CN111388758A - 基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，该复合生物墨水的组分包括脱细胞基质溶液、光交联甲基丙烯酸化水凝胶以及羟乙基纤维素，所述脱细胞基质溶液为动物或者人的肝脏、肾脏、胰腺等其他组织脱细胞基质的胃蛋白酶溶液。本发明还公开了所述的基于光交联甲基丙烯酸化水凝胶/脱细胞基质/羟乙基纤维素的复合生物墨水的制备方法及应用。本发明的基于光交联甲基丙烯酸化水凝胶/脱细胞基质/羟乙基纤维素的复合生物墨水，表征效果好，可打印性强，生物相容性好。

Description

基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合 生物墨水及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物墨水技术领域，具体涉及一种用于体外细胞打印的高活性复合生物墨水及其制备方法与应用。
背景技术
3D生物打印是一种能在数字三维模式驱动下按照增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元，制造医疗器械、组织工程支架和组织器官的技术。近年来，3D打印技术和微流控技术的逐渐成熟，各式新型的器官组织芯片不断涌现，在筛选药物、推动个性化和精准化医疗快速发展方面具有重大的作用。既可以降低药物筛选的成本，也可以减少测试时间，节约人力和财力资源；更重要的是可以提高被测试对象的一致性，使实验结果更具有说服力。利用“生物墨水”作为打印材料，模拟天然的3D ECM，结合细胞以构建含有活性的组织或器官。虽然目前已研制出来的生物墨水非常类似于ECM的活性，但由于体外3D培养***仍然缺乏促进细胞生长和维持细胞功能的合适天然生长因子，导致3D生物打印构建的组织活性相对原型具有较大的差距。因此使用天然生长因子对3D ECM进行模拟是当前3D生物打印实现高仿生性的当务之急。
具有复杂天然组成和仿生结构的脱细胞基质是生物墨水的首选。脱细胞基质是指将组织经过脱细胞工艺处理后，去除能够引起免疫排斥的抗原部分。具有良好的机械力学性能，良好的生物相容性，在体内起着支撑、连接细胞的作用，同时其三维空间的结构及生长因子有利于细胞的黏附和生长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新型的用于体外细胞打印的高活性复合生物墨水，其表征效果好，可打印性强，生物相容性好。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，所述复合生物墨水的组分包括脱细胞基质溶液(DECM)、光交联甲基丙烯酸化水凝胶(GelMA)以及羟乙基纤维素。
本发明中，脱细胞基质由动物或人的肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胆、胰腺、心脏、肺、胃、脾、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子、眼等器官组织经脱细胞工艺处理得到，具有良好的机械力学性能以及生物相容性，其三维的空间结构以及生长因子也有利于细胞的粘附和生长。甲基丙烯酸酐化水凝胶是由甲基丙烯酸酐(MA)与明胶(Gelatin)制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶材料，具有优异的生物相容性，且可由紫外光或可见光激发固化反应，形成适于细胞生长与分化且有一定强度的三维结构。两种材料的结合可显著提高生物墨水的生物活性，但也降低了生物墨水的可打印性。
进一步地，所述脱细胞基质溶液为脱细胞基质的胃蛋白酶溶液，其浓度优选为1-50mg/ml。
本发明中，通过在体系中加入一定量的羟乙基纤维素，作为一种助变剂，能够改善生物墨水的流变性能，进一步增强生物墨水的机械强度，有效提高了生物墨水的打印性能。
进一步地，所述光交联甲基丙烯酸化水凝胶与脱细胞基质溶液的体积比为5:1～1:5，优选为1:1。
进一步地，所述羟乙基纤维素的添加量为脱细胞基质溶液与光交联甲基丙烯酸化水凝胶总质量的0.1％～15％，优选为1％。
进一步地，所述复合生物墨水可用于打印的细胞包括动物或人的肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胆、胰腺、心脏、肺、胃、脾、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子、眼等器官组织的细胞。
本发明另一方面提供了所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水的制备方法，包括：
S1、将脱细胞基质冻干、研磨，加入胃蛋白酶溶液溶解，制成脱细胞基质溶液；
S2、将得到的脱细胞基质溶液与光交联甲基丙烯酸化水凝胶混合，再加入羟乙基纤维素，混合均匀，即得到所述复合生物墨水。
进一步地，步骤S1中，所述脱细胞基质是由解冻后的组织连接蠕动泵进行脱细胞灌注而得到的，所述脱细胞灌注具体依次包括：
(1)去离子水振荡洗脱2h；
(2)0.1％胰酶浸3h；
(3)1％TritonX-100振荡洗脱1h；
(4)4％SDC振荡洗脱1h；
(5)80U/ml DNase、5U/ml RNase振荡洗脱30min；
(6)2％青霉素-链霉素、2.5μg/ml两性霉素B的PBS振荡洗脱30min。
进一步地，振荡洗脱的速率为60rpm/min。
进一步地，制备脱细胞基质后，还需要对其进行表征，所述表征包括：残留核酸检测，定量DNA浓度，HE染色验证脱细胞过程。
进一步地，步骤S1中，所述胃蛋白酶溶液是由胃蛋白酶溶解于盐酸中得到的，浓度为0.1-10mg/mL。
进一步地，步骤S2中，还包括对制备的生物墨水进行可打印性和生物相容性的验证的步骤。
本发明还提供了所述的复合生物墨水在构建组织工程支架中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明的制备方法简单易操作，选取动物或人的肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胆、胰腺、心脏、肺、胃、脾、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子、眼等器官组织作为脱细胞基质的来源，来源广泛，容易获得；
(2)由于本发明在制备生物墨水的过程当中，加入了脱细胞基质和羟乙基纤维素，所以制备出来的生物墨水表征效果好，可打印性强，生物相容性好；
(3)本发明制备而得的新型的用于细胞打印的高活性复合生物墨水，用于医疗或制药行业，将在一定程度上降低药物筛选成本，减少筛选测试时间，节约人力和财力资源，对于未来医疗事业的发展具有奠基作用。
附图说明
图1为1％的羟乙基纤维素加入GelMA与脱细胞基质(DECM)不同的体积比中形成生物墨水的打印效果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一、制备基于肝脏脱细胞基质的复合生物墨水
(1)肝脏准备：获取新鲜猪肝脏，切为10mm2大小的方块，-80℃冷冻12小时；
(2)肝脏脱细胞基质的制备：肝脏常温解冻，进行振荡细胞(振荡速率为60rpm/min)去离子水振荡洗脱2h；0.1％胰酶浸泡3h；1％TritonX-100振荡洗脱1h；4％SDC振荡洗脱1h；80U/ml DNase、5U/ml RNase振荡洗脱30min；2％青霉素-链霉素、2.5μg/ml两性霉素B的PBS振荡洗脱30min。
(3)肝脏脱细胞基质的表征：肝脏脱细胞基质经历冷冻干燥后，DNA含量检测以及胶原蛋白等一系列表征，证明脱细胞较完全以后，可以进行下一步；
(4)肝脏脱细胞基质溶液的制备与表征
①肝脏脱细胞基质溶液的制备：将肝脏脱细胞基质冻干，取冻干后的脱细胞基质进行剪碎、研磨，使其易于溶解，研磨至合适颗粒大小，溶于胃蛋白酶中制成溶液；
②肝脏脱细胞基质溶液的表征：检测溶液中胶原蛋白的浓度，以及溶液中GAG含量，确保检测的含量尽量与未脱细胞处理的天然肝脏对比，没有极为显著的变化，保证制成的生物墨水具有一定的生物活性；
(5)生物墨水的制备：将肝脏脱细胞基质与明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)1:1混合，并加入1％的羟乙基纤维素，制成生物墨水。
二、生物墨水性能的检测
(1)生物墨水可打印性的验证：电镜SEM检测生物墨水的孔径，测量杨式模量，检测打印结构和弹性模量；
(2)生物墨水生物相容性的验证：细胞活死染色评估细胞活性，定量尿素和ALB分泌评估肝功能。
三、细胞打印检测
(1)肝癌细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的HepG2细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
(2)正常肝细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的LO2细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
(3)肝原代细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的肝原代细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
附图1示出了1％的羟乙基纤维素加入GelMA与脱细胞基质(DECM)不同的体积比中形成生物墨水的打印效果。
从图1中可以看出，当GelMA：DECM的比例为1：1～1：2时，得到的生物墨水都显示出了良好的打印性能。当GelMA：DECM的比例上升至1:3时，生物墨水的打印性能出现明显的下降。
现有技术中，未加羟乙基纤维素时，生物墨水中GelMA：DECM最大比例为1：1，即DECM的上限为50％。本实施例中，通过在生物墨水中引入了1％的羟乙基纤维素，明显的提高生物墨水的打印性能，使得DECM的可打印含量增加至67％，有利于提高打印支架的生物活性。
实施例2
一、制备基于肾脏脱细胞基质的复合生物墨水
(1)肾脏准备：获取新鲜猪肾脏，切为10mm2大小的方块，-80℃冷冻至少12小时；
(2)肾脏脱细胞基质的制备：肾脏常温解冻，进行振荡细胞(振荡速率为120rpm/min)去离子水振荡洗脱2h；0.1％胰酶浸泡3h；1％TritonX-100振荡洗脱1h；4％SDC振荡洗脱1h；80U/ml DNase、5U/ml RNase振荡洗脱30min；2％青霉素-链霉素、2.5μg/ml两性霉素B的PBS振荡洗脱30min。
(3)肾脏脱细胞基质的表征：肾脏脱细胞基质经历冷冻干燥后，DNA含量检测以及胶原蛋白等一系列表征，证明脱细胞较完全以后，可以进行下一步；
(4)肾脏脱细胞基质溶液的制备与表征
①肾脏脱细胞基质溶液的制备：将肾脏脱细胞基质冻干，取冻干后的脱细胞基质进行剪碎、研磨，使其易于溶解，研磨至合适颗粒大小，溶于胃蛋白酶中制成溶液；②肾脏脱细胞基质溶液的表征：检测溶液中胶原蛋白的浓度，以及溶液中GAG含量，确保检测的含量尽量与未脱细胞处理的天然肾脏对比，没有极为显著的变化，保证制成的生物墨水具有一定的生物活性；
(5)生物墨水的制备：将肾脏脱细胞基质与明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)1:1混合，并加入1％的羟乙基纤维素，混合均匀，制成生物墨水。
二、生物墨水性能的检测
(1)生物墨水可打印性的验证：电镜SEM检测生物墨水的孔径，测量杨式模量，检测打印结构和弹性模量；
(2)生物墨水生物相容性的验证：细胞活死染色评估细胞活性，定量尿素和ALB分泌评估肾功能。
三、细胞打印检测
(1)肾癌细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的MPC5细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
(2)正常肾细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的HK2细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
(3)肾原代细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的肾原代细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (11)

1.基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述复合生物墨水的组分包括脱细胞基质溶液、光交联甲基丙烯酸化水凝胶以及羟乙基纤维素。
2.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述脱细胞基质溶液为动物或人的肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胆、胰腺、心脏、肺、胃、脾、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子或眼的脱细胞基质的胃蛋白酶溶液。
3.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述脱细胞基质溶液的浓度为1～50mg/ml。
4.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述光交联甲基丙烯酸化水凝胶的浓度为1％～50％。
5.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述光交联甲基丙烯酸化水凝胶与脱细胞基质溶液的体积比为5:1～1:5。
6.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述羟乙基纤维素的添加量为脱细胞基质溶液与光交联甲基丙烯酸化水凝胶总质量的0.1％～15％。
7.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述复合生物墨水用于打印的细胞包括动物或人的肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胆、胰腺、心脏、肺、胃、脾、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子、眼的细胞。
8.根据权利要求1-7任一项所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水的制备方法，其特征在于，包括：
S1、将脱细胞基质冻干、研磨，加入胃蛋白酶溶液溶解，制成脱细胞基质溶液；
S2、将得到的脱细胞基质溶液与光交联甲基丙烯酸化水凝胶混合，再加入羟乙基纤维素，混合均匀，即得到所述复合生物墨水。
9.如权利要求8所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述脱细胞基质是由解冻后的组织经多步脱细胞操作得到的，所述多步脱细胞具体依次包括：
(1)去离子水振荡洗脱2h；
(2)0.1％胰酶浸3h；
(3)1％TritonX-100振荡洗脱1h；
(4)4％SDC振荡洗脱1h；
(5)80U/ml DNase、5U/ml RNase振荡洗脱30min；
(6)2％青霉素-链霉素、2.5μg/ml两性霉素B的PBS振荡洗脱30min。
10.如权利要求8所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述胃蛋白酶溶液是由胃蛋白酶溶解于盐酸中得到的，浓度为0.1-10mg/mL。
11.根据权利要求1-7任一项所述的复合生物墨水在构建组织工程支架中的应用。
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