CN111394279A - 一种纤维单胞菌及其制备微生物絮凝剂的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纤维单胞菌及利用纤维单胞菌制备微生物絮凝剂的方法和应用，本发明解决现有微生物絮凝剂生产成本高，絮凝后易产生二次污染等问题，新发现菌株40‑2的分类命名为家畜纤维单胞菌(Cellulomonaslivestock sp.)40‑2，家畜纤维单胞菌40‑2已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1.17732。本发明优点如下：1、发现一个纤维单胞菌的新种—家畜纤维单胞菌2、利用家畜纤维单胞菌制备的微生物絮凝剂絮凝性能良好；3、所产微生物絮凝剂高效、安全、无毒且不产生二次污染；4、所产微生物絮凝剂发酵时间短，投加量低，节约成本。此外，本发明涉及微生物絮凝剂在处理家畜养殖场废水方面具有较大的应用潜力和良好的应用前景。

Description

一种纤维单胞菌及其制备微生物絮凝剂的方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种纤维单胞菌及其制备微生物絮凝剂的方法和应用。
背景技术
传统的絮凝剂虽然在絮凝性能、经济成本等方面有很多的优势，但很容易造成二次污染且在安全方面有着很大隐患。例如：传统的絮凝剂虽然在絮凝性能、经济成本等方面有很多的优势，铝盐类的絮凝剂广泛使用在农林业中，导致植物出现铝害的现象，严重威胁到植物的正常生长，与此同时这些农作物进入人体，能够影响人体的健康。医学上常出现的病情有铝性脑病、骨病以及贫血等病症，其中老年人的痴呆症状就是脑病的一种；铁盐类的絮凝剂对金属有腐蚀性，铁的浓度过高时会对人体健康产生危害，也会对生态环境产生不好的影响；虽有机高分子絮凝剂已被较为普遍的应用，但丙烯酞胺具有严重的神经毒性和致癌性，所以对它的使用作出了一定的限制。
众所周知，污水处理***的处理效率一方面是由功能微生物的代谢效率决定，絮凝则是一种广泛应用于实现水处理***泥水分离、降低出水浊度的重要处理手段，其通过增加处理***中微生物菌团的比重来提高污泥的沉降效率，有效的降低出水浊度。絮凝过程通常借助于絮凝剂来实现，絮凝剂是一类可以使液体中的胶体和悬浮颗粒絮凝成较大的絮凝体沉淀或者上浮的物质，其剂主要分为无机絮凝剂、有机絮凝剂和微生物絮凝剂。其中，微生物絮凝剂是由微生物产生的有絮凝活性的高分子代谢产物，成分有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA等，其利用微生物技术，通过细菌、真菌等微生物发酵、提取、精制而得到，具有可生物分解、安全性高、无毒且无二次污染等的优点，能够克服常规的无机絮凝剂及有机絮凝剂的处理缺陷。我国对微生物絮凝剂及其产生菌的开始研究起步相对来说比较落后，发现和研制出的生物絮凝剂的数量和种类也要比国外学者研究出来的少的多。目前，我国在微生物絮凝剂的工业化生产过程中普遍存在絮凝性能不稳定、生产成本过高等问题，所以对于高产量、性能优良的生产絮凝剂菌株的缺乏依然是限制我国微生物絮凝剂产业化进程的主要元素。因此，制备一种生产成本低、絮凝性能稳定，不产生二次污染的微生物絮凝剂是十分有必要的。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种纤维单胞菌及其制备微生物絮凝剂的方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种纤维单胞菌，所述纤维单胞菌的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.17732。
一种制备微生物絮凝剂的方法，包括如下步骤：
步骤一、培养纤维单胞菌，纤维单胞菌的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.17732；
步骤二、将纤维单胞菌发酵培养，然后破碎纤维单胞菌的细胞壁得到的破碎液即微生物絮凝剂。
进一步的改进，所述步骤一包括如下步骤：
1.1)将纤维单胞菌平板菌落接种到液体种子培养基中培养得到菌株种子液；
1.2)菌株种子液接种到种子发酵培养基中培养发酵，得到发酵液。
进一步的改进，所述液体种子培养基为LB液体培养基，LB液体培养基包括酵母粉5重量份，蛋白胨10重量份，NaCl 5重量份，蒸馏水1000重量份， pH7.0-8.0，并经121℃灭菌30min得到；
所述种子发酵培养基包括CMC-Na 10重量份，KH2PO4 1重量份，K2HPO4 1重量份，MgSO40.2重量份，(NH4)2SO4 3重量份，NaCl 1重量份，蒸馏水1000重量份，pH7.0-8.0，并经121℃灭菌30min得到。
进一步的改进，菌株种子液制备方法如下：将纤维单胞菌平板菌落接种到液体种子培养基中，36-37℃，155r/min震荡培养24h，得到菌株种子液；
菌株种子液接种到种子发酵培养基中36-37℃条发酵48h制得发酵液，其中菌株种子液与发酵培养基的体积比为2:98。
进一步的改进，所述步骤二中，发酵液在8000r/min下离心5min，弃去上清液，保留菌体沉淀，沉淀用0.1M PBS溶解清洗两次，8000r/min离心5min，再将沉淀菌体用PBS溶液重悬，重悬时菌体与PBS溶液的质量体积比为0.1g/ml pH值为7.4，超声破碎处理后得到的破碎液即为微生物絮凝剂。
进一步的改进，所述纤维单胞菌40-2的16SrRNA含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
一种上述制备微生物絮凝剂的方法制得的微生物絮凝剂，其特征在于，所述微生物絮凝剂用于处理家畜养殖场废水。
进一步的改进，所述家畜养殖场废水为养猪场废水。。
本发明具有以下优点：
1、微生物絮凝剂无毒性，无二次污染。
2、利用纤维单胞菌制备的微生物絮凝剂絮凝性能良好。
3、发酵时间短，投加量低，节约成本。
4、操作过程简单。
因此本发明涉及微生物絮凝剂在处理家畜养殖场废水方面具有较大的应用潜力和良好的应用前景。
附图说明
图1是家畜纤维单胞菌40-2菌落形态图。
图2是家畜纤维单胞菌40-2革兰氏染色镜检图。
图3是家畜纤维单胞菌40-2扫描电镜图谱。
图4是家畜纤维单胞菌40-2MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱。
图5是家畜纤维单胞菌40-2 16s rRNA扩增图谱。
图6家畜纤维单胞菌40-2菌株构建***进化树。
图7家畜纤维单胞菌40-2极性脂图谱。
图8本发明微生物絮凝剂处理含有4g/L高岭土的絮凝效果图(自左向右依次为对照未处理、家畜纤维单胞菌40-2发酵液、发酵上清液、发酵破壁液)。
图9为本发明微生物絮凝剂处理含有猪粪水的絮凝效果图(左猪粪水原液，右为家畜纤维单胞菌40-2破壁液处理猪粪水的絮凝效果)。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是：下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规的实验方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的；下述实施例中所涉及的各实验均设置三次重复，结果取平均值。
本发明一方面提供一种纤维单胞菌40-2(家畜纤维单胞菌(Cellulomonas livestocksp.))，于2019年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路，保藏编号为 CGMCC No.1.17732。
具体地，本发明的菌株40-2的16S rRNA的核苷酸序列具有序列表所示的序列。序列的长度为1377bp，在GenBank中基因序列登录号为MN 596022。
更具体地，本发明所提供的菌株40-2是从东北牛羊养殖主产区和屠宰加工区环境中采集大量动物毛发、粪便、血液样品中分离出来的。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1：
菌株40-2的分离及鉴定
1、菌株40-2的分离及纯化
本实施例所用的样品采自动物毛发、粪便、血液，纤维单胞菌40-2的筛选采用平板划线法，其中液体培养条件为温度37℃、摇床转速为155rpm，固体平板培养条件为生化培养箱37℃培养。具体的分离及纯化按如下步骤进行：
1)菌株的富集、分离和纯化：在无菌条件下，取1.0g样品放入装有5mL富集培养基的10mL塑料离心管中，37℃培养24h。取培养液划线于LB固体培养基表面，37℃培养48h。挑取表面光滑黏稠的黄色单菌落，多次平板划线纯化后，用磁珠菌株保存管-80℃保存。
具体地，上述步骤所涉及的培养基的构成分别为：
LB液体培养基的构成(每升)：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl5g；
LB固体培养基的构成(每升)：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂18g。
更具体地，本实施例的培养基在使用之前均进行灭菌处理，灭菌条件为：高压蒸汽灭菌锅、121℃灭菌30min；并且，本实施例的上述的取样、接种及稀释过程均在无菌环境下进行。
2)菌株40-2的鉴定
挑取单个纯菌落进行革兰氏染色，使用德国布鲁克Bruker基质辅助激光解析飞行时间质谱仪MALDI-TOF MS进行细菌种类鉴定，菌种的生理生化试验采用API 20E、API 20NE细菌鉴定试剂盒和GP革兰氏阳性菌鉴定卡进行鉴定。细菌基因组之间平均核苷酸同源性(ANI)和基因组杂交已经是公认的界定细菌种的黄金标准。因此菌种的种级别鉴定采用与纤维单胞菌40-2亲缘关系最近的细菌基因组做DNA-DNA杂交鉴定。同时检测菌株40-2细胞脂肪酸、细胞极性脂组分、细胞壁氨基酸组份和糖组分，以鉴定菌株40-2是否为新种。
本实施例的菌株40-2为革兰氏阳性菌，菌落呈浅黄色，圆形，不黏稠，表面湿润且光滑、半透明，边缘整齐、中间凸起，直径为1-2mm。菌体程短杆状，菌体两端钝圆，单个或成对排列，无荚膜和芽胞，如图1，2，3所示。
提取纤维单胞菌40-2的DNA，以其为模板，以16S rRNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，测定其全序列。将所测得的16S rDNA基因序列上传至Genbank数据库,利用BLAST进行序列同源性比对，上传序列与标准菌株进行相似性比较.采用ClustalX软件进行多序列比对,利用MEGA10.0软件, 采用邻接法(neighbor-joining method)构建***发育树,通过自举分析 (bootstrap)1 000次,检测置信度。
将菌株40-2和Cellulomonas denverensis W6929进行全基因组测序。在 IlluminaHiseq 2000platform工作平台上，获得1Gbp清晰数据(测序深度达 200x)；所获取的数据用SPAdes v 3.8.1with the default settings组装(默认的设置)，大于1kb的contigs用于进一步分析。菌株40-2和Cellulomonas denverensis W6929 之间DNA同源性通过DSMZ线上服务获得。基因组之间平均核苷酸同源性(ANI) 通过EzBiocloud线上服务获得。DNA-DNA杂交率(dDDH)和基因组间平均核苷酸同源性(ANI)是鉴定菌株是否为新品种唯一“金标准”。
细胞极性脂组分测定：采用氯仿-甲醇抽滤法抽提总脂成分，参考英国Minnikin 等(1977)使用薄板双相层析方法鉴定极性脂成分。极性脂样品制备：1)100mg 干菌体，悬浮于9.5ml氯仿：甲醇：0.3％NaCl(2.5:5:2)。2)水浴80℃，15min，冷却后，滤纸过滤至50ml离心管中，加入2.5ml氯仿和2.5ml 0.3％NaCl，4000rpm 离心5min，取下层。小心分取下层氯仿相至干净的旋转蒸发仪专用烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压旋转蒸发除去氯仿(水浴温度不超过40℃)。若样品中有少量水，滴入少量苯再减压旋转蒸发至获得干燥的总脂样品。3)收集有机相，旋转蒸发后，溶于250有机氯仿-甲醇(2:1，v/v)，4℃冰箱保存备用。
极性脂的TLC检测：1)TLC薄板的活化：将10cm：将。转蒸发的硅胶板(Merck 公司，25TLCaluminium sheets 20cme20cm Silica gel 60F254)在110℃烘箱活化 1h，取出，冷却。2)点样和展层：用10和展移液器吸取2液器总脂样品点于TLC 板上，重复点3次。采用两个密闭层析缸，首先TLC板置于第一个层析缸内展层，第一向展层剂为氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4，v/v)，溶媒展至顶部后取出薄板吹干。再将薄板放入第二个层析缸，第二向展层剂为氯仿∶甲醇∶乙酸∶水 (80∶12∶15∶4，v/v)，按与第一向垂直的方向上行，溶媒展至顶部，取出薄板吹干备用。3)薄板显色：检测全脂：磷钼酸显色剂喷洒至TLC板完全湿润， 100℃加热5-8min，待清晰斑点显出，立即在扫描仪上扫描TLC板，记录结果。细胞壁氨基酸组份测定一、纯细胞壁的制备方法：1)取湿菌体1.5g或冻干菌体0.3g。2)菌体悬浮在10-20mL纯水中，加入1g玻璃珠(直径为0.11-0.12 mm)，180w超声波破碎细胞，30min。3)5000r/min离心30min，去掉未裂解细胞，取上清液。4)上清液在18000r/min离心30min，取下层沉淀。5)将沉淀悬浮在4％SDS溶液中，100℃加热40min，冷却到室温。6)在室温下，将悬浮液18000r/min离心30min，取下层沉淀，悬浮在100℃热水中摇晃20min，冷却到室温，18000r/min离心30min。7)重复步骤6两次，将沉淀进行冷冻干燥，即为菌体细胞的肽聚糖成分。二、细胞壁中氨基酸组分的检测将2-5mg纯细胞壁样品放入安培管中，加入0.2mL 4N HCl用喷灯封口后置于烘箱，120℃水解 16小时，使用Merck公司TLC纤维素层析板(10x20cm)分析水解的纯细胞壁中氨基酸组分；层析***：甲醇：吡啶：冰乙酸：水＝10：1：0.25：5；上层法 2次层析，风干，用0.4％茚三酮显色，层析板放置121℃烤箱中加热3-5分钟，观察结果。扫描记录结果。
细胞壁中糖组分测定：一、纯细胞壁的制备方法：1)取湿菌体1.5g或冻干菌体 0.3g。2)菌体悬浮在10-20mL纯水中，加入1g玻璃珠(直径为0.11-0.12mm)， 180w超声波破碎细胞，30min。3)00r/min离心30min，去掉未裂解细胞，取上清液。4)液在18000r/min离心30min，取下层沉淀。5)淀悬浮在4％SDS 溶液中，100℃加热40min，冷却到室温。6)温下，将悬浮液18000r/min离心 30min，取下层沉淀，悬浮在100℃热水中摇晃20min，冷却到室温，18000r/min 离心30min。7)步骤6两次，将沉淀进行冷冻干燥，即为菌体的肽聚糖成分。二、细胞壁中糖组分的检测：1)取纯化的细胞壁样品，用1N硫酸(1ml),在密封的安培管中水解2h。2)待冷却后，逐滴加入饱和氢氧化钡，使pH达到5.5,离心除去沉淀，真空抽干。3)加入0.2ml氢氧化氨溶液和0.2ml 10％硼氢化钠移于8ml螺口玻璃管中，拧紧螺盖，37℃水浴60分钟，待样品管冷却后，加入0.3ml 甲基咪唑溶液和2ml乙酸酐溶液拧紧螺盖，室温反应15分钟。4)加入5ml去离子水，再加入1ml二氯甲烷溶液,快速振荡5分钟左右，弃去上层水相，取下层有机相置气相色谱样品瓶中备用。5)气相色谱分析：采用HP6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器(FID)及HP气相色谱化学工作站(HP CHEMSTATION ver A 6.0)；色谱柱为UItra-2柱，长25m,内径0.2mm，液膜厚度0.33μm；载气为氢气，分流进样模式，分流比100：1，进样量2μl；检测器温度300℃，氢气流速30ml/min，空气流速400ml/min，补充气(氮气)流速30ml/min。6)用1％标准糖液(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、***糖、木糖、核糖、鼠李糖)，按上述操作，制备各个标准糖的乙酸酯衍生物，进行气相色谱分析，作为标准。根据糖标准品的出峰值(RT)确定样品中各种单糖的组分，记录结果。
结果表明，纤维单胞菌40-2的16S rDNA基因序列见序列表，序列长度为 1377bp，在GenBank中基因序列的登录号为MN 596022。菌株40-2与 Cellulomonas denverensisW6929的序列相似度达到99.13％，跟Cellulomonas pakistanensis strain NCCP-11和Cellulomonas hominis strain CE40的序列相似度达到98.4％和98.1％。菌株40-2和Cellulomonas denverensis W6929dDDH值是 29％，远低于细菌种界定的dDDH标准70％，ANI值是85.33％，远低于细菌种界定的ANI标准95-96％。菌株40-2极性脂包括：二磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、甘露糖苷磷脂酰肌醇(PIM)、两个未知的磷脂(PL)和一个未知的糖脂(GL)(见附图7)。菌株40-2细胞脂肪酸测定结果见表1。菌株40-2细胞壁中含有特征性氨基酸为鸟氨酸(Orn)，以及丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和谷氨酸(Glu)。菌株40-2细胞壁糖类包括葡萄糖、鼠李糖半乳糖和甘露糖。
表1
脂肪酸名称(English) 脂肪酸名称(中文) 百分含量(％)
C14:0 十四碳饱和脂肪酸 1.87
C15:1anteiso A A-型反异式十五碳单不饱和脂肪酸 5.52
C15:0iso 异式十五碳饱和脂肪酸 4.30
C15:0anteiso 反异式十五碳饱和脂肪酸 54.58
C16:0iso 异式十六碳饱和脂肪酸 4.73
C16:0 十六碳饱和脂肪酸 10.89
C17:0anteiso 反异式十七碳饱和脂肪酸 11.12
C18:1w9c W9c－十八碳单不饱和脂肪酸 1.04
因此，结合以上鉴定结果和分析，判定菌株40-2属于纤维单胞菌(Cellulomonas)的一个新种，并将其命名为家畜纤维单胞菌(Cellulomonas livestock sp.)40-2。见图5，6，7。
实施例2：
纤维单胞菌40-2菌株产生的微生物絮凝剂的制备工艺
纤维单胞菌40-2接种至发酵培养基，培养温度37℃，155rpm摇床培育 48h，得到含所述微生物絮凝剂的发酵液，经过8000rpm离心5min，弃去上清液，保留菌体沉淀，沉淀用PBS溶解重悬清洗两次，8000r/min离心5min，再将沉淀菌体用PBS溶液重悬后细胞超声破碎仪超声破碎，半个小时后得到的破碎液即为微生物絮凝剂。
具体地，在本实施例中，所涉及的发酵培养基的构成为(每升)：CMC-Na 10g， KH2PO41g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.2g，(NH4)2SO4 3g，NaCl1g蒸馏水1000mL，pH7.0-8.0， 121℃灭菌30min；
实施例3：
纤维单胞菌40-2菌株产生的絮凝活性分布研究
制备高岭土悬浊液(4g/L)作为模拟废水测试微生物絮凝剂的絮凝性能。具体方法为：将100mL高岭土悬浊液(4g/L)置于150mL烧杯中，加入1mL微生物絮凝剂，常温下快速搅拌1min，慢速搅拌2min,静止10min后，取中间高度的液体样本，在分光光度计的550nm波长下测定其吸光度，用蒸馏水取代微生物絮凝剂作为对照组。
絮凝率计算公式为：絮凝率＝(A﹣B)/A×100％其中，A为对照组在550nm 处的吸光度，B为实验组在550nm处的吸光度。氯化钙是微生物絮凝剂常用的助凝剂，使用10％CaCl2 1mL作为助凝剂，与微生物絮凝剂一同加入高岭土悬浊液，测定微生物絮凝剂的絮凝效果。
具体地，本实施例采用絮凝活性分布实验来分析纤维单胞菌40-2所产生的不同活性物质的絮凝能力，实验同时探讨了纤维单胞菌40-2在发酵培养基培养条件下，絮凝活性物质：发酵原液、发酵液离心后上清液以及发酵液经离心菌悬液经破壁后的破碎液，这三者的絮凝能力。
结果如图7所示，纤维单胞菌40-2发酵液絮凝率为48.51％，上清液絮凝率为44.21％，菌体破碎液的絮凝率达到99.40％，说明起到絮凝作用的物质都在细胞壁中，经超声破壁后释放出来。
实施例4：
研究本发明制得的微生物絮凝剂的最佳絮凝条件：分别采用不同絮凝剂投加量、絮凝体系pH值、阳离子助凝剂添加量、静沉时间测定微生物絮凝剂粗品对高岭土悬浊液的絮凝率。
结果表明最佳絮凝条件为：絮凝剂用量1mL/100mL、絮凝体系pH7.0、助凝剂10％的CaCl2用量1mL/100mL、静沉时间15min。
实施例5：
研究本发明制得的微生物絮凝剂在处理猪养殖场废水中的应用：
取二个透明玻璃瓶，分别加入150mL猪场粪水水样和1.5mL10％的CaCl2溶液，然后投入10mL纤维单胞菌40-2菌体破壁液，震荡混匀，静置沉降1h测定废水的絮凝率、COD值和氨氮浓度。
结果表明，猪场粪水水样的微生物絮凝率为96.07％，COD值由152mg/L下降到44mg/L，COD去除率达71.05％。氨氮浓度由135.25mg/L下降到110.61mg/L，氨氮去除率达18.22％。如图8所示。由此证明本发明制得的生物絮凝剂在处理猪养殖场废水方面有良好的应用效果。综上所述，本发明提供的微生物絮凝剂是一种性能良好的水处理絮凝剂，在处理猪养殖场废水方面具有潜在应用价值。
以上仅为本发明的具体实施实例，并不限定本发明的范围，在本发明的构思和原则之内所做的任何修改、同等替换和改进等，都属于本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 盘锦检验检测中心 吉林大学
<120> 一种纤维单胞菌及其制备微生物絮凝剂的方法和应用
<130> 2020.02.22
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1377
<212> DNA
<213> Cellulomonas sp.
<400> 1
tgcagtcgaa cggtgaagcc cagcttgctg ggtggatcag tggcgaacgg gtgagtaaca 60
cgtgagtaac ctgcctctga ctctgggata agccttggaa acggggtcta atactggata 120
cgagacgctc gggcatccga agtgtctgga aagatttatc ggtcagagat ggactcgcgg 180
cctatcagct tgttggtggg gtaatggcct accaaggcga cgacgggtag ccggcctgag 240
agggcgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg 300
gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcgacg ccgcgtgagg gatgacggcc 360
ttcgggttgt aaacctcttt cagcagggaa gaagcgaaag tgacggtacc tgcagaagaa 420
gcgccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggcgcaagc gttgtccgga 480
attattgggc gtaaagagct cgtaggcggt ttgtcgcgtc tggtgtgaaa actcaaggct 540
caaccttgag cttgcatcgg gtacgggcag actagagtgc ggtaggggag actggaattc 600
ctggtgtagc ggtggaatgc gcagatatca ggaggaacac cgatggcgaa ggcaggtctc 660
tgggccgcaa ctgacgctga ggagcgaaag catggggagc gaacaggatt agataccctg 720
gtagtccatg ccgtaaacgt tgggcactag gtgtggggct cattccacga gttccgtgcc 780
gcagcaaacg cattaagtgc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaaga 840
aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgcggatt aattcgatgc aacgcgaaga 900
accttaccaa ggcttgacat acaccggaaa cttccagaga tggttgcccc gcaaggtcgg 960
tgtacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1020
aacgagcgca accctcgtcc tatgttgcca gcgggttatg ccggggactc ataggagact 1080
gccggggtca actcggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgtctt 1140
gggcttcacg catgctacaa tggccggtac aaagggctgc gataccgcga ggtggagcga 1200
atcccaaaaa gccggtctca gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga 1260
gtcgctagta atcgcagatc agcaacgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1320
ccgcccgtca agtcacgaaa gtcggtaaca cccgaagccg gtggcccaac ccttgtg 1377

Claims (9)

1.一种纤维单胞菌，其特征在于，所述纤维单胞菌的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.17732。
2.一种制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、培养纤维单胞菌，纤维单胞菌的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.17732；
步骤二、将纤维单胞菌发酵培养，然后破碎纤维单胞菌的细胞壁得到的破碎液即微生物絮凝剂。
3.如权利要求2所述的制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于，所述步骤一包括如下步骤：
1.1)将纤维单胞菌平板菌落接种到液体种子培养基中培养得到菌株种子液；
1.2)菌株种子液接种到种子发酵培养基中培养发酵，得到发酵液。
4.如权利要求3所述的制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于，所述液体种子培养基为LB液体培养基，LB液体培养基包括酵母粉5重量份蛋白胨10重量份，NaCl 5重量份，蒸馏水1000重量份，pH7.0-8.0，并经121℃灭菌30min得到；
所述种子发酵培养基包括CMC-Na 10重量份，KH2PO4 1重量份，K2HPO4 1重量份，MgSO40.2重量份，(NH4)2SO4 3重量份，NaCl 1重量份，蒸馏水1000重量份，pH7.0-8.0，并经121℃灭菌30min得到。
5.如权利要求4所述的制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于，菌株种子液制备方法如下：将纤维单胞菌平板菌落接种到液体种子培养基中，36-37℃，155r/min震荡培养24h，得到菌株种子液；
菌株种子液接种到种子发酵培养基中36-37℃条发酵48h制得发酵液，其中菌株种子液与发酵培养基的体积比为2:98。
6.如权利要求5所述的制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于，所述步骤二中，发酵液在8000r/min下离心5min，弃去上清液，保留菌体沉淀，沉淀用0.1M PBS溶解清洗两次，8000r/min离心5min，再将沉淀菌体用PBS溶液重悬，重悬时菌体与PBS溶液的质量体积比为0.1g/mlpH值为7.4，超声破碎处理后得到的破碎液即为微生物絮凝剂。
7.如权利要求2所述的制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于，所述纤维单胞菌40-2的16SrRNA含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
8.一种权利要求2-7任一所述制备微生物絮凝剂的方法制得的微生物絮凝剂，其特征在于，所述微生物絮凝剂用于处理家畜养殖场废水。
9.如权利要求8所述的制备微生物絮凝剂的方法制得的微生物絮凝剂，其特征在于，所述家畜养殖场废水为养猪场废水。
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