CN111394434A - 一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用 - Google Patents
一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用,所述的试剂盒包含:CHO DNA Control,DNA Dilution Buffer,2x MaxDetect qPCR Mix,10x CHO Detection Mix;本发明还涉及上述试剂盒的用途和使用方法。试剂盒中包含制备标准曲线的DNA参考品CHO DNA Control,已溯源至国家标准品,利用Taqman探针定量PCR方法,能快速、特异地检测fg水平的CHO宿主细胞的DNA残留。本试剂盒适用于生物制药的中间产物到最终成品的不同样本类型,检测结果准确可靠,精密度高,可检测浓度范围为0.3ng/μL‑3fg/μL。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,具体地说,是一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用。
背景技术
TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针,其5’端携带荧光基团,如FAM、TET、VIC、HEX等,3’端携带淬灭基团,如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告基团和淬灭基团分离,从而荧光监测***可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
TaqMan探针法的开发
通过引入基于Taq DNA聚合酶5’-3’外切酶活性的荧光标记探针,实时定量PCR***得到了显著提升。这些荧光探针的使用,使得实时定量的方法得到了发展,实现了仅对特定扩增产物的检测,避免了普通荧光定量PCR染料会结合引物二聚体或非特异性扩增产物的假阳性。此外,荧光标记探针的开发,也免去了用于探针降解分析的PCR反应后处理过程。
TaqMan探针法的工作原理
TaqMan试剂通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。工作原理是:
1.构建一段寡核苷酸探针:5’端标记荧光染料报告基团,3’端标记淬灭染料基团。当探针保持完整时,淬灭基团的靠近会通过空间上的荧光共振能力转移(FRET)而显著降低由报告染料基团发射的荧光。
2.如果存在目标序列,探针便会在其中一个引物结合位点的下游发生退火,并随着引物的延伸通过Taq DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性,完成切除。
3.探针的切除会:
将报告染料基团和淬灭染料基团进行分离,增强报告染料基团的信号。
将探针从目的链上去除,使引物继续沿模板链末端延伸。因此,探针的介入并不会抑制整个PCR过程。
4.每经过一个循环,就会有更多的报告基团染料分子从各自的探针上切断,荧光强度会随着合成的扩增片段数量的增加而增加。
TaqMan探针法的优缺点
TaqMan方法的优点如下:
需要在探针和目标分子(靶点)之间发生特异性的水解(杂交),方可生成荧光信号
可使用明显不同的报告基因染料标记探针,在一个反应管内扩增并检测两个不同的序列,无需PCR后处理,减少分析工作量并节省材料成本。
TaqMan方法的主要缺点在于需要根据不同的序列,合成不同的探针。
使用TaqMan探针法的检测类型
用于RNA定量的一步法RT-PCR;
用于RNA定量的两步法RT-PCR;
DNA/cDNA定量;
等位基因检测;
通过IPC进行的正负检测。
TaqMan探针法的应用
TaqMan探针法荧光定量PCR适用于病原体检测,宿主核酸残留检测,疾病耐药基因研究,药物疗效考核,遗传疾病的诊断。新型的TaqMan-MGB探针还用于分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
由上可知,TaqMan探针法特异性好,准确度高,是一种极其灵敏的核酸检测方法。随着生物制药行业的蓬勃发展,为提高行业生产工艺的标准,TaqMan探针法荧光定量PCR被广泛的应用于CHO宿主细胞DNA残留的检测,加之进口试剂盒价格昂贵,国产试剂盒容易污染的现状,急需一款检测精度高,外源无干扰的试剂盒。
基于此,我们研发了这款TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒,能快速、特异、精确地检测低至fg水平的CHO宿主细胞的DNA残留,较国内同款产品有无外源干扰,精密度更高的优势。关于本发明一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用目前还未有相关报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足,提供一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的引物对。
本发明的第二个目的是针对现有技术的不足,提供一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的反应体系。
本发明的第三个目的是针对现有技术的不足,提供如上所述反应体系的用途。
本发明的第四个目的是针对现有技术的不足,提供一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的方法。
本发明的第五个目的是针对现有技术的不足,提供一种TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒。
本发明的第六个目的是针对现有技术的不足,提供如上所述试剂盒的使用方法。
为实现上述第一个目的,本发明采取的技术方案是:
一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的引物对,其特征在于,所述引物对为senseprimer:5’-GACAGGGTTTCTCTGTGTAG-3’(SEQ ID NO:1)所示的正向引物和anti primer:5’-CAGCACTCGGGAGGCAGA-3’(SEQ ID NO:2)所示的反向引物。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的反应体系,所述的反应体系为实时荧光定量PCR反应体系,包含权SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对和probe:5’-CTTTGGAGCCTATCCTG-3’(5'-FAM,3'-BHQ1)(SEQ ID NO:3)所示的探针。
为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:
如上所述的反应体系在制备CHO宿主细胞DNA残留检测的试剂盒中的应用。
优选地,所述的CHO宿主细胞DNA残留检测是适用于但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。
优选地,所述的CHO宿主细胞DNA残留检测是适用于以CHO为宿主细胞的生物制药工艺的中间产物到最终成品的不同样本类型。
为实现上述第四个目的,本发明采取的技术方案是:
一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的方法,所述的方法为:使用上述反应体系对待测样本提取DNA后进行实时荧光定量PCR,根据所获得的标准曲线,计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。
优选地,所述的待测样本可为但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。
优选地,所述的待测样本是以CHO为宿主细胞的生物制药工艺的中间产物到最终成品的不同样本类型。
为实现上述第五个目的,本发明采取的技术方案是:
一种TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒,所述的试剂盒包含CHO DNAControl,DNA Dilution Buffer,2x MaxDetect qPCR Mix,10x CHO Detection Mix;所述的DNA Dilution Buffer中含有NaN3;所述的10x CHO Detection Mix中含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对和SEQ ID NO:3所示的探针。
优选地,所述的CHO DNA Control浓度为30ng/μL,可溯源至国家标准品。
为实现上述第六个目的,本发明采取的技术方案是:
TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
a)样本通过前处理试剂盒提取DNA后,利用DNA Dilution Buffer稀释到合适浓度;
b)将CHO DNA Control利用DNA Dilution Buffer十倍梯度稀释,生成6个浓度的标准品:300pg/μL,30pg/μL,3pg/μL,300fg/μL,30fg/μL,3fg/μL;
c)根据要检测的数量配置PCR反应混合液,依次加入Negative Control(water),10x CHO Detection Mix,2x MaxDetect qPCR Mix,混匀后分装于用作荧光定量PCR的0.2mL的八连管或96孔板中;
d)将阴性对照,a)中稀释好的样本,b)中稀释好的标准品依次加入已分装的PCR反应混合液中,混匀后放入定量PCR仪进行检测;
e)根据检测结果绘制标准曲线,计算待测样本中含有的CHO宿主DNA的浓度。
优选地,所述的DNA Dilution Buffer中NaN3的含量比例是1/10000。
本发明优点在于:
本发明提供了一种TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒。该检测试剂盒设计的TaqMan探针及引物对可以特异性检测到CHO多位点的目的序列,且不会被亲缘关系较近的小鼠、大鼠基因组及人、大肠杆菌等生物制药工艺中常见的外源基因组干扰。在同类产品中,准确性好,精密度高,且专属性更好,无外源基因组干扰,可以为重组蛋白药物的生产提供可靠的质量检测数据,为重组蛋白药物的研发和安全生产提供重要支持。
附图说明
附图1是本发明的原理图。
附图2是实施例1中6个标准品的扩增曲线。
附图3是实施例1中6个标准品的标准曲线。
附图4是实施例1中CHO参考品与CHO参考品中分别混合了人、大肠杆菌、小鼠或大鼠的基因组污染后的检测对比结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
应用本发明的TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行CHO宿主细胞DNA残留检测的总体思路为:提取工艺流程中待测样本的DNA,稀释到合适的浓度范围,同时将CHO DNA Control参考品用DNA Dilution Buffer稀释为6个浓度梯度的标准品,将上述样品,标准品还有阴性对照利用试剂盒中已有的PCR反应试剂进行qPCR的检测,然后根据标准曲线计算待测样本中CHO宿主DNA的浓度。
实施例1效果实验
一、试剂准备
1)CHO DNA Control制备
首先使用天根生物的“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒”(DP304-02)提取CHO细胞的基因组。
然后将CHO DNA国家标准品(批号:270026-201101)和上述提取的CHO基因组稀释到CHO DNA Control所需浓度30ng/μL,并进一步稀释到6个制备标准曲线的标准品所需浓度梯度。通过qPCR运行后扩增曲线的Ct值将提取的CHO基因组与CHO DNA国家标准品对标,从而得到CHO DNA Control。
2)DNA Dilution Buffer制备
表1
试剂原液浓度 | 终浓度 |
2M Tris HCl(pH7.5) | 1mM |
1M EDTA | 0.1mM |
10%NaN<sub>3</sub> | 0.01% |
3)2x MaxDetect qPCRMix制备
即生工产品B532953 SGExcel GoldStar TaqMan qPCR预混液(含ROX)按包装规格分装即可。
4)10x CHO Detection Mix制备
表2
根据以上序列进行序列合成,并配制sense/anti primer及probe的终浓度为10μM,-20℃保存备用。
二、DNA样本准备
1)将待测样本用1xPBS稀释到合适浓度范围。
2)采用依科赛MaxExtract通用型宿主DNA残留样本前处理试剂盒(MB000-0011)抽提待测样本中的DNA。
三、梯度稀释CHO DNA Control制备标准品
对于CHO,需要准备6个稀释梯度的标准品:300pg/μL,30pg/μL,3pg/μL,300fg/μL,30fg/μL,3fg/μL。
1)标记7个低吸附的1.5mL离心管,标记为C0,C1,C2,C3,C4,C5,C6。C0为中间稀释过渡管,其余C1至C6依次对应以上6个稀释梯度的标准品。
2)以上7个离心管中均加入90μL DNA Dilution Buffer。
3)将CHO DNA Control(30ng/μL)从-20℃冰箱取出,轻微涡旋混匀后快速离心,使管盖和管壁的液体聚集到离心管底部。
4)取10μL CHO DNA Control加入C0管中,与已有的90μL DNA Dilution Buffer充分涡旋混匀,并快速离心所有液体到管底。
5)再按以下表格依次进行6次10倍梯度稀释,操作步骤同步骤4。
表3
管号 | 稀释方法 | 浓度 |
C0 | 10μL CHO DNA Control+90μL DNA Dilution Buffer | 3ng/μL |
C1 | 10μL C0+90μL DNA Dilution Buffer | 300pg/μL |
C2 | 10μL C1+90μL DNA Dilution Buffer | 30pg/μL |
C3 | 10μL C2+90μL DNA Dilution Buffer | 3pg/μL |
C4 | 10μL C3+90μL DNA Dilution Buffer | 300fg/μL |
C5 | 10μL C4+90μL DNA Dilution Buffer | 30fg/μL |
C6 | 10μL C5+90μL DNA Dilution Buffer | 3fg/μL |
四、PCR反应混合液的准备
1)首先确定要检测的样本数量和对照数量。
2)将所需试剂在室温完全解冻后,混匀并快速离心。
3)按以下表格里的试剂和对应体积准备一个PCR反应混合液。
表4
试剂 | 1个30μL反应中所需体积 |
Negative Control(water) | 2μL |
10x CHO Detection Mix | 3μL |
2x Max Detect qPCR Mix | 15μL |
Total | 20μL |
五、准备标准曲线和样本测试
1)根据标准品和样本数量,计算反应所需孔数,一般一个模板三个复孔(首次测定标准曲线时,不可只做一个复孔)。
反应孔数=(6个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性质控NEG+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数)*3
NTC=No Template Control(DNA稀释液DNA Dilution Buffer或阴性对照water)
NEG=Negative Extraction Control(样本基质溶液或PBS与待测样本一起进行样本前处理,所得纯化液为NEG)
TS=Test Sample(待测样本)
ERC=Extraction Recovery Control(待测样本中加入如30pg CHO标准品DNA后与同批待测样本一起进行样本前处理,所得纯化液为加标回收ERC)。
2)如下示例96孔板排版
表5
3)每孔加入20μLPCR反应混合液。
4)加入10μL上述模板DNA到对应孔。
5)盖好管盖或封好96孔板的封口膜后,混匀并快速离心后上机检测。
六、定量PCR程序设置及上机
以下操作步骤为Agilentent Technologies公司Stratagenes Mx3000P,软件为MxPro:
1)打开软件。
2)点击Setup,首先选择Plate Setup按钮在96孔面板上设定排版。
3)选择报告荧光基团为FAM,淬灭荧光基团为none(Applied Biosystems7500qPCR仪检测参比荧光为ROX)。
4)然后选择Thermal Profile Setup按钮设定PCR的循环程序。
5)点击RUN进行定量PCR测定。
七、定量PCR数据分析
以下操作步骤为Agilent Technologies公司Stratagene Mx3000P,软件为MxPro:
1)点击Analyze,在Results的Amplification Plot面板中,此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2)点击Setup,在Plate Setup面板中,将标准曲线孔的Well type一栏设置为Standard,并且在Standard Quantity一栏分别赋值为3000、300、30、3、0.3、0.03(含义为每孔的DNA总量,单位为pg),并且在相应的Show Well Names一栏中命名为C1,C2,C3,C4,C5,C6。
3)在Plate Setup面板中,将无模板对照NTC孔的Well type一栏设置为NTC,将阴性质控NEG孔、待测样本孔、样本ERC孔的Well type一栏设置为Unknow,并且在相应的ShowWell Names一栏中命名为NTC、NEG、TS、ERC。
4)点击Analyze,在Results的Standard Curve面板中,可读取标准曲线的R2、斜率(Slope)、截距(Intercept)和扩增效率(Efficiency)。
5)在Results的Text Report面板中,Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NEG、待测样本、样本ERC的检测值,单位为pg/10μL。后续可在检测报告中将单位换算为pg/μL或pg/mL。
八、实验结果
如图2所示为6个标准品的扩增曲线,图中显示扩增曲线有明显的指数增长期,每个浓度的扩增曲线均匀叠和在一起,表明本方法重复性好。
如图3所示为6个标准品的标准曲线,图中显示标准曲线线性良好,检测灵敏度可达到3.0fg/μl。标准曲线方程为Y=-3.469*log(X)+27.93,R2=1.000,扩增效率Eff.=94.2%。
如图4所示为CHO参考品与CHO参考品中分别混合了人、大肠杆菌、小鼠或大鼠的基因组污染后的检测对比结果,从图4可以看到,加入人、大肠杆菌、小鼠或大鼠的基因组与未加其他种类的基因组DNA的标准曲线高度重合,说明了引物和探针不会在其他物种的基因组DNA发生非特异性反应,说明本实验所设计的引物和探针具有高度的特异性,专属性较好。
九、结论
(1)本发明设计的试剂盒,每个Q-PCR反应管中都设置了内控试剂,保证所有的反应管中的PCR扩增效率的一致性,提高结果的可信度。
(2)参考品的标准曲线线性良好,检测灵敏度可达到3.0fg/μl。
(3)在专属性实验中,掺入人、大肠杆菌、小鼠或大鼠的基因组DNA均不会产生非特异性扩增,所以,本方法的专属性很好,能特异性的检测CHO细胞基因组DNA。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 依科赛生物科技(太仓)有限公司
<120> 一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctttggagcc tatcctg 17
Claims (10)
1.一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的引物对,其特征在于,所述引物对为SEQ IDNO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。
2.一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的反应体系,其特征在于,所述的反应体系为实时荧光定量PCR反应体系,包含权利要求1所述的引物对和SEQ ID NO:3所示的探针。
3.权利要求2所述的反应体系在制备CHO宿主细胞DNA残留检测的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的CHO宿主细胞DNA残留检测是适用于但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。
5.一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的方法,其特征在于,所述的方法为:使用权利要求2所述的反应体系对待测样本提取DNA后进行实时荧光定量PCR,根据所获得的标准曲线,计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的待测样本可为但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。
7.一种TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包含CHO DNAControl,DNADilution Buffer,2x MaxDetect qPCR Mix,10x CHO DetectionMix;所述的DNADilution Buffer中含有NaN3;所述的10x CHO Detection Mix中含有权利要求1所述的引物对和SEQ ID NO:3所示的探针。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述的CHO DNAControl浓度为30ng/μL。
9.权利要求7所述的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
a)样本通过前处理试剂盒提取DNA后,利用DNADilution Buffer稀释到合适浓度;
b)将CHO DNA Control利用DNADilution Buffer十倍梯度稀释,生成6个浓度的标准品:300pg/μL,30pg/μL,3pg/μL,300fg/μL,30fg/μL,3fg/μL;
c)根据要检测的数量配置PCR反应混合液,依次加入Negative Control(water),10xCHO Detection Mix,2x MaxDetect qPCR Mix,混匀后分装于用作荧光定量PCR的0.2mL的八连管或96孔板中;
d)将阴性对照,a)中稀释好的样本,b)中稀释好的标准品依次加入已分装的PCR反应混合液中,混匀后放入定量PCR仪进行检测;
e)根据检测结果绘制标准曲线,计算待测样本中含有的CHO宿主DNA的浓度。
10.根据权利要求9所述的使用方法,其特征在于,所述的DNADilution Buffer中NaN3的含量比例是1/10000。
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