CN111394258A - 匍枝根霉fl-3及其在提取茯苓多糖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株匍枝根霉FL‑3及其在提取茯苓多糖中的应用，所述应用的方法为：将匍枝根霉FL‑3孢子接种于含无菌水的茯苓粉中，于28–30℃发酵2–3d，发酵物经超声水提后浓缩，获得浓缩物；再将浓缩物沉淀和真空干燥后，获得茯苓多糖。在茯苓多糖超声水提前，增加了匍枝根霉FL‑3的发酵预处理。匍枝根霉FL‑3是从茯苓的微生物富集培养物中分离，经过筛选获得的优良菌株，在茯苓粉中适度生长而产生多糖水解酶，对茯苓不溶性多糖结构组织的水解，促进结合态可溶性多糖的解离，较不采用发酵预处理的常规方法相比，茯苓多糖的提取收率可以提高30％以上。

Description

匍枝根霉FL-3及其在提取茯苓多糖中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种微生物发酵技术在茯苓多糖提取中的应用。
(二)背景技术
中药茯苓(Poria)，又称茯兔、松柏玉，是多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos Wolf)的干燥菌核。茯苓是传统的药食两用的中药材，收载于2015中国药典一部，其性味甘、淡、平；归心、肺、脾、肾经；具有利水渗湿，健脾，宁心功效；主治水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠。茯苓是中药“四君八珍”组成之一，用途广、用量大，使用茯苓为原料生产的中成药达数百种，同时，在营养保健、食用药膳中的用量也很大。
现代科学研究表明，茯苓中含有多种化学成分，包括萜类、甾体类、多糖类、蛋白类等，其中，茯苓多糖的活性备受人们关注，其具有抗肿瘤、抗病毒、调节机体免疫和保肝等功能，特别是羧甲基茯苓多糖(CMP)是干扰素的诱生剂和促生剂。目前，市场已有茯苓多糖口服液销售，功能主治健脾益气，用于肿瘤患者放化疗和脾胃气虚证者。
目前，常见的茯苓多糖的提取方式主要有热浸水提法、稀碱浸提法、超声提取法和酶提取法等。不同的提取工艺有各自的优缺点，多糖的收率也差异较大。热水浸提法的耗时长且多糖提取率低；稀碱浸提法极易破坏多糖的结构，使其生物活性降低；酶解法成本高，限制了它的广泛应用；超声提取法有相对的优势，不会破坏多糖结构，成本较低，提取收率相对较高。为了进一步提高茯苓多糖的提取收率，本发明对茯苓多糖超声提取法工艺进行改进，增加微生物发酵步骤，从而提高了茯苓多糖的提取收率。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株新的微生物菌株—匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)FL-3，及其在茯苓多糖提取中的应用，能够显著提高茯苓多糖提取的收率。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株—匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)FL-3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60981，保藏日期2020年3月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
本发明所述匍枝根霉FL-3，是从茯苓的微生物富集培养物中分离，经过筛选得到的优良菌株。所述匍枝根霉FL-3的形态特征如下：在马铃薯琼脂平板培养基(PDA)上，28℃条件下培养，菌落初期为白色绒毛状，1天后逐渐变为灰白色，菌落表层有大量黑色孢子。假根和匍匐菌株发达，孢子囊柄直立，不分枝，长在假根上方。孢子囊圆形、黑色。分生孢子为球形或近球形，表面略有粗糙，直径7–10μm。匍枝根霉FL-3在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1；匍枝根霉FL-3的rDNA核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQID NO.1所示。
本发明还提供一种所述匍枝根霉FL-3在茯苓多糖提取中的应用，所述应用的方法为：将匍枝根霉FL-3孢子接种于含无菌水的茯苓粉中，于28–30℃发酵2–3d，发酵物经超声水提后浓缩，获得浓缩物；再将浓缩物沉淀和真空干燥后，获得茯苓多糖。
进一步，所述无菌水体积用量以茯苓粉重量计为2–3mL/g；所述匍枝根霉FL-3孢子接种量以茯苓粉重量计为1–2×107个/g；所述茯苓粉是将茯苓粉碎后过60目筛获得。
进一步，所述匍枝根霉FL-3孢子以孢子液的形式加入，所述孢子液的制备方法为：低温保藏的匍枝根霉FL-3接种于PDA平板培养基，于28–30℃恒温培养2–3d后，加入无菌水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为1–2×108个/mL。所述的PDA平板培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/L(煮沸30min后过滤留汁)，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)。
进一步，所述浓缩物的制备方法为：发酵物加入去离子水中，搅拌均匀后置于80–90℃恒温水浴锅中浸提1.5–2h后，转入水温80℃的超声波清洗机中，100–200W超声提取20–30min；超声水提结束后，趁热过滤，将滤液65℃减压浓缩至原体积的1/4–1/5，获得浓缩物；所述去离子水体积加入量以发酵前茯苓粉重量计为20–30mL/g。
进一步，所述茯苓多糖的制备方法为：向浓缩物中加入3–4倍体积的95％乙醇，静置10–15h后，布氏漏斗抽滤，收集多糖沉淀，于60℃真空干燥至恒重，得茯苓多糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在茯苓多糖超声水提前，增加了匍枝根霉FL-3的发酵预处理。匍枝根霉FL-3是从茯苓的微生物富集培养物中分离，经过筛选获得的优良菌株，在茯苓粉中适度生长而产生多糖水解酶，对茯苓不溶性多糖结构组织的水解，促进结合态可溶性多糖的解离，较不采用发酵预处理的常规方法相比，茯苓多糖的提取收率可以提高30％以上。
(四)附图说明
图1匍枝根霉FL-3的菌落形态图。
图2苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所述的茯苓(Poria)为真菌茯苓(Poria cocos)的菌核去皮后的部分。真菌茯苓的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、多孔菌目(Polyprales)、多孔菌科(Polyporaceae)、茯苓属(Poria)、茯苓(Poria cocos)。
实施例1
1、菌株FL-3的筛选
(1)250-mL三角瓶中加入约10g经粉碎过60目筛的茯苓粉，再加入20mL无菌水润湿，于28℃恒温培养4d。将长满霉菌的富集培养物用无菌水稀释1×106倍后涂布于PDA平板培养基上，于28℃恒温培养2d，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA培养基，置于28℃恒温培养3d，得纯培养菌株6株，分别予以编号FL-1～FL-6。6个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入5mL无菌水，用接种环搅拌使得孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为1×108个/mL。
(2)250-mL三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g经粉碎过60目筛的茯苓粉，加20mL的无菌水，再接种1mL上述步骤(1)各菌株孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下培养2d。
经发酵的茯苓粉，加入200mL的去离子水，摇匀后置于80℃恒温水浴锅中，浸提1.5h，间隔15min手摇振荡一次。之后，三角瓶转入水温80℃的超声波清洗机中，100W超声提取30min。
超声水提结束后，趁热用布氏漏斗抽滤，将滤液65℃减压浓缩至50mL，加入150mL的95％乙醇，静置10h后，布氏漏斗抽滤，收集多糖沉淀，60℃真空干燥10h，得茯苓粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中的多糖含量。同样条件下，以不接种孢子液作为未经发酵的对照。
茯苓粉经不同菌株发酵后，多糖的提取收率见表1。
表1不同菌株发酵茯苓后多糖提取收率
Figure BDA0002436171860000041
由表1数据可以看出，茯苓经菌株FL-3发酵后，较未经发酵的对照相比，多糖的提取收率提高幅度最高，达到了28.6％，本发明选定该菌株作为提高茯苓多糖提取收率的发酵菌株。
2、菌株FL-3鉴定
菌株霉FL-3的形态特征如下：在马铃薯琼脂平板培养基(PDA)上，28℃条件下培养，菌落初期为白色绒毛状，1天后逐渐变为灰白色，菌落表层有大量黑色孢子。假根和匍匐菌株发达，孢子囊柄直立，不分枝，长在假根上方。孢子囊圆形、黑色。分生孢子为球形或近球形，表面略有粗糙，直径7–10μm。匍枝根霉FL-3在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1。
将菌株FL-3交由生工生物工程(上海)有限公司鉴定，测得其rDNA核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据菌株FL-3菌落特征和rDNA-ITS核苷酸序列比对，确定菌株FL-3的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)、毛霉门(Mucoromycota)毛霉纲(Mucoromycetes)、毛霉目(Mucorales)、根霉科(Rhizopodaceae)、根霉属(Rhizopus)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)。将菌株FL-3命名为匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)FL-3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60981，保藏日期2020年3月20日。
所述的平板培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入蔗糖20g、琼脂20g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后倒入直径9cm的无菌培养皿，冷却后备用。
所述的茯苓多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：将茯苓粗多糖配制成浓度为0.1mg/mL的水溶液，作为样品溶液。吸取样品溶液2mL于25mL比色管中，加1mL的6％苯酚水溶液，摇匀后迅速滴加5mL浓硫酸，摇匀后室温放置10min，沸水浴中加热15min，流水冷却至室温。以2mL蒸馏水作为空白对照的相同处理为参比，测定吸光度A490。以相同方法测定不同浓度(g/L)葡萄糖水溶液样品的A490，绘制葡萄糖浓度—A490标准曲线(图2)，得回归方程，由回归方程计算测定茯苓粗多糖样品中多糖含量。
实施例2
匍枝根霉FL-3应用于茯苓多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)匍枝根霉FL-3孢子液的制备：低温保藏的匍枝根霉FL-3(冻干管或平板菌落)接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养3d，加5mL的无菌水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为1×108个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)500-mL三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入20g经粉碎过60目筛的茯苓粉，加60mL的无菌水，再接种2mL步骤(1)制备匍枝根霉FL-3的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下培养2d。
(3)步骤(2)经发酵的茯苓粉中，加入400mL的去离子水，搅拌均匀后置于80℃恒温水浴锅中，浸提1.5h，间隔15min手摇振荡一次。之后，三角瓶转入水温80℃的超声波清洗机中，100W超声提取30min。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液65℃减压浓缩至100mL。
(4)步骤(3)的浓缩液中加入300mL的95％乙醇，静置10h后，布氏漏斗抽滤，收集多糖沉淀，60℃真空干燥10h，得茯苓粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中的多糖含量。
按上述步骤，得茯苓粗多糖1.19g，多糖含量为71.8％，即得到茯苓多糖0.853g，提取收率为4.26％，产品为灰白色粉状物。
实施例3
匍枝根霉FL-3应用于茯苓多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)匍枝根霉FL-3孢子液的制备：低温保藏的匍枝根霉FL-3(冻干管或平板菌落)接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养3d，加5mL的无菌水于培养皿中，用接种环搅动是孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为2×108个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)2-L三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入50g经粉碎过60目筛的茯苓粉，加150mL的无菌水，再接种5mL步骤(1)制备FL-3的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于30℃条件下培养3d。
(3)步骤(2)的制备的茯苓粉中，加入1500mL的去离子水，搅拌均匀后置于90℃恒温水浴锅中，浸提2h，间隔15min手摇振荡一次。之后，三角瓶转入水温50℃的超声波清洗机中，200W超声提取20min。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液65℃减压浓缩至300mL。
(4)步骤(4)的浓缩液中加入1200mL的95％乙醇，静置15h后，布氏漏斗抽滤，收集多糖沉淀，60℃真空干燥10h得茯苓粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中的多糖含量。
按上述步骤，得茯苓粗多糖3.20g，多糖含量为72.4％，即得到茯苓多糖2.31g，提取收率为4.63％，产品为灰白色粉状物。
实施例4
匍枝根霉FL-3应用于茯苓多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)匍枝根霉FL-3孢子液的制备：低温保藏的匍枝根霉FL-3(冻干管或平板菌落)接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养3d，加5mL的无菌水于培养皿中，用接种环搅动是孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为2×108个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)5-L三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入100g经粉碎过60目筛的茯苓粉，加300mL的无菌水，再接种10mL步骤(1)制备FL-3的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于30℃条件下培养3d。
(3)步骤(2)的制备的茯苓粉中，加入3000mL的去离子水，搅拌均匀后置于90℃恒温水浴锅中，浸提2h，间隔15min手摇振荡一次。之后，三角瓶转入水温80℃的超声波清洗机中，200W超声提取20min。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液65℃减压浓缩至600mL。
(4)步骤(4)的浓缩液中加入2400mL的95％乙醇，静置15h后，布氏漏斗抽滤，收集多糖沉淀，60℃真空干燥10h得茯苓粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中的多糖含量。
按上述步骤，得茯苓粗多糖6.37g，多糖含量为71.5％，即得到茯苓多糖4.56g，提取收率为4.56％，产品为灰白色粉状物。
如不经本实施例步骤(2)的发酵过程，其他步骤按本实施例方法，100g的茯苓粉可提取获得茯苓粗多糖4.78g，多糖含量为72.4％，即得到茯苓多糖3.46g，提取收率为3.46％。可见，在茯苓多糖超声水提前，增加了匍枝根霉FL-3的发酵预处理，较不采用发酵预处理的常规方法相比，茯苓多糖的提取收率可以提高30％以上。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 匍枝根霉FL-3及其在提取茯苓多糖中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 854
<212> DNA
<213> 匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)
<400> 1
tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tacttatgta atggggggaa gggaaaaaaa 60
aaaaaaagca gtttactgtc tctctttttt tttttttcct tccattcaac ccatcatctc 120
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ctgattatta tttttttatt aaaataatta attttggaga taataaaaat gaggctcttt 540
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tacaactttt tttttttttt ctcctttttg tgtagttaat actctattaa atttatttac 720
ttggtattat aacgattatg caagaaggga gagaacaaag aataatgaaa gagagttttt 780
aaataaattc ttttttcatt ttttcaatca atgatctgaa gtcaagtggg attaccgatc 840
tgaagtcaag tggg 854

Claims (8)

1.匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)FL-3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60981，保藏日期2020年3月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
2.一种权利要求1所述匍枝根霉FL-3在茯苓多糖提取中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将匍枝根霉FL-3孢子接种于含无菌水的茯苓粉中，于28–30℃发酵2–3d，发酵物经超声水提后浓缩，获得浓缩物；再将浓缩物沉淀和真空干燥后，获得茯苓多糖。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无菌水体积用量以茯苓粉重量计为2-3mL/g；所述匍枝根霉FL-3孢子接种量以茯苓粉重量计为1–2×107个/g。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述匍枝根霉FL-3孢子以孢子液的形式接种，所述孢子液的制备方法为：低温保藏的匍枝根霉FL-3接种于PDA平板培养基，于28–30℃恒温培养2–3d后，加入无菌水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述浓缩物的制备方法为：发酵物加入去离子水中，搅拌均匀后置于80–90℃恒温水浴锅中浸提1.5–2h后，转入水温80℃的超声波清洗机中，100–200W超声提取20–30min；超声水提结束后，趁热过滤，将滤液65℃减压浓缩至原体积的1/4–1/5，获得浓缩物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述去离子水体积加入量以发酵前茯苓粉重量计为20-30mL/g。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述茯苓多糖的制备方法为：向浓缩物中加入3–4倍体积的95％乙醇，静置沉淀10–15h后，布氏漏斗抽滤，收集多糖沉淀，于60℃真空干燥至恒重，得茯苓多糖。
CN202010252999.4A 2020-04-02 2020-04-02 匍枝根霉fl-3及其在提取茯苓多糖中的应用 Active CN111394258B (zh)

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