CN1113951A

CN1113951A - 枯草芽孢杆菌及固体碱性果胶酶生产工艺

Info

Publication number: CN1113951A
Application number: CN 94105708
Authority: CN
Inventors: 李明凤; 汤懋竑; 范树田; 李心治
Original assignee: Institute of Genetics of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 1994-05-24
Filing date: 1994-05-24
Publication date: 1995-12-27
Anticipated expiration: 2014-05-24
Also published as: CN1055118C

Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC No.0213以及用该菌，在高培养基浓度、适当碳、氮比条件下培养、发酵然后高温快速喷雾干燥，生产一种不含纤维素酶，以果胶酶为主，同时含有蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶的复合固体酶工艺。工艺简单，周期短，原料廉价、酶活性高，菌和酶无毒性，耐热、耐碱，不加防腐剂便可贮藏，且活性稳定，运输，使用皆方便，酶作用条件温和，可重复使用，废水无污染，用于苎麻脱胶回收率高，麻纤维结实，可节省 4—5道工序，耗能低。

Description

本发明涉及一种芽孢杆菌（Bacillus），特别是枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）菌株的培养及用该菌生产固体碱性果胶酶生产工艺。通过分离、诱变、筛选出此菌株，然后在高浓度和适当C.N比的条件下，培养和发酵，再经高温喷雾干燥，生产出一种不含纤维素酶，而含果胶酶（为主），同时含蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶的复合固体酶制剂。

果胶酶作为脱胶剂广泛应用於纺织工业的苎麻脱胶，造纸工业及其它轻工业。用于苎麻脱胶方面主要有丹麦NOVO公司出品的苎麻酶（《苎麻纺织科技》第十二卷总五十三期）是一种棕色液体酶，由曲霉（属真菌）菌株产出的，一般含有果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶等的混合酶，偏酸性。国内也有厂家生产真菌酸性果胶酶制剂。但上述酶因含有纤维素酶;在酸性下易分解纤维，致使纤维强度和制成率降低，麻厂避而用之。中国湖南师范大学申请了中国专利CN85104284和CN85104285提供一种枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）A2-5，经工业发酵生产出果胶混合酶，这两项专利虽提到生产固体酶，但说明书中没有提供固体酶的生产工艺，也未谈到固体酶的应用，只谈到液体酶生产工艺和浓缩酶在呈强碱性时，再加入千分之一的苯甲酸盐可防腐保酶，最好保存半年，否则液体酶很快失去活性，少者几天，多者几个月就失活，一般液体酶较难保存。

本发明目的在于克服上述发明诸多不足，提供一种枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）CGMCC NO.0213及用该菌株生产固体碱性果胶酶工艺方法，这种酶是一种不含纤维素酶，而含果胶酶（为主），同时含蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶的固体复合酶制剂。本发明工艺简单，周期短，原料廉价，酶活性高，菌和酶无毒性，耐热、耐碱、不加任何防腐剂也能贮存达一年，且活性稳定，固体酶运输和使用方便，酶作用条件温和，麻纤维强度和制成率高，又能重复利用，从而降低成本，与传统方法相比，可节省4-5道工序，耗能低，废水无污染，并可综合利用，麻厂在现有条件下便可用此酶进行麻脱胶，不必增加新投资。

本发明内容是用不产纤维素酶，营养条件要求不高，耐热、耐碱的枯草芽孢杆菌突变株、保藏号为CGMCC NO.0213，将其菌株接种到适当C.N比的玉米粉-豆饼粉培养基中（内含少量无机盐），经培养发酵，然后高温喷雾干燥制成固体碱性果胶酶，此酶活性高，耐热，耐碱，适于麻类脱胶生产、造纸及其它轻工业生产应用。其菌种枯草芽孢杆菌，是从麻土壤中分中离的，再经紫外线（UV）和亚硝基胍（NG）诱变、筛选出带有遗传记号链霉素抗性（Sm^r）的突变体，它主要产生碱性果胶酶，同时产生蛋白酶，淀粉酶和木聚糖酶。在肉汤平板上，菌落由灰白、薄、逐渐边变白，增厚，然后全白变厚，无同心园。最适生长条件：PH7-7.2，37℃;在有机或合成的无机培养基上均很好生长，营养要求不高;液体静止培养时，表面形成菌膜，下边培养基清亮;肉汤琼脂穿刺培养，只表面有菌苔，证明生长产生芽孢，耐热带有Sm^r遗传记号，有利菌纯化、防杂保存。此菌在玉米-豆饼粉培养基中通氧会生长更旺盛，本身不产气。

本发明所涉及的枯草芽孢杆菌菌株已於1994年5月6日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（地址：中国北京中关村），其分类命名及其保藏号为：枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CGMCC NO.0213.

用上述枯草芽孢杆菌菌株CGMCC NO.0213，生产固体碱性果胶酶工艺过程为：菌种→试管肉汤斜面→扁平大斜面→种子罐→发酵罐→高温快速喷雾干燥制成固体酶制剂→包装：

1.将上述枯草芽孢杆菌菌株CGMCC NO.0213接入试管肉汤斜面上，肉汤培养基成份有牛肉膏、猪血蛋白胨、NaCl、琼脂，PH值为7.0-7.2，在高压灭菌锅（15磅）中灭菌30分钟，37℃条件下培养16-24小时;

2.转接到扁瓶斜面上，37℃下培养16-24小时，培养基成份同上述步骤1.，之后加入一定量的肉汤，作成菌悬浮液;

3.转入种子罐中扩大培养，罐中培养基成份有一定碳、氮配比的玉米粉，豆饼粉和MgSO₄·7H₂O，KH₂PO₄，Na₂CO₃，K₂HPO₄，（NH₄）₂SO₄及适量豆油，121-123℃下灭菌40分钟，灭菌前PH为8-9，灭菌后PH降为6.5左右，37℃-40℃和不断搅拌通氧条件下，培养10-12小时;

4.再转接到发酵罐中，培养基成份和培养条件基本同上步骤3.，但培养基浓度增大，培养时间24小时-28小时;

5.将发酵罐中酶液置入高温喷雾塔，快速喷雾干燥，进口160℃左右，出口80℃左右，制成固体酶制剂。

用下列方法测定酶制剂中各种酶的活性：

1.果胶酶活性的测定，测定方法为常规的DNS法，即3.5-二硝荃水杨酸定糖法，结果液体酶果胶酶活性达到水解果胶，产生半乳糖醛酸几千/μg/ml·min或固体酶，达到几万/μg/g。

2.木聚糖酶活性的测定，用肉汤-木聚糖平板法：将菌接种在此平板上，37℃培养24小时左右，观察结果透圈明显，证明产生木聚糖酶。

3.淀粉酶活性的测定，用上述第2方法进行测定，所不同的是底物改用可溶性淀粉，结果有明显透明圈，说明可产生淀粉酶。

4.蛋白酶活性的测定，用Tolin-酚法测定，结果蛋白酶活性达到水解酪素产芳香族氨基酸几佰μg/ml·min。另用上述第2方法测定，底物换为酪蛋白，结果有明显透明圈，证明产生蛋白酶。

5.纤维素酶测定：用滤纸崩溃法，结果滤纸未消失或变形，证明不产纤维素酶。

总之：测定结果证明枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）CGMCC NO.0213除不产纤维素酶外，可产生果胶酶（为主），并产生蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶。

果胶酶活性具体测法：0.4%进口柑桔果胶-Tris-HCl（PH7.0）0.1ml+酶液（或稀释过的酶液）0.1ml→50℃10分钟→加DNS0.2ml→50℃10分钟→加酒石酸钾钠3.6ml→用721分光光度计于575nm波长处比色测定OD值，对照用煮沸15分钟的死酶，其它条件相同。在标曲线上查出相应的半乳糖醛酸含量，或按下公式计算出果胶酶活性单位。

果胶酶活性X（μg/ml·min）＝[804.16065Y+23.495915]×Z

其中Y为OD值，Z为酶稀释倍数

可将菌种予先加热处理（80℃10分钟或65℃30分钟）或利用抗Sm^r特性，可纯化菌种，防止污染，在生产酶的过程中，未见污染现象，镜检或平板单菌落检查，都证明菌很纯、未污染杂菌。

本发明所选出的CGMCC NO.0213菌株，营养要求不高，在廉价的玉米粉-豆饼粉培养基上（内含少量无机盐）生长良好，产酶多，耐热，耐碱，产生芽孢并带有Sm^r遗传标记，适合高温喷雾干燥，工业化生产和有利于防治杂菌污染纯化菌种和长期保存。用它生产固体碱性果胶复合酶的工艺简单，周期短（3天），故生产率高，此复合酶耐热、耐碱、活性高，含果胶酶（为主），及蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶，但绝不含纤维素酶，适合麻类脱胶应用;上述固体果胶酶制剂，本身可防腐，不加任何防腐剂，也能耐贮藏，室温贮存一年，活性很稳定;而且运输和使用都方便，麻厂在现有件下便可使用，不必再投资，麻厂易接受;经几次生产规模试验，已证明残胶率、纤维强度等均可达国标，酶可重复利用，降低成本;酶作用条件温和，又偏碱和不含纤维素酶，对纤维损伤，故纤维强度和回收率高;与传统法比较，可省4-5道工序，耗能低，废水无污染，还可综合利用，再创效益。由于采用高浓度培养基进行发酵，菌生长好，酶产量高，回收率也高，还有利以后酶的重复使用和废水的再利用，降低成本。由于采用适当的C、N配比，PH不致于降低太多而影响菌的生长和酶的产量，也有利于酶的重复利用和废水的再利用。酶偏碱性对苎麻脱胶有好处。由于采用高温喷雾干燥法制成固体酶制剂，因干燥不加防腐剂仍能贮藏一年，且活性仍稳定，运输和使用均方便。由于选用产芽孢带有Sm^r遗传记号，菌株生产酶制剂，有利于菌种纯化，长期保存和防止杂菌污染。

实施例1：

1）将枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）CGMCC NO.0213接入试管肉汤斜面上，肉汤培养基成份及含量为牛肉膏1%，猪血蛋白胨1%，NaCl0.5%，琼脂为1.5-2%，PH7.0-7.2，15磅灭菌30分钟，37℃培养16-24小时;

2）转接到二个扁平肉汤斜面上，扩大培养，其培养基成份和含量均同步骤1，之后每瓶加入100ml肉汤作成菌悬液;

3）将菌液转接到种子罐中，种子罐为1吨罐，内装500kg培养基，培养基成份及含量为：玉米粉2%，豆食饼粉4%，MgSO₄·7H₂O0.02%，K₂HPO₄0.4%，（NH₄）₂SO₄0.4%，Na₂CO₃200g，KH₂PO₄0.03%，豆油适量，121-123℃灭菌40分钟，冷到37-40℃再接菌，PH在灭菌前调到9，灭菌后降到6.3，在37-40℃，不断搅拌和通氧达140（空气流量计上刻度数）的条件下培养12小时;

4）再转接到发酵罐中继续培养，发酵罐10吨罐，内装500kg培养基，培养基成份和含量为：玉米粉3%，豆饼粉4%，余下同步骤3，在37-40℃不断搅拌和通氧条件下培养28小时;

5）将酶液于高温喷雾塔，喷雾干燥制成固体酶制剂，酶回收率3-6%。

检测酶活力：（1）液体酶培养28小时达4969μg/ml·min

（2）固体酶活力为28000μg/g，为浅黄色

实施例2：

所有工艺步骤同实施1，用1吨罐内装500Kg

培养基成份：玉米粉2%，豆饼粉4%，其它无机盐同上，PH灭菌前为7.4，灭菌后为PH6，其结果37℃-40℃培养28小时，液体酶达4697.948μg/ml·min，经高温快速喷雾干燥制得固体酶制剂，回收率5%。

Claims

1、一种枯草芽孢杆菌，其特征在于该菌为枯草芽孢杆菌(B-acillus Subtilis CGMCC NO.0213；

2、一种固体碱性果胶酶生产工艺，其特征在于：将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）CGMCC NO.0213菌株接种到适当C.N比的玉米粉-豆饼粉培养基（内含少量无机盐）中，经培养、发酵，然后高温，快速喷雾干燥，制成固体碱性果胶酶;

3、按权利要求2所述的固体碱性果胶酶生产工艺，其特征在于具体工艺步骤如下：

1）将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株CGMCC NO.0213接入试管肉汤斜面上，肉汤培养基成份有牛肉膏、猪血蛋白胨、NaCl、琼脂、PH值为7.0-7.2、在高压灭菌锅（15磅）中灭菌30分钟，37℃条件下培养16-24小时;

2）转接到扁瓶斜面上37℃下培养16-24小时，培养基成分同上述步骤1.，之后加入一定量的肉汤，作成菌悬浮液;

3）转入种子罐中扩大培养，罐中培养基成份有一定碳、氮配比的玉米粉，豆饼粉和MgSO₄·7H₂O，KH₂PO₄，Na₂CO₃，K₂HPO₄，（NH₄）₂SO₄及适量豆油，121-123℃下灭菌40分钟，灭菌前PH为8-9，灭菌后PH降为6.5左右，37℃-40℃和不断搅拌通氧条件下，培养10-12小时;

4）再转接到发酵罐中，培养基成份和培养条件基本同上步骤3.但培养基浓度增大，培养时间24小时-28小时;

5）将发酵罐中酶液置入高温喷雾塔，快速喷雾干燥，进口160℃左右，出口80℃左右，制成固体酶制剂。