究的病例数加权平均ORR。对于用细胞毒性剂或非细胞毒性/非抗血管发生药物治疗的患者，ORR分别为6％(范围为0至17％)和4％(范围为0至9％)。非细胞毒性/抗血管发生药物的结果更好，其ORR率为14％。目前设计基于ORR为6％的零假设对比用PRX 321治疗后ORR为18％的备择假设。

给药

总共72名患有复发性或进行性恶性神经胶质瘤的受试者(66名患有复发性GB的受试者和6名患有AA的受试者)已接受范围为6μg(0.2μg/mL×30mL)至855μg(9μg/mL×95mL)的瘤内剂量的PRX 321。最高施用浓度和体积分别为15μg/mL和185mL(在8天内)。

在第一研究中(研究者启动的研究；Rand等人,2000)，给9名患有经组织学证实的复发性GB的受试者输注PRX 321。输注体积的范围为30mL至185mL。两名受试者接受多于一次治疗。以0.2μg/mL的剂量输注四次，以2.0μg/mL的剂量输注三次，并且以6.0μg/mL的剂量输注五次。

在1期研究中(输注后不切除；与该研究的治疗计划一致)，受试者被按顺序招募于各组中，每组接受递增剂量：240μg(6μg/mL×40mL)、360μg(9μg/mL×40mL)、600μg(15μg/mL×40mL)和900μg(9μg/mL×100mL)。在15μg/mL×40mL剂量组中观察到剂量限制性毒性。因此，最初将9μg/mL×40mL视为最大耐受剂量(MTD)。另外的患者以9μg/mL×40mL剂量招募，以获得另外的MTD的经验。在接受9μg/mL×40mL剂量的另外的受试者中观察到剂量限制性毒性，并因此MTD被重新定义为240μg(6μg/mL×40mL)。

在2期研究中，PRX 321以90μg(1.5μg/mL×60mL)、240μg(6μg/mL×40mL)或300μg(3μg/mL×100mL)的剂量施用，然后在输注后3周进行手术切除。在该研究中未建立MTD。

观察到与所施用的剂量或输注后切除无关的治疗活性。在另一个方面，在两项研究中，毒性似乎是剂量相关的(参见《研究者手册》第10版)。

在该研究中，针对每个受试者的总剂量将为180μg(3μg/mL×60mL)。根据以下治疗目的来计算施用体积：施用足够体积的PRX 321输注液，以实现针对可能的最大4cm直径肿瘤的肿瘤和瘤周边缘的覆盖(假设估算的Vd/Vi比率为2.0，并且球形形状)。灌注液中PRX321的浓度被设定为3μg/mL。在此前的1期和2期研究中，已经在21名受试者中安全地使用3μg/mL或更高的PRX 321的建议浓度。从1期(N＝9)和2期(N＝6)剂量递增研究起，180μg(3μg/mL×60mL)的总剂量确保了保持在所选的240μg(6μg/mL×40mL)的MTD内，甚至在(错误地)施用超过60mL的情况下。

用于PRX 321施用的导管的选择

在用PRX 321和其他治疗剂进行的较早临床研究中，导管并非针对有效的CED而设计，并且容易使治疗剂从目标区域回流和渗漏。近年来，已经引入分阶段设计的直径较小的MRI兼容的导管，并且与此前GB研究中使用的大直径柔性脑室导管相比，所述导管已经显示出可显著减少沿导管道的回流(Krauze等人,2005b；Rosenbluth等人,2011；White等人,2011；Gill等人,2013；Jahangiri等人,2016)。这允许提高流速。

在美国，基本上有2种分阶段设计的导管可供选择，并且这两者正在和/或已经用于CED研究；这些包括Brainlab柔性导管[510(k)K123605]和MRI干预

套管[510(k)K102101]。

Brainlab导管是MRI兼容的柔性导管，所述导管具有刚性探针设计用于准确定位。该导管可以在手术后留在原地，并因此将在本研究中使用，因为它允许继续进行手术后输注。在另一个方面，

套管是刚性的，并且只能在术中使用。它像Brainlab导管那样，也是MRI兼容的，具有相同的针尖设计，并且适用于准确放置。这两种导管仅旨在用于单次使用，并且不旨在用于移植。PRX 321输注液(与0.02％HSA和7mM Gd-DTPA一起在Elliotts

溶液中制备)已经过测试，并且显示出与Brainlab导管和所有导管组件(包括输注组装件)具有生物相容性，并因此将被用于该研究。

输注计划/导管放置计划

CED将药物分配到肿瘤中的效率取决于导管在肿瘤内的正确放置、导管直径、流速、输注液特征以及治疗区域的组织一致性(Wein等人,2002；Sampson等人,2007；Jahangiri等人,2016)。不正确放置的导管可以导致输注的药物通过脑沟流出肿瘤或找到进入脑脊液(CSF)的阻力最小的路径，从而导致肿瘤的药物暴露有限，并因此缺乏功效和潜在毒性。

为了确保最佳放置以实现最大肿瘤覆盖，Brainlab

Flow软件将被用作在输注之前产生导管放置的治疗前计划的主要工具(Sampson等人,2007)。使用在输注之前获得的肿瘤的MRI，该软件将被用于预测每个导管放置的最佳轨迹，以确保避免出现脑裂、脑沟和可能导致分布不充分的其他要素。

软件将有助于根据导管放置指南来预测导管尖的放置，优化输注液的对流并且通过避免血管来确保导管的安全放置等。

使用

Flow软件，进行治疗前导管轨迹计划，目的是尽可能多地放置4个导管，但是在增强的肿瘤组织中通常最少放置2个导管，但是当这不可行或不可实施时在最小肿瘤中除外。任何其余的一个或多个导管都应放置在增强的肿瘤组织的外部，在T2 flair信号区域内，并且距离肿瘤的增强边缘≤2cm。

被选择进行该研究的所有研究部位均具有先前的CED经验；然而，在早期病例的对等支持下，在导管的正确使用、输注计划、导管放置和输注方面将对所有部位进行充分训练，以确保各个研究部位之间的一致性。

输注液流速的基本原理

输注参数(诸如导管大小和形状、输注流速和输注液浓度)已被定义为对CED效率具有影响的因素。在此前用PRX 321进行的临床研究中，评价10μL/min/导管的输注流速(使用不针对CED而设计的大直径脑室导管)，以在若干天内施用大体积的输注液。

如上文所讨论，已经开发出针对进入脑肿瘤的治疗剂的CED而专门设计的直径较小的导管，由于分阶段设计，所述导管允许产生更高的流速和最小的回流(Krauze等人(2005b)和Richardson等人(2011))。同样，UCSF的最近研究(Butowski等人,2015)显示，50μL/min是安全的流速，并且无回流，并且得到输注动力学的更好操纵，从而允许实现更好的肿瘤覆盖，尤其是以较大的体积。此外，Butowski等人(2015)报道，为了在脑肿瘤中实现有效的CED，应在尽可能短的时间内输注最大体积的药物。在该研究中，流速将被个性化，因为实时MRI输注监测的使用将使研究者能够确定针对每个受试者的输注液的最佳流速。

虽然PRX 321输注液已显示出在最多50μL/min的流速下与Brainlab导管具有生物相容性，但是经由Brainlab柔性导管实现体内PRX 321的有效瘤内和瘤周分布的最佳流速尚未建立，并且由于肿瘤异质性可以因患者而异。因此，输注速率将保守评估，据此流速从3μL/min/导管开始并且以逐步的方式逐渐增加。在输注的至少前3个小时期间，根据研究者的判断调整输注流速，在此期间通过实时MRI监测输注液的时间分布(受试者维持麻醉)。所有功能性导管的总流速不应超过50μL/min，并且所有功能性导管应以相似的流速对流。在实时MRI输注监测期完成后，其余的输注液将在受试者清醒时继续进行。如果受试者显示出不耐受的征象，则可以根据研究者的判断将输注速率降低50％或停止并重新开始。

输注液分布的实时成像

NeoPharm在2004年至2006年进行了一项使用IL-13-PE融合蛋白(cintredekinbesudotox,CB)来靶向已知在GB中过表达的IL-13诱饵受体IL 13Rα2的研究。这是一项针对首次复发的GB患者的随机3期试验，其中在手术切除肿瘤后使用CED来局部施用CB。与Gliadel相比，CB未显示出存活优点(Kunwar等人,2010)。

已经提出若干原因来解释CB的功效缺乏(Chandramohan等人,2012；Jarboe等人,2007；Sampson等人,2010)。

试验不包括确定是否递送所需的药物量至肿瘤部位的实时成像(Sampson等人,2010)。

相关靶标体积的估算覆盖率很低，因此仅覆盖切除腔周围半影的20.1％(Chandramohan等人,2012)。

导管定位的试验后分析显示，只有49.8％的导管符合所有定位标准(Chandramohan等人,2012)。

因此，即使在肿瘤中存在IL-13Rα2的情况下(Jarboe等人,2007)，药物至肿瘤靶标的递送是次佳的。这些结果突出显示了对评估导管放置和药物分布的实时成像的需要。

该研究中的目的是实现肿瘤和瘤周边缘的最大覆盖。因此，通过示踪剂的共输注进行的药物分布的实时成像，将被用作评估输注液分布的手段。

使用PRX 321进行临床前研究，以评价成像剂Gd-DTPA与各种浓度的PRX 321(Ding等人,2010)和人血清白蛋白(HSA)组合的作用(通过经由CED直接输注至大鼠脑中来施用)。结果显示，Gd-DTPA(7μmol/mL)的添加具有良好的耐受性，并且Gd-DTPA不影响PRX 321的效力。在很多临床研究中展示了Gd-DTPA作为替代示踪剂安全共输注的可行性(Chittiboina等人,2014；Lonser等人,2007；Souweidane 2014；Weber等人,2003a；Weber等人,2003b)。因此，在该研究中，将进行Gd-DTPA(商购获得的

)与PRX 321的共输注，以描绘总体药物分布，而无需担心安全性。值得注意的是，Gd-DTPA的共输注将能够连续实时监测PRX321分布(至少在输注的前3小时内)，并且允许在必要时通过关闭非对流的导管、重新放置导管或调整输注液流速来实时调整输注液递送。

在输注后不切除

在患有复发性GB的受试者中用PRX 321进行的此前临床研究中，目的是通过递送增加的瘤内和瘤周剂量的PRX 321来靶向原位块状肿瘤。在第一研究(1期)中，仅响应于不受控制的水肿来进行切除。在第二研究(2期)中，目的是在输注后三周切除肿瘤，而不管是否有水肿响应。

治疗后肿瘤切除既不会影响疾病结果，也不会改善患者存活(参见《研究者手册》第10版)。切除的肿瘤的组织学检查显示，在肿瘤除去时(输注后3周)，大多数肿瘤主要由坏死组织组成。

因此，与未切除的受试者相比，治疗后切除似乎不能提供更好的治疗结果，同时使受试者暴露于与CNS手术相关的另外的风险中。因此，该研究的治疗策略将包括PRX 321的瘤内和瘤周施用而无肿瘤切除。

研究目的

主要目的

次要目的

这些目的包括评估CED后PRX 321的安全性，评估总体存活期(OS)，评估PFS(使用修改的RANO标准)

探索性目的

这些目的包括评估外周血浆中PRX 321的药代动力学(PK)，评估血清抗PRX 321抗体滴度，并且如果升高，则测定中和抗体滴度，并且根据该研究中获取的数据根据需要进行另外的特设功效和安全性分析。

研究设计

这是一项在大约52名患有已复发的或进展的原发性(新发)GB的成人中进行的单臂、开放标签、多中心研究(根据RANO标准)。在机构审查委员会批准和填写知情同意书后，研究将在最多12个临床中心进行。

合格受试者将接受与研究药物施用相关的手术。施用PRX 321输注液，目的是实现肿瘤和瘤周边缘的最大覆盖。

预期输注的持续时间在24小时至36小时的范围内；然而，如果需要完成，其则可以持续最多48小时。将进行MRI扫描以记录在导管位置发生任何变化之前的分布，并且作为输注完成4小时内(理想地在2小时内)PRX 321输注液分布的最终评价。

研究群体

该研究的群体将包括患有在有或无化学疗法的情况下进行一次或多次治疗(包括手术和放射疗法)后和在中止任何此前标准或研究治疗线(最多2个先前治疗线)后已复发的或进展的(根据RANO标准)组织学证实的原发性(新发)GB的受试者(根据当地惯例；Stupp方案，Stupp等人,2005年)。

受试者的数量

将招募大约52名患有复发性或进行性GB的受试者，以实现36名可用于主要和次要分析的可评价的受试者。

合格标准

预期受试者必须在用PRX 321治疗之前进行基线评价，并且必须符合所有纳入和排除标准。此外，受试者必须全面了解研究的所有方面，包括研究访视时间表和所需的评价以及知情同意书的所有法规要求。在进行任何研究特定程序之前，必须从受试者获得书面知情同意书。

除非另外指明，否则以下标准适用于考虑招募至研究中的所有预期受试者。

纳入标准

如果预期受试者符合所有以下标准，则具有参与资格：

●受试者必须≥18岁并且预期寿命≥12周

●在有或没有化学疗法的情况下进行一次或多次治疗(包括手术和放射疗法)后和在中止任何此前标准或研究治疗线后已复发的或进展的(第一次或第二次复发，包括本次复发)组织学证实的原发性(新发)GB(根据当地惯例；Stupp方案，Stupp等人,2005年)。

●确认存档组织可以从针对生物标志物分析的GB的初次诊断获得

●受试者必须具有在标准疗法后根据标准RANO标准确定的肿瘤复发/进展的证据：

●包括原发性GB

●必须在计划输注之前14天内进行筛选性MRI，并且接受类固醇的受试者必须在成像前至少5天接受稳定的或减少的剂量

●从进入研究时完成放射疗法起，必须已经超过12周

●根据在导管放置前14天内进行的MRI，复发性肿瘤必须是幕上、造影增强的GB，在单个方向上不小于1cm×1cm(最大垂直尺寸)并且不大于4cm最大值

●卡诺夫斯基行为评分(KPS)≥70

●有生育能力的女性必须具有治疗前14天内β-人绒毛***妊娠测试阴性的记录

●有生育能力的女性和男性必须同意使用适当的避孕措施：激素或屏障性节育方法；在参与研究期间和药物施用后6个月内禁欲等。如果女性在参与本研究时或她的配偶参与本研究时怀孕或疑似怀孕，则她应立即通知她的治疗内科医生

●对器官和骨髓功能的要求如下：

○足够的骨髓功能：

о白细胞＞2,000个/μL

○中性粒细胞绝对计数＞1,000个/μL

○血小板＞100,000个/μL

○足够的肝功能：

○总胆红素＜1.5×机构正常值上限(ULN)

○天冬氨酸转氨酶(AST)＜2.5×机构正常值上限(ULN)

○丙氨酸转氨酶(ALT)＜2.5×机构ULN

○足够的肾功能：

○肌酐不超过1.5×机构ULN

○或者

○肌酐清除率：对于肌酐水平大于机构ULN的受试者，≥60mL/min/1.73m2

○淋巴细胞＞500个/μL

●足够的凝血功能

●国际标准化比率(INR)＜1.4

●部分促凝血酶原激酶时间(PTT)≤机构ULN，除非接受治疗性低分子量肝素(如果必需，进行校正，以排除潜在的抗体作用)

●能够在进行任何研究特定程序之前阅读、理解和签署知情同意书文档，或具有这样做的法定代表意愿；受试者必须在接受研究药物治疗之前进行注册

●受试者必须能够并且愿意接受多次脑部MRI检查

●受试者必须能够并且愿意遵守所有研究程序

●在中止先前GB疗法后的任何相关毒性在纳入本研究前必须已恢复为CTCAE 1级或更低

排除标准

●如果受试者符合任何以下标准，则不具有参与资格：

●先前用细胞毒性化学疗法治疗

●在计划输注前的过去4周内接受替莫唑胺(标准诱导和/或维持给药)

●在计划输注前的过去7天内接受“节拍性”替莫唑胺(低剂量，连续施用)

●在计划输注前的过去6周内接受亚硝基脲

●在计划输注前的过去4周内用任何其他细胞毒性剂进行治疗

●在过去4周内接受先前研究性治疗，或者在计划输注前的过去4周内接受先前免疫疗法或抗体疗法；在计划输注的6个月内接受先前免疫疗法的受试者必须具有通过iRANO或mRANO标准确定的肿瘤复发/进展的确认证据。

●在计划输注前的过去4周内用贝伐单抗(Avastin)或其他血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂或VEGF-受体信号传导抑制剂进行先前治疗。

●在计划输注前的过去12周内进行包括间隙性近距离治疗或

干胶片(卡莫斯汀植入物)的先前疗法。

●在计划输注前的过去4周内接受先前手术(包括立体定向放射手术和活检程序)。

●在计划输注的5天内正在进行

疗法。

●继发性GB(即，从低级恶性弥漫性星形细胞瘤或AA进展的GB)。

●在异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)或IDH2基因中具有已知突变。

●脑干中的肿瘤(不包括流体衰减反转恢复[FLAIR]变化)，幕下肿瘤，诊断为脑胶质瘤病(高度浸润性T2高强度肿瘤，边界不明确，涵盖至少三个脑叶。

●多灶性或多中心性卫星肿瘤，在单个平面上的4cm×4cm区域(输注液覆盖的最大区域)外部观察到增强。多灶性病变被定义为＞1个可测量的增强病变(1cm×1cm垂直尺寸)，相隔至少1cm，病变之间具有汇合T2高强度。多中心性病变被定义为＞1个可测量的增强病变(1cm×1cm垂直尺寸)，相隔至少1cm，病变之间为正常脑)。目前研究不包括相隔至少1cm的可测量的增强肿瘤和间隔＞4cm的任何增强组分，因为输注不会覆盖这些区域。

具有质量效应(例如，中线偏移1-2cm)的肿瘤在稳定的皮质类固醇剂量下会产生临床上显著的影响

●患有肿瘤的受试者，所述受试者的组织优势不是可能对流的类型(例如，囊肿组分的优势)

●具有这样的几何特征的肿瘤：使它们难以通过使用CED导管用输注液充分覆盖肿瘤体积；这些肿瘤包括以下：

○似乎包裹在可能损害对流的脑室结构(诸如“肘”或“L形”)周围的肿瘤

○切除腔周围边缘中的T1图像在手术后增强的肿瘤可能与复发性肿瘤混淆；该增强小于1cm厚度的受试者被排除在外

○专家评审确定肿瘤不是对流的良好候选者(例如，基于一致性、位置、几何形状、与周围结构的关系、囊肿的存在等。

○在MRI上显著可见肿瘤直接浸润至皮质表面中的浅表肿瘤，除非增强的肿瘤的远侧边缘距离皮质表面≥3cm(患有浅表肿瘤(其中肿瘤通过完整皮质的连续层与硬膜下隙的分离在MRI上显著可见)的受试者仍然合格)

●研究者认为临床症状是颅内压力不受控制的增加、溢血或脑水肿导致的

●任何无法施用麻醉的情况

●已知人类免疫缺陷病毒呈阳性

●正在进行细胞毒性疗法的治疗；在PRX 321的施用后，不计划进行另外的抗肿瘤疗法(包括手术方式)，直到具有肿瘤进展的确凿证据(根据修改的RANO标准)。

●研究者认为无法用适当疗法充分控制、或者会损害受试者耐受研究药物疗法的能力和/或使受试者处于另外的风险中、或者干扰对该试验的结果的解释的并发疾病或任何重大医学病史

●已知具有钆造影剂过敏史

●存在筛选访视前＜3年内需要治疗的另一种恶性肿瘤类型，但充分治疗的原位***、未得到积极治疗的***癌和皮肤的基底或鳞状细胞癌除外

●不愿意或不能遵守本方案的要求，包括可能影响受试者返回研究中心进行随访的任何条件(身体、精神、或社会或地理)的存在，包括出于研究者或发起者认为受试者的招募与研究目的不符的成像或其他非特定原因

受试者退出标准

只要继续参与不再符合受试者的最大利益，研究者就会让该受试者退出。受试者退出的原因包括但不限于以下：

●根据修改的RANO标准的疾病进展(附录2)；鼓励研究者通过MRI和其他方式(例如，灌注MRI、PET扫描、TRAM、活检)进行真性进展和假性进展的稳健区分

●发生AE或并发疾病，

●受试者不依从或者

●研究者认为存在重大不确定性，继续参与需要谨慎。

应对所有开始治疗的受试者进行安全性和功效随访。对在无疾病进展的情况下完成第360天评估，或在无疾病进展的情况下提前中止的受试者连续进行疾病状态随访，直到产生进展(在可能的情况下)。在进展后(在研究时或在研究后随访期间)，将继续随访受试者的存活(在可能的情况下)，GB的一种或多种研究后治疗，以及GB成像，直到死亡(或发起者终止数据收集或受试者同意退出)。如果受试者接受PRX 321并且需要减压手术，则它们不应中止，因为水肿可能是由于肿瘤坏死(有利的治疗变化)而不是肿瘤进展所致。

中止的原因(例如，撤回同意书、失去随访、不能或不愿意进行成像程序)必须在电子数据捕获(EDC)表格和受试者的病历中作出完整记录。出于任何原因中断研究的受试者应在中断时接受计划在第360天访视的评估，并且应对进展/存活进行随访，除非他们撤回这样做的同意书。

研究持续时间

每个受试者的研究持续时间为12个月，导管放置/输注开始当天被指定为第0天。

在无疾病进展的情况下完成第360天研究随访访视或在无疾病进展的情况下提前中止的受试者将持续进行疾病状态随访，直到产生进展(在可能的情况下)。在进展后(在研究时或在研究后随访期间)，将继续随访受试者的存活，和GB的一种或多种研究后治疗，以及GB成像(在可能的情况下)，直到死亡(或发起者终止数据收集或受试者同意退出)。

研究药物是PRX 321(IL-4[38-37]-PE38KDEL)，它是大约53kDa的重组融合毒素，包括遗传融合至强效有效负载的白介素-4(cpIL 4)的工程化的环状排列(cp)型式，所述强效负载由细菌毒素铜绿假单胞菌外毒素(PE)A的截短型式组成(Kreitman等人,1994)。

作用机制

PRX 321的作用机制已有所描述(Rand等人,2000；Kreitman等人,1994；Puri等人,2009)，并如图1所描绘。PRX 321结合至在肿瘤细胞的表面上过表达的IL-4R，并且整个复合物被内吞。在通过以高浓度存在于癌细胞的胞内体中的弗林蛋白酶样蛋白酶切割和活化后，截短的PE的催化结构域被释放至胞质溶胶中，在该处经由延伸因子-2的ADP-核糖基化和通过半胱天冬酶活化进行的细胞凋亡诱导来诱导细胞死亡(Shapira和Benhar,2010)。

PRX 321通过使用重组大肠杆菌的分批补料发酵过程来产生。它以包涵体形式在胞内表达。在细胞裂解和包涵体溶解后，使用多个色谱纯化步骤来纯化粗蛋白。

PRX 321以浓度为500μg/mL的于0.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，10mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH7.4±0.1)中的无菌冷冻溶液形式提供，其填充在用具有13mm特氟龙表面的塞子密封并且根据不同国家的监管要求标记的无菌、一次性2mL 1型美国药典/欧洲药典(USP/EP)无热原透明玻璃小瓶中。

储存和处理

小瓶将储存在-70℃(±10℃)下；已知PRX 321可稳定至少3年。

用于CED的输注液的组成

PRX 321药品将在Elliotts

溶液中稀释，以产生终浓度为3μg/mL、含有0.02％HSA和Gd DTPA(商购获得的

469.1mg/mL；1∶70稀释)的输注液。《药房手册》提供了关于PRX 321输注液的制备的细节。

注意：可以调节Gd-DTPA的浓度，以优化输注液分布的可视化并且最大程度地减少假象。

副作用

完整和更新的AE信息可见于《研究者手册》(第10版)。

治疗计划

剂量

PRX 321将以3μg/mL的固定浓度施用。该研究被设计为采用固定输注体积(Vi)，从而实现肿瘤和瘤周边缘的最大覆盖，并且另外在所有受试者中维持PRX 321的相同局部瘤内和瘤周浓度。在PRX 321的输注期间替代示踪剂(Gd-DTPA)的使用旨在监测肿瘤和瘤周边缘的覆盖模式，并且估计分布体积(Vd)。假设Vd/Vi比率为2.0，并且在任何方向上的最大肿瘤直径为4cm，则预计60mL输注体积(180μg总剂量)可以覆盖最大允许的肿瘤(筛选时在任何方向上为4cm)和瘤周边缘。

剂量施用

60mL的总输注体积(3μg/mL×60mL＝总剂量为180μg PRX 321)，将经由最多4个根据导管放置指南进行手术放置的导管来施用。

输注液将包括于Elliotts

溶液中的3μg/mL PRX 321和0.02％HSA和Gd-DTPA(商购获得的

469.1mg/mL；1:70稀释)。

针对这种程序的常规抗生素预防是所需的，并且应根据机构策略来施用；表10概述了示例性抗生素方案。

表11概述了示例性***方案。常规类固醇预防或治疗不是所需的，并且应由临床症候学来指导。如果需要，表12概述了示例性甘露糖醇方案。

表10：示例性抗生素和H-2拮抗剂疗法^＊

●^*根据机构策略施用；缩写：BID＝每日两次；IV＝静脉内；QID＝每日4次

表11：示例性***方案^＊

^*仅作为一个实例。根据机构策略施用。如果更低的剂量方案或更快的减少被认为有效，则应优先地使用这些方案。

表12：示例性甘露糖醇方案^＊

^*根据机构策略施用

PRX 321输注液施用说明

在批准受试者招募后导管放置14天内，使用CT扫描和筛选性MRI(通过

Flow Infusion计划软件注册)来进行初步治疗前导管轨迹计划。使用以下指南来计划导管轨迹：

a)目的是在所有情况下尽可能多地放置4个导管，但是在增强的肿瘤组织中通常最少放置2个导管，但是其中这不可行的最小肿瘤除外。

b)任何其余的一个或多个导管都应放置在增强的肿瘤的外部，在T2 flair信号区域内，并且距离肿瘤的增强边缘≤2cm。

c)导管尖必须不定位于坏死、囊肿或CSF区域内，包括脑室***、脑沟和任何切除腔。

d)通常应将导管尖放置于室管膜/软脑膜仍然完整的区域中，距离脑室***或脑沟≥0.5cm之处，以及距离无完整边缘的这些区域和此前切除腔≥1cm之处。

e)一个或多个导管不应跨过脑沟。

f)在计划导管锚定螺钉点的位置(根据参考CT扫描)时，应考虑颅骨表面的适合性(来自此前手术的骨骼条件和假体材料)。

支持导管轨迹计划的计划图像的时间排程在计划MRI图像中有所描述，所述计划MRI图像将通过

Flow Infusion计划软件注册，以支持导管轨迹计划的完成。

Brainlab批准的神经导航***VarioGuide^TM将在第0天被用于导管的手术放置。表13描述了采用VarioGuide^TM进行的PRX 321施用的工作工作流。该表还概述了导管放置和输注所需的材料。

据认为，经验可以对这些程序产生细微改进。此类改进将不需要对方案进行修订，只要它们不增加受试者的风险即可。

表13：使用VarioGuide^TM神经导航来进行导管放置，然后进行输注的程序

表13：使用VarioGuide^TM神经导航来进行导管放置，然后进行输注的程序(续)

图像采集-时间表和要求

在本研究中将使用MRI来评价合格性、计划和确认导管放置、评估输注液分布并且随访受试者的响应、进展或假性进展。

出于本方案的目的，成像核心实验室Intrinsic Imaging LLC(San Antonio,TX)将提供独立的中心图像检查。医学图像的解释将根据研究特定成像章程来进行。

表14汇总了本研究必须获取的图像。必须使用预定义的成像方案来获得所有扫描，以确保在不同时间点和与共识指南一致方式的再现性(Ellingson等人,2015)。所有图像数据将通过电子传输发送至成像核心实验室。将为相关中心人员(放射科医生、放射技术员)提供培训，以确保在指定时间点使用所需的MRI扫描参数。

研究特定图像采集指南详细介绍了成像方案以及图像数据的成功采集和传输的最低要求。表14概述了图像采集/传输的一般程序。

表14：成像时间表^＊

^*研究特定图像采集指南详细介绍了成像方案以及图像至成像核心实验室的成功采集和电子传输的最低要求。

a)仅在计划输注的3个月内未进行CT扫描时才需要进行CT扫描采集

b)发起者将向研究者提供远程和/或现场案例支持，以进行导管轨迹计划和实时输注监测

c)如果从筛选时就有肿瘤生长，则需要高质量MRI扫描来进行基线响应评估、中心肿瘤测量以及完成导管轨迹计划。此外，需要MRI成像来登记头皮基准点的放置，这可能仅需要有限的扫描方案并且可以使用术中扫描仪来进行。最终导管轨迹计划应在手术前充分完成，以便及时进行中心同行评审；

计划MRI-术前计划MRI的时间排程可以根据当地能力和操作计划根据需要在一个或两个MRI检查中进行。如果可以在单个检查中实现计划MRI的所有功能，则就所需的质量和审查者可用的时间排程而言，将在导管放置前24小时内通过头皮基准点原位完成单个计划MRI。如果不能在单个检查中实现计划MRI的所有功能，则计划MRI应在计划导管放置的3个工作日内进行，并且在导管放置前24小时内通过头皮基准点原位完成进一步检查图像。

d)修改的RANO标准(参见下文)和中心肿瘤测量指南(参见成像采集指南)。

将对筛选性MRI进行评估，以确定疾病状态和受试者资格。这些图像将在中心进行评价，并传输至成像核心实验室，以提供客观肿瘤特征的独立中心评估。涉及研究终点的所有图像审查将由独立的审查者以盲法进行，而无需了解受试者的临床状况或身份或当地中心评估。可以由CED专家进行针对对流的关于受试者的适用性评价的另外的图像审查。

以下标准将被用于客观肿瘤特征的独立评价，以如下考虑确定是否合格：

●肿瘤直径≥1cm×≥1cm(垂直尺寸)，任何单个尺寸的最小和最大尺寸为4cm

●肿瘤位置不位于幕下或涉及脑干

●脑胶质瘤病的诊断(高度浸润性T2高强度肿瘤，边界不明确，涵盖至少三个脑叶)

●不鼓励多灶性病变和多中心性病变，但是只要任何多灶性、可测量的增强病变的所有边界在4cm×4cm面积(输注液覆盖的最大面积)内，则是允许的。多灶性病变被定义为＞1个可测量的增强病变(1cm×1cm垂直尺寸)，相隔至少1cm，病变之间具有汇合T2高强度。多中心性病变被定义为＞1个可测量的增强病变(1cm×1cm垂直尺寸)，相隔至少1cm，病变之间为正常脑。

筛选性MRI的独立中心审查将被加快。如果未进行该中心成像评估并且由医学监测员进行审查，以及根据需要根据CED专家的成像审查提供另外的建议，尤其是关于被认为不是CED的良好候选者的肿瘤(参见上文)，则受试者将不会被招募在研究中。在筛选资格包(包括独立中心成像评估以及证实筛选评估的文档)的全面审查后，所有受试者的招募都将由医学监测员批准。

随访MRI将接受当地中心审查，以确定响应/进展，包括根据修改的RANO标准(参见附录2)确定的肿瘤尺寸。为了确保所有局部肿瘤响应评估的一致性，将按照具体指南进行肿瘤测量(参见图像采集指南)。重要的是，目前研究中所用的修改的RANO标准允许患者在初始放射照相进展后继续研究，以排除可能的假性进展。具体而言，修改的RANO标准建议将初始进行性疾病(PD)事件称为“初步PD”，并进行随访以确认真实PD，随后让患者退出治疗，仅在初步PD事件后至少4周进行重复MRI和支持性评估(例如，灌注MRI)之后。虽然建议遵守这一修改的RANO标准，但是由于在治疗后极有可能进行早期进行性增强，因此可以根据研究者的判断进行患者管理。

随访MRI还将接受独立中心图像审查，以确定响应/进展，包括每个随访时间点的肿瘤尺寸。

研究程序和观察

功效评价-肿瘤响应评估

相对于术前计划MRI(基线)的肿瘤响应的独立评估将由成像核心实验室进行，并且基于MRI扫描的评价(相对于基线检查在输注后30天、60天、90天、120天、180天、240天和360天进行)。响应和进展将使用修改的RANO标准(Ellingson等人,2017附录2)来确定，该标准允许患者在初始放射照相进展后继续研究，以排除假性进展。受试者应仅在初步PD事件后至少4周进行重复MRI和支持性评估(例如，灌注MRI)之后退出。

PFS、ORR、响应的持续时间(DOR)和临床益处的持续时间(DOCB)将根据独立的评估来评估。

存活

在进展后(在研究时或在随访期间)，将继续随访受试者的存活，和GB的一种或多种研究后治疗，以及GB成像(在可能的情况下)，直到死亡(或发起者终止数据收集或受试者同意退出)。

安全性评价

安全性将通过AE监测、临床评价(即，生命体征、身体检查、心电图[ECG])、实验室测试(即，血液学、血清化学和尿液分析)、抗体(血清抗PRX 321抗体和中和抗体(如果适用))评估、和从签署知情同意书到最后一次研究访视(输注后或终止后360天)的PK样品上的血浆药物水平来评价。

每个小组所需的临床实验室测试如下：

血液学：血红蛋白、血细胞比容、血小板计数、白细胞(WBC)计数和WBC分类；

凝血：凝血酶原时间(PT)/PTT/INR(PTT，如果必需，进行校正)；

血清化学：AST、ALT、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素、间接胆红素、碱性磷酸酶、总蛋白、白蛋白、钠、钾、氯化物、二氧化碳、钙、磷、血尿素氮(BUN)、肌酐、尿酸和葡萄糖；

尿液分析：pH、比重、蛋白质、葡萄糖、酮、血液、白细胞酯酶和亚硝酸盐。随访临床上显著的异常发现只需要显微术；以及

怀孕：所有有生育能力的女性都应在筛选时和输注后30天和180天进行血清妊娠测试。

研究者或指定助理将审查所有临床实验室结果，并且将临床上显著的发现报告为AE，并且根据机构指南或治疗医生的医学判断进行随访或治疗。

安全性考虑因素

将在筛选时、在导管放置之前24小时内以及在第1天或第2天(根据输注持续时间)、第14天、第30天、第60天、第90天、第120天、第180天、第240天和第360天(或提前终止)输注后进行身体检查。筛选和第360天(或提前终止)检查将是完整的身体检查；其他检查应根据研究者的判断，专注于评估相对于此前检查的变化。在治疗期间或之后，身体检查发现的临床上显著的变化(包括短暂性神经症状)将被报告为AE。

其他安全性评估将包括生命体征。研究者或指定助理将审查所有生命体征结果，并且将临床上显著的发现报告为AE，并且根据机构指南或治疗医生的医学判断进行随访或治疗。在筛选期间和输注完成后2小时内进行一式三份十二导程ECG，并且研究者必须随访临床上显著的异常发现。

药代动力学和免疫参数评价

在瘤内和瘤周输注后，预期不会发生PRX 321的全身暴露，并且在此前临床研究中未检测到循环的PRX 321。为了继续评价全身暴露的可能性，将在表15指示的时间收集血样进行分析。

还将收集血样以测试针对PRX 321的抗体的存在(表15)。如果存在血清抗PRX 321抗体，则将进行另外的免疫原性评估，以确定抗体中和潜力，并且还可以评估其他免疫参数。

所有采集的血样将根据实验室手册进行处理，并将样品储存在-70℃下，直到中心收到将样品运输到中心测试实验室(MicroConstants Inc.，San Diego，CA)的指示。

肿瘤组织分析

在筛选期间，需要确认患者可以从初始GB诊断获取存档肿瘤组织。

来自初始GB诊断的存档组织样品和/或复发后的存档组织样品将被用于通过使用免疫组织化学(IHC)进行IL-4R表达的回溯性分析。如本文所述，组织样品还可以接受其他生物标志物的回溯性分析，包括但不限于MGMT基因的甲基化状态。

将进行生物标志物分析以确定IL-4R表达和/或MGMT状态和对PRX 321的治疗响应之间是否存在相关性。

在其他手术程序或疾病状态的局部评价期间获得的其他肿瘤组织样品(例如，通过重复切除或活检采集的样品，以建立组织响应状态)的分析应记录下来，并且可以用于敏感性、亚组和其他探索性分析。

IL-4R表达

来自进入研究的受试者的存档肿瘤组织样本将在CLIA认证的实验室(QualTekMolecular Laboratories,Goleta,CA)通过IHC处理，以分析IL-4R表达，从而确定IL-4R表达和PRX 321治疗后的肿瘤响应之间是否存在相关性。

将通过使用0、1+、2+和3+(以及H评分)的半定量标度以盲法检查每个样本的染色强度来对组织切片的IL-4R表达进行分级。IL-4R染色的另外定量评估可以包括标准化图像分析。将针对IL-4R表达强度来评价功效终点(诸如PFS、ORR、OS、DOR、DOCB)。

O6-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶分析

MGMT表达癌细胞(具有未甲基化的MGMT启动子，并因此对替莫唑胺具有抗性)对PRX 321敏感。

因此，来自受试者的肿瘤组织样本将在CLIA认证的实验室进行处理，以使用定量甲基化特异性PCR技术进行MGMT DNA甲基化分析。主要和次要终点将针对MGMT甲基化状态进行分析。

进展对比假性进展的评价

对于恶性神经胶质瘤，目前使用常规MRI来测定放射响应。虽然此方法已用于确定总体肿瘤响应，但是由于常规MRI不能区分肿瘤/非肿瘤增强组织，因此在某些情况下图像解释会因假性响应或假性进展而混淆(Verma等人,2013年)。因此，真实响应的确定可能需要在治疗后数月才能完成(Floeth等人,2002)。为了解决这个问题，已评价先进成像技术(诸如延迟造影剂外渗MRI，用于计算高分辨率治疗响应评估图(TRAM))确定局部治疗效果、区分真实响应和假性响应或假性进展并且确认GB患者在早期时间点的响应的能力(Zach等人，2012；Zach等人，2015；Daniels等人，2016)。同样，灌注MRI、PET扫描和活检可以用于帮助区分真实响应和假性响应或进展。

研究访视时间表

将根据评估时间表(表15)和以下各节中列出的说明进行所有临床研究评价和程序。

除非另外说明，否则所有研究时访视程序都允许具有时间窗口。*由于周末、公共假期或天气条件造成的治疗或访视延迟不构成违反方案。

表15：评价和程序的时间表^＊

^*由于周末、公共假期或天气条件造成的治疗或访视延迟不构成违反方案

●a在开始输注后(在整个住院期输注期间和之后)评估安全性，并且在第14天和第30天(±3天)以及第60天、第90天、第120天、第180天、第240天和第360天(±7天)进行安全性随访

●b计划在输注开始后的第30天(±3天)和第60天、第90天、第120天、第180天、第240天和第360天(±7天)输注后进行最多12个月的MRI随访

●c如果在随访时间点之间提前终止，则在第360天访视前中止的受试者将接受为第360天访视安排的所有程序，特别规定如果最后一次MRI在提前终止日期前2周内，则不需要MRI。当提前终止与研究随访时间点(即第30天、第60天、第90天、第120天、第180天或第240天)一致时，则访视将被视为提前终止时间点，并且除各自的访视日期评估外，不需要其他评估。

●d可以在14天筛选期的之前签署ICF

●e将增加手术报告

●f生物标志物分析所需的初始GB诊断的切除的存档组织，包括IL-4R IHC、MGMTDNA甲基化和其他翻译生物标志物

●g将遵循整个研究时间表中获得的所有MRI，将根据研究特定图像采集指南中概述的成像方案进行

●g1进行筛选性MRI以独立评估，从而验证客观放射肿瘤特征[例如肿瘤大小；受试者在任何方向上必须具有≥1cm×≥1cm(最小)至4cm的肿瘤直径，等]；可以由CED专家进行针对对流的关于受试者的适用性评价的筛选性MRI的另外图像审查；如果受试者被批准招募，则筛选性MRI还可以用于使用

Flow进行的初步导管轨迹计划

●g2术前计划MRI可以根据局部能力和操作计划根据需要在一个或两个MRI检查中进行。如果可以在单个检查中实现计划MRI的所有功能，则就所需的质量和审查者可用的时间排程而言，将在导管放置前24小时内通过头皮基准点原位完成单个计划MRI。如果不能在单个检查中实现计划MRI的所有功能，则计划MRI应在计划导管放置的3个工作日内进行，并且在导管放置前24小时内通过头皮基准点原位完成进一步检查图像。

●g3在第0天，在开始输注之前以及在输注期间在导管放置后进行MRI，以进行实时MRI输注监测(在维持受试者麻醉的情况下，持续最少3小时的时间)(参见输注程序，本文所述)。

●g4在第1天或第2天(取决于输注的持续时间)，在完成输注后4小时内(理想地2小时内)(相对于输注结束日期/时间)进行MRI

●g5在第30天、第60天、第90天、第120天、第180天、第240天和第360天/提前终止，作为计划随访的一部分进行MRI

●g6仅在计划输注的3个月内未进行CT扫描时才需要进行CT扫描采集

●h1仅在筛选、第30天和第180天时，具有生育能力的女性

●h2血液学：血红蛋白、血细胞比容、血小板计数、白细胞(WBC)计数和WBC分类；

●血清化学：AST、ALT、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素、间接胆红素、碱性磷酸酶、总蛋白、白蛋白、钠、钾、氯化物、二氧化碳、钙、磷、血尿素氮(BUN)、肌酐、尿酸和葡萄糖

●h3凝血：凝血酶原时间(PT)/PTT/INR(PTT，如果必需，进行校正)

●h4尿液分析：pH、比重、蛋白质、葡萄糖、酮、血液、白细胞酯酶和亚硝酸盐。随访临床上显著的异常发现只需要显微术

●i在筛选(基线)时(尽快，但是不超过输注结束时间后1小时)，在输注完成后大约3小时，然后(在～3小时样品收集后)每6小时±2小时，直到24小时或直到受试者出院(以先出现者为准)以及第14天评估PK

●j在筛选(基线)和第14天、第30天、第120天、第240天和第360天/提前终止时评估免疫原性

●k将从筛选收集基线疾患/症状，直到对受试者进行导管放置手术麻醉之前第0天；在导管放置前记录的任何基线疾患或症状都将记录在病史中

●l参见本文的输注液制备和分配说明

●m在输注完成后(仅在输注MRI结束后和受试者出院前的任何时间)，可以根据机构惯例移除导管和关闭切口。必须由委派的神经外科医生进行导管的移除。

●n从知情同意书日期至30天安全期，将在电子数据捕获(EDC)***上收集所有伴随药物和皮质类固醇药物。其后，将收集与治疗相关SAE和详细的抗肿瘤疗法相关的伴随药物。

●o从导管放置至研究访视结束，将收集所有AE，并且对所有AE和SAE进行随访，直到恢复、稳定、数据截止或死亡。

●p在无疾病进展的情况下完成第360天研究随访或在无疾病进展的情况下提前中止的受试者将持续进行疾病状态随访，直到产生进展(在可能的情况下)。在进展后(在研究时或在研究后随访期间)，将继续随访受试者的存活，和GB的一种或多种研究后治疗，以及GB成像(在可能的情况下)，直到死亡(或发起者终止数据收集或受试者同意退出)。

●q当在出院前对患者进行日间护理时，将在输注完成后进行身体检查和KPS评估

●r生命体征监测(无体重参数)将在整个手术工作流中根据机构最佳惯例来进行，以进行导管放置和输注；在手术工作流期间的研究特定生命体征检查点在麻醉开始之前、所有导管放置之后，但是在将患者装入MRI机进行实时输注监测段之前和输注开始后大约1小时；注意：将记录在手术生命体征监测期间的任何时间点观察到的任何异常生命体征，作为计划外发现结果。

●s当受试者在出院前能走动时，将在输注完成后进行生命体征检查

●t在筛选时和输注完成后(在输注结束时间的2小时内)立即进行ECG(一式三份评估)；在3条即时迹线中进行一式三份评估

●u针对血液学、血清化学和凝血的血样应与输注完成后1小时内进行的PK采血或输注完成后～3小时内进行的PK采血平行进行

预处理期

筛选评估(在输注的14天内)

在可考虑将受试者纳入研究前，研究者必须从咨询医生获得受试者的临床病史、一般实验室结果、特定放射学评价和诊断以及针对GB治疗的所有此前疗法的时间顺序，包括结果。受试者应具有初始原发性(新发)GB的此前组织学诊断和研究前MRI扫描的结果，从而提供复发或进展的放射学证据。

在开始任何研究特定评估之前，必须获得书面和签署的ICF和HIPAA授权。可以在14天筛选期的之前签署ICF。

必须在导管放置前14天内进行以下评估：

●筛选性MRI，以评估放射合格标准。

○在采集后立即进行电子图像数据传输(＜4小时)。

●在筛选期间评估CT扫描，以确保不存在妨碍导管放置的先前颅骨缺损或硬件(仅在计划输注的3个月内CT扫描不可用时才需要进行CT扫描采集)。

○电子图像数据传输(应与筛选性MRI的传输同时进行)。

●证实可以(从初始GB诊断)获取存档肿瘤组织，以进行回溯性生物标志物分析。

●完整的病史和肿瘤史，包括先前手术程序和先前治疗史、先前疾患、体征和症状以及涉及一种或多种先前治疗的任何残留/持续毒性。

●完整的身体和神经检查，包括身高、体重、精神状态、颅神经、运动和感觉检查以及KPS。

●基线体征和症状。

●生命体征(脉搏、呼吸率、体重和血压)。

●标准12导程ECG(一式三份评估)

●血液学、血清化学和凝血。

○如果凝血值具有临床显著性，则必须重复进行直到在正常范围内，除非受试者正在接受治疗性低分子量肝素。

●注意：可以根据研究者的判断重复在参考范围之外的任何测试结果。

●收集血样以进行免疫原性分析(基线)。

●收集血样以进行PK分析(基线)。

记录从输注前14天(第0天)直到第360天(或提前终止)访视的伴随药物和治疗，并且记录从知情同意书文档签署时直到第360天(或提前终止)访视的AE。

此外，必须在输注前14天(第0天)内对所有具有生育能力的女性受试者进行血清妊娠测试。

在进行上述评估时，将由CED专家审查涉及针对对流的肿瘤适用性评价的筛选性MRI。筛选性MRI还被发送至成像核心实验室，以对客观放射肿瘤特征进行独立中心评估。

在全面审查所有筛选结果后，将由医学监测员批准受试者的招募。

在批准受试者招募后，将通知研究者/中心，并且可以接着使用CT扫描和筛选性MRI(通过

Flow Infusion计划软件注册)进行初步治疗前导管轨迹计划。

注意：将采用

Flow软件来进行导管轨迹计划。

治疗期

在导管放置的24小时内的术前研究程序

在导管放置之前24小时内，受试者将接受以下程序和评估：

术前计划MRI

术前计划MRI可以根据局部能力和操作计划根据需要在一个或两个MRI检查中进行。如果可以在单个检查中实现计划MRI的所有功能，则就所需的质量和审查者可用的时间排程而言，将在导管放置前24小时内通过头皮基准点原位完成单个计划MRI。如果不能在单个检查中实现计划MRI的所有功能，则计划MRI应在计划导管放置的3个工作日内进行，并且在导管放置前24小时内通过头皮基准点原位完成进一步检查图像。

计划MRI图像将通过

Flow Infusion计划软件注册，以支持导管轨迹计划的完成。

注意：需要使用

Flow软件来进行导管轨迹计划。

简要病史以及身体和神经检查(包括KPS)，注意/记录从筛选以来的任何变化；

生命体征(脉搏、呼吸率、体重和血压)

基线体征和症状的审查，注意/记录从筛选以来病史中的任何变化或新体征/症状；还将记录伴随药物的任何变化；

治疗计划(研究特定来源工作表)将完成，并且在第0天要求的时间报告给医院药房以分配注射液。

研究药物施用(第0天)

在第0天，受试者将接受以下程序和评估：

根据上文所述进行导管放置和输注。

参见上表的强制性抗生素/H-2拮抗剂疗法的实例以及治疗颅内压力升高(ICP)的任选的***和甘露糖醇疗法。

将根据机构最佳惯例针对导管放置和输注生命体征(脉搏、呼吸率和血压)进行整个手术工作流；手术工作流期间的研究特定生命体征检查点如下：

麻醉开始前采集的生命体征

在所有导管放置后但是在将患者装入MRI机进行实时输注监测段之前采集的生命体征

在输注开始后大约1小时采集的生命体征

部位将记录在手术生命体征监测期间在任何时间点观察到的任何异常生命体征，作为计划外发现结果

在导管放置程序期间或输注期间经历的任何AE或接受的伴随药物都会记录在受试者的病历和EDC***中

注意：受试者可能会住院2晚。

输注的中断或中止

如果受试者经历研究者认为与研究药物相关或由于输注程序而产生的临床上显著的3级或4级AE，则将中止输注。如果AE对医学管理有响应，则可以根据研究者的判断重新开始输注；否则，应永久中止输注。

如果由于观察到的质量效应/颅内压力增加(ICP)而中断输注，则建议用甘露糖醇治疗(参见上文)，并且在恢复后继续输注(如果可能的话)，以便可以在48小时的最大输注持续时间窗口内完成。

可以根据研究者的判断中止治疗。万一所有导管被错误放置(与放置指南不符)或不能使用(例如，导管不能发挥作用/对流)，则将停止程序，并且不对受试者进行输注。

输注结束(第1-2天)

这些程序必须在输注结束时完成：

输注完成后(在2小时内)立即进行标准12导程ECG(一式三份评估)

在输注完成后4小时内(理想地2小时内)进行MRI，以对药物分布进行最终评价(导管维持在原位)

根据机构的床边惯例，移除导管和关闭切口。注意：仅在输注MRI结束后才移除导管。

尽快(但是不超过输注结束时间后1小时)，在输注完成后大约3小时，然后(在～3小时样品收集后)每6小时±2小时，直到24小时或直到受试者出院(以先出现者为准)收集血样以进行PK分析

针对血液学、血清化学和凝血的血样应与输注完成后1小时内进行的PK采血或输注完成后～3小时内进行的PK采血平行进行。

当患者在出院前能走动时，应进行简要病史以及身体和神经检查(包括KPS)，注意从研究药物施用之前以来的任何变化。

当在出院前对患者能走动时采集的生命体征(脉搏、呼吸率、血压和体重)。

在整个住院期间，将记录任何AE和新型伴随药物和/或伴随药物的变化。

治疗后随访评估

在输注后第14天(±3天)将进行安全性的评估。在输注开始后第30(±3)天、第60(±7)天、第90(±7)天、第120(±7)天、第180(±7)天、第240(±7)天和第360(±7)天将进行功效和安全性评估二者。在观察到其后4周通过重复评估确认了初步CR或PR或PD(修改的RANO标准；参见附录2)时，可以需要计划外MRI检查来确认总体响应状态(如果在第120天、第180天、第240天或第360天观察到初步响应或初步进展，则需要)。

在第360天研究访视结束后，将在18个月和24个月通过电话联系受试者，以确定疾病/存活状态。在第360天访视前中止的受试者将接受为第360天访视安排的所有程序，并且如果可能的话，对疾病状态、疾病相关治疗和存活进行随访。

输注后14天(±3天)

受试者将在输注后14(±3)天返回。

伴随药物/疗法和AE将通过询问非引导性问题进行评估，并且还将进行以下程序：

生命体征(脉搏、呼吸率、体重和血压)

身体和神经检查(包括KPS)

血液学、血清化学和凝血

收集血样以用于免疫原性；

收集血样以用于PK

在输注后30天、60天、90天、120天、180天、240天和360天

受试者将在输注后第30(±3)天、第60(±7)天、第90(±7)天、第120(±7)天、第180(±7)天、第240(±7)天和第360(±7)天返回，以接受随访MRI。对于使用TRAM的中心，可以在第30天、第60天、第90天、第120天和第180天进行延迟造影剂外渗MRI，以计算TRAM图像图，所述TRAM图像图可用于组织响应的探索性分析(可以根据或如果研究者要求在其他随访访视时进行TRAM的计算，只要可获取基线采集即可)。

在所有上述访视时，伴随药物/疗法和AE将通过询问非引导性问题进行评估，并且还将进行以下程序：

●身体和神经检查(包括KPS)。

●生命体征(脉搏、呼吸率、体重和血压)。

●血液学、血清化学和凝血。

●血清妊娠测试(女性受试者；仅第30天和第180天访视)。

●收集血样以用于免疫原性(第30天、第120天、第240天和第360天或提前终止)。

在随访期间的任何时间点，如果根据研究者的判断对肿瘤组织样品材料进行分析(例如，确立组织响应状态的活检)，则应记录结果和保留材料以进行生物标志物分析(在可能的情况下)。

将根据研究者的判断进行其他评估，并且根据需要对此前记录的任何AE进行随访。

第360天访视相当于提前终止访视，并且将结束受试者的安全报告。

提前终止访视

如果在随访时间点之间提前终止，则在第360天访视前中止的受试者将接受为第360天访视安排的所有程序。如果在提前终止日期之前2周内进行最后一次MRI，则不需要新/重复MRI，所述先前MRI的结果将转入早期终止评估。当提前终止在研究随访访视时间点后2周内(即第30天、第60天、第90天、第120天、第180天或第240天)，则访视将被视为提前终止时间点，并且除各自的访视日期评估外，不需要另外的评估。如果受试者在第360天访视之前从研究退出，则应进行研究后随访(参见下文)。

研究后随访

在完成治疗后18个月和24个月通过电话联系受试者，以评估存活状态。对在无疾病进展的情况下完成第360天研究随访访视，或在无疾病进展的情况下提前中止的受试者将继续进行疾病状态随访，直到产生进展(在可能的情况下)。在进展后(在研究时或在研究后随访期间)，将继续随访受试者的存活，和GB的一种或多种研究后治疗，以及GB成像(在可能的情况下)，直到死亡(或发起者终止数据收集或受试者同意退出)。

伴随药物的使用

根据可接受的局部医学护理标准由研究者判断治疗潜在恶性肿瘤的所有并发医学疾患和并发症。受试者应根据需要接受镇痛药、止吐药、抗生素、退热药和血液产品。虽然允许使用华法林类抗凝疗法，但是必须仔细监测凝血参数，以避免任何可能的药物相互作用的并发症。所有伴随药物(包括血液产品的输注)都将记录在EDC***中。

下文讨论了用于治疗某些医学疾患的指南；然而，也可以使用治疗这些疾患的机构指南。下文讨论了需要特别注意的伴随疗法。

止吐药

***和5-HT3阻断剂(例如，昂丹司琼(ondansetron)或格拉司琼(granisetron))可以作为预用药施用于受试者，除非个别受试者禁忌使用。在研究期间，还将根据临床指示开具止吐药处方。

菌落刺激因子

虽然不太可能需要，但是允许使用粒细胞集落刺激因子来治疗患有中性粒细胞减少或中性粒细胞减少发热的受试者，但是不允许有研究资格。

饮食限制

无。

违禁药物

不期望纳入以下疗法作为本研究的一部分：

●其他抗赘生物疗法，包括细胞毒素、靶向剂、内分泌疗法或具有任何治疗目的的其他抗体(包括

(贝伐单抗))。

●放射疗法

●任何其他研究疗法

如果受试者由于进行性疾病而退出研究，则应施用于此类疗法，将继续收集相关疾病相关的治疗数据，直到死亡或发起者终止数据收集或受试者撤回同意书。

结果

功效的评价

客观响应率

客观响应率(ORR)是在所有治疗的受试者中实现确认的持久性完全响应(CR)或确认的持久性部分响应(PR)的受试者的比例。

根据修改的RANO标准，响应者通过放射照相和临床标准来定义(参见附录2)。首先通过放射照相变化来评估CR和PR，所述放射照相变化通过肿瘤大小的二维评价的改善来确定。此外，将考虑神经功能的变化和类固醇的使用，以确定总体客观响应状态。造影增强的肿瘤大小的体积变化也将作为治疗功效的探索性指标来检查。

PRX 321与免疫疗法共有很多性质，包括在长时间(＞3个月)假性进展后响应的可能性(Weber等人,2003a；2003b)。因此，将使用标准RANO标准的修改版来评估进展(参见下文和附录2)。

假性进展是在无真实肿瘤进展的情况下MRI上的造影增强增加。无法识别这种现象可能会导致过早退出研究。具有假性进展的受试者常常会出现脑水肿、质量效应和其他症状，这使临床检查成为与成像变化的其他原因区分的重要组成部分。然而，在假性进展确定的挑战中，单独的临床检查并不是唯一的考虑因素；MRI上增强的量和程度可以受到不涉及肿瘤的因素的影响，诸如放射技术的差异、所施用的造影增强的量、造影增强与图像采集的关系的时间排程、术后变化、梗塞、治疗相关炎症、癫痫发作活动、亚急性放射效应、放射或治疗相关坏死以及皮质类固醇剂量的变化。修改的RANO标准和本研究的其他特征被设计为使真实进展鉴定的不确定性最小化，如下文所示：

成像评估将使用目前全面成像指南来进行，以在可能的情况下帮助鉴定假性进展。这些指南由RANO工作组成员创建，在方案附录1)中有所概述，并且还可见于Wen等人,2010(标准RANO标准)和Ellingson等人,2017和方案附录2(修改的RANO标准)。对于患有脑肿瘤的受试者，该组制定了临床试验的标准化响应标准(标准的RANO标准)，这解释了GB的放射照相评估的已知挑战，以及与新型药剂相关的新兴挑战。随后引入修改的RANO标准，以进一步改善在标准的RANO标准实施后存在的操作和科学缺陷，包括允许在放射照相进展的初始证据期间继续疗法，以确认后续肿瘤生长和/或鉴定可能的假性进展。

修改的RANO标准的主要特征包括：

●可测量的和不可测量的疾病的准确定义；

●对可以区分假性进展的可用的成像技术的评论；

●响应和进展的更准确定义

●通过在不存在临床进展的情况下要求放射学进展必须在后续检查中确认，然后将所述进展视为真实进展，来将根据假性进展做出治疗决定的风险进一步最小化。

主治神经肿瘤科医生和神经放射科医生(以及如果需要恢复差异，则中心特定肿瘤小组)将评估和定量造影图像、T2/FLAIR信号和所有MRI序列，并且通过使用临床病史、MRI的其他部分(如扩散加权成像(DWI)和灌注)或另一种短间隔MRI(TRAM)，将它们与信号变化的其他原因(包括放射效应、降低的皮质类固醇给药、脱髓鞘、缺血性损伤、感染、癫痫发作和术后变化)区分开。

将根据修改的RANO标准(参见附录2)采用成像核心实验室(Intrinsic ImagingLLC，San Antonio，TX)来提供PRX 321治疗后的响应、进展的独立评估。

使用先进成像(包括TRAM、扩散MRI、灌注MRI或活检)来鉴定早期进行性增强期间的假性进展的标志物的鉴定。注意：中心可以使用优选的局部方法来帮助区分真实进展和假性进展。

事件发生时间终点

表16中定义了事件发生时间终点。

表16：功效终点

必须使用MRI来确定肿瘤响应并且评估出现客观进行性疾病的时间(用于估算PFS、DOR和DOCB)。

安全性的评价

可评价经由CED接受PRX 321的每个受试者的安全性。安全性参数包括所有实验室测试和血液异常、身体发现、ECG、成像参数和AE。

将定期评估每个受试者的如本文概述的任何毒性的发展。

本方案中提供的AE的定义和报告程序与目前的ICH E6和其他适用性国际和当地法规要求一致。医学监测员将立即审查与PRX 321的安全性相关的所有信息。研究者将在整个研究过程中仔细监测每个受试者的AE，并且将对所有AE进行随访，直到充分恢复。CTCAE4.0将被用于确定AE和SAE的严重性。

定义

不良事件

AE(也称为不良经历)被定义为与药物在人体中的使用相关的任何不当医学事件，无论认为是否与药物相关。更具体而言，AE可以是在时间上与药物的使用相关的任何不利的和不期望的体征(例如，异常实验室发现)、症状或疾病，而无需对因果关系做出任何判断。AE可以来源于任何药物使用(例如，标示外使用，与另一种药物组合使用)和任何施用途径、配制或剂量(包括过量)。

在导管放置前存在的任何疾患(包括既往疾患和研究前AE)都将被视为病史，并且除非疾患在导管放置期间或之后恶化，否则不会被报告为治疗中出现的AE。既往疾患的任何恶化(即，频率和/或强度的任何临床上显著的不良变化)(在时间上与发起者的产品的使用相关)也是AE。

不良反应

不良反应被定义为药物使用导致的任何AE。不良反应是所有疑似的不良反应的子集，对于这些疑似的不良反应，有理由得出药物导致所述事件的结论。

疑似

疑似的不良反应被定义为存在药物导致AE的合理可能性的任何AE。出于IND安全性报告的目的，“合理可能性”表示有证据表明药物和AE之间存在因果关系。疑似的不良反应意味着关于因果关系的确定性程度低于不良反应。

严重

如果研究者或发起者认为，AE或疑似的不良反应导致以下结果中的任一者，则所述AE或疑似的不良反应被认为是严重的：

●死亡

●危及生命的AE

○如果研究者或发起者认为，AE或疑似的不良反应的发生使受试者立即面临死亡的风险，则所述AE或疑似的不良反应被认为是危及生命的。它不包括假如以更严重的形式发生则可能已经导致死亡的AE或疑似的不良反应。

●住院病人住院或延长现有住院时间

○如果所报告的AE需要至少24小时进行住院病人住院，或如果研究者认为延长现有住院时间，则适用。根据此标准，因选择性程序或常规计划的治疗而住院不是SAE，因为“程序”或“治疗”不是不当医学事件。短于24小时的急诊访视本身不构成SAE。

●进行正常生活功能的能力的持续或显著失能或基本上破坏

●先天性异常/出生缺陷

○如果暴露于(研究性)药品的受试者生下具有先天性异常或出生缺陷的孩子，则适用。

在确定其他情况下的严重性时，应进行医学和科学判断，诸如可能不会立即危及生命、导致死亡或住院，但是可能危及受试者或可能需要干预以防止上文定义中列出的其他结果之一的重要医疗事件。

此类事件的实例是在急诊室或家里对过敏性支气管痉挛进行的强化治疗；不会导致住院的血质不调或痉挛。

不良事件的评价和记录

每次访视时，由研究者观察到的、引发的或由受试者报告的所有AE都将记录在EDC***的适当部分中，并且由研究者和医学监测员来评价。

每个AE所需的最少信息包括事件的描述、持续时间(开始和结束日期)、严重性、严重性评估以及研究药物和递送/输注程序的因果关系。

如果在完成EDC***中的AE部分时可识别，则研究者应识别出特定的疾病或综合征，而不是个体相关的体征和症状，并且记录在EDC***中的适当AE部分中。但是，如果研究者认为观察到的或报告的体征、症状或临床上显著的实验室异常不是特定疾病或综合征的组成部分，则应作为单独的AE记录在EDC***内的适当AE部分中(临床上显著的实验室异常是由研究者识别为此的那些和/或需要干预的那些)。

不良事件的相关性

研究者将为事件与研究药物的使用的可能的关系，以及单独地针对手术/输注程序来分配属性(即在研究治疗剂开始输注之前导管放置期间发生的AE对比开始输注后发作的AE)。各自的关系将如下确定：

相关：有证据表明药物和AE之间存在因果关系，诸如：

少见和已知与药物暴露密切相关的事件(例如，血管性水肿、肝损伤、史蒂芬斯-强森(Stevens-Johnson)综合征)

通常与药物暴露无关，但是在暴露于药物的群体中很少见的事件(例如，肌腱破裂)

无关：AE的另一个原因似乎更合理(例如，由于潜在疾病或通常在研究群体中发生)，或者无法在AE的发作和研究治疗剂的施用之间建立时间顺序，或者因果关系被认为是在生物学上难以置信的。

通常，除非有理由相信恶化可归因于研究药物，否则认为基线或既有疾患的恶化的AE是无关的。此外，如果由于进行性疾病而发生死亡，则不认为死亡可归因于PRX 321。

不良事件的严重性

研究者将使用美国国家癌症研究所CTCAE 4.0版指南对AE的严重性进行分级和记录。当特定AE未在CTCAE 4.0中列出时，研究者将根据以下等级和定义将它们分级为无、轻度、中度或重度：

等级定义

●0级：无AE(或在正常范围内)。

●1级：轻度；无症状或轻度症状；仅临床或诊断观察；干预未指定

●2级：中度；指定的最小、局部或非侵入性干预(例如包装、烧灼)；限制适合年龄的工具性日常生活活动(ADL)

●3级：严重或有医学显著性，但不会立即威胁生命；指定的住院或延长住院时间；失能；限制自我护理ADL

●4级：危及生命的后果；指定的紧急干预

●5级：涉及AE的死亡

不良事件的随访

通过适当的医学管理对所有AE进行随访，直到恢复。将对由于不可接受的AE而从研究退出的受试者进行随访，直到AE恢复或稳定。对于中止研究药物的施用的选定AE，如果认为研究药物既安全又合乎伦理，则可以用研究药物对受试者进行再激发。

统计学方法

样品量的确定

在单侧α＝0.1时，针对6％的无效ORR对比18％的替代(“寻求”)ORR的单段二项式设计测试，对于36名可评价的受试者将具有80％的功效(PASS 14，2016；Fleming，T.R.1982.′One-sample multiple testing procedure for Phase II clinicaltrials.′Biometrics,第38卷,第143-151页)。为了解释大约10％至15％的患者不符合可评价标准的可能性(参见下文)，计划在试验中招募大约52名受试者，包括根据方案3.0版的大约35名受试者。

可评价的受试者将是接受任何量的研究药物并且具有用于主要分析的足够的成像或临床数据的那些；这将是主要分析群体(mITT)，并且将包括来自所有方案版本的在研究时可评价的所有患者。使用相同的假设和α进行的主要终点的次要分析，将对根据方案3.0版及更高版本招募的受试者(包括根据此前方案版本类似地治疗的患者)进行。这些主要和次要分析将以固定的顺序进行，首先进行主要分析，并且仅在主要分析不能达到统计学显著性的情况下，才允许次要分析具有说明性。这将总体试验假阳性率控制在10％(单侧)。对于36名mITT受试者，针对次要测试的功效为大约80％，对于超过36名合并mITT受试者，针对主要测试的功效超过80％。

统计学和分析计划

当所有受试者都完成第360天访视或在完成第360天访视之前中止时，将进行主要分析。所有可用的数据将在主要分析中进行分析。随访数据的收集将继续，直到所有患者退出随访为止。如果需要，将在2年存活随访期结束后和之后准备提供最新的事件发生时间数据的补充报告。

将提供描述性统计，包括类别变量的数量和百分比以及连续变量的观察数、平均值、标准偏差、中位数和范围；在适当情况下还将提供95％置信区间(CI)。

随机分组

本研究是单臂设计。所有受试者将接受积极治疗。不会进行随机分组。

分析群体

修改的治疗意向(mITT)

将对mITT群体进行治功效果和功效的评估。mITT群体将包括接受任何量的研究药物并且具有来自所有方案版本的用于主要分析的足够的成像或临床数据的所有受试者；这将是主要分析群体(mITT)。

次要分析群体(参见下文)将包括根据方案3.0版及更高版本招募的所有受试者，包括根据此前方案版本类似地治疗的患者，这些患者接受任何量的研究药物并且具有用于主要分析的足够的成像或临床数据。

注意：在第一次MRI检查之前临床过期或进展的患者将不能进行针对任何响应评估的评价。

符合方案(PP)群体

PP群体将包括mITT群体中的所有患者，所述患者在研究期间未严重违反方案。在研究数据的最终锁定和主要分析之前，将完成该群体。将对该群体进行功效分析，以支持主要功效结果。

IL-4R分析群体

安全性群体

安全性群体将包括在研究时治疗的所有患者。安全性分析将针对该群体而提供。

基线和人口统计学特征

基线和人口统计学特征将以描述性汇总和提供。

功效的分析

主要功效变量

相对于术前计划MRI(基线)，ORR将通过修改的RANO标准(附录2)以具有CR或PR的受试者的百分比提供；仅考虑确认的响应(即，在相隔不小于4周的2个连续MRI扫描时，在与此前扫描时所施用相同的剂量下或在减少的剂量下，在每次扫描前稳定使用皮质类固醇14天时观察到的那些响应，具有稳定的或改善的神经疾患)。

次要功效变量

次要功效变量将是OS和PFS。

OS和PFS将使用卡普兰-梅尔法汇总，包括在6个月、9个月和12个月时的图形显示和发病率估算。在研究的主要分析之前，还将在次要分析中使用单一样品对数秩检验来测试OS，其中在统计学分析计划中使用预先指定的零假设和备择假设。该假设检验将与ORR的主要假设检验一起在固定序列分析中进行，以控制总体试验假阳性率。如果主要ORR分析在预先指定的显著性水平上失败，则次要OS分析将被视为纯探索性的，并且不对显著性作要求。

OS被定义为从输注开始直至由于任何原因而死亡的时间(以周为单位)。在分析时未知已经死亡的受试者将在最后一次联系时进行审查。

PFS被定义为从输注开始直至放射或神经疾病进展或由于任何原因而死亡的时间(以周为单位)。在分析时未知已经死亡或经历疾病进展的受试者将在最后一次放射评估时进行审查，以表示缺乏进展，或者如果在随访期间，在最后一次联系时进行审查，以表示缺乏进展。

其他功效变量和分析

DOR将使用卡普兰-梅尔法汇总，包括图形显示。仅针对具有响应(CR或PR)的受试者的子集计算DOR，并且将DOR定义为从第一次响应至放射疾病进展(根据修改的RANO标准，并且由独立图像审查来确定)或因任何原因而死亡的时间(以周为单位)。在分析时存活和无进展的响应者将在最后一次放射评估时进行审查，以表示缺乏进展，或者如果在随访期间，在最后一次联系时进行审查，以表示缺乏进展。

类似于DOR，DOCB将使用卡普兰-梅尔法汇总。仅针对具有稳定疾病或更好(CR、PR或SD)的受试者的子集计算DOR，并且将DOR定义为从第一次响应至放射疾病进展(根据修改的RANO标准，并且由独立图像审查来确定)或因任何原因而死亡的时间(以周为单位)。审查将以类似于DOR的方式进行。

另外的探索性功效变量可以包括基于研究者对响应的评估，和其他事件发生时间终点(例如，GB的研究后治疗的时间)的ORR和PFS。还通过IL-4R层进行分析，包括层内ORR的95％置信区间估算值，并且通过IL-4R水平来检查治疗效果。

功效分析还将研究受试者子集(程序成功、IL-4R水平、按中心排列的序列号[学习]、肿瘤大小、肿瘤覆盖、输注的时间、最大流速、导管的数量、计划施用的输注液的百分比、KPS、性别、年龄、类固醇使用、免疫状态)和按其他适用标准计的响应。可以研究比较方案3.0版之前和之后纳入的受试者的子组和敏感性分析。

安全性变量的分析

安全性变量(包括AE、实验室结果、生命体征、ECG、抗体评估和PK样品上的血清药物水平)将在适当情况下根据研究时间进行汇总和提供。

将使用《医学监管活动词典(Medical Dictionary for Regulatory Activities,MedDRA)》对AE进行编码。癌症治疗评价程序(CTEP)不良事件常用术语标准(CommonTerminology Criteria for Adverse Events)NCI CTCAE v4.0将被用于对AE的严重性进行分级。针对所有治疗的受试者和所关注的受试者的子集，将通过***器官类别(SOC)和优选术语来汇总治疗中出现的AE。还将根据严重性、与研究药物的关系、与输注的关系、导管放置、输注液的体积以及先前疗法来产生治疗中出现的AE的某些汇总。将汇总经历3级和4级实验室测试结果的患者的比例。

MRI分析

将进行探索性分析，以评估计划组织覆盖、实际组织覆盖、组织毒性、组织响应(TRAM相关性)和临床结果以及IL-4R表达之间的关系。这些分析在本质上是描述性的。

肿瘤组织分析

将进行探索性分析，以评估肿瘤组织中的IL-4R表达水平与治疗响应、组织响应和存活的关系。该分析在本质上是描述性的。

参考文献

Assaf Shapira and Itai Benhar.Review Toxin-Based TherapeuticApproaches.Toxins 2010，2，2519-2583.

Bankaitis KV and Fingleton B.Targeting IL4/IL-4R for the treatment ofepithelial cancer metastasis.Clin Exp Metastasis.2015Dec；32(8)：847-56.

Brem H，Piantadosi S，Burger PC，et al.Placebo-controlled trial ofsafety and efficacy of intraoperative controlled delivery by biodegradablepolymers of chemotherapy for recurrent gliomas.Lancet 1995；345：1008-12.

Butowski N，et al.Abstract：Initial Clinical Development of a Nano-liposomal Formulation of CPT-11.2015SNO-SCIDOT Joint Conference.http：//www.soc-neuro-onc.org/therapeutic-delivery-conference/

Chandramohan V，Sampson JH，Pastan I，et al.Toxin-based targeted therapyfor malignant brain tumors.Clin Dev Immunol.2012；2012：480429.

Chen MY，et al.，Variables affecting convection-enhanced delivery tothe striatum：a systematic examination of rate of infusion，cannula size，infusate concentration，and tissue-cannula sealing time.J Neurosurg 1999；90(2)：315-20.

Chiron MF，Fryling CM，FitzGerald D.Furin-mediated cleavage ofPseudomonas exotoxin-derived chimeric toxins.J Biological Chemistry；272：50，31707-11.

Chittiboina P,Heiss JD,Warren KE,Lonser RR.Magnetic resonance imagingproperties of convective delivery in diffuse intrinsic pontine gliomas.JNeurosurg Pediatr 2014Mar；13(3)：276-82.

Cohen MH,Yuan LS,Keegan P,Pazdur R.FDA Drug Approval Summary：Bevacizumab

as Treatment of Recurrent Glioblastoma Multiforme.TheOncologist 2009；14：1131-38.

Daniels et al.Early biomarkers from conventional and delayed-contrastMRI to predict the response to bevacizumab in recurrent high-gradegliomas.AJNR Am J Neuroradiol.2016Jul 7.

De Jong MC,Scheffer GL,Broxterman HJ,et al.Multidrug-resistant tumorcells remain sensitive to a recombinant interleukin-4-Pseudomonas exotoxin,except when overexpressing the multidrug resistance protein MRP1.Clin CancerResearch 2003；9：5009-17.

Ding D，Kanaly CW，Cummings TJ，et al.Long term safety of combinedintracerebral delivery of free gadolinium and targeted chemotherapeutic agentPRX 321.Neurol Res 2010Oct；32(8)：810-5.

Ellingson BM，Bendszus M，Boxerman J，et al.Consensus recommendationsfor a standardized Brain Tumor Imaging Protocol in clinical trials.Neuro-Oncology 2015；17(9)：1188-98.

Ellingson BM，Wen PY，Cloughesy TF.Modified Criteria for RadiographicResponse Assessment in Glioblastoma Clinical Trials.Neurotherapeutics.2017Jan20.doi：10.1007/s13311-016-0507-6.[Epub ahead of print]PubMed PMID：28108885.

Fiandaca MS,et al.Image-guided convection-enhanced delivery platformin the treatment of neurological diseases.Neurotherapeutics 2008；5(1)：123-7.

Fiandaca MS,et al.Real-time MR imaging of adeno-associated viralvector delivery to the primate brain.Neuroimage 2009；47 Suppl 2：T27-35.

Floeth FW,et al.Comparative follow-up of enhancement phenomena withMRI and Proton MR Spectroscopic Imaging after intralesional immunotherapy inglioblastoma--Report of two exceptional cases.Zentralbl Neurochir.2002；63(1)：23-8.

Friedman HS,et al.Bevacizumab alone and in combination withirinotecan in recurrent glioblastoma.J Clin Oncol 2009 Oct 1；27(28)：4733-40.

Gill SS,et al.Direct brain infusion of glial cell line-derivedneurotrophic factor in Parkinson disease.Nat Med 2003；9(5)：589-95.

Gill T,Barua NU,Woolley M,et al.In vitro and in vivo testing of anovel recessed-step catheter for reflux-free convection-enhanced drugdelivery to the brain.J Neurosci Methods.2013Sep 30；219(1)：1-9.

Hadaczek P,et al.The“perivascular pump”driven by arterial pulsationis a powerful mechanism for the distribution of therapeutic molecules withinthe brain.Mol Ther 2006；14(1)：69-78.

Hall WA,Fodstad AE.Immunotoxins and central nervous systemneoplasia.J Neurosurg 1992；76：1-2.

Hamilton JF,et al.Heparin coinfusion during convection-enhanceddelivery(CED)increases the distribution of the glial-derived neurotrophicfactor(GDNF)ligand family in rat striatum and enhances the pharmacologicalactivity of neurturin.Exp Neurol 2001；168(1)：155-61.

Harshyne LA，Nasca BJ，Kenyon LC，et al.Serum exosomes and cytokinespromote a T-helper cell type 2 environment in the peripheral blood ofglioblastoma patients.Neuro Oncol 2016 Feb；18(2)：206-15.

Healy AT，Vogelbaum MA.Convection-enhanced drug delivery forgliomas.Surg Neurol Int 2015 Feb 13；6(Suppl 1)：S59-67.

Huang H.Lin H.Zhang X.Li J.Resveratrol reverses temozolomideresistance by downregulation of MGMT in T98G glioblastoma cells by the NF-κB-dependent pathway.

Oncology Reports 2012；27：2050-56.

Jahangiri A，Chin AT，Flanigan PM，et al.Convection-enhanced delivery inglioblastoma：a review of preclinical and clinical studies.J Neurosurg.2016Apr 1：1-10.

Jarboe J，Johnson K，Choi Y，et al.，Expression of interleukin-13receptor A2 in glioblastoma multiforme：Implications for targetedtherapies.Cancer Res 2007；67(17)：7983-65.

Joshi BH，Leland P，Asher A，et al.In situ expression of interleukin-4(IL-4)receptors in human brain tumors and cytotoxicity of a recombinant IL-4cytotoxin in primary glioblastoma cell cultures.Cancer Res 2001；61∶8058-61.

Joshi BH，Leland P，Silber J，et al.IL-4 receptors on humanmedulloblastoma tumours serve as a sensitive target for a circular permutedIL-4-Pseudomonas exotoxin fusion protein.

British Journal of Cancer(2002)86，285-291.

Kanner AA，Wong ET，Villano JL，Ram Z；EF-11 Investigators.Post hocanalyses of intention-to-treat population in phase III comparison of NovoTTF-100A^TM system versus best physician′s choice chemotherapy.Semin Oncol.2014；41(suppl 6)：S25-S34.

Kawakami M，Kawakami K，Stepensky VA et al.IL4-R on Human Lung Cancer Amolecul target for cytotoxin therapy.Clin Cancer Res 2002；8：3503-11.

Keles GE，Lambom KR，Chang SM，et al.Volume of residual disease as apredictor of outcome in adult patients with recurrent supratentorialglioblastoma multiforme who are undergoing chemotherapy.J Neurosurg 2004；100：41-6.

Kennedy B，Showers C，Anderson D，et al.Tumor-associated macrophages inglioma：frien or foe？J Oncol.2013；2013：486912.

Kohanbash G，McKaveney K，Sakaki M，et al.GM-CSF promotes theimmunosuppressive activity of glioma-infiltrating myeloid cells throughinterleukin-4receptor-α.Cancer Res.

2013；73(21)：6413-23.

Kokkinakis DM，Ahmed MM，Chendil D，et al.Sensitization of pancreatictumor xenografts to carmustine and temozolomide by inactivation of their O6-methylguanine-DNA methyltransferase with O6-benzylguanine or O6-benzyl-2’-deoxyguanosine.Clin Cancer Re 2003；9：3801-07.

Krauze MT，et al.Real-time visualization and characterization ofliposomal delivery into the monkey brain by magnetic resonance imaging.BrainRes Brain Res Protoc 2005a；16(1-3)：20-6.

Krauze MT,Saito R,Noble C,et al.Reflux-free cannula for convection-enhanced high-spee delivery of therapeutic agents.J Neurosurg 2005b；103：923-29.

Kreitman RJ，Puri RK,Pastan I.A circularly permuted recombinantinterleukin 4toxin with increased activity.Proc Natl Acad Sci USA 1994；91：6889-93.

Kreitman RJ,Puri RK,Pastan I.Increased antitumor activity of acircularly permuted interleukin 4-toxin in mice with interleukin 4receptor-bearing human carcinoma.Cancer Re 1995；55：3357-63.

Kunwar S,Chang S，Westphal M，et al.Phase III randomized trial of CEDof IL 13-PE38QQR vs Gliadel wafers for recurrent glioblastoma.Neuro Oncol2010；12：871-81.

Kuo CC，Liu JF，Shiah HS，et al.Tamoxifen accelerates proteasomaldegradation of O6-methylguanine DNA methyltransferase in human cancercells.Int.J.Cancer 2007；121∶22932300.

Levin VA,Mendelssohn ND,Chan J,et al.Impact of bevacizumabadministered dose on overall survival of patients with progressiveglioblastoma.J Neurooncol 2015 Mar；122(1)：145-50.

Levin VA，Tonge PJ，Gallo JM，et al.CNS Anticancer Drug Discovery andDevelopment Conference White Paper Neuro-Oncology 17：vi1-vi26，2015

Lewis O，Woolley M，Johnson D，et al.Chronic，intermittent convection-enhanced delivery devices.J Neurosci Methods 2016 Feb 1；259：47-56.

Lonser RR，Samtinoranont M，Morrison PF，et al.Convection-enhanceddelivery to the central nervous system.J Neurosurg 2015Mar；122(3)：697-706.

Lonser RR，Warren KE，Butman JA，et al.Real-time image guided directconvective perfusion of intrinsic brainstem lesions.Technical note.JNeurosurg 2007；107(1)：190-7.

Mardor Y，Last D,Daniels D,et al.Convection-Enhanced Drug Delivery ofInterleukin-4，Pseudomonas Exotoxin(PRX 321)：Increased Distribution andMagnetic Resonance Monitoring.JPET 330：520525，2009.

Marks WJ Jr.，et al.Gene delivery of AAV2-neurturin for Parkinson′sdisease：a double-blind，randomized，controlled trial.Lancet Neurol 2010；9(12)：1164-72.

Mercapide J，Lopez De Cicco R，Bassi DE，et al.Inhibition of furin-mediated processing results in suppression of astrocytoma cell growth andinvasiveness.Clin Cancer Res 2002Jun；8(6)：1740-6.

Merchant F，Fidai S，Patel B.Inhibition of Pancreatic And Colon Cancercells and/or cancer stem cells By Targeting IL4-Rα With PRX 321.Abstract#420.Innovations in Cancer Prevention and Research Conference.Nov 9-10，2015，Austin，Texas.

Morrison PF，et al.Focal delivery during direct infusion to brain：roleof flow rate，catheter diameter，and tissue mechanics.Am J Physiol 1999；277(4Pt 2)：R1218-29.

Murad GJ，et al.Real-time，image-guided，convection-enhanced delivery ofinterleukin 13bound to pseudomonas exotoxin.Clin Cancer Res 2006；12(10)：3145-51.

Neeves KB，et al.Dilation and degradation of the brain extracellularmatrix enhances penetration of infused polymer nanoparticles.Brain Res 2007；1180：121-32.

Nguyen JB，et al.Convection-enhanced delivery of AAV-2 combined withheparin increases TK gene transfer in the rat brain.Neuroreport 2001；12(9)：1961-4.

Nguyen TT，et al.Convective distribution of macromolecules in theprimate brain demonstrated using computerized tomography and magneticresonance imaging.J Neurosurg 2003；98(3)：584-90.

Puri et al.,A review of studies on targeting interleukin 4receptorfor central nervous system malignancy.Curr Mol Med 2009；9：732-39.

Puri RK,Hoon DS,Leland P,et al.Preclinical development of arecombinant toxin containing circularly permuted interleukin 4and truncatedpseudomonas exotoxin for therapy of malignant astrocytoma.Cancer Res 1996；56：5631-37.

Puri RK,Leland P,Kreitman RJ,et al.Human neurological cancer cellsexpress interleukin-4(IL-4)receptors.Int.J.Cancer 1994；58：574-81.

Puri S.，Joshi，BH，Sarkar C et al.Expression and structure ofinterleukin 4receptors in primary meningeal tumors.Cancer，2005，103：2132-2142.

Rand RW，Kreitman RJ，Patronas N，et al.Intratumoral administration ofrecombinant circularly permuted interleukin-4-pseudomonas exotoxin inpatients with high-grade glioma.Clin Can Res 2000；6：2157-2165.

Richardson RM,et al.Novel platform for MRI-guided convection-enhanceddelivery of therapeutics：preclinical validation in nonhuman primatebrain.Stereotact Funct Neurosurg 2011；89(3)：141-51.

Rosenbluth KH,Eschermann JF,Mittermeyer G,et al.Analysis of asimulation algorithm for direct brain drug delivery.Neuroimage.2012 Feb 1；59(3)：2423-9.

Rosenbluth KH,Luz M,Mohr E,et al.J Neurosci Methods.Design of an in-dwelling cannula for convection-enhanced delivery.2011 Mar 15；196(1)：118-23.

Sampson JH,Archer G,Pedain C,et al.Poor drug distribution as apossible explanation for the results of the PRECISE trial.J Neurosurg.2010；113(2)：301-9.

Sampson JH,Brady M,Raghavan R,et al.Colocalization of gadolinium-diethylene triamine pentaacetic acid with high-molecular-weight moleculesafter intracerebral convection-enhanced delivery in humans.Neurosurgery.2011Sep；69(3)：668-76.

Sampson JH,Raghavan R,Brady ML,et al.Clinical utility of a patient-specific algorithm for simulating intracerebral drug infusions.Neuro-Oncology2007；9：343-353.

Shimamura T,Royal RE,Kioi M,et al.Interleukin-4Cytotoxin TherapySynergizes with Gemcitabine in a Mouse Model of Pancreatic DuctalAdenocarcinoma.Cancer Res 2007；67：9903-9912.

Sorensen AG,Patel S,Hannath C,et al.Comparison of diameter andperimeter methods for tumor volume calculation.J Clin Oncol 2001Jan 15；19(2)：551-7.

Souweidane MM.Editorial：Convection-enhanced delivery for diffuseintrinsic pontine glioma.J Neurosurg Pediatr.2014Mar；13(3)：273-5.

Strome SE,Kawakami K，Alejandro D，et al.Interleukin 4receptor-directedcytotoxin therapy for human head and neck squamous cell carcinoma in animalmodels.Clin Cancer Res 2002；8：281-6.

Stupp R，Mason WP，van den Bent MJ，Weller M，Fisher B，et al.Radiotherapyplus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.N Engl J Med2005；352：987-96.Varenika V，et al.Detection of infusate leakage in the brainusing real-time imaging of convection-enhanced delivery.J Neurosurg，2008，109(5)：874-80.

Verma N，Cowperthwaite MC，Burnett MG and Markey MK.Differentiatingtumor recurrence from treatment necrosis：a review of neuro-oncologic imagingstrategies.Neuro Oncol.2013May；15(5)：515-34.

Weber F，Asher A，Bucholz R，et al.Safety，tolerability，and tumorresponse of IL4-Pseudomonas exotoxin(NBI-3001)in patients with recurrentmalignant glioma.Journal of Neuro-Oncology 2003a；64：125-37.

Weber FW，et al.Local convection enhanced delivery of IL4-Pseudomonasexotoxin(NBI-3001)for treatment of patients with recurrent malignantglioma.Acta Neurochir Suppl 2003b；88：93-103.

Wein LM，Wu JT，Lanculescu AG，et al.A mathematical model of the impactof infused targeted cytotoxic agents on brain tumors：implications fordetection，design and delivery.Cell Prolif 2002；35：343-61.

Weller M，Coughesy T，Perry J，Wick W.Standards of care for treatment ofrecurrent glioblastoma--are we there yet？Neuro Oncol 2013Jan；15(1)：4-27.

Wen PY，et al.Response assessment challenges in clinical trials ofgliomas.Curr Oncol Rep 2010；12(1)：68-75.

Wen PY，et al.Updated response assessment criteria for high-gradegliomas：response assessment in neuro-oncology working group.J Clin Oncol2010；28(11)：1963-72.

White E，Bienemann A，Malone J，et al.An evaluation of the relationshipsbetween catheter design and tissue mechanics in achieving high-flowconvection-enhanced delivery.J Neurosci Methods.2011Jul 15；199(1)：87-97.

Wick W,Wild-Bode C，Frank B，Weller M.BCL-2-induced glioma cellinvasiveness depends on furin-proteases.J Neurochem.2004Decl 91(6)：1275-83.

Yin D，Valles FE，Fiandaca MS，et al.Optimal region of the putamen forimage-guided convection-enhanced delivery of therapeutics in human and non-human primates.

Neuroimage.2011Jan；54Suppl 1：S196-203.

Zach L，Guez D，Last D，et al.Delayed contrast extravasation MRI fordepicting tumor and non-tumoral tissues in primary and metastatic braintumors.PLoS One.2012；7(12)：e52008.zach L，Guez D，Last D，et al.Delayed contrastextravasation MRI：a new paradigm in neuro-oncology.Neuro Oncol.2015Mar；17(3)：457-65.

神经肿瘤响应评估(RANO)

在本研究中，将仅使用标准的RANO标准(Wen等人,2010)来确定合格。

受试者必须患有在有或无化学疗法的情况下进行一次或多次治疗(包括手术和放射疗法)后和在中止任何此前标准或研究治疗线(最多2个先前治疗线)后已复发的或进展的(根据标准的RANO标准)组织学证实的原发性(新发)GB(根据局部惯例；Stupp方案，Stupp等人,2005年)。

放化疗完成后不到12周的进行性疾病的定义

如果在放射区域外部(超出高剂量区或80％等剂量线)存在新的增强，则只能使用诊断成像来定义进展。

或者

如果在组织病理学采样中明确存在活肿瘤的证据(例如，实体瘤区域[即，区域中＞70％的肿瘤细胞核])，与先前活检相比，MIB-1增殖指数升高或进行性增加，或肿瘤中的组织进展或退行发育增加的证据。

注意：鉴于很难将真实进展与“假性进展”区分开，因此在不存在进展的放射照相或组织学确认情况下，单独的临床下降将不足以定义完成治疗后前12周中的进行性疾病。

放化疗完成12周及以后的进行性疾病的定义

减少、稳定或增加剂量的皮质类固醇施用时，放射场外部的新的造影剂增强病变。

在第一次放射疗法后扫描、或肿瘤尺寸较小的后续扫描、以及稳定或增加剂量的皮质类固醇施用时12周或之后的扫描之间，垂直直径乘积的总和增加25％或更多。

不能归因于同步药物或合并症的临床恶化足以宣布目前治疗的进展，但是不足以进入针对复发的临床试验。

对于接受抗血管发生疗法的患者，T2/FLAIR非增强性病变的显著增加也可以被视为进行性疾病。与基线扫描或疗法开始后的最佳响应相比，患者在稳定或增加剂量的皮质类固醇时必须发生T2/FLAIR升高，并且不是由于合并症事件(例如放射疗法的作用、脱髓鞘、缺血性损伤、感染、癫痫发作、术后变化或其他治疗效果)导致的。

参考文献：

Wen PY.Macdonald DR，Reardon DA.et al.Updated response assessmentcriteria for high-grade gliomas：response assessment in neuro-oncology workinggroup.J Clin Oneol 2010：28(11)：1963-1972.

针对恶性神经胶质瘤的修改的神经肿瘤响应评估(修改的RANO)

在本研究中，将根据修改的RANO标准确定PRX 321治疗后的响应和进展(Ellingson等人，2017)，据此定义如下文所概述。

通过组合患者对靶标病变、新疾病、神经状态(KPS)和类固醇剂量/使用的放射照相响应来确定总体客观状态，如下表17所定义。注意，具有可能的假性进展(PsP)或假性响应的患者应分别给予初步进展或初步响应的客观状态。一旦确定PsP、假性响应或真实进展/响应，即可相应地改变客观状态(参见下文的定义)。

表17：针对恶性神经胶质瘤的修改的RANO标准的总体客观状态的汇总(针对具有可测量的(＞1cm×1cm)疾病的患者)：(下页继续)

表17：针对恶性神经胶质瘤的修改的RANO标准的总体客观状态的汇总(针对具有可测量的(＞1cm×1cm)疾病的患者)：(续)

a注意，将可测量的疾病的新部位添加至二维积或总病变体积的总和，或者在基线或最佳响应下无可测量的疾病的情况下构成初步PD。

b神经恶化的定义根据主治医生的判断确定，但是建议将KPS从100或90降低至70或更低、KPS从80或更低降低至少20、或者KPS从任何基线降低至50或更低，持续至少7天，视为神经恶化，除非可归因于合并症事件或皮质类固醇剂量的变化(Wen等人,2010)

c鼓励研究者对MRI和其他方式(例如，灌注MRI、PET扫描、TRAM、活检)进行真性进展和假性进展的稳健区分

完全响应(CR)要求

所有增强的可测量的和不可测量的疾病的消失维持至少4周。显示出所有增强的可测量的和不可测量的疾病的消失的第一次扫描被认为是“初步CR”。如果第二次扫描显示出相对于“初步CR”扫描的可测量的增强的疾病，则响应不能维持，称为假性响应PsR，并且现在被认为是“初步PD”(注意，确认的PD需要肿瘤体积的至少2次连续增加)。如果第二次扫描继续显示出增强的疾病的消失或不可测量的疾病的出现(小于10mm二维积)，则被认为是持久性CR，并且患者应继续疗法直到观察到确定的PD。

患者必须停用皮质类固醇(或仅接受生理替代剂量)。

稳定的或改进的临床评估(即神经检查)

注意：只有在基线时具有不可测量的疾病的患者不能具有CR；可能的最佳响应是稳定疾病(SD)。

部分响应(PR)要求

与基线相比，所有可测量的增强的病变的垂直直径乘积的总和减少≥50％，持续至少4周。显示出与基线相比，所有可测量的增强病变的垂直直径乘积的总和减少≥50％的第一次扫描被认为是“初步PR”。如果第二次扫描显示出相对于“初步PR”扫描的PD，则响应不能维持，称为假性响应PsR，现在被认为是“初步PD”(注意，确认的PD需要肿瘤大小的至少2次连续增加)。如果第二次扫描显示出SD、PR或CR，则被认为是持久性PR，并且患者应继续疗法直到观察到确定的PD。

与基线扫描相比，类固醇剂量应相同或更低

稳定的或改进的临床评估

注意：只有在基线时具有不可测量的疾病的患者不能具有PR；可能的最佳响应是稳定疾病(SD)。

进行性疾病(PD)：由以下任一项来定义：

在≥4周时，进行了至少2次单独的连续扫描，均显示出增强的病变的垂直直径乘积的总和增加≥25％。显示出增强的病变的垂直直径乘积的总和增加≥25％的第一次扫描应与在基线(如果不减少)或最佳响应(在稳定的或增加的类固醇剂量下)获得的最小肿瘤测量值进行比较，并且记录为“初步PD”。如果至少4周后的第二次扫描显示出相对于“初步PD”扫描，增强的病变的垂直直径乘积的总和后续增加≥25％，则被认为是“确认的PD”，并且患者应中止疗法。如果至少4周后的第二次扫描显示出SD或PR/CR，则显示出“初步PD”的该扫描被记录为“假性进展”PsP，并且患者应继续疗法直到观察到相对于PsP扫描，肿瘤大小第二次增加。注意，任何新的可测量的(＞10mm×10mm)增强的病变均不应立即被视为PD，相反应添加至表示整个增强的肿瘤负荷的二维积的总和。

在基线或最佳响应表明无可测量的增强的病变(可见或不可见)的情况下，则在≥4周后续扫描(显示出相对于首次展示出新的可测量的疾病的扫描，增强的病变的垂直直径乘积的总和增加≥25％)确认后，将任何新的可测量(＞10mm×10mm)增强的病变视为PD。显示出新的可测量的疾病的第一次扫描被记录为“初步PD”。如果至少4周后的第二次扫描显示出相对于“初步PD”扫描，增强的病变的垂直直径乘积的总和后续增加≥25％，则被认为是“确认的PD”，并且患者应中止疗法。如果至少4周后的第二次扫描显示出SD、CR、PR或变为不可测量的，则显示出“初步PD”的该扫描被记录为“假性进展”PsP，并且患者应继续疗法直到观察到相对于“初步PD”或PsP扫描，肿瘤大小第二次增加。注意，在初步PD扫描后的后续扫描时，任何新的可测量的(＞10mm×10mm)增强的病变均不应立即被视为确认的PD，相反应添加至表示整个增强的肿瘤负荷的二维积的总和中。

不可归因于除肿瘤之外的其他原因(例如癫痫发作、药物不良作用，治疗并发症、中风、感染)或可归因于类固醇剂量变化的明确临床恶化。

因死亡或情况恶化而未能返回进行评价。

稳定疾病(SD)要求：

不符合如上文定义的CR、PR或PD的条件。注意，这也适用于在确认扫描未显示出PD或PsP时、在确认扫描未显示出PR/CR时显示出PsP的患者。

如果皮质类固醇剂量增加(针对新症状/体征)，而未在神经成像上确认疾病进展，并且后续随访成像显示由于疾病进展需要增加类固醇，则被认为是显示疾病稳定的最后一次扫描将是当皮质类固醇剂量等于基线剂量时获得的扫描。

初步放射照相进展：如果病变大小在MRI扫描1和N之间的二维积增加＞25％，则将这些患者分类为“初步放射照相进展”。如果研究者认为患者可以安全地继续进行疗法，则他们应在下一个扫描间隔(从MRI扫描(N)起8周±4周，或初步PD和确认的PD扫描之间的最短持续时间不少于4周)继续治疗并获得随访证实性扫描[MRI(N+1)]以验证肿瘤生长和进展。对于总体切除(GTR)和无可测量的增强疾病的患者，初步放射照相进展被定义为从无可测量的疾病至不可测量(但是存在)的疾病(＜1cm×1cm)或可测量的疾病(＞1cm×1cm)的转变。如果研究者认为使患者继续是安全的，则应在MRI(N+1)上进行证实性扫描以验证肿瘤进展。

确认的进展：如果患者在MRI扫描N和N+1之间的二维积增加＞25％，则这为“确认的进展”，患者应中止疗法，并且放射照相进展的日期为疑似进展的日期MRI(N)。如果患者在MRI(N+1)时相对于MRI(N)具有SD/PR/CR，则确认PsP，并且患者应继续接受疗法。然后，患者将继续接受疗法，并且接受另外的随访MRI扫描[MRI(M)]。如果相对于最低点或MRI(N+1)中的较小值，病变大小在MRI(M)时的二维积增加＞25％，则患者具有“确认的进展”，患者应中止疗法，并且放射照相进展的日期是新日期MRI(M)。对于在RT后基线时无可测量的疾病的患者，“确认的进展”将被定义为从MRI(N)时不可测量(但是存在)的疾病(＜1cm×1cm)至MRI(N+1)时可测量的疾病(＞1cm×1cm)的转变。对于具有确认的PsP和在最低点无可测量的疾病的患者，“确认的进展”将被定义为从无可测量的疾病至可测量的疾病(＞1cm×1cm)的转变。在所有情况下，具有确认的进展的患者均应中止疗法。

初步和确认的放射照相响应：如果在MRI(1)和MRI(N)之间的可测量的病变减少＞50％，则这些患者将被分类为“初步放射照相响应者”，并且将监测另外的时间点和/或治疗周期。在另外的治疗周期(从MRI(N)起8周±4周)后，患者将接受证实性MRI(N+1)。如果病变从MRI(N)起增加＞25％(表示从MRI(N)起的放射照相进展)，则这被认为是“不持续的放射照相响应”或“假性响应”。这些患者的放射照相进展的日期将为MRI(N+1)，并且患者应中止疗法。或者，如果病变从MRI(N)起未增加，则这被认为是“持久性放射照相响应”，患者将继续接受疗法，并且初步放射照相进展的日期为在研究的其余部分期间(从最低点)增加＞25％的时间点。然后，如果研究者认为患者无法安全地继续疗法，则研究者可以决定是否继续安全地接受治疗，直到在后续时间点中止治疗时确认进展为止。

稳定疾病：如果病变大小不增加或减少超出扫描1和N之间的设定阈值，则患者被认为是“稳定的”。此类患者将继续接受疗法，并且初步进展的日期为在研究的其余部分期间二维积(从最低点)增加＞25％的时间点。在初步进展后，研究者可以选择继续疗法并且确认进展或中止疗法。对于如MRI(N)所确定在成像进展时神经显著下降的情况，可能无法或不必须在时间点MRI(N+1)进行证实性扫描。对于这些情况，将MRI(N)定义为进展时间点是适当的。

毛细管间隙+载玻片上的组织放置

表18：针对恶性神经胶质瘤的修改的RANO标准的总体客观状态的汇总(针对具有可测量的(＞1cm×1cm)疾病的患者)：

(下页继续)

表18：针对恶性神经胶质瘤的修改的RANO标准的总体客观状态的汇总(针对具有可测量的(＞1cm×1cm)疾病的患者)(续)：

实施例2：PRX 321制剂

引言

本实施例提供了关于对患有复发性或进行性胶质母细胞瘤(GB)的患者进行PRX321的瘤内施用的开放标签、单臂、多中心研究的更多细节。最多52位受试者将经由对流增强递送(CED)接受固定浓度为3μg/mL的PRX 321的单次瘤内输注，输注体积为60mL，通过最多4根手术放置的导管施用，如实施例1中的详细描述。预计输注的持续时间在24至36小时的范围内，取决于流速和对流导管的数量；然而，如果输注是完成所需的，则可以持续最多48小时。

PRX 321药品在Elliotts

)(7mM)的最终组成的输注液。输注液在医院药房制备；下文提供了关于输注液的制备的说明。

表19：用于制备输注液的试剂

PRX 321药品

药品的组成：药品以浓度为500μg/mL的于0.5mL磷酸盐缓冲盐水(10mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH7.4±0.1)中的PRX 321的无菌冷冻溶液形式提供，其填充在用具有13mm特氟龙表面的塞子密封并且如下标记的无菌、一次性2mL 1型USP脱氢透明玻璃小瓶中：

PRX 321药品小瓶：PRX-321含有0.5mL PRX 321(500μg/m)，并应储存在≤-70℃下。小瓶标记有“用于经由立体定向放置的导管进行的瘤内施用的无菌单剂量小瓶”。

处理：使用无菌技术使用预先消毒的生物安全(垂直流)柜来制备输注液。在输注液制备后，应根据医院药房的标准操作程序丢弃用过的药品小瓶。

赋形剂

赋形剂的接收：每批货物将含有2个单独的赋形剂试剂盒，并且将通过预批合格的隔热运输容器送达医院药房。每个赋形剂试剂盒均提供用于单次输注液制备的材料。将使用赋形剂试剂盒库存表(附录3)来管理赋形剂试剂盒库存。

每个赋形剂试剂盒含有4个组件：

●人血清白蛋白(HSA)

●Elliotts B溶液

●Magnevist(Gd-DTPA)

●空静脉内袋

赋形剂试剂盒组件：

●1×250mL瓶装HSA 5％(水)溶液

●1×单位Elliotts B溶液(10×10mL安瓿瓶)

●1×5mL小瓶装Gd-DTPA

●1×空(150mL大小)静脉内袋

如本实例所述，将赋形剂试剂盒组件用于PRX 321输注液制备中。该试剂盒提供了用于单次(1×)PRX 321输注液制备的材料。

人血清白蛋白

将人血清白蛋白(HSA)以0.02％的终浓度添加至输注液，以防止PRX 321吸附至输注组装件中所用的注射器、管和导管的内表面。

供应：1×250mL瓶装(Octapharma HSA 5％(水)溶液，NCT号68982-0623-02)

储存：按照制造商的建议储存在控制的室温下。

缓冲鞘内电解质/葡萄糖注射液(Elliotts

溶液)

在Elliotts

溶液中稀释PRX 321药品。

表20：组成/成分信息：

关于Elliott’s B溶液的更多信息。Elliotts

溶液是不含有抑菌性防腐剂的无菌、无热原、等渗溶液。Elliotts B溶液是用于氨甲蝶呤钠和阿糖胞苷的鞘内施用的稀释剂。每10毫升Elliotts B溶液含有：

表21：每10毫升的组成

表22：电解质的浓度：

表23：成分的式和分子量：

Elliotts B溶液的pH为6.0-7.5，并且渗透压体积摩尔浓度为288mOsmol/L(计算值)。

临床药理学

表24：Elliotts B溶液和CSF的电解质组成、pH和非电解质成分的比较：

当激发溶液为0.01N HCl时，Elliotts B溶液的近似缓冲容量为1.1X10^-2当量，并且当激发溶液为0.01N NaOH时，近似缓冲容量为7.8X10^-3当量。与氨甲蝶呤钠和阿糖胞苷的相容性研究表明，这些药物与Elliotts B溶液物理相容。

供应：1个单位(透明玻璃10mL安瓿瓶，每盒包装有10个安瓿瓶)(可从LukareMedical商购获得)。

储存：根据制造商的说明储存。

处理：Elliotts

溶液应在预先消毒的生物安全柜中使用无菌技术进行处理。一旦打开和/或使用Elliotts

溶液安瓿瓶，则应根据中心/医院药房的标准操作程序丢弃剩余物。

钆-二亚乙基三胺五乙酸(Gd-DTPA)

Gd-DTPA(稀释至～1∶70)作为造影剂添加至输注液中，因为在输注期间该替代示踪剂的共输注允许实时监测PRX 321输注液分布。

供应：1×5mL一次性小瓶的Gd-DTPA(Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc.

469.1mg/mL,NDC#50419-188-05)。

储存：根据制造商的说明储存。

处理：Gd-DTPA

赋形剂试剂盒中提供的辅助组件

无菌静脉内袋将被用于输注液制备，作为药品和赋形剂混合的容器。

供应：1×具有PVC端口、无菌流体路径的空(150mL大小)INTRAVIA容器(Baxter，产品号2B8011)

储存：根据制造商的说明储存。

处理：静脉内袋应在预先消毒的生物安全柜中使用无菌技术进行处理。一旦打开或使用，则应根据医院药房的标准操作程序丢弃袋子。

输注液的制备和分配

无菌：必须使用无菌技术来维持输注液的无菌性。这包括戴无菌手套，按照医院/机构SOP的规定使用批准的杀菌剂对所有小瓶的表面杀菌，以及在预先消毒的生物安全柜中制备输注液。

无菌输注液的制备

在计划给受试者输注之前24小时内，研究者或指定人员将向药剂师提供受试者特定的治疗计划，以指定用于输注的分配信息。所有受试者的总输注体积将为60mL。

在计划的导管放置开始时间的2小时内，在室温下，在预先消毒的生物安全柜中制备输注液，如下文所述：

●使用酒精擦拭布对用于输注液制备的每个组件进行消毒

●一个PRX 321药品小瓶从-70℃冰箱中取出，并在室温下解冻，并且在解冻后储存在冰上。解冻时间为大约15分钟。

●一个赋形剂试剂盒从储存中取出，并且将各自的内容物放置于生物安全柜中。

●通过橡胶隔垫端口将以下溶液添加至按以下指定顺序添加至静脉内袋中。静脉内袋隔垫的橡胶隔垫也要用酒精擦拭布特别消毒。

注意：请勿直接混合。在测量每种试剂时，请非常温和和非常缓慢地吸出和分配液体，以避免搅拌或任何气泡形成。

○68.32mL Elliott’s

溶液

■由于Elliott’s

溶液在10mL安瓿瓶中提供，因此必须在静脉内袋中无菌组合多个安瓿瓶。

■注意：Elliott’s

溶液安瓿瓶略有过量，大于10mL。因此，必须先测量每个安瓿瓶中的内容物，然后再添加至静脉内袋，直到达到所需的体积。

■为了将Elliott’s

溶液转移至静脉内袋，请从每个安瓿瓶上取下玻璃密封件，并且使用装有长度为至少1英寸(优选地更长)的16号针的60mL注射器从小瓶中无菌移除Elliotts B。缓慢抽回注射器以虹吸安瓿瓶内容物，并且重复直到吸出34mL。通过橡胶隔垫端口转移至静脉内袋。重复此步骤以转移另外剩余的34mL。

■使用1mL注射器测量剩余的0.32mL，并且通过橡胶隔垫端口无菌转移至静脉内袋。

以～10毫升/分钟的速率非常缓慢地抽吸和分配Elliotts B，以避免任何搅拌或气泡形成。

○使用装有针头(20–23号)的1mL注射器，0.28mL 5％HSA

●如果针的长度不足以清除注射口，则应将袋保持直立位置，并且确保在注射前用Elliotts溶液填充端口。

○使用装有针头(20–23号)的3mL注射器，0.98mL Gd-DTPA

■如果针的长度不足以清除注射口，则应将袋保持直立位置，并且确保在注射前用Elliotts溶液填充端口。

非常轻柔地颠倒混合3次。请勿涡旋或振荡。翻转不超过3次。在每次翻转和弹匀后，请确保注射口填充有溶液，以确保彻底冲洗端口。

○使用装有针头(20–23号)的1mL注射器，0.42mL PRX 321药品

非常轻柔地颠倒混合5次。请勿涡旋或振荡。翻转不超过5次。在每次翻转和弹匀后，请确保注射口填充有溶液，以确保彻底冲洗端口。

注意：为避免起泡，应将所有成分非常轻柔地添加至静脉内袋，并且请勿振荡静脉内袋或搅拌其内容物。通过将静脉内袋非常轻柔地翻转5次即可完成上述成分的混合。

所得的输注液的最终PRX 321浓度为3μg/mL，含有0.02％HSA和7mM Gd-DTPA，总体积为70mL。根据分配说明将输注液从静脉内袋无菌转移至注射器中(参见下文)。

输注液的分配

所需材料：需要一个或多个20mL和/或30mL Medfusion 3500兼容的无菌鲁尔接头注射器来分配输注液。所分配的注射器的数量和大小根据受试者特定的治疗计划中放置和概述的导管数量来确定。

注意：在输注液转移期间务必采用无菌技术；在输注液制备后，立即将输注液从静脉内袋转移至注射器中。

分配说明：如受试者特定的治疗计划所概述，在生物安全柜中将输注液分入最多4个无菌鲁尔接头注射器中。应使用大小合适的注射器末端上足够长的16号针头以～10μL/min的速率缓慢地从静脉内袋隔膜端口吸出输注液。参见受试者治疗计划工作表，以获取适当大小的注射器和所需的抽吸/注射器体积。

注意：当从静脉内袋中抽吸输注液至分配注射器时，请轻轻向后拉动柱塞，以避免溶液搅拌和起泡。

将与受试者特定的治疗计划一致的导管编号(如适用1、2、3、4)标记准备好的注射器，并且根据医院药房的标准操作程序将其保持无菌状态递送至手术室。分配必须由药剂师或指定人员使用针对该受试者的药物责任表(附录2)进行记录。

将输注液分配到手术室的时间：必须将输注液分配到手术室，在手术室中研究受试者要接受一个或多个导管的放置手术，然后放置一个或多个导管，因为需要输注液来灌注导管。指定中心的研究者有责任将计划的导管放置开始时间告知药剂师。

注意：注射液应在注射器中制备/分配，并且在计划的导管放置开始时间的2小时内运送至手术室。在准备好后，可以将注射器储存在2–8℃下，直到运送至研究受试者。

监测输注的中心工作人员必须使用来源工作表来负责空的或含有未使用的残留输注液的所有注射器，以捕获每个注射器中剩余的注射液体积，然后根据医院药房的标准操作程序丢弃。

在第1天重复输注液制备

对于每个受试者，输注液的制备将进行两次，因为总处方体积(60mL)的施用输注持续时间将超过24小时。尽管从制备时间起，输注液在至少24小时内保持稳定，但是在第1天输注开始后的20-24小时时，应制备新的输注液，并用含有新鲜输注液的新注射器替换初始分配的注射器。

PRX 321的第二小瓶以及第二赋形剂试剂盒将被用于制备新鲜的无菌输注液，所述输注液在20-24小时输注时间点至剩余的输注时间进行施用。应按照与本文概述的制备和分配相同的制备和分配程序来制备新鲜的输注液。唯一的区别是，将新鲜的注射器分配至研究受试者所在的医院场地而不是手术室。

实施例3：复发性胶质母细胞瘤(RGBM)中的图像指导的高流动CED

靶向免疫疗法PRX 321(CPIL-4PE)的2期研究的初始经验

引言：PRX 321是一种包含融合至假单胞菌外毒素A(PE)的截短型式的环状排列的白介素-4的靶向免疫治疗剂。PRX 321结合至胶质母细胞瘤细胞和肿瘤微环境的免疫抑制细胞过表达的白介素-4受体，并且通过切割的PE结构域内吞，从而经由延伸因子2的ADP-核糖基化诱导肿瘤细胞死亡。

方法：当前研究是一项使用分阶段导管、输注建模(用于导管放置)和药物分布的术中实时成像进行的rGBM中的PRX 321的瘤内输注的多中心、单臂、2b期研究。输注以3μL/min/导管开始，然后根据所观察的药物分布模式和关键结构的接近程度，在实时MRI成像下逐渐增加。

已完成对CED成功、耐受性和安全性的中期评价。

药物浓度：1.5μg/mL

输注体积：7–60mL-根据肿瘤体积进行个性化

流速：最多30μL/min/导管，因为更高的流速改善了分布

导管：1cm–2cm肿瘤：最多2个导管或2cm–4cm肿瘤：最多4个导管。

实时输注监测–输注的前3-6小时：钆。

导管轨迹计划：Brainlab

Flow软件。

结果：10名在第一次或第二次复发时具有直径为1.8–4.3cm的肿瘤的rGBM受试者接受经由1-3个导管以1.5μg/mL的浓度递送的12-66ml PRX 321，流速高达15μL/min/导管。

表25：安全性的汇总

未报告SUSAR，并且无报告暗示急剧升高的ICP、脑部刺激或体积相关的影响。AE通常与潜在疾病一致。

已经观察到一些显著的分布。肿瘤覆盖范围从43％至100％，其中1cm和2cm半影分别覆盖70％和40％。分布体积(Vd)与输注体积(Vi)的比率范围为2.2至0.6。将详述Vd/Vi比率降低的原因。

当导管放置不准确时，GdDTPA分布的实时成像使得能够调整导管深度，从而显著改善肿瘤覆盖。

结论：初始安全性特征可以接受-这与疾病和疗法的性质一致。CED候选物的选择很重要。对等技术支持和经验交流非常重要。可耐受的最大体积为60ml，最高速率为20μl/min。希望避免(早期)向CSF的泄漏，但是这是不可预测的。可以实现较高的覆盖百分比，但是仍有进一步优化的空间。良好的计划可以克服操作复杂性。方案修订为对于所有受试者60ml固定体积。

在实时MRI指导下提高输注速率，使得能够通过CED在rGBM中以最高15μL/min/导管的输注速率递送PRX 321。因此，MRI引导对于脑肿瘤中的最佳药物分布是至关重要的。重复确保的初步安全审查使正在进行的研究募集成为可能。

提供上述实施例以便为本领域的普通技术人员提供关于如何实现和使用本发明的组合物、***和方法的实施方案的完整公开内容和描述，并且不旨在限制发明人所认为的发明的范围。对于本领域的技术人员显而易见的、用于实施本发明的对上述模式的修改旨在落入以下权利要求的范围内。本说明书中提及的所有专利和公开表示本发明所属领域的技术人员的水平。本公开中引用的所有参考文献以引用的方式并入，达到如同各参考文献单独以引用的方式整体并入的相同程度。

所有标题和章节名称仅用于澄清和参考的目的，不应视为以任何方式进行限制。例如，本领域的技术人员将会理解根据本文所述的本发明的精神和范围适当组合来自不同标题和章节的各个方面的有用性。

本文引用的所有参考文献据此以引用的方式整体并入本文并用于所有目的，达到如同具体和单独指示各个公开或专利或专利申请以引用的方式整体并入用于所有目的的相同程度。

如本领域的技术人员所显而易见，可以在不脱离本申请的精神和范围的情况下对本申请进行许多修改和变型。本文描述的特定实施方案和实施例仅以举例的方式提供，并且本申请仅由所附权利要求的术语以及权利要求所赋予的等同物的全部范围来限制。

Claims

1.一种治疗受试者中的中枢神经***(CNS)肿瘤的方法，所述方法包括将包含以下各项的制剂施用于所述受试者：

iii.于人工脑脊液(CSF)溶液中的IL-4靶向的货物蛋白，和

iv.白蛋白，

其中所述制剂与替代示踪剂一起共施用于有需要的受试者。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白包含一个或多个货物部分。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白包含毒素。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述毒素包括细菌毒素、动物毒素或植物毒素。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述毒素包括成孔毒素。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述成孔毒素包括气单胞菌溶素或气单胞菌溶素原。

7.根据权利要求4所述的方法，其中植物毒素包括布加宁或蓖麻毒素。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述细菌毒素包括选自由假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素组成的组的毒素。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白包括BCL-2家族的促凋亡成员，所述成员选自由BAX、BAD、BAT、BAK、BIK、BOK、BID BIM、BMF和BOK组成的组。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白包括PRX321(SEQ ID NO:1)或其衍生物或变体。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述替代示踪剂是磁共振成像(MRI)造影剂。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述替代示踪剂是钆结合的示踪剂。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述替代示踪剂选自由钆-二亚乙基三胺五乙酸(Gd-DTPA)和钆结合的白蛋白(Gd-白蛋白)组成的组。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述人工CSF溶液是Elliotts

溶液。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白作为所述靶向部分包含在IL-4R抗体中。

17.根据权利要求15所述的方法，IL-4R抗体是人源化抗体。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白包含人类货物部分，所述人类货物部分选自由RNA酶A和穿孔素组成的组。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白包括融合蛋白。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有复发性CNS肿瘤或新诊断的CNS肿瘤。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有复发性或难治性CNS肿瘤。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是难治性的。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有IL-4R阳性CNS肿瘤。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有O6-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶(MGMT)阳性CNS肿瘤。

25.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者患有弗林蛋白酶阳性CNS肿瘤。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括确定所述受试者是否是放射或化学疗法难治性的；其中如果所述受试者是难治性的，则表明他们将受益于所述IL-4靶向的货物蛋白的施用。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在施用所述IL-4靶向的货物蛋白之后将化学疗法或放射疗法施用于所述受试者，和/或在施用所述IL-4靶向的货物蛋白之后手术摘除肿瘤的至少一部分。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在施用所述IL-4靶向的货物蛋白之前将化学疗法或放射疗法施用于所述受试者，和/或在施用所述IL-4靶向的货物蛋白之前手术摘除肿瘤的至少一部分。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在用所述IL-4靶向的货物蛋白治疗期间将化学疗法或放射疗法施用于所述受试者，和/或在手术摘除所述受试者中的肿瘤的至少一部分期间施用所述IL-4靶向的货物蛋白，任选地其中在施用所述IL-4靶向的货物蛋白的施用后1周、2周、3周或4周进行手术切除。

30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在施用所述IL-4靶向的货物蛋白之前将使癌症干细胞敏化的激动剂施用于所述受试者。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中瘤内施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述瘤内施用包括颅内施用。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白经由颅内导管施用。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白通过对流增强递送(CED)施用。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白经由对流增强递送(CED)以单剂量施用。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白以单剂量施用。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以约90μg(1.5μg/mL于60mL中)、约240μg(6μg/mL于40mL中)或约300μg(3μg/mL于100mL中)的单剂量施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

38.根据权利要求36所述的方法，其中以1.5μg/mL于60mL中的剂量施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

39.根据权利要求36所述的方法，其中以6μg/mL于40mL中的剂量施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

40.根据权利要求36所述的方法，其中以3μg/mL于100mL中的剂量施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白以约1.5μg/mL至约3μg/mL的单剂量施用。

42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以单剂量施用所述IL-4靶向的货物蛋白持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。

43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白以1次、2次、3次、4次或5次输注来施用。

44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据前述权利要求中的任一项施用所述IL-4靶向的货物蛋白，然后停止所述施用约1天至约8天，任选地停止所述施用1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天，然后根据前述权利要求中的任一项施用，并且重复这种施用和停止施用模式持续所述CNS肿瘤治疗所必需的时间。

45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CNS肿瘤选自由神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经神经胶质瘤、脑膜神经神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤组成的组。

46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CNS肿瘤是胶质母细胞瘤。

47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CNS肿瘤是复发性或难治性胶质母细胞瘤。

48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白经由一个或多个颅内导管施用。

49.根据权利要求48所述的方法，其中通过所述导管以约5μL/min/导管至约20μL/min/导管的流速施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

50.根据权利要求49所述的方法，其中通过所述导管以约15μL/min/导管的流速施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

51.根据权利要求49所述的方法，其中通过所述导管以1.5μg/mL的浓度和约15μL/min/导管的流速施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

52.根据权利要求51所述的方法，其中使用1至3个导管。

53.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中所述IL-4靶向的货物蛋白是PRX321。

54.一种用于CNS肿瘤的治疗的单位剂量制剂，所述单位剂量制剂包含：

iv.于人工脑脊液(CSF)溶液中配制的IL-4靶向的货物蛋白；

v.白蛋白；以及

vi.替代示踪剂，

其中所述单位剂量制剂被配制成通过一个或多个颅内导管来颅内施用于所述CNS肿瘤。

55.根据权利要求54所述的单位剂量制剂，其中以约90μg(1.5μg/mL于60mL中)、约240μg(6μg/mL于40mL中)或约300μg(3μg/mL于100mL中)的单剂量施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

56.根据权利要求54至55所述的单位剂量制剂，其中以1.5μg/mL于60mL中的剂量施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

57.根据权利要求54至56所述的单位剂量制剂，其中以6μg/mL于40mL中的剂量施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

58.根据权利要求54至57所述的单位剂量制剂，其中以3μg/mL于100mL中的剂量施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

59.根据权利要求54至58所述的单位剂量制剂，其中以约1.5μg/mL至约3μg/mL的单剂量施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

60.根据权利要求54至59所述的单位剂量制剂，其中通过所述导管经由约5μL/min/导管至约20μL/min/导管的流速施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

61.根据权利要求54至60所述的单位剂量制剂，其中通过所述导管以约15μL/min/导管的流速施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

62.根据权利要求54至61所述的单位剂量制剂，其中通过所述导管以1.5μg/mL的浓度和约15μL/min/导管的流速施用所述IL-4靶向的货物蛋白。

63.根据权利要求54至62所述的单位剂量制剂，其中使用1至3个导管。

64.根据权利要求54至63所述的单位剂量制剂，其中IL-4靶向的货物蛋白的所述单位剂量制剂被配制成根据前述权利要求中的任一项施用，然后停止所述施用约1天至约8天，任选地停止所述施用1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天，然后根据前述权利要求中的任一项施用，并且重复这种施用和停止施用模式持续所述CNS肿瘤治疗所必需的时间。

65.一种包含于人工脑脊液(CSF)溶液中的IL-4靶向的货物蛋白、白蛋白和替代示踪剂的制剂，其用于治疗中枢神经***(CNS)肿瘤。

66.一种包含于人工脑脊液(CSF)溶液中的PRX 321、白蛋白和替代示踪剂的制剂，其用于治疗神经胶质瘤。

67.一种包含于人血清白蛋白中的PRX 321和替代示踪剂的制剂，其用于治疗中枢神经***(CNS)肿瘤。

68.一种包含于人工脑脊液(CSF)溶液中的IL-4靶向的货物蛋白、白蛋白和钆结合的示踪剂的制剂，其用于治疗中枢神经***(CNS)肿瘤例如神经胶质瘤。

69.一种包含于人血清白蛋白中的PRX 321和钆结合的示踪剂的制剂，其用于治疗中枢神经***(CNS)肿瘤例如神经胶质瘤。

70.根据权利要求65至69中任一项所述的制剂，其中所述使用根据权利要求1至53中任一项所述的方法进行。