CN1113951A - 枯草芽孢杆菌及固体碱性果胶酶生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus
Subtilis)CGMCC No.0213以及用该菌,在高培养基
浓度、适当碳、氮比条件下培养、发酵然后高温快速喷
雾干燥,生产一种不含纤维素酶,以果胶酶为主,同时
含有蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶的复合固体酶工艺。
工艺简单,周期短,原料廉价、酶活性高,菌和酶无毒
性,耐热、耐碱,不加防腐剂便可贮藏,且活性稳定,运
输,使用皆方便,酶作用条件温和,可重复使用,废水
无污染,用于苎麻脱胶回收率高,麻纤维结实,可节省
4—5道工序,耗能低。
Description
本发明涉及一种芽孢杆菌(Bacillus),特别是枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)菌株的培养及用该菌生产固体碱性果胶酶生产工艺。通过分离、诱变、筛选出此菌株,然后在高浓度和适当C.N比的条件下,培养和发酵,再经高温喷雾干燥,生产出一种不含纤维素酶,而含果胶酶(为主),同时含蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶的复合固体酶制剂。
果胶酶作为脱胶剂广泛应用於纺织工业的苎麻脱胶,造纸工业及其它轻工业。用于苎麻脱胶方面主要有丹麦NOVO公司出品的苎麻酶(《苎麻纺织科技》第十二卷总五十三期)是一种棕色液体酶,由曲霉(属真菌)菌株产出的,一般含有果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶等的混合酶,偏酸性。国内也有厂家生产真菌酸性果胶酶制剂。但上述酶因含有纤维素酶;在酸性下易分解纤维,致使纤维强度和制成率降低,麻厂避而用之。中国湖南师范大学申请了中国专利CN85104284和CN85104285提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)A2-5,经工业发酵生产出果胶混合酶,这两项专利虽提到生产固体酶,但说明书中没有提供固体酶的生产工艺,也未谈到固体酶的应用,只谈到液体酶生产工艺和浓缩酶在呈强碱性时,再加入千分之一的苯甲酸盐可防腐保酶,最好保存半年,否则液体酶很快失去活性,少者几天,多者几个月就失活,一般液体酶较难保存。
本发明目的在于克服上述发明诸多不足,提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC NO.0213及用该菌株生产固体碱性果胶酶工艺方法,这种酶是一种不含纤维素酶,而含果胶酶(为主),同时含蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶的固体复合酶制剂。本发明工艺简单,周期短,原料廉价,酶活性高,菌和酶无毒性,耐热、耐碱、不加任何防腐剂也能贮存达一年,且活性稳定,固体酶运输和使用方便,酶作用条件温和,麻纤维强度和制成率高,又能重复利用,从而降低成本,与传统方法相比,可节省4-5道工序,耗能低,废水无污染,并可综合利用,麻厂在现有条件下便可用此酶进行麻脱胶,不必增加新投资。
本发明内容是用不产纤维素酶,营养条件要求不高,耐热、耐碱的枯草芽孢杆菌突变株、保藏号为CGMCC NO.0213,将其菌株接种到适当C.N比的玉米粉-豆饼粉培养基中(内含少量无机盐),经培养发酵,然后高温喷雾干燥制成固体碱性果胶酶,此酶活性高,耐热,耐碱,适于麻类脱胶生产、造纸及其它轻工业生产应用。其菌种枯草芽孢杆菌,是从麻土壤中分中离的,再经紫外线(UV)和亚硝基胍(NG)诱变、筛选出带有遗传记号链霉素抗性(Smr)的突变体,它主要产生碱性果胶酶,同时产生蛋白酶,淀粉酶和木聚糖酶。在肉汤平板上,菌落由灰白、薄、逐渐边变白,增厚,然后全白变厚,无同心园。最适生长条件:PH7-7.2,37℃;在有机或合成的无机培养基上均很好生长,营养要求不高;液体静止培养时,表面形成菌膜,下边培养基清亮;肉汤琼脂穿刺培养,只表面有菌苔,证明生长产生芽孢,耐热带有Smr遗传记号,有利菌纯化、防杂保存。此菌在玉米-豆饼粉培养基中通氧会生长更旺盛,本身不产气。
本发明所涉及的枯草芽孢杆菌菌株已於1994年5月6日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址:中国北京中关村),其分类命名及其保藏号为:枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CGMCC NO.0213.
用上述枯草芽孢杆菌菌株CGMCC NO.0213,生产固体碱性果胶酶工艺过程为:菌种→试管肉汤斜面→扁平大斜面→种子罐→发酵罐→高温快速喷雾干燥制成固体酶制剂→包装:
1.将上述枯草芽孢杆菌菌株CGMCC NO.0213接入试管肉汤斜面上,肉汤培养基成份有牛肉膏、猪血蛋白胨、NaCl、琼脂,PH值为7.0-7.2,在高压灭菌锅(15磅)中灭菌30分钟,37℃条件下培养16-24小时;
2.转接到扁瓶斜面上,37℃下培养16-24小时,培养基成份同上述步骤1.,之后加入一定量的肉汤,作成菌悬浮液;
3.转入种子罐中扩大培养,罐中培养基成份有一定碳、氮配比的玉米粉,豆饼粉和MgSO4·7H2O,KH2PO4,Na2CO3,K2HPO4,(NH4)2SO4及适量豆油,121-123℃下灭菌40分钟,灭菌前PH为8-9,灭菌后PH降为6.5左右,37℃-40℃和不断搅拌通氧条件下,培养10-12小时;
4.再转接到发酵罐中,培养基成份和培养条件基本同上步骤3.,但培养基浓度增大,培养时间24小时-28小时;
5.将发酵罐中酶液置入高温喷雾塔,快速喷雾干燥,进口160℃左右,出口80℃左右,制成固体酶制剂。
用下列方法测定酶制剂中各种酶的活性:
1.果胶酶活性的测定,测定方法为常规的DNS法,即3.5-二硝荃水杨酸定糖法,结果液体酶果胶酶活性达到水解果胶,产生半乳糖醛酸几千/μg/ml·min或固体酶,达到几万/μg/g。
2.木聚糖酶活性的测定,用肉汤-木聚糖平板法:将菌接种在此平板上,37℃培养24小时左右,观察结果透圈明显,证明产生木聚糖酶。
3.淀粉酶活性的测定,用上述第2方法进行测定,所不同的是底物改用可溶性淀粉,结果有明显透明圈,说明可产生淀粉酶。
4.蛋白酶活性的测定,用Tolin-酚法测定,结果蛋白酶活性达到水解酪素产芳香族氨基酸几佰μg/ml·min。另用上述第2方法测定,底物换为酪蛋白,结果有明显透明圈,证明产生蛋白酶。
5.纤维素酶测定:用滤纸崩溃法,结果滤纸未消失或变形,证明不产纤维素酶。
总之:测定结果证明枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC NO.0213除不产纤维素酶外,可产生果胶酶(为主),并产生蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶。
果胶酶活性具体测法:0.4%进口柑桔果胶-Tris-HCl(PH7.0)0.1ml+酶液(或稀释过的酶液)0.1ml→50℃10分钟→加DNS0.2ml→50℃10分钟→加酒石酸钾钠3.6ml→用721分光光度计于575nm波长处比色测定OD值,对照用煮沸15分钟的死酶,其它条件相同。在标曲线上查出相应的半乳糖醛酸含量,或按下公式计算出果胶酶活性单位。
果胶酶活性X(μg/ml·min)=[804.16065Y+23.495915]×Z
其中Y为OD值,Z为酶稀释倍数
可将菌种予先加热处理(80℃10分钟或65℃30分钟)或利用抗Smr特性,可纯化菌种,防止污染,在生产酶的过程中,未见污染现象,镜检或平板单菌落检查,都证明菌很纯、未污染杂菌。
本发明所选出的CGMCC NO.0213菌株,营养要求不高,在廉价的玉米粉-豆饼粉培养基上(内含少量无机盐)生长良好,产酶多,耐热,耐碱,产生芽孢并带有Smr遗传标记,适合高温喷雾干燥,工业化生产和有利于防治杂菌污染纯化菌种和长期保存。用它生产固体碱性果胶复合酶的工艺简单,周期短(3天),故生产率高,此复合酶耐热、耐碱、活性高,含果胶酶(为主),及蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶,但绝不含纤维素酶,适合麻类脱胶应用;上述固体果胶酶制剂,本身可防腐,不加任何防腐剂,也能耐贮藏,室温贮存一年,活性很稳定;而且运输和使用都方便,麻厂在现有件下便可使用,不必再投资,麻厂易接受;经几次生产规模试验,已证明残胶率、纤维强度等均可达国标,酶可重复利用,降低成本;酶作用条件温和,又偏碱和不含纤维素酶,对纤维损伤,故纤维强度和回收率高;与传统法比较,可省4-5道工序,耗能低,废水无污染,还可综合利用,再创效益。由于采用高浓度培养基进行发酵,菌生长好,酶产量高,回收率也高,还有利以后酶的重复使用和废水的再利用,降低成本。由于采用适当的C、N配比,PH不致于降低太多而影响菌的生长和酶的产量,也有利于酶的重复利用和废水的再利用。酶偏碱性对苎麻脱胶有好处。由于采用高温喷雾干燥法制成固体酶制剂,因干燥不加防腐剂仍能贮藏一年,且活性仍稳定,运输和使用均方便。由于选用产芽孢带有Smr遗传记号,菌株生产酶制剂,有利于菌种纯化,长期保存和防止杂菌污染。
实施例1:
1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC NO.0213接入试管肉汤斜面上,肉汤培养基成份及含量为牛肉膏1%,猪血蛋白胨1%,NaCl0.5%,琼脂为1.5-2%,PH7.0-7.2,15磅灭菌30分钟,37℃培养16-24小时;
2)转接到二个扁平肉汤斜面上,扩大培养,其培养基成份和含量均同步骤1,之后每瓶加入100ml肉汤作成菌悬液;
3)将菌液转接到种子罐中,种子罐为1吨罐,内装500kg培养基,培养基成份及含量为:玉米粉2%,豆食饼粉4%,MgSO4·7H2O0.02%,K2HPO40.4%,(NH4)2SO40.4%,Na2CO3200g,KH2PO40.03%,豆油适量,121-123℃灭菌40分钟,冷到37-40℃再接菌,PH在灭菌前调到9,灭菌后降到6.3,在37-40℃,不断搅拌和通氧达140(空气流量计上刻度数)的条件下培养12小时;
4)再转接到发酵罐中继续培养,发酵罐10吨罐,内装500kg培养基,培养基成份和含量为:玉米粉3%,豆饼粉4%,余下同步骤3,在37-40℃不断搅拌和通氧条件下培养28小时;
5)将酶液于高温喷雾塔,喷雾干燥制成固体酶制剂,酶回收率3-6%。
检测酶活力:(1)液体酶培养28小时达4969μg/ml·min
(2)固体酶活力为28000μg/g,为浅黄色
实施例2:
所有工艺步骤同实施1,用1吨罐内装500Kg
培养基成份:玉米粉2%,豆饼粉4%,其它无机盐同上,PH灭菌前为7.4,灭菌后为PH6,其结果37℃-40℃培养28小时,液体酶达4697.948μg/ml·min,经高温快速喷雾干燥制得固体酶制剂,回收率5%。
Claims (3)
1、一种枯草芽孢杆菌,其特征在于该菌为枯草芽孢杆菌(B-acillus Subtilis CGMCC NO.0213;
2、一种固体碱性果胶酶生产工艺,其特征在于:将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC NO.0213菌株接种到适当C.N比的玉米粉-豆饼粉培养基(内含少量无机盐)中,经培养、发酵,然后高温,快速喷雾干燥,制成固体碱性果胶酶;
3、按权利要求2所述的固体碱性果胶酶生产工艺,其特征在于具体工艺步骤如下:
1)将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株CGMCC NO.0213接入试管肉汤斜面上,肉汤培养基成份有牛肉膏、猪血蛋白胨、NaCl、琼脂、PH值为7.0-7.2、在高压灭菌锅(15磅)中灭菌30分钟,37℃条件下培养16-24小时;
2)转接到扁瓶斜面上37℃下培养16-24小时,培养基成分同上述步骤1.,之后加入一定量的肉汤,作成菌悬浮液;
3)转入种子罐中扩大培养,罐中培养基成份有一定碳、氮配比的玉米粉,豆饼粉和MgSO4·7H2O,KH2PO4,Na2CO3,K2HPO4,(NH4)2SO4及适量豆油,121-123℃下灭菌40分钟,灭菌前PH为8-9,灭菌后PH降为6.5左右,37℃-40℃和不断搅拌通氧条件下,培养10-12小时;
4)再转接到发酵罐中,培养基成份和培养条件基本同上步骤3.但培养基浓度增大,培养时间24小时-28小时;
5)将发酵罐中酶液置入高温喷雾塔,快速喷雾干燥,进口160℃左右,出口80℃左右,制成固体酶制剂。
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