CN111378632A - cfDNA末端修复的酶组合物、缓冲液试剂和测序文库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了cfDNA末端修复酶组合物,包括如下几种酶:使cfDNA在dNTP存在下进行DNA双链修复及3’端加A的酶Ⅰ,所述的酶Ⅰ为Taq DNA聚合酶及Klenow Fragment,Exo‑;使cfDNA 5’端发生磷酸化修饰的酶Ⅱ,所述的酶Ⅱ为T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase,简称T4 PNK)。本发明还提供了一种cfDNA末端修复缓冲液试剂。本发明还提供了使用上述的试剂进行cfDNA末端修复和构建cfDNA测序文库的方法。本发明具有如下技术效果:本发明的试剂酶用量少,成本低,且具有意想不到的更高的修复效率,适用于样本量较低的cfDNA进行末端修复。
Description
技术领域
本发明涉及一种cfDNA末端修复的酶组合物、缓冲液试剂和测序文库的构 建方法,属于生物技术领域。
背景技术
血浆游离DNA(circulating cell free DNA,cfDNA)是一种细胞外游离于体 液中的DNA,cfDNA片段大小在150-400bp之间。cfDNA测序广泛应用于肿瘤 疾病的诊断,产前筛查。鉴于血液中cfDNA含量较少,而且片段较短,限制了 高通量测序的测序深度。
因此,有必要通过提高cfDNA的末端修复及加A效率,保证建库效率,高 通量测序数据能够覆盖到所有cfDNA,提高测序数据的真实性及可靠性。
中国专利CN201480062608.5提供了一种用于DNA末端修复、腺苷酸化、 磷酸化的酶组合物,所述组合物包含缺乏5'-3'和3'-5'外切核酸酶活性的经修饰 的Taq DNA聚合酶,其与T4 DNA聚合酶、Klenow片段和T4多核苷酸激酶和 所有其它必要的组分包括反应缓冲液和三磷酸核苷预混,其为在一个管内并经两 个步骤进行DNA钝化、磷酸化和单核苷酸延伸反应所需。
中国专利CN201610040334.0公开了一种采用一步法进行DNA末端修复/加 dA的方法及应用,具体涉及一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的方法 及其应用,所述方法采用T4DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶 的混合酶系。
国际申请PCT/CN2016/106609(国际公布号:WO 2018/090373 A1)公开 了一种DNA末端修复与加A的方法,该方法包括:在同一反应体系中,在dNT P存在下,利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平,利用多聚核苷酸激酶 将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基;在过量dATP存在下, 利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在双链DNA3’末端加上dATP。
上述专利都存在着一些不足,如酶用量较多,成本较高,或者不适用于样本 量较低的cfDNA进行末端修复。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明所要解决的技术问题:提供一种新的 cfDNA末端修复的酶组合物以及缓冲液试剂,来提高cfDNA末端平齐化及双链 DNA 3’端加A效率。
本发明的技术构思如下:
现有技术中DNA片段的末端修复可以使用klenow fragment、T4 DNA Polymerase、Taq DNA polymerase、T4 Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment, Exo-。其中KlenowFragment保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5' 外切酶活性,但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。T4 DNA Polymerase 具有3'→5'外切酶活性,但不具有5'→3'外切酶活性,用于末端平齐化。由于 Klenow Fragment,Exo-没有外切酶活性,其在末端补平时经常会在3'末端额外加 上1个或多个核苷酸,用于加A。Taq DNA polymerase具有5'→3'聚合酶活性, 形成3’端带A的产物。cfDNA完整性较物理打断的基因组DNA高,末端修复 酶混合液可在此基础上进行缩减。
本研究选择Klenow Fragment,Exo-、Taq DNA Polymerase、T4 PolynucleotideKinase进行末端修复、5’端磷酸化修饰及3’端加A。经过末端平齐化的cfDNA 3’ 端添加碱基A,以获得具有粘性末端A的cfDNA片段。末端平齐化所需的四种 脱氧核糖核苷三磷酸很少,末端平齐化后通过Klenow Fragment,Exo-为DNA 双链的3’端添加碱基A,所以反应体系中dATP浓度对于cfDNA 3’端加A效率 影响较大。
另外,发明人在研究上述问题时,在调整cfDNA末端修复缓冲液的过程中 发现,改变缓冲液中三磷酸核苷dATP、dTTP、dCTP和dGTP比例时,末端修 复效率会发生改变,dATP浓度会影响双链DNA 5’端加A效率。基于上述发现, 发明人提高末端修复缓冲液中dATP在其他三种脱氧核糖核苷三磷酸的占比,而 不是同时加入四种等量的脱氧核糖核苷三磷酸,从而完成本发明。
本发明的技术方案如下:
cfDNA末端修复酶组合物,其特征在于,包括如下几种酶:
使cfDNA在dNTP存在下进行DNA双链修复及3’端加A的酶Ⅰ,所述的 酶Ⅰ为Taq DNA聚合酶及Klenow Fragment,Exo-;
使cfDNA 5’端发生磷酸化修饰的酶Ⅱ,所述的酶Ⅱ为T4多聚核苷酸激酶 (T4Polynucleotide Kinase,简称T4 PNK)。
优选地,
每50μL反应体系中含有:T4多聚核苷酸激酶2.5U;Klenow Fragment, Exo-1U;TaqDNA聚合酶3U。
本发明的cfDNA末端修复缓冲液试剂,包括Tris-Hcl、MgCl2、DTT、ATP、 dATP、dGTP、dCTP和dTTP,其中的dATP浓度是dGTP、dCTP和dTTP各成 分的浓度的5-10倍。
优选地,每50微升反应体系中,末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下:1 00-105mM Tris-Hcl,18-20mM MgCl2,15-20mM DTT、18-20mM KCl、0.05-1% NP40、0.05-1%Tween 20、1.5-2.5mM ATP、0.2-0.5mM dGTP、0.2-0.5mM dCTP和0.2-0.5mM dTTP。
更优选地,末端修复时,每50ul反应体系中加入5ul的10×末端修复缓冲液, 所述的10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下:
组分 | 含量 |
Tris-Hcl(pH8.3) | 1M |
MgCl<sub>2</sub> | 0.2M |
DTT | 0.2M |
KCl | 0.2M |
ATP | 20mM |
dATP | 20mM |
dTTP | 2mM |
dCTP | 2mM |
dGTP | 2mM |
NP40 | 0.7%v/v |
Tween-20 | 0.7%v/v |
本发明还提供了含有上述酶组合物以及上述缓冲液试剂的cfDNA末端修复 试剂。
本发明还提供了含有上述cfDNA末端修复试剂的cfDNA末端修复试剂盒。
本发明还提供了含有上述cfDNA末端修复试剂的cfDNA建库试剂盒。
使用上述cfDNA末端修复试剂进行cfDNA末端修复的方法,具体方法如下: 在末端修复缓冲液试剂中用末端修复酶组合物处理cfDNA以产生末端平齐化且 3’端加A的cfDNA;
所述的末端修复反应体系的pH值为8.0~8.3左右;
所述的反应条件为先在35~40℃反应10~15min;然后在60~70℃反应10~15min。
优选地,所述的反应条件为先在37℃反应10min,然后在65℃反应15min。
使用上述cfDNA末端修复试剂进行适用于MGI测序平台的cfDNA测序文 库的构建方法,包括如下步骤:
1)在末端修复缓冲液试剂中用末端修复酶组合物处理cfDNA以产生5’端 磷酸化且3’端加A的cfDNA;
2)末端修复产物接头连接反应,在末端修复体系中直接加入MGI接头、T 4连接酶及T4连接Buffer,进行接头连接;
3)接头连接产物进行磁珠纯化,去除反应体系中的酶、盐离子及残余接头;
4)使用高保真DNA聚合酶,对连接产物进行富集,反应结束后磁珠纯化。
所述的步骤1)中,
末端修复反应体系的pH值为8.0-8.3左右;
反应条件为先在35~40℃反应10~15min;然后在60~70℃反应10~15 min。
优选地,
所述的步骤1)中,反应条件为先在37℃反应10min,然后在65℃反应15 min。
本发明的技术方案提供了多个技术贡献:
与中国专利CN201480062608.5相比,现有专利的末端修复酶体是由4种酶 组合物,分别是T4多核苷酸激酶,T4 DNA聚合酶,klenow fragment及mod-Tbr DNA聚合酶。而本发明使用的末端修复酶混合物由三种酶组成,分别是1)T4 PNK,2)Klenow Fragment,Exo及3)Taq DNA聚合酶。cfDNA浓度较低,针 对该类样本建库时所需末端修复酶量较少,本发明在减少混合酶组分的同时,减 少酶的用量,大大降低反应成本。
与中国专利CN201610040334.0相比,由于血浆中cfDNA浓度较低,基因组 DNA样本量相对较高,这两类样本在进行末端修复时所需的酶量不同,同时物 理打断的基因组DNA,缺刻及断裂区域较多,对具有5’-3’聚合酶活性的这类酶 需求度较高,dNTP底物消耗率较高。本发明中,cfDNA基因组序列较为完整, 对5’端磷酸化修饰及3’端加A这些酶的需求度较高。同时本发明设计的末端修 复程序为37℃10min,65℃15min,末端修复时间为25min,较基因组DNA的末 端修复时间更短。
与国际申请PCT/CN2016/106609(国际公布号:WO 2018/090373 A1)相 比,现有专利提及的方案用于完整基因组建库,末端修复体系中包含片段化试剂, 现有专利的方案不适用于样本量较低的cfDNA进行末端修复。本发明中,cfD NA片段大小在150-400bp之间,无需片段化处理,提取的cfDNA只需使用末端 修复酶反应混合液的作用下,进行末端平齐化及3’端加A反应。本发明将cfDN A在同一反应管中进行在末端修复,完成cfDNA片段的末端平齐化,5’端磷酸 化修饰以及3’端加A反应,反应结束后无需纯化,即可加入含接头的连接反应 体系,cfDNA两端加上接头。
本发明具有如下技术效果:本发明的试剂酶用量少,成本低,且具有意想不 到的更高的修复效率,适用于样本量较低的cfDNA进行末端修复。
附图说明
图1为实施例2中实验一的电泳结果图。图中泳道M为DNA分子量标记 (DNAmarker)。
图2为实施例2中实验二的电泳结果图。图中泳道M为DNA分子量标记 (DNAmarker)。
图3为实施例2中实验三的电泳结果图。图中泳道M为DNA分子量标记(DNA marker)。
具体实施方式
本发明所用的试剂购自康为世纪。
实施例1 cfDNA建库
cfDNA建库,包括如下步骤:
一、末端修复
每50微升反应体系中,使用末端修复缓冲液试剂为10×End Repair ReactionBuffer,其组分和含量如下:
组分 | 含量 |
Tris-Hcl(pH8.3) | 1M |
MgCl<sub>2</sub> | 0.2M |
DTT | 0.2M |
KCl | 0.2M |
ATP | 20mM |
dATP | 20mM |
dTTP | 2mM |
dCTP | 2mM |
dGTP | 2mM |
NP40 | 0.7%v/v |
Tween-20 | 0.7%v/v |
每50微升反应体系中,末端修复酶组合物的组分和含量如下:
组分 | 含量 |
T4 Polynucleotide Kinase | 2.5U |
Klenow exo- | 1U |
Taq DNA Polymerase | 3U |
甘油 | 50%v/v |
MgCl<sub>2</sub> | 10mM |
Tris-Hcl | 70mM |
末端修复包括如下步骤:
1、取1ng游离DNA于PCR管中,体积应≤42μL,不足42μL用水补平,在 PCR管中配制如下末端修复反应混合液:
2、震荡混匀5s,瞬时离心将反应液收集至管底;
3.将含有上一步反应混合液的PCR管置于PCR仪上,如下条件反应:
温度 | 时间 |
热盖 | 66℃ |
37℃ | 10min |
65℃ | 15min |
4℃ | Hold |
二、接头连接,包括如下步骤:
1、向上一步PCR管中加入以下连接反应混合液;
组分 | 体积 |
T4 DNA Ligase Buffer | 14μL |
T4 DNA ligase | 4μL |
Adaptor | 5μL |
Nuclease-free Water | 7μL |
Total | 80uL |
2、震荡混匀10s,请保证混匀充分,瞬时离心将反应液收集至管底;
3、将含有上一步反应液的PCR管置于PCR仪上,按照下表的条件进行反 应:
温度 | 时间 |
热盖 | 30℃ |
23℃ | 20min |
4℃ | Hold |
三、连接产物纯化
使用康为世纪磁珠法DNA纯化回收试剂盒(CW2508)进行DNA片段的纯 化回收。
包括如下步骤:
1.提前30min取出CMPure磁珠置于室温,使用前充分震荡混匀;
2.吸取80uL CMPure磁珠至80uL连接产物中,用移液器轻轻吹打10次 充分混匀,室温孵育5min;
3.瞬时离心,将不粘管置于磁力架,静置2min至液体澄清,移液器吸取 并弃掉上清;
4.保持不粘管固定于磁力架上,加入250uL新鲜配制的80%乙醇,保持 离心管固定于磁力架上,待悬起的磁珠完全吸附后彻底弃去乙醇(1min左右)。
5.重复步骤4一次,最后一次尽量吸干管底液体,有少量残留在管壁时可 将离心管瞬时离心,在磁力架上分离后,用小量程的移液器把管底液体吸干。 注意:不要吸取磁珠,以免影响产量。
6.保持不粘管固定于磁力架上,打开不粘管管盖,室温干燥3~5min,直至 磁珠无反光、无开裂;
7.将不粘管从磁力架上取下,加入46uL TE进行DNA洗脱,移液器吹打 混匀并室温下溶解5min;
8.瞬时离心,将不粘管置于磁力架上,静置2min至液体澄清,将44uL上 清液全部转移到新的PCR管中,进行下一步反应或者-20℃保存。
四、PCR扩增,包括如下步骤:
1.向上一步的每个PCR管中单独加入3ul Index primer(index 1-8),每 个样品中加入一种index,然后再按照下表配制PCR反应混合液;
组分 | 体积 |
2×HiFidelity PCR Mix | 50uL |
PCR-universal primer | 3μL |
Index primer | 3μL |
DNA | 44uL |
Total | 100uL |
2.震荡混匀5s,瞬时离心将反应液收集至管底;
3.将上述PCR管置于PCR仪上,按照下表的条件进行反应:
注意:PCR循环数可根据入库DNA浓度进行调整
五、PCR产物纯化,包括如下步骤:
使用康为世纪磁珠法DNA纯化回收试剂盒(CW2508)进行DNA片段的纯 化回收
1.提前30min取出CMPure磁珠置于室温,使用前充分震荡混匀;
2.吸取100uL CMPure XP磁珠至100uL PCR产物中,使用移液器轻轻吹 打10次充分混匀,室温孵育5min;
3.瞬时离心,将不粘管置于磁力架,静置2min至液体澄清,移液器吸取 并弃掉上清;
4.保持不粘管固定于磁力架上,加入250uL新鲜配制的80%乙醇,保持 离心管固定于磁力架上,待悬起的磁珠完全吸附后彻底弃去乙醇(1min左右)。
5.重复步骤4一次,最后一次尽量吸干管底液体,有少量残留在管壁时可 将离心管瞬时离心,在磁力架上分离后,用小量程的移液器把管底液体吸干; 注意:不要吸取磁珠,以免影响产量。
6.保持不粘管固定于磁力架上,打开不粘管管盖,室温干燥3~5min,直至 磁珠无反光、无开裂;
7.将不粘管从磁力架上取下,加入32uL TE进行DNA洗脱,移液器吹打 混匀并室温下溶解5min;
8.瞬时离心,将不粘管置于磁力架上,静置2min至液体澄清,将30uL上 清液转移到新的1.5mL不粘管中,进行环化或者-20℃保存。
实施例2对照试验
配方一:末端修复缓冲液试剂中,三磷酸核苷dATP、dTTP、dCTP和dGT P终浓度均分别为0.2mM。(此为作为对照的技术方案)
配方二:末端修复缓冲液试剂中,三磷酸核苷dATP终浓度为2mM;dTTP、 dCTP和dGTP终浓度分别为0.2mM。(此为本发明的技术方案)
配方三:配制末端修复酶混合液,成分如下:T4多聚核苷酸激酶2.5U;Kl enowFragment,Exo-1U;Taq DNA聚合酶3U。以上三种酶混合物用于50ul 的反应体系的组成单位。(此为本发明的技术方案)
配方四:配制末端修复酶混合液,成分如下:T4多聚核苷酸激酶4U;Kle nowFragment 1U;Taq DNA聚合酶1U,T4 DNA聚合酶1.2U。以上四种酶 混合物用于50ul的反应体系的组成单位。(国际申请PCT/CN2016/106609(国 际公布号:WO 2018/090373A1)的技术方案)
不同配方的末端修复缓冲液与末端修复酶组合,分别用于不同浓度的cfDN A建库。cfDNA建库方法参考实施例1。
实验一:将配方一及配方二的末端修复缓冲液分别与配方三末端修复酶组 合,用于1ng的cfDNA样本建库,每个样本做2个重复,PCR扩增循环数12。
实验结果如下:
结果见图1。
实验二:将配方一及配方二的末端修复缓冲液分别与配方三末端修复酶组 合,用于cfDNA样本建库,投入量分别为1ng、2ng及3ng,PCR扩增循环数1 2。
实验结果如下:
结果见图2。
实验三:将配方一及配方二的末端修复缓冲液分别与配方三及配方四末端修 复酶组合,用于1ng的cfDNA样本建库,PCR扩增循环数12。
实验结果如下:
结果见图3。
结论:
从图1、图2和图3以及上表,可以看出,提高末端修复缓冲液中dATP浓 度,同时优化末端修复酶混合液组分,可提高cfDNA片段3’端加A效率,接头 5’含有游离的碱基T,与经修复的3’末端含有游离碱基A的DNA片段连接,因 此DNA片段加A效率越高,接头连接效率越高。
通过接头引入的特异性序列进行PCR扩增,引入Barcode序列,获取完整 DNA文库。末端修复效率影响文库产量,提高cfDNA末端修复效率以及3’端加 A效率,可有效提高建库效率。
Claims (10)
1.cfDNA末端修复酶组合物,其特征在于,包括如下几种酶:
使cfDNA在dNTP存在下进行DNA双链修复及3’端加A的酶Ⅰ,所述的酶Ⅰ为Taq DNA聚合酶及Klenow Fragment,Exo-;
使cfDNA 5’端发生磷酸化修饰的酶Ⅱ,所述的酶Ⅱ为T4多聚核苷酸激酶(T4Polynucleotide Kinase,简称T4 PNK)。
2.根据权利要求1所述的cfDNA末端修复酶组合物,其特征在于,每50μL反应体系中含有:T4多聚核苷酸激酶2.5U;Klenow Fragment,Exo-1U;Taq DNA聚合酶3U。
3.cfDNA末端修复缓冲液试剂,其特征在于,包括Tris-Hcl、MgCl2、DTT、ATP、dATP、dGTP、dCTP和dTTP,其中的dATP浓度是dGTP、dCTP和dTTP各成分的浓度的5-10倍。
4.根据权利要求3所述的cfDNA末端修复缓冲液试剂,其特征在于,每50微升反应体系中,末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下:100-105mM Tris-Hcl,18-20mM MgCl2,15-20mM DTT、18-20mM KCl、0.05-1%NP40、0.05-1%Tween 20、1.5-2.5mM ATP、0.2-0.5mMdGTP、0.2-0.5mM dCTP和0.2-0.5mM dTTP。
5.根据权利要求3所述的cfDNA末端修复缓冲液试剂,其特征在于,末端修复时,每50ul反应体系中加入5ul的10×末端修复缓冲液,所述的10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下:
6.含有如权利要求1或2所述酶组合物以及如权利要求3-4中的任意一项所述缓冲液试剂的cfDNA末端修复试剂。
7.含有如权利要求6所述的cfDNA末端修复试剂的cfDNA末端修复试剂盒。
8.含有如权利要求6所述的cfDNA末端修复试剂的cfDNA建库试剂盒。
9.使用如权利要求6所述的cfDNA末端修复试剂进行cfDNA末端修复的方法,其特征在于,具体方法如下:在末端修复缓冲液试剂中用末端修复酶组合物处理cfDNA以产生末端平齐化且3'端加A的cfDNA;
所述的末端修复反应体系的pH值为8.0~8.3左右;
所述的反应条件为先在35~40℃反应10~15min;然后在60~70℃反应10~15min。
10.使用如权利要求6所述的cfDNA末端修复试剂进行cfDNA测序文库的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)在末端修复缓冲液试剂中用末端修复酶组合物处理cfDNA以产生5’端磷酸化且3’端加A的cfDNA;
2)末端修复产物接头连接反应,在末端修复体系中直接加入MGI接头、T4连接酶及T4连接Buffer,进行接头连接;
3)接头连接产物进行磁珠纯化,去除反应体系中的酶、盐离子及残余接头;
4)使用高保真DNA聚合酶,对连接产物进行富集,反应结束后磁珠纯化;
所述的步骤1)中,
末端修复反应体系的pH值为8.0-8.3左右;
反应条件为先在35~40℃反应10~15min;然后在60~70℃反应10~15min。
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CN202010194914.1A CN111378632B (zh) | 2020-03-19 | 2020-03-19 | cfDNA末端修复的酶组合物、缓冲液试剂和测序文库的构建方法 |
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