CN111373051A - 用于无扩增dna数据存储的方法、装置和*** - Google Patents

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保罗·莫拉
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Abstract

在各种实施方式中，公开了无扩增DNA信息方法、装置和***。一种无扩增信息存储和检索的方法包括使用编码方案将诸如二进制之类的数字数据编码为核苷酸序列基序，以及使用无扩增DNA写入过程合成复制DNA分子。解码存储在DNA中的信息的无扩增过程包括将复制的DNA分子中的至少一个分子暴露于分子电子传感器，该传感器在传感器的测量电参数中生成可识别信号，其中可识别信号对应于序列基序，提供对数字数据的解码。

Description

用于无扩增DNA数据存储的方法、装置和***
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年10月10日提交的、名称为“无扩增DNA数据存储的方法、装置和***”的美国临时专利申请号62/570,458的优先权和权益，其公开内容通过引用全部并入本文。
技术领域
本公开整体上涉及电子数据存储和检索，并且更具体地涉及使用DNA分子存储和检索数字数据的无扩增DNA信息存储和检索***。
背景技术
20世纪数字计算的出现产生了对大量数字或二进制数据进行档案存储的需求。档案存储旨在以非常低的成本长期(例如数年、数十年或更长时间)存储数据，并且支持较少地需要再次访问数据。尽管档案存储***可能具有以非常低的成本保存无限数量的数据的功能，例如通过能够长时间保持休眠状态的物理存储介质实现，但在这种***中数据写入和恢复可能相对流程缓慢，或者否则成本高昂。迄今为止，已开发的档案数字数据存储的主要形式包括磁带以及最近的紧凑型光盘(CD)。然而，随着数据产生的增长，需要更高的密度、更低的成本以及更长持续时间的档案数字数据存储***。
已发现，在生物学中，活生物体的基因组DNA作为数字信息档案存储的形式。在物种可能存在数千到数百万年的时间尺度上，基因组DNA实际上存储了定义该物种的遗传生物学信息。该生物所体现的复杂的酶促生化过程、物种的繁殖和生存提供了写入、读出和维护该信息档案的方式。此发现激发了如下思路：即可以利用DNA的基本信息存储能力作为更通用的数字信息的高密度、长时档案存储的基础。
DNA用于信息存储的吸引力在于：分子规模的信息存储产生极高的信息密度。例如，理论上，迄今记录的所有人类产生的数字信息(估计约为1ZB(泽字节，ZettaByte)(～1021字节))可以记录在少于1022个DNA碱基或1/60摩尔的DNA碱基中，其质量仅为10克。除了高数据密度外，DNA还是非常稳定的分子，可以很容易地保持数千年而没有实质损坏，并且可能持续更长的时间，长达数万年，甚至数百万年，例如天然观察到的永久冻土中冻结的DNA或琥珀包封的DNA。
尽管存在这些吸引力，但由于合成DNA分子时分子结构错误的许多来源，分子的丢失/降解以及用于对分子进行测序的DNA测序仪进行信号检测的限制，使用单个DNA分子进行数字信息存储和检索可能仍然效率低下甚至无法实现。因此，经常提出引入扩增以提供更多分子参与所有这些过程。然而，扩增将增加DNA信息***的成本、时间和操作复杂性。因此，需要的是一种特定的方法，该方法单独或共同消除了构成DNA数据存储***的各种方法中对扩增步骤的需要。
发明内容
在各种实施方式中，公开了无扩增DNA信息存储和检索***。在各个方面，该***包括DNA读出装置、数字数据编码/解码算法和DNA写入装置，其中这三种元件的性能被共同优化以最小化或减少各种成本指标并提高整体***性能。在各个方面，共同优化可以包括：通过平衡、避免或校正DNA读取和写入中的错误来降低***的错误率。在其他情况下，共同优化可以包括：例如通过避免使用较慢速度的DNA序列基序和/或通过使用错误校正/避免来补偿由于***的快速运行的错误从而减少***中DNA的读取或写入时间。
在本公开的各种实施方式中，描述了一种存档信息的方法。该方法包括：使用编码方案将信息转换为一个或多个核苷酸，预先确定所述核苷酸以产生与分子电子传感器的可测量电参数中的信息有关的可识别信号；以及将一个或多个核苷酸组装成核苷酸序列；以及在不扩增DNA分子的情况下合成复制DNA分子池，其中每个所述的复制DNA分子均包含核苷酸序列。
在各种实施方式中，所述信息包括二进制数据串。
在各种实施方式中，所述编码方案将二进制数据串内的一个或多个0/1位二进制数据转换为包含一个以上核苷酸的序列基序。
在各种实施方式中，所述转换信息的步骤包括将二进制数据串分成区段，其中每个区段编码一个序列基序。
在各种实施方式中，二进制数据位0编码A的均聚物，并且二进制数据位1编码C的均聚物。
在各种实施方式中，一个或多个核苷酸包含修饰的核苷酸。
在各种实施方式中，一个或多个核苷酸包含与相同核苷酸的变体相比抵制所述复制DNA分子中的二级结构形态的核苷酸。
在各种实施方式中，所述编码方案包括图4所示的BES1、BES2、BES3、BES4、BES5和BES6中的任何一个或组合。
在各种实施方式中，所述存档信息的方法还包括：将复制的DNA分子中的至少一种暴露于所述分子电子传感器，而无需事先扩增DNA分子；产生可识别的信号；并将所述可识别的信号转换为所述信息，其中所述分子电子传感器包括一对间隔开的电极和附着于每个电极以形成传感器电路的分子传感器复合物，其中所述分子传感器复合物包括电连接至一对隔开的电极中的每个电极的桥分子以及所述与桥分子共轭的探针分子。
在各种实施方式中，将至少一个复制DNA分子暴露于所述分子电子传感器的步骤包括将DNA分子池悬浮在缓冲液中，取缓冲液的等分试样，并将所述等分试样提供给所述传感器。
在各种实施方式中，所述缓冲溶液包含修饰的dNTP。
在各种实施方式中，所述传感器的可测量电参数包括在隔开的电极间并且通过所述分子传感器复合体的源极—漏极电流。
在各种实施方式中，用于所述传感器的探针分子包含聚合酶，并且在处理任一种复制DNA分子时，通过聚合酶的酶促活性来调节传感器的可测量电参数。
在各种实施方式中，所述聚合酶包含大肠杆菌聚合酶I的Klenow区段，并且所述桥分子包含双链DNA分子。
在本公开的各种实施方式中，描述了一种在无扩增DNA信息存储和检索***中归档和检索二进制数据串的方法。该方法包括：将所述二进制数据串分为至少一个二进制位的区段；将每个区段分配给序列基序，每个所述的序列基序包含至少两个核苷酸，预先确定所述序列基序以在分子电子传感器的可测量电参数中产生可识别的信号；将所述序列基序组装成核苷酸序列；使用无扩增DNA写入方法在固相支持体上合成复制DNA分子池，每个所述的复制DNA分子均包含所述核苷酸序列；将所述DNA分子池悬浮在缓冲液中；取缓冲液的等分试样；将所述等分试样提供给传感器，而无需事先扩增DNA分子；产生可识别的信号；并将所述可识别的信号转换为二进制数据串，其中所述传感器包括一对间隔开的电极和附着于每个电极上以形成分子电子电路的分子传感器复合物，其中所述分子传感器配合物包括电连接至一对隔开的电极中的每个电极的桥分子和与桥分子共轭的探针分子。
附图说明
图1示出了无扩增DNA数字数据存储***的实施方式；
图2示出了用于无扩增DNA数字数据存储***的实施方式的数据输入和检索的一般处理流程；
图3示出了用于无扩增DNA数字数据存储***的实施例方式的数据输入和检索的受限处理流程；
图4示出了使用DNA的二进制数据编码方案(BES)的实施方式；
图5示出了用于数字数据存储的DNA分子的DNA物理和逻辑结构的实例；
图6示出了能够在每个序列的分子复制物中产生许多不同序列的各种DNA合成方法的实施方式，其中每个序列使用具有M个合成起始位点的N个序列；
图7示出了分子电子感测电路的实施方式，其中桥分子形成电路并且测量电路参数随时间的变化，其中所测量的参数的变化包括桥分子与环境中其他相互作用分子的相互作用相对应的信号；
图8示出了基于聚合酶的分子传感器的实施方式，其可用作编码为合成DNA分子的数据的读取器。包含聚合酶的传感器在与不同的DNA分子特征相对应的受监控的电参数中产生可识别的信号，其中这些特征可用于将信息编码为合成DNA分子，然后可由传感器读取。
图9示出了基于聚合酶的分子传感器的实施方式，其中聚合酶分子连接至连接源电极和漏电极的桥分子，并且其中两个不同的序列基序AA和CCC在传感器的监测电参数中产生两个可识别的信号；
图10示出了大肠杆菌聚合酶I的Klenow区段的详细蛋白质结构，该酶是用在文中的DNA读取装置中的一种特定的聚合酶分子；
图11示出了分子电子传感器的实施方式，其中聚合酶从聚合酶上的特定位置轭合至连接在电极间的桥分子；
图12示出了图11的分子传感器的具体实施方式，其中桥分子包括双链DNA，聚合物—桥轭合包括生物素—链霉亲和素结合，并且其中电极包括钛上金，以支持从桥分子到每个电极的硫醇—金键；
图13示出了在本文的基本传感器实验中使用的纳米电极测试芯片和测试装置的实施方式；
图14示出了还包括金纳米点接触的金属纳米电极的实施方式，其被用于各种传感器实验中；
图15示出了通过处理A、T、C和G的均聚物序列获得的实验电流迹线；
图16示出了由图12的传感器产生的实验数据，其中示出了多聚腺苷酸和多聚肌苷酸的特定序列基序产生可识别的信号，表明了编码二进制数据的潜力；
图17示出了物理DNA结构和DNA数据存储分子的逻辑结构的关系，该DNA数据存储分子包括合适的衔接子、引物区段、缓冲区段和数据有效载荷区段。
图18示出了用于将DNA读取器传感器放置在芯片上以进行低成本大规模并行配置的制造堆栈的实施方式；
图19示出了基于芯片的聚合酶传感器阵列和包括跨阻放大器的示例性单像素电路的概念架构；
图20示出了用于图19的像素阵列芯片实施方式的具有256个像素的阵列的完整的、注释的芯片设计以及所制造的芯片的光学显微镜图像的实施方式；
图21示出了图20的制造的芯片的电子显微镜图像的示意图，包括在适当位置具有聚合酶分子复合物的纳米电极的插图；
图22示出了用于利用基于芯片的DNA读取器传感器读取DNA数据的完整***的实施方式的示意图，该***无扩增。
图23示出了基于云的DNA数据档案存储***的实施例的示意图，在该***中，聚集了图22的多个DNA读取***以提供数据读取器服务器，并且该***不进行扩增。
图24示出了DNA数据读取器传感器的替代实施方式，该传感器包括纳米孔离子电流传感器，该传感器在处理DNA时在纳米孔离子电流中产生可区别的信号特征。
图25示出了DNA数据读取器传感器的实施方式，其包括与跨越正电极和负电极的碳纳米管分子线复合的聚合酶，其在通过碳纳米管的测量电流中产生可识别的信号特征；以及
图26示出了与单个聚合酶复合的零模式波导传感器的实施方式，以横截面示出，其产生对应于DNA特征的可识别的光信号。
具体实施方式
在各种实施方式中，公开了利用DNA分子作为数字信息存储的通用手段而不扩增DNA的方法、装置和***。在各个方面，物质DNA不需要在整个信息存储***的任何方面或在本文的信息存储***的任何特定子***中进行扩增。扩增过程会给DNA信息存储***带来成本、时间、复杂性、性能可变性和其他限制的负担。此外，扩增与包含修饰的碱基的DNA不相容。因此，根据本公开的用于DNA信息存储的方法、装置和***被配置为避免DNA扩增。
在各种实施例中，公开了一种利用DNA分子作为数字信息存储的通用手段的DNA数据存储***。在某些方面，用于数字信息存储的***包括DNA读取设备、信息编码器/解码器算法和DNA写入设备。在各个方面，该***进一步包括用于管理物理DNA分子以支持数据归档操作的子***。公开了这些元件的相互关系及其共同优化。
在各种实施例中，公开了一种用于DNA数据存储***的数据读取器。在各个方面，DNA读取装置包括传感器，该传感器从单个DNA分子提取信息，因此不需要DNA扩增。传感器可以以基于芯片的格式布置。在各种实施例中，公开了支持这种基于芯片的传感器设备的数据读取***。
定义
如本文所用，术语“DNA”不仅可以指生物DNA分子，而且可以指通过各种化学合成方法(例如核苷酸亚磷酰胺化学方法)或通过DNA低聚物的串联连接制成的完全合成的形式，并且还可在碱基、糖或主链上形成化学修饰形式，其中许多是核酸生物化学领域的技术人员已知的，包括甲基化碱基、腺苷酸化碱基、其他表观遗传标记的碱基，或还包括非标准或通用碱基(例如肌苷或3-硝基吡咯)或其他核苷酸类似物、核糖核酸(ribobase)或无碱基位点或受损位点，还包括诸如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、异种核酸(XNA)(糖修饰形态的DNA家族，包括己糖醇核酸(HNA)、乙二醇核酸(GNA)等)，还包括生物化学相似的RNA分子以及合成的RNA和修饰的形式的RNA。在涉及的DNA存储***中使用的数据存储分子的情形中，术语DNA的使用暗含了所有这些与生物化学密切相关的形式，包括模板单链、单链上结合有寡聚物、双链DNA和带有结合基团的双链，例如修饰各种碱基的基团。另外，如本文所用，术语DNA可指此类分子的单链形式，以及双螺旋或双链形式，包括杂合双链形式，包括含有错配或非标准碱基配对的形式，或非标准螺旋形式(例如三链体形式)，以及部分双链的分子(例如与寡核苷酸引物结合的单链DNA)或具有发夹二级结构的分子。在各种实施方式中，DNA是指包含单链DNA组分的分子，该单链DNA组分具有结合的寡核苷酸区段和/或干扰基团，其可以作为探针分子例如聚合酶的底物，以进行加工，并在此过程中产生分子传感器的监控电参数中的可识别信号。
除非另有说明，否则本文所写的DNA序列(例如GATTACA)是指5'至3'方向的DNA。例如，本文所写的GATTACA代表单链DNA分子5'-G-A-T-T-A-C-A-3'。通常，本文使用的惯例遵循分子生物学领域中使用的书面DNA序列的标准惯例。
如本文所用，术语“寡核苷酸”或“结合寡核苷酸”是指DNA或上述类似形式的短链段，其长度为3个至100个碱基、或5个至40个碱基或10至30个碱基，可以与模板链中包含的互补序列杂交。这样的杂交可以通过完美的Watson-Crick碱基配对匹配，或者可以涉及错配或非标准碱基配对。
如本文所用，术语“探针分子”是指电连接在分子传感器中的一对间隔开的电极中的两个电极间的分子，其能够与传感器周围的环境中的分子相互作用以在与分子相互作用有关的分子传感器监测的电参数中提供扰动。本文中的探针分子可包含聚合酶分子或任何其他进行性酶，例如解旋酶或核酸外切酶。在本文用作DNA读取装置的分子传感器中，探针分子可以与桥分子轭合，该桥分子通过桥分子与电极间的直接键合而直接跨接在一对电极中的两个间隔开的电极上。
如本文所用，术语“聚合酶”是指是指一种酶，对于模板DNA或RNA链通过合并DNA或DNA类似物或者RNA或RNA类似物而催化形成核苷酸链。术语聚合酶包括但不限于：野生型和突变型的DNA聚合酶(例如Klenow E.Coli Pol I、Bst、Taq、Phi29、T7))、野生型和突变型的RNA聚合酶(例如T7、RNA Pol I)、野生型和突变型的逆转录酶(其对RNA模板操作以产生DNA，例如AMV和MMLV)。选择聚合酶是作为DNA读取器的分子传感器中探针分子。
如本文中所使用，“桥分子”是指结合在一对电极中的两个间隔开的电极间的分子，以跨越两个电极间的电极间隙并形成分子传感器的电路。在各种实施方式中，桥分子具有与电极间隙大致相同的长度，例如1nm至100nm，或在某些情况下为约10nm。用于本文的桥分子可以包含双链DNA，其他类似的DNA双链体结构，例如DNA—RNA、DNA—PNA或DNA—LNA或DNA—XNA双链体杂合体、肽、蛋白质α螺旋结构、抗体或抗体Fab结构域、石墨烯纳米带或碳纳米管、硅纳米线或分子电子领域的技术人员已知的各种分子线或导电分子中的任何其他分子。本文中的桥分子可以描述为具有“第一”和“第二”末端，例如作为桥分子的DNA分子的3'末端或附近的碱基以及5'末端或附近的碱基。例如，可以在一对间隔开的电极中对每个末端进行化学修饰，使得桥分子的第一末端结合至第一电极，桥分子的第二末端结合至第二电极。该术语有助于可视化跨越电极间隙并键合到一对间隔开的电极中的每个电极的桥分子。在各种实施方式中，可以对桥分子的第一和第二末端进行化学修饰，以提供桥分子和探针分子(例如聚合酶)之间和/或桥分子与在一对电极中一个或两个电极间的自组装。在非限制性实例中，桥分子的末端通过硫醇(-SH)-金键结合至一对间隔开的电极中的两个电极中的每个。
如本文所用，术语“传感器分子复合物”或“传感器探针复合物”是指探针分子和桥分子的组合，其中两个分子共轭在一起，并电组装到传感器电路中的组合，或一起连接到传感器电路的两个以上分子的任何组合。
如本文所用，术语“dNTP”是指用于生物合成DNA的标准的天然存在的核苷三磷酸(即dATP、dCTP、dGTP和dTTP)和它们的天然或合成类似物或修饰形式，包括那些带有碱基修饰、糖修饰或磷酸基团修饰，例如α硫醇修饰或γ磷酸修饰，或四、五、六或更长的磷酸盐链形式，或是具有额外基团在链中轭合到任意磷酸盐(例如β、γ或更高级磷酸盐)的任意前述结构的形式。通常，如本文所用，“dNTP”是指在延伸引物时可被聚合酶合并的或将进入该酶的活性凹穴并作为试配候选者瞬时接合以合并的任意核苷三磷酸类似物或修饰形式。
如本文所用，“缓冲液”、“缓冲溶液”和“试剂溶液”是指提供分子传感器可以在其中运行并从供应的DNA模板产生信号环境的溶液。在各种实施方式中，溶液是水溶液，其可以包含溶解的、悬浮的或乳化的组分，例如盐、pH缓冲剂、二价阳离子、表面活性剂、封闭剂、溶剂、模板引物寡核苷酸、与传感器的聚合酶复合的其他蛋白质，并且可能还包括聚合酶底物，即dNTP、dNTP的类似物或修饰形式以及DNA分子底物或模板。在非限制性实例中，缓冲液用于水合和悬浮以冻干状态留在DNA信息库中的DNA分子，以便将DNA提供给DNA阅读器以解码存储的信息。
如本文所使用的，“二进制数据”或“数字数据”是指使用标准二进制代码或以基数2{0,1}编码的数据、以十六进制基数16字母表编码的数据、以基数10{0-9}字母表编码的数据、使用ASCII字符编码的数据或使用任何其他离散符号或字符的线性编码方式的数据。
如本文所用，“数字数据编码格式”是指一系列二进制数字或其他符号数字或字符，这些二进制数字或字符来自用于编码DNA中信息的DNA序列特征的初步翻译，或此类已分类DNA特征的等效逻辑字符串。在一些实施方式中，可以将要存档为DNA的信息转换为二进制数据，或者最初可以二进制数据形式存在，然后此数据可进一步通过错误校正和组装信息而编码为直接翻译为由能够辨别的DNA序列特征提供的码的形式。后一种关联是信息的主要编码格式。组装和纠错过程的应用是解码的又一个辅助级别，回到恢复源信息。
如本文所用，“可识别的DNA序列特征”是指数据编码的DNA分子的那些特征，其在被诸如包含聚合酶的分子传感器处理时，产生与编码的信息相对应的不同信号。这样的特征可以是例如不同的碱基、不同的修饰的碱基或碱基类似物、不同的序列或序列基序，或这些的组合，以实现当通过传感器聚合酶处理时产生可识别信号的特征。
如本文所用，“DNA序列基序”是指特定字母(碱基)序列或代表这种字母序列的特定集合任何成员的样式。例如，以下是特定字母序列的序列基序：GATTACA、TAC或C。相反，以下是作为模式的序列基序：G[A/T]A是代表明确的序列集{GAA、GTA}，并且G[2-5]是引用序列{GG、GGG、GGGG、GGGGG}的集合的模式。明确的序列集是对主题的明确描述，而诸如此类的图案速记符号是描述此类集合的常见紧凑方式。在各种情况下，诸如此类的基序序列可以描述天然DNA碱基，或可以描述修饰的碱基。在各种情况下，基序序列可以描述模板DNA分子的序列，和/或可以描述分子上与模板互补的序列。
如本文所用，在模式的情况下，“具有能够识别的信号的序列基序”(在样式情况下)是指：存在第一基序样式体现第一组显性序列且该序列中的任一项产生第一信号，存在第二基序样式体现第二组显性序列且该序列中的任一项产生第二信号，且第一信号区别于第二信号。例如，如果基序G[A/T]A和基序G[3-5]产生能够辨别的信号，则其意味着：组{GAA,GTA}中的任一项产生第一信号，而组{GGG,GGGG,GGGGG}中的任一项产生第二信号(区别于第一信号)。
如本文所用，“可识别的信号”是指来自传感器的一个电信号在数量上(例如峰值幅度、信号持续时间等)或在质量上(例如峰值形状等)可与传感器的另一个电信号可辨别地区别，以便可以将差异用于特定用途。在非限制性实例中，如果来自工作分子传感器的两个电流峰值在时间上的差异大于约1×10-10安培，则它们是可识别的。这种差异足以将两个峰值用作两个不同的二进制位读数，例如0和1。在某些情况下，第一个峰值可能具有正振幅，例如，从大约1×10-10安培到大约20×10-10安培振幅，而第二个峰值可能具有负振幅，例如，从大约0安培到大约﹣5×10-10安培振幅，使得这些峰值可辨别地不同并且可用于编码不同的二进制位，即0或1。
如本文所用，“数据编码DNA分子”或“DNA数据编码分子”是指合成以编码DNA分子结构内数据的DNA分子，以后可以检索该数据。
如本文所用，“从DNA读取数据”是指测量可识别事件的任何方法，例如电路的受监视电参数中的电信号或其他扰动，其对应于内置于合成DNA中的合成DNA分子的分子特征。合成DNA将信息编码到DNA分子中。
如本文中所使用的，“电极”是指成对布置并且由任一对电极中的两个电极间的纳米级电极间隙隔开的纳米级电导体(更简单地，“纳米电极”)。在各种实施方式中，术语“电极”可以指源极、漏极或栅极。栅电极可以电容性地耦合到源电极和漏电极间的间隙区域，并且可以包括“埋栅”、“背栅”或“侧栅”。一对间隔开的电极中的电极可以具体称为(在各种附图中如此标记)“源”电极和“漏”电极，“正”电极和“负”电极或“第一”电极和“第二”电极。每当本文中任何附图中的电极分别标记为“正极”和“负极”时，应理解所指示的极性可以颠倒(即图中两个元素的标号可以颠倒)，除非另有说明(例如电子可能流向负极的实施方式)。一对电极中的纳米级电极间测量的电极间隔约为1nm至100nm，并且每个电极在此相同的纳米级范围内也可以具有其他关键尺寸，例如宽度、高度和长度。这样的纳米电极可以由各种具有导电性和机械稳定性的材料组成。它们可以由金属或半导体组成，例如由这些材料的组合组成。金属电极可以包括例如钛、铬、铂或钯。可以通过纳米级光刻技术将成对的间隔开的电极设置在基板上。
如本文所用，术语“轭合”是指化学领域中已知的任何类型的化学键合(即键)，例如共价、离子、范德华等。可以通过偶联化学领域技术人员已知的轭合方法各种，例如生物素—亲和素偶联、硫醇—金偶联、半胱氨酸—马来酰亚胺偶联、金结合肽或材料结合肽、点击化学偶联(click chemistry coupling)，侦探—侦探捕获(Spy-Spy Catcher)蛋白相互作用偶联或抗体—抗原结合(例如(FLAG肽标签/抗FLAG抗体***)等，来实现探针分子(例如作为聚合酶)与诸如双链DNA分子之类的桥分子或桥分子与电极或电极上金属沉积物之间的轭合。探针分子与一对隔开的电极中的每个电极的共轭包括将探针分子的“电连接”或“电布线”连接到包括探针分子和一对电极的电路中。换句话说，探针分子与一对电极中的每个电极共轭，以在电极之间提供导电通路，否则该电极间的电极间隙会将它们彼此绝缘。通过探针分子的化学键(例如通过C-C键)的离域/移动来提供导电路径。在各种实施方式中，通过重组方法或合成生物学方法工程化成探针分子(例如聚合酶)的轭合位点可包含半胱氨酸、醛标记位点(例如肽基序CxPxR)、四半胱氨酸基序(例如肽基序CCPGCC)和非天然或非标准氨基酸(NSAA)位点，例如通过使用扩展的遗传密码引入对乙酰基苯丙氨酸或非天然可交联氨基酸，例如通过使用5-溴尿苷的RNA-或DNA-蛋白质交联(参见Gott,JM等人，Biochemistry，30(25)，6290-6295(1991))。
如本文所用，术语“扩增”是指分子生物学方法，其产生DNA分子的一个或多个拷贝，并且当在合适的DNA分子的库中进行时共同地实现该库的复制。此类复制方法包括将DNA分子转换为RNA，反之亦然。此类方法包括所有形式的指数复制，例如PCR，其中从一组初始模板产生的拷贝数随循环数或时间成指数增长。这包括分子生物学技术人员已知的PCR的许多变化或扩展。这些包括例如等温方法和滚环方法以及依靠切口或重组酶来产生引发位点的方法，或诸如LAMP、DMA或RPA的扩增方法。这样的方法还包括线性扩增方法，其中产生的拷贝数随循环数或时间线性增长，例如T7扩增或使用具有热循环的单一引物或通过等温手段重新启动引物的聚合酶延伸。这包括使用简并引物或随机引物。本文使用的扩增还明确地包括创建单链模板的互补链的特殊情况，例如，在数据存储过程中，例如在阅读器情形下(在恢复存储数据的过程中阅读2条链)，这种互补链还用于表示存储的信息。这样的互补链可以与其互补链保留在存储DNA分子中的双链物理构象中，或者可以与互补链分开存在于存储***中，无论哪种情况，都构成了用于信息存储的原始模板的扩增(即复制)。这与DNA读取器在从单链模板读取数据的过程中生成一条互补链的情况有所区别，该链条不是本文所用的术语扩增，因为在这种情况下，这种链仅是读取过程的副产物，并且其本身用作信息编码分子，可以从中潜在地提取信息。产生这种副产物链的DNA阅读器包括本文所述的以及图8～12和24～26所示的聚合酶分子电子阅读器。如本文所用，此类DNA读取器***是无扩增的。
免扩增DNA数字数据存储：
参照各个附图，公开了根据本公开的并且可用于存档和以后访问所存储的数据的无扩增DNA数据存储方法、装置和***的各个方面：
图1示出了根据本公开的免扩增DNA信息存储***的实施方式。如图1所示，免扩增DNA存储***包括信息编码器/解码器算法、DNA写入设备(合成器)、DNA读取设备(测序仪)和用于管理数据物理存储器中物理DNA分子的库管理子***，以支持归档操作。此实例显示了DNA存储***的主要元件，包括用于在存储过程中处理和维护DNA材料的物理***，并且该物理***对存储的档案进行操作(例如复制)。外部计算机对***进行高级控制，提供存储信息并接收提取的信息。信息被编码为DNA序列，合成为DNA分子，进行存储，然后读取、解码和输出。另外，这种***也能够对DNA档案材料样品进行物理I/O。
图2说明了主要的DNA存储***信息阶段和过程，包括整个***内存在的主要信息阶段(在图2中以方框表示)，以及主要操作从一种形式转换为另一种形式(在图2中用箭头表示)。如图2所示，写入、读取和库管理的每个元素都包含物理处理DNA分子的步骤。
如图3所示，本***的一个方面是这些过程(图2的过程)没有任何扩增所存储DNA。即DNA存储***是无扩增的。图3中描绘了用于无扩增元件的各种方法和装置。在各种实施方式中，DNA存储***是完全无扩增的。即图2所示的所有过程都是无扩增的。在其他实施方式中，根据本公开的DNA存储***可以包括无扩增元件，但是该***总体上可能不是完全无扩增的。尽管如此，***中并非完全没有扩增的无扩增元件仍具有单独的好处。这样的***不是完全没有扩增，而是包括至少一个没有扩增的过程，在本文中被称为“还原扩增”DNA信息存储***。
下面详细描述根据本公开的DNA数据存储***的每个主要元件，包括该***的每个元件如何与DNA扩增有关或涉及DNA扩增，以及如何为DNA数据存储***配置相关的无扩增元件。
在本公开的各个方面，DNA信息存储***包括：编码器/解码器、DNA写装置和DNA读取装置。
编码器/解码器：
在各个方面，编码器/解码器提供两个功能：编码器部分将给定的数字/二进制信息或数据转换成特定的DNA序列数据集，这些特定的DNA序列数据被输入到DNA写入器。解码器然后部分将由DNA读取器提供的一组指定类型的DNA序列翻译回数字信息。
图4示出了用于将二进制数据转换成DNA序列的几种二进制编码方案(在本文中称为“BES”)。本文使用的其他编码方案包括那些能够支持错误检测和错误校正的方案。在这些示例编码方案中，将要存储为DNA的原始数字数据通常以电子二进制数据的形式产生。在各种示例中，信息(例如语言、音乐等)可以首先被转换为电子二进制数据。然后将这些原始二进制数据划分为多个段，通过重组数据进行扩充，并通过适用于DNA数据存储的纠错编码进行转换，以生成实际的二进制数据有效载荷段(例如图4中所示)，然后需要将其转换为DNA，用于随后的DNA合成以产生物理存储分子的DNA序列。如下面将更详细地讨论，DNA逻辑结构包括其中编码特定数据的数据有效载荷段。在各种实施方式中，数据有效载荷段包括与存储方法的元数据一起存储的实际主要数字数据，其可以包括与将这样的信息区段正确地组装成更长的字符串有关的数据，和/或与错误检测和校正有关的数据，例如校验位、校验和或其他此类高架数据(information overhead)。
在各种实施例中，由二进制到DNA序列的初级翻译是由二进制编码方案(BES)执行的，例如图4中例示的那些。这些编码方案通过首先生成一系列暗示相应DNA区段的可识别的信号特征而提供了从数字数据格式(诸如二进制数据格式)到DNA分子序列格式的初级翻译。这些信号特征暗示了对应的DNA区段，这些区段被组装成编码DNA分子。选择哪种BES是适当的，部分取决于可识别的信号特征的类型及其布置(如下面在图8的上下文中讨论并在图8的插图中所示)。如本文中所讨论的，优选包括将一位数字二进制数据转换成一个以上的DNA碱基的BES，至少是为了减少否则将在DNA写入和DNA读取中发生的错误。
图4示出了几种这样的主要编码，从示例二进制数据有效载荷，特定的32位字“00101001100111001111101000101101”开始，并将二进制数据转换为编码的DNA分子的一个或多个可识别的信号特征。如图4所示，BES1是将2位数据编码为1个DNA字母，例如将1位数据编码为2个可识别的信号特征F1和F2，用于可识别这些特征的DNA读取传感器；BES2是将两个二进制数字编码成两个基数(每个一个二进制位一个DNA字母)，例如将两个二进制位00、01、10和11的组合编码成四个特征F1、F2、F3和F4，以供使用具有区分这些特征的DNA读取传感器；BES3显示了一个示例，其中使用序列束的长度来编码信息，这适用于从DNA读取传感器读取这种序列产生可识别信号的情况。BES将两个二进制数字编码成两个基数，即AA和CCC(每一个二进制位一个DNA字母)。例如BES3将二进制字符串0、1和00编码为3个可识别的特征F1、F2和F3。BES4和BES5说明了可能使用的其他DNA碱基，例如碱基类似物的修饰碱基，在此表示为X、Y、Z和W。如果此类类似物产生了来自DNA读取器的可识别信号，则可以在BES4中使用两个此类可识别的类似物实现二进制代码。BES5总共使用8个可识别的DNA字母表示3位二进制数据，使用由4个天然碱基和4个修饰碱基组成的DNA分子编码8种可能的1/0 3位状态(每3位数据1个DNA碱基或修饰碱基)。BES6说明了使用序列基序编码二进制信息(每一个二进制位一个DNA序列基序)，在这种情况下，这些基序会产生可识别的信号轨迹。
本文中使用的编码方案必须具有能够区分编码特征信号的关联传感器，例如基于聚合酶的分子传感器，以便BES的选择与区分特征的传感器特性直接相关。除了二进制以外的数字数据格式或字母，例如十六进制、十进制、ASCII等，也可以通过类似于图4的BES的方案很好地编码为DNA信号特征。在最优信息密度方面，方案比现实的更复杂，例如Lempel-Ziv编码可以高效地将数据从一个字母转换为另一个字母并将其压缩。通常，为了将二进制或其他数字数据有效载荷字符串或字符串集合转换为DNA序列字符串或此类字符串的集合，可以使用无损和有损编码或压缩的方法来设计方案，用于将输入的数字数据有效载荷初次转换为DNA数据有效载荷。
在示例性的实施方式中，基于聚合酶的分子电子传感器在遇到与存在于合适的缓冲液中的合成DNA分子中各自的反向互补模板区段F1＝5'-GGGG-3'、F2＝5'-CCCC-3'和F3＝5'-TTTT-3'结合的寡核苷酸5'-CCCC-3'、5'-GGGG-3'和5'-AAAA-3'的可识别信号特征时，在传感器的监测电参数中产生可识别信号。在该实施例中，使用二进制编码方案，其中位0被编码为GGGG(即F1)，位1被编码为CCCC，即F2，并且二进制串00被编码为TTTT，即F3。注意，该编码方案包括将00编码为TTTT，即编码为数据串00而不是编码为GGGGGGGG的两个连续数据位0。然后，使用该编码方案将输入的二进制数据有效载荷“01001”编码为核苷酸序列，以整合入合成的DNA分子中。通过将二进制数据01001的输入数据串分为段0、1、00和1，并将这些数据段转换为F1-F2-F3-F1的特征序列，开始转换为F1-F2-F3-F1的特征序列。编码的DNA分子为5'-GGGGCCCCTTTTGGGG-3'。在其他实施方式中，在可识别的信号特征之间可以***“标点”序列区段，其不改变可识别的特征，例如结合的寡核苷酸，其提供诸如适应DNA合成化学的特殊性质或约束的益处，或提供间隔物，以增加信号特征之间的时间间隔或减少空间位阻，或改善DNA分子的结构。例如，如果A是这样的标点序列，则DNA编码序列将变为5'-AGGGGACCCCATTTTAGGGGA-3'。通常，这样的标点序列或填充序列的***可以是从数字数据有效载荷转换为要合成的编码DNA序列的过程的一部分。
在各种实施方式中，可以使用三种状态A、B、C对诸如010011100010之类的二进制数据进行编码，其中，每当出现00时，0编码为A，1编码为B，00编码为C(即不是将00编码为AA)。根据此方案，二进制字010011100010等效于编码形式ABCBBBCABA。
通常，为了将二进制或其他数字数据有效载荷字符串或字符串集合转换为DNA序列字符串或此类字符串的集合，许多无损和有损编码或压缩方法(例如计算机科学中众所周知的方法)可以用于设计将输入数字数据有效载荷初步转换为DNA序列数据有效载荷的方案，作为可识别特征DNA区段的字符串，概括了图4的示例。在这种较广泛的语境下，图4中示例的BES方案说明了可以成为数据编码字母符号的特征元素的类型，例如标准碱基、修饰的碱基或序列基序或序列读出(run)，前提是这些元素具有同源的读取器传感器。
图5示出了物理DNA分子与其中编码的数字数据之间的关系。物理DNA可以单链或双链形式存在，例如，取决于存储***的详细信息。在所示的逻辑结构中，序列数据有效载荷表示二进制数据，包括纠错和寻址信息，并且仅包含物理DNA分子序列的一部分。可能存在与DNA的物理处理相关的其他左侧(LEFT)和右侧(RIGHT)序列区段，例如特定互补寡核苷酸的结合位点，带有其他形式可用于DNA操作的常用结合基团的区域(例如生物素位点)或提供空间间隔部分或用于校准读取或写入***的属性的序列段。由于编码器/解码器过程通常是对数据而不是对物理DNA进行的，因此它本身通常不需要或规定任何形式的DNA物理扩增。
继续参考图5，所示的DNA逻辑结构是携带信息的DNA区段的示例结构。在这个例子中，引物(PRIMER)区段包含引物靶/结构。此外，L-BUFFER区段可以包含用于DNA读取器的信号校准序列，或在数据有效荷载(DATA PAYLOAD)区段之前的缓冲序列，其包含存储编码序列和相关的纠错序列例如校验位的信息。R-BUFFER可能包含其他校准序列以及允许探针分子(例如聚合酶)避免在读取DNA时过于靠近模板末端的缓冲序列。L适配子(ADAPTER)和R适配子可以是与相关DNA区段的存储或操作有关的序列元件，例如用于PCR扩增的外部引物位点的衔接子，或基于杂交的选择，或代表该***区段的周围载体DNA，包括***宿主生物基因组作为载体。逻辑结构的数据有效载荷部分通常可以包括正在归档的实际主要数据以及用于存储方法的元数据，例如与将该信息组装成更大的字符串或错误检测和纠正有关的元数据。
DNA写入装置：
在各种实施方式中，用于本文的DNA写装置获得指定组的输入DNA序列数据，并产生具有这些序列的DNA分子。对于每个所需序列，产生代表该序列的多个DNA分子。对于每个所需的序列，产生的分子多样性可以在10、100、1000、数百万、数十亿或数万亿个DNA分子拷贝的范围内。代表所有所需序列的所有这些拷贝可以合并到一个分子主库中。这种DNA书写***的典型特征是书写不完美，并且如果合成了N个分子来表示给定的输入序列，则并非所有这些分子都能真正实现所需的序列。例如，它们可能包含错误的删除、***或不正确或物理损坏的碱基。这样的***通常将依赖于合成DNA分子的一些主要手段，例如包括化学反应以及根据所合成的不同序列的数量来大规模执行该过程的流体***(例如参见Kosuri和Church，“大规模从头合成DNA：技术与应用”，《自然方法》，11：499-509，2014)。合成DNA分子的方法和装置的非限制性实例包括由安捷伦科技公司和Twist BioScience提供的商业技术。
图6示出了合成DNA分子的方法。在各种实施方式中，合成DNA的主要方法在不使用任何扩增程序的情况下共同合成了相同DNA序列的许多实例。这样的方法执行许多物理或化学分离的反应，其中每个分离的区域包括用于合成每个靶序列的许多分子起始位点。在图6中，分子起始位点表示为“M”，并且位于例如所示的固体支持物表面上。不同的靶序列“N”沿着表面在不同的分离反应区域中产生，使同一反应中的所有起始位点发生反应，其中这些反应可以按时间顺序或并行应用于不同的序列靶，例如取决于使用的***。这些偶联反应，例如图6中从A到B到C，将一个或多个所需的碱基添加到在该区域的起始位点延长的分子中。该方法包括诸如经典的亚磷酰胺DNA合成的方法，以及可能依赖于酶促加成碱基的方法，诸如利用末端转移酶实现碱基加成的方法。
在各种实施方式中，可以基于核苷酸在形成分子的写入过程中的合成容易度，在合成分子中形成二级结构的倾向降低和/或在数据解码过程中的读取容易度，优先选择核苷酸以整合到核苷酸序列中。在各个方面，在选择核苷酸结合到核苷酸序列时避免了不良的写入基序和不良的阅读基序，着重于在核苷酸序列中整合入当读取该核苷酸序列以解码编码信息的核苷酸时将产生相互可识别的信号的区段。例如，在读取核苷酸序列时，可以相互区分A和T，可以相互区分C和G，可以相互区分A、C和G，可以相互区分AAA和TT，可以相互区分A、GG和ATA，可以相互区分C、G、AAA，可以相互区分TTTT和GTGTG。这些以及许多其他的核苷酸和核苷酸区段的集合提供了在阅读器中相互可识别的信号，因此，当将一组信息编码成核苷酸序列时，可以考虑将其整合到核苷酸序列中。
另外，存在难以写入的核苷酸区段，因此应避免将一组信息编码成核苷酸序列。在各种实施方式中，将一组信息编码成核苷酸序列包括使用剩余的可识别特征集合中的一个作为编码符号，例如可以对应于二进制0/1、三进制0/1/2或四进制0/1/2/3代码等，以及纠错编码来定义信息集，从而避免了难以阅读和难以写入的特征。以此方式，改善了信息存储***的整体性能。
DNA读取装置：
在各个方面，本文中使用的DNA读取装置是一种装置，该装置获取DNA分子库并针对从该库中采样或选择的每个分子产生一组测量信号。然后将此类信号翻译成DNA序列，或用于表征DNA分子中存在的基本模式或基序。目前用于读取存储在DNA中的数据的方法可能依赖于商业下一代DNA测序仪，以从DNA样品中初步回收序列。这样的阅读器实际上只检查引入***的一小部分DNA分子，因此只有一小部分会进行实际的读取尝试。因此，鉴于大多数输入的DNA分子从未被分析过，只是被浪费掉了，因此在DNA读取之前进行扩增是很常见的。此外，许多DNA测序方法为了准备测序都将扩增步骤作为将DNA扩增到表面或珠子上的基本步骤，例如商业Illumina HiSeq***(Illumina，Inc.)454System(Roche，Inc.)或IonTorrent System(Thermo Fisher，Inc.)，或采用经典的Sanger测序方法，例如使用热循环终止子测序反应产生足够的输入物质，以满足检测过程的限制。此外，在纳米孔测序中可能存在扩增步骤。其他方法可以使用扩增来添加标签以进行测序。
DNA测序方法也可以在样品制备阶段分别依靠一轮或多轮扩增程序。此类方法已用于添加衔接子DNA区段以支持后续处理。另外，某些测序方法至少要求单链模板具有互补链以进行测序，例如Pacific BioSciences，Inc.的“Circular Consensus Sequencing”或Oxford Nanopore Technologic，Inc.的“2D”发夹测序。这种方法，如果以单链模板作为输入，则需要一个至少具有一轮延伸的过程，即一种扩增形式，以在开始实际测序之前产生互补链。另外，对于初级测序过程需要相对大量输入模板的方法，例如具有无效孔加载的纳米孔测序，也可能需要扩增输入DNA以达到所需输入量下限。
DNA文库管理：
在各种实施方式中，DNA文库管理包括对物理DNA进行的操作程序以及相关方法和装置的集合。一些这样的过程涉及DNA的物理存储和检索的机制，例如由溶液干燥DNA，将干燥的DNA重新悬浮到溶液中以及将物理量的DNA转移和存储(例如放入冷冻机中或取出)。其他过程与信息存储管理有关，例如制作数据副本，删除数据和选择数据子集，所有这些都需要对DNA材料进行物理操作。通常使用PCR扩增或线性扩增方法来复制DNA或从库中选择DNA，因此用于库管理的常用方法可能依赖于DNA的扩增。例如，对于已准备好的具有PCR引物位点的文库，可以通过提取DNA的代表性样本，然后进行PCR扩增使其达到复制所需的数量，来复制整个档案。再例如，对于用体积特异性PCR引物制备的文库，可通过使用PCR引物从代表整个文库的小DNA样品中仅扩增所需体积来从文库中选择体积。
在DNA数字数据存储中扩增的动机：
由上述元素(DNA写入器、DNA读取器)构想的DNA信息存储***可能无法在特定的单个分子水平上有效地工作，因此激发了扩增的使用。也就是说，如果存在目标DNA数据存储序列(例如GATTACA)，则仅制作一个代表该序列的物理分子，然后存档和处理该单个分子，然后从该单个分子读取数据是不可行的。不可行是由于许多此类组成过程中存在许多分子结构错误，分子损失和信号检测极限的原因。因此，经常提出在该过程的各个阶段存在单个分子的扩增，以提供更多的试验分子来参与所有这些过程。因此，本文所实现的目的是提供具体的方法，其单独地或共同地消除了构成DNA数据存储***的各种方法中对扩增步骤的需要。
免扩增方法和仪器在DNA数据存储中的优势：
DNA信息存储***中的无扩增过程有很多好处。通常，根据过程的直接要求，在信息存储***中扩增DNA将增加***的成本、时间和操作复杂性。扩增通常还会比其他序列扩增更多的序列，因此它可能会在存储***的数据中引入代表性的偏差，这可能导致信息丢失或信息不准确，或者恢复信息的时间或成本增加。扩增还会在DNA序列中产生错误，因为所涉及的酶会在复制过程中产生错误，或者会产生包含不同模板DNA的序列部分的嵌合分子，或者不是完整拷贝的部分分子。因此，扩增会导致数据错误或伪造的“噪声”分子。DNA扩增还可能导致污染，因为扩增过程中产生的大量DNA可能污染其他未扩增的样品，并导致此类样品中总DNA含量的很大一部分来自污染源。因此，扩增可能会导致存储数据“损坏”。扩增方法通常还需要在DNA分子的末端有一个、两个或多个侧翼引物序列，以支持用于实现扩增的引物和酶促延伸过程。此类引物序列通常长度在6至30个碱基范围内，必须合成到DNA分子中，所以增加了成本、复杂性以及DNA写入过程中出现错误的可能性。
扩增通常也不能复制DNA修饰，DNA修饰在核酸化学中是众所周知的，并用于本文所述的方法中。因此，在DNA数据存储***中的任何点上使用扩增极大地限制了使用这种修饰DNA的大的多样性，否则其可被用于改善DNA数据存储***的性能。因此无扩增***的优点在于，这种***能够使用这种修饰形式的DNA用作信息存储分子。例如，修饰的DNA可以包含DNA碱基上的取代基，当传感器读取DNA时，该取代基会增加传感器中的信噪比，从而大大提高了读取***的功率。DNA修饰可用于增强写入过程，所得分子的稳定性，或增强处理和读取分子数据的能力。通过具有仅受信任方知道的可检测的修饰，或者只有特殊的读取***才能读取的修饰，修饰的DNA的使用才可供数据安全性或加密。这类化学领域的技术人员已知许多类型的修饰，它们可潜在地用于增强DNA数据存储***的功能，例如修饰的碱基、对DNA骨架的修饰，例如在肽核酸(PNA)中或骨架的硫醇磷酸或碘磷酸修饰，或其他DNA类似物，例如锁核酸(LNA)或多种异种核酸(XNA)，或糖环的修饰，或甲基化的碱基，或标记的碱基，或在DNA分子各个位置添加其他化学基团，例如生物素或其他轭合或结合基团，或为阅读器产生更强信号的基团。
根据本公开的DNA数字数据存储***通过完全无扩增或通过包含至少一个无扩增子***而具有较低的操作成本。本***的另一个优点是可以减少存储和/或恢复信息所花费的时间。另一个好处是该***可能具有较低的复杂性，因此较低的总保有成本、较低的故障风险或较长的平均故障间隔时间。另一个好处是，避免了扩增过程中固有的表达偏差，从而在写入、提取或读取DNA时，所涉及的各种序列在这些各自的过程中以及在用于存储和检索信息的整个***中获得了更均等的表达。避免由扩增造成的引入错误或数据损坏的形式还有另一个好处。避免需要将扩增引物序列合成到DNA分子中是另一个益处。另一个好处是消除了扩增产物对其他DNA数据存储样品的潜在污染，从而提高了***完整性、鲁棒性、效率和安全性。另一个好处是，无扩增的DNA信息***或其中的子***与修饰的DNA保持兼容，修饰的DNA可能包含对DNA的碱基、糖或主链的修饰，并且可以提供更有效的阅读***(例如增强的传感器信号)或更有效的书写***(例如更有效的合成化学)，或者可以提供更多选项来将信息编码为DNA。
写入中避免扩增的方法：
在各种实施方式中，提供了用于写DNA的合成方法，其针对每个所需序列共合成物理DNA分子的许多实例。图6显示了旨在从每个靶序列的M个不同的起始位点产生代表N个靶序列的DNA分子的合成过程。这里，该方法包括循环合成反应，该循环合成反应通过区域或化学分离的和局部的本体反应连续地平行于这些M位点添加一个碱基或碱基区段。理想地，产生M个DNA分子，全部代表靶DNA序列。对于这种周期性的、连续的碱基加成过程，自然产生了每个靶DNA序列的共同合成的复制品，因此它们可以提供无扩增过程，用于写入每个靶DNA序列的M个物理实例。这样的方法可以是无扩增DNA存储***的一部分。此类DNA合成方法的实例包括用于印刷DNA寡核苷酸的喷墨打印机合成方法，例如由Twist Bioscience，Inc.和Agilent，Inc.在商业上完成的DNA寡核苷酸的光导平行合成，例如已经由Affymetrix，Inc.和Nimblegen，Inc.商业完成，以及许多用于操作大量小体积或微流体的经典亚磷酰胺DNA合成反应的方法，例如Applied Biosystems，Inc.已经完成的在他们的3900DNA合成仪中(48个平行合成柱)。因此，通过在这样的合成过程中直接共合成大量每个靶序列的分子，避免了合成后扩增这些合成产物以产生所需数目的拷贝。
读取中避免扩增的方法：
使用当前的测序技术读取DNA时，通常需要扩增输入的DNA。在某些方法中，发生这种情况是因为该方法需要较大的输入量，因此需要的DNA数量要比从各种样品来源通常可获得的DNA大得多。在其他方法中，测序文库的创建包括扩增步骤。在其他通常称为克隆测序方法的方法中，必须直接产生许多待测序分子的副本，并将其定位在支持体上，作为测序过程的组成部分，例如Solexa/HiSeq仪器中使用的DNA簇(Illumina，Inc.)，Ion Torrent仪器(Thermo Fisher，Inc.)中使用的DNA“SNAP或ISP”磁珠，或ABI SOLiD仪器(LifeTechnologies，Inc.)所需的DNA磁珠，或454仪器(Roche，Inc.)中使用的磁珠。通过使用合适的单分子测序方法可以消除这种扩增要求。在此类方法中，传感器分析单个DNA分子，以产生基本序列读取或从分子中提取数据。原则上，这种方法不需要在传感器分析前扩增DNA分子。因此，利用合适的单分子DNA读取传感器提供了实现无扩增读取的手段。图24和25示出了这种DNA测序的单分子方法。
还值得注意的是使用其上连接有聚合酶的碳纳米管产生电信号的方法，如图25中所示的传感器。但应注意，虽然原则上，这种单分子测序***如在商业上所使用的那样可以提供无扩增的读数，这种***通常需要在其已建立的方案中进行扩增。例如，OxfordNanopore Minion测序仪在标准方案中需要微克数量的输入DNA，这可能需要某种形式的扩增才能在DNA数据存储的情形下实现。此外，牛津***“2D”测序的首选测序模式需要具有双链分子，因为在样品制备阶段将其与发夹衔接子连接后，它会读取两条链以产生更准确的一致性序列。这通常将需要酶促扩增步骤以合成用于初级单链合成存储分子的互补DNA链。其他测序仪可能需要双链输入DNA，因此通常需要扩增步骤才能从初级级单链合成存储分子产生互补链。
如图7-23和25所示，不需要任何扩增而读取的DNA的单分子DNA读取器的实施方式是布置在CMOS传感器像素阵列芯片上的分子电子传感器，在下面进一步描述。
在DNA档案管理中避免扩增的方法：
DNA数据存储档案管理***可能包含的主要操作如下：
1.DNA存储存档操作
对于给定的存档，可能需要执行以下操作：
·创建存档的副本；
·将数据追加到存档；
·从存档中读取目标卷；
·从存档中删除卷；和
·搜索档案。
在各种实施方式中，根据本公开的DNA档案库主要以DNA分子的集合(即混合物)的物理状态以存在，每个所需的DNA序列由许多分子实例表示。DNA分子库可以干燥状态或溶液状态存储。在任何情况下，都可以在兼容的缓冲液中将存档暂时提升到工作温度，以执行这些操作。这些操作将由物理存储***有效地执行，该物理存储***可以包括用于管的自动化处理、液体处理、进行生化反应以及与维护和操作物理档案资料有关的其他过程。
无需扩增即可实现这些与存储相关的操作，与通常通过扩增完成这些操作相反，如下所示：
2.复制
通过简单地取等分的储备溶液，可以在不进行任何扩增的情况下执行复制存档的操作。只要提供足够的数量以支持将来的信息检索，并且还可能支持有限数量的其他存档操作(例如进一步的复制)，就可以提供功能副本。相比之下，通常会通过扩增来完成复制，例如在编码的DNA分子中包含扩增引物位点，因此可以从库存中提取少量样品，然后在线性或指数扩增反应中引发和扩增，获得代表原始档案的功能副本的大量材料。因此，提供了避免这种用于复制档案的扩增过程的有益方式。
也可以使用无扩增DNA读取***拷贝档案以从档案读取所有信息，然后使用无扩增DNA写入***将所有信息写入新的DNA档案中，从而获得原始DNA数据档案的DNA数据副本。
3.添加
只需将其他DNA或存档材料集中起来并与之混合，就可以将数据添加到存档或合并存档中。这不需要扩增。
4.针对性的读取
可以通过将对于每个卷可访问的具有不同标识符/结合序列的DNA分子序列特异性寡核苷酸结合位点编码，以无扩增的方式对档案库中的各个“卷”进行操作。然后，为了读出特定体积，可以使用基于杂交的捕获来选择具有所需结合序列的特定DNA区段。该过程可以无扩增。还可以通过合成具有核苷酸修饰的DNA来添加体积标识符，因此相关的结合靶标本身并不是通过DNA序列特异性杂交，而是在合成中使用碱基上的其他修饰。例如，使用生物素化的碱基或带有各种半抗原修饰的碱基、PNA、非典型DNA碱基或带有抗体结合的表位靶点的区段或提高结合亲和力的PNA引物位点，所有这些都类似地提供了选择性，以通过在合成中有目的地引入与这些修饰相应的相互作用配体来结合或操纵DNA的子集，以进行合成中有意引入的修饰。这些无扩增的靶向方法都与靶向阅读相反，后者依赖于类似PCR的过程来扩增出目标靶标。
无扩增靶向读取的另一个实施方式是这样的过程，即首先将档案或档案的代表性样本提供给无扩增阅读器，从整个档案的信息内容中获取读取样本。假设读取中有一个卷标识符，则从所有此类读取数据中以信息方式选择所需卷的读取数据，从而通过信息学选择来实现目标读取。另一个这样的实施例依赖于读取器，该读取器可以实时读取区段上的卷标识符，并且如果该标识符不在目标卷中，则终止、拒绝或获取另一个DNA区段，但是如果发现目标卷标识符中，则完成该读取，实现目标读取。这是一种动态信息学选择，它的优点是在读取目标卷的过程中读取了较少的不必要信息。可以提供此功能的阅读器包括以下详细描述的分子电子传感器以及纳米孔测序传感器的某些实施方式。
5.检索
通过将感兴趣的一个或多个搜索字符串编码为DNA形式，合成所需形式的DNA序列的互补形式或相关引物，以及使用来自这些所需序列区段的存档中的杂交提取物，可以实现对档案库中文字输入字符串的搜索。可以通过定量回收的DNA数量或使用DNA数据读取器来调查回收的材料来识别命中。搜索可以报告存在或不存在，或者可以恢复包含搜索字符串的相关区段以进行完整阅读。相反，应避免依赖于类似PCR过程的搜索方法，以扩增出搜索目标或捕获此类目标，然后放大结果。
无扩增读取的实施方式：
在各种实施方式中，本文的无扩增DNA读取包括对单个DNA分子的全电子测量，这是由于其被聚合酶或其他探针分子处理并整合到监测传感器电路的电参数的电路中，例如现在这样。在用于DNA数据存储读取的实施方式中，这些传感器被布置在CMOS传感器阵列芯片上，具有提供电流测量电路的大像素阵列。这样的传感器芯片可以具有数百万个传感器，每个传感器处理连续的DNA分子，因此所需的输入DNA量可以低至数百万个总分子。这提供了可扩展性强的DNA分子快速读取，而无需在读取过程中预先扩增DNA或扩增特定的目标DNA分子。
在本文的DNA信息存储***的各种实施方式中，DNA读取装置包括大规模平行的DNA测序装置，其能够从每个特定DNA分子高速读取碱基，从而读取存储的DNA信息的总速率可以足够快，并且量足够大，可用于大规模档案信息检索的实际用途。读取碱基的速率设定了数据检索最短时间，该时间与存储的DNA分子的长度有关。
图7示出了用于能无扩增读取DNA的分子电子传感器的分子电子感测电路的实施例，其中分子完成电路，并且测量电路参数与时间的关系以提供信号，其中信号的变化反映了分子与环境中其他分子的相互作用。如图7所示，分子电子传感器电路1包含一个电路，其中单个探针分子2(或可替换地包含两个或少量分子的传感器复合体)通过跨越电极间隙9形成完整的电路，电极间隙9在一对定距间隔的纳米尺度的电极3和4之间。电极3和4可以是正电极和负电极，或者是源电极和漏电极，并且在这种情况下被布置在支撑层5上。传感器分子通过特定的附着点6和7与每个电极电共轭。在某些方面，当传感器分子2与各种相互作用分子8相互作用以提供信号101时，测量电路的电子参数100。如图7中(i)与(t)的关系所示，所测量的参数100可以包括相对于时间在电极之间流过并且流过传感器分子2的电流(i)，其中所测量的参数中的电信号101指示相互作用的分子8和传感器分子2之间的分子相互作用。
图8示出了在本文中用作DNA读取器装置的基于聚合酶的分子电子传感器的实施方式。当聚合酶遇到DNA上不同的分子特征时，传感器(例如图8中所示)包含聚合酶或其他过程性酶，会随时间流逝在受监控电流中产生可分辨的信号(在图8中缩写为“特征1”、“特征2”，依此类推)。可以在计划安排中使用此类独特的分子特征将信息编码为合成的DNA分子，然后可以通过传感器读取这些信息，已知在监控的电参数中会看到可识别的信号。在各种实施方式中，单个传感器电路的分子复合物包含单个聚合酶分子，该单个聚合酶分子与靶DNA分子接合以在其处理DNA模板时产生电信号。在适当的条件下，这种聚合酶将产生与模板DNA分子的特定独特特征相对应的可识别电信号特征，例如图8中信号迹线中两个不同的峰形/振幅所示。因此，通过诸如上文讨论的图4的各种编码方案，这种可识别的信号特征可以用于在合成DNA分子中编码信息，并且因此这种传感器为读取器提供了编码数据。
图9示出了一个实施方式，其中聚合酶分子轭合至桥分子，桥分子的末端轭合至源电极和漏电极以跨越电极对之间的间隙。即传感器包括进一步包含聚合酶和桥分子的分子传感器复合物。传感器可以进一步包括如图所示的掩埋栅电极，其可以用于进一步调节电路的灵敏度。电极间的电流是测得的电参数。如图所示，当聚合酶在合适的缓冲溶液和dNTP存在下与合适的模板接合时，例如引物、单链DNA分子，聚合酶在合成互补链中的活性会引起与酶活性的详细动力学相关的测量信号扰动。这种情况下，流过电极的电流与时间的关系图提供了信号，信号具有可分辨的特征(例如幅度变化)，该特征对应于被处理的DNA分子的结构特征。在该实施方式中，当遇到聚合酶时，在编码的DNA分子中使用两个不同的序列基序AA和CCC以提供两个可识别的信号。这样，基序AA和CCC提供了将二进制位0/1编码到模板DNA中的方法，例如通过使用AA表示二进制位0，以及使用CCC表示二进制位1。通过不依赖于可识别的序列基序，即使没有DNA序列的单碱基解析，有用地编码和读取信息也是可能的，这对于使用单位/单DNA碱基BES具有明显的优势，而BES则需要在读取中使用单碱基解析。
图10显示了用作本文的分子传感器的探针分子，特别是示例性聚合酶之一的大肠杆菌Klenow区段的详细的蛋白质解剖结构和DNA接合。所示的结构为PDB ID 1KLN。详细的结构及其与模板DNA的结合方式决定了如何选择以最佳地将酶偶联到电路中，从而不干扰其与DNA的相互作用，以及将蛋白质或DNA的信号传导部分置于分子附近，以通过邻近信号而增强信号生成。在该构象中指出了酶的螺旋、薄片和环部分，其中DNA与酶结合。
图11示出了可用作DNA读取装置的分子传感器130A的实施方式，其中聚合酶134A在代表酶134A上的特定位点与桥分子133A上的特定位点间的键的结合点135A处轭合至分子桥分子133A。如图所示，桥分子133A结合到每个隔开的电极上以跨越电极间隙139A。桥分子133A包括第一端和第二端，所述第一端和第二端被官能化以在结合点131A和132A处结合至一对电极中的每个电极。
图12示出了用于在DNA信息存储和检索***中读取DNA的基于聚合酶的分子传感器130B的一个特定实施方式的分子结构，其中聚合酶134B与包括20nm长(＝6个螺旋形)的双链DNA的桥分子133B轭合。传感器130B还包括一对间隔开的铬电极138B和139B，其设置在诸如SiO2的基底层上并且间隔开约10nm。在每个电极138B和139B上沉积金131B，参与桥分子与每个电极的键合。所示的DNA桥分子133B通过DNA桥的第一和第二端上的硫醇基团与铬电极上的金偶联，通过硫金键132B与金结合，其中聚合酶134B分子133B在DNA桥135B上位于中心的生物素化碱基上与DNA桥偶联，与链霉亲和素分子136B结合，进而通过聚合酶134B上的特定生物素化位点135B与聚合酶134B结合。以此方式，链霉亲和素136B通过两个生物素—链霉亲和素键135B将聚合酶134B连接至DNA桥分子133B。示出了进行性酶分子传感器130B移位DNA底物分子137B。如所讨论，DNA底物分子137B可以用包括信号传导特征的排列的信息编码，所述信号传导特征例如是结合的DNA寡核苷酸区段或干扰基团。
在用于本文的分子电子传感器的各种实施方式中，聚合酶可以是Klenow、Taq、Bst、Phi29或T7的天然或突变形式，或者可以是逆转录酶。在各种实施方式中，突变的聚合酶形式将使得能够通过在聚合酶中引入特异性轭合位点而使聚合酶与桥分子、臂分子或电极进行位点特异性轭合。在各种实施方式中，通过重组方法或合成生物学方法工程化到蛋白质中的此类轭合位点可包含半胱氨酸、醛标记位点(例如肽基序CxPxR)、四半胱氨酸基序(例如肽基序CCPGCC)、或非天然或非标准氨基酸(NSAA)位点(例如通过使用扩展的遗传密码引入对乙酰基苯丙氨酸)或非天然可交联氨基酸(例如通过使用用5-溴尿苷交联的RNA-或DNA-蛋白)。
在各种实施方式中，桥分子可包含双链DNA、其他DNA双链体结构，例如DNA-PNA或DNA-LNA或DNA-RNA双链体杂合体，肽，蛋白质α螺旋结构，抗体或抗体Fab结构域，石墨烯纳米带或碳纳米管，或分子电子领域的技术人员已知的各种分子导线或导电分子的任一种。可以通过多种轭合化学领域的技术人员已知的轭合方法进行聚合酶与此类分子或此类分子与电极的轭合，例如生物素—亲和素偶联、硫醇—金偶联、半胱氨酸—马来酰亚胺偶联、金或材料结合肽、点击化学(click chemistry)偶联、侦探-侦探捕获蛋白相互作用偶联、抗体—抗原结合(例如FLAG肽标签/抗FLAG抗体***)等。可以通过材料结合肽，或通过使用SAM(自组装单分子层)或电极表面上的其他表面衍生化来偶联电极，以提供合适的偶联功能基团，例如叠氮化物或胺基。电极包括导电结构，该导电结构可以包括任何金属，例如金、银、铂、钯、铝、铬或钛，这些金属的任意组合的层，例如铬上的金，或半导体，例如掺杂的硅，或在其他实施方式中，第一材料在载体上的接触点包含第二材料，使得该接触点是将分子复合物的化学自组装引导至电极的部位。
在各种实施例中，在诸如图12所示的传感器的传感器中测量的电参数通常可以是在激活传感器时可测量的传感器电路的任何电特性。在一个实施例中，该参数是当在电极之间施加固定的或变化的电压时，在电极之间流过的电流与时间的关系，以连续的或以离散的时间采样的。在各种实施例中，栅电极电容性地耦合至分子结构，例如掩埋栅或背栅，其在测量期间施加固定或可变的栅电压。在各种其他实施例中，所测量的参数可以是两个电极之间的电阻、电导或阻抗，随时间连续测量或定期采样。在各个方面，所测量的参数包括电极之间的电压。如果有栅电极，则测得的参数可以是栅电压。
在各种实施例中，在诸如图12的传感器的分子电子传感器中的测量参数可以包括电容，或者在耦合到电路的电容器上累积的电荷或电压的量。该测量可以是电压光谱测量，使得该测量过程包括捕获I-V或C-V曲线。该测量可以是频率响应测量。在所有这样的测量中，对于所有这样的测量参数，存在其中在测量期间栅电极在分子复合物附近施加固定的或可变的栅极电压的实施方式。这样的门通常将物理上位于微米距离内，并且在各种实施方式中，位于分子复合物的200nm距离内。对于电气测量，在某些实施例中，在与传感器接触的溶液中会存在一个参比电极，例如Ag/AgCl参比电极或铂电极，并保持在外部电势，例如接地，使溶液保持在稳定或观察到的电位，从而更好地定义或控制电气测量。另外，当进行电参数测量时，可以将各种其他电参数保持固定为规定值，或者以规定的模式变化，例如源极—漏极电压，如果存在栅极则为栅极电压，或源极—漏极电流。
使用传感器(例如图12中所示的传感器)来测量DNA分子的可识别特征需要将聚合酶维持在适当的物理和化学条件下，以使聚合酶具有活性，处理DNA模板并产生高于任何背景噪声(即高信噪比或“SNR”)的强而可识别的信号。为此，聚合酶可留在缓冲水溶液中。在各种实施方式中，缓冲溶液可包含盐的任何组合，例如纳尔科或氯化钾、pH缓冲剂、Tris-HCl、多价阳离子辅助因子、Mg、Mn、Ca、Co、Zn、Ni、Fe或Cu或其他离子、表面活性剂(例如Tween)、螯合剂(例如EDTA)、还原剂(例如DTT或TCEP)、溶剂(例如甜菜碱或DMSO)、体积浓缩剂(例如PEG)以及分子生物学应用和分子生物学领域的技术人员已知的用于聚合酶的缓冲液中典型的任何其他组分。通过将这样的缓冲液保持在一定的pH或温度范围内或一定的离子强度下，也可以增强传感器信号。在各种实施方式中，可以选择离子强度以在溶液中获得有利于产生电信号的德拜长度(电荷屏蔽距离)，其可以例如在约0.3nm至约100nm的范围内，在某些实施方式中为约1nm至约10nm的范围内。相对于标准分子生物学程序(例如PCR)中常规使用的缓冲液浓度，配制为具有更大德拜长度的此类缓冲液可能更稀或具有较低的离子强度，分别为10、100、1000、100,000或1百万倍。还可以选择或优化缓冲液成分、浓度和条件(例如pH、温度或离子强度)以改变酶动力学，从而在读取储存在DNA分子的数据的情形下有利地增加传感器的信噪比(SNR)、总信号产生速度或总体信息产生速率。这可能包括通过这些方法减慢或加快聚合酶的活性，或改变聚合酶的保真度或准确性。最佳的缓冲区选择过程包括：从所有此类参数变化的矩阵中选择试验条件；根据经验衡量品质因数，例如与可分辨特征的辨别有关，或与处理模板时特征辨别的超速相关，并使用各种搜索策略(例如统计实验设计(DOE)方法中应用的策略)来推断最佳参数组合。
使用传感器(例如图12的传感器)来测量DNA分子的可识别特征需要向聚合酶提供dNTP，以使聚合酶可以选择性地作用于模板单链DNA分子，以合成互补链。标准或天然dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP，它们以酶作用于底物上所需的形式提供A、C、G和T碱基单体以聚合成DNA链。天然的或突变的聚合酶也可以接受这些天然dNTP的类似物或修饰形式，可以增强或实现可分辨信号的生成。
在本文的DNA读取的各个方面，如果***以每10分钟1个碱基的速度读取DNA分子，如当前代表下一代的光学染料标记的终止子测序仪，那么读取300个碱基的DNA分子至少需要除了准备读取样本所需的任何时间外，还需要3000分钟(50小时)。因此，这种相对较慢的***倾向于以大量较短的读取来存储信息，例如可以在5小时内读取的30个碱基读取。但是这总体需要大量的读取，因此***必须支持数十亿或更多的此类读取，就像此类测序仪的情况一样。当前一代的光学大规模并行测序仪，每6分钟循环读取30亿个DNA字母的DNA序列，大约相当于每分钟10亿位，或每秒2MB，尽管对于以100个碱基DNA字存储的数据来说，这也将需要600分钟(5小时)。尽管在实际范围内，这可以看作是相对较低的数据读取率，因为一本典型的书可能包含1MB的文本数据。总体速率是实用的，但是每碱基花费时间的缓慢使得读取单个数据手册的效率非常低，并且相当与理想情况下在5个小时内并行读取36000本书的批量读取。因此，这种性能当前也缺乏可扩展性，并且读取设备的资金成本很高(光学DNA测序仪的成本目前在十万美元至一百万美元之间)。更严重的是，在当前这样的***上，对人类基因组DNA(1000亿个碱基)进行测序的成本约为1000美元，这意味着读取信息的成本为每200十亿位1000美元，即每GB 40美元。这从根本上高于从磁带存储或CD读取信息的成本，后者的成本约为每10000GB一美元，或每GB 0.0001美元，成本降低了40万倍。因此，读取DNA的成本应减少几个数量级，甚至减少一百万倍，以使其对大规模、长期的档案存储具有吸引力，而不考虑其他优点。自从生产第一批商业测序仪以来，测序成本已降低了百万倍，证明了这种改进的确是可能的。
在各种实施方式中，与当前可用的下一代光学测序仪器相比，本***的DNA读取器包括实质上较低的仪器投资成本，较高的每碱基读取速度以及每次运行的读取总数中较大的可扩展性。在各个方面，本文中使用的读取设备基于CMOS芯片传感器阵列设备，以便提高速度和可扩展性，并降低资金成本。这种设备的实施例包括CMOS传感器阵列设备，其中每个传感器像素包含分子电子传感器，该分子电子传感器能够读取DNA的单个分子而无需任何分子扩增或复制，例如PCR。在各种实施方式中，CMOS芯片包括可扩展的像素阵列，每个像素包含分子电子传感器，并且该传感器包含桥分子和聚合酶，其被配置为酶处理DNA模板分子时产生电流的序列相关的调制(或相关的电参数，例如电压、电导率等)。
图12、13和18-23中描述了在本DNA数据存储***中可用作DNA读取器设备的示例性分子传感器和芯片组合。如所讨论，图12示出了包括桥和探针分子传感器复合物的示例性分子传感器，该复合物还包括具有约20nm长度(～60个碱基)的双链DNA的桥，在两个5'末端具有巯基以偶联至金触点在金属电极上。图12的实施方式包括偶联至由DNA组成的分子线的聚合酶，其***纳米电极对中以形成能够在聚合酶处理引发的DNA模板时产生序列相关信号的传感器。
如图13所示，可以通过后处理将这种纳米传感器放置到CMOS传感器像素阵列的像素上，该传感器还包括从大量并行运行的传感器产生这些信号所需的所有支持的测量、读出和控制电路。传感器并行运行。图13示出了分子传感器中的各种电组件和连接的实施方式。在该图的上部，示出了电极—衬底结构300的横截面，其连接到分析器301，用于施加电压和测量通过传感器的桥分子的电流。在该图的下部，示出了可用于桥接电路的电极阵列302的透视图。每对电极包括在分隔电极的间隙附近的每个电极端处的第一金属(例如“金属1”)和第二金属的接触点或岛(例如“金属2”)。在各种示例中，金属1和金属2可以包括相同的金属或不同的金属。在其他方面，接触点是在包含不同金属的金属电极上方的金(Au)岛。在各种实验中，接触点包括金(Au)珠或金(Au)涂层的电极头，这些电极头支持单个桥分子在电极对之间的每个间隙上的自组装，例如通过硫醇—金结合。
图14A至图14C示出了电极的电子显微(EM)图像的图，该电极包括用于桥接DNA传感器的金金属点接触。在此示例中，电极位于硅基板上，并通过电子束光刻法生产。图14A示出了具有金点接触的钛电极的阵列。图14B示出了在较近的EM图像中具有金点接触并且金对金间隔为约15nm的约7nm的电极间隙。在图14C中，特写图EM示出了位于电极尖端处的尺寸约为10nm金的点(gold dot)。
图15列出了通过用图12的传感器测量DNA整合信号而获得的电流相对时间的曲线图。该图显示了提供了各种引物、单链DNA测序模板和用于整合和聚合的dNTP的传感器所产生的电流信号。在每种情况下，主要信号峰代表来自离散整合事件的信号，其中聚合酶将另一碱基添加至延伸链。在图15的左上角，模板是20个T碱基；右上方的模板为20G碱基；左下方的模板为20A碱基；右下角的模板为20C基数。观察到的掺入速率约为每秒约10-20个碱基，与标准酶动力学一致，但由于速率限制因素(例如较低的dNTP浓度)而导致每秒较低的约为1个碱基的速率。
图16示出了从图12的传感器获得的实验数据，其中特定的序列基序产生了可用于编码0/1二进制数据的信号。图12的传感器包括轭合至DNA桥的Klenow聚合酶，其从实验模板DNA中的编码DNA序列基序20A、3C和30A产生可区别的信号。通过将图12的传感器与标准1×Klenow缓冲液和相对较高浓度的dTTP(10μM)结合使用，以及将其他dNTP的浓度降低100倍，产生了此类信号。其他dNTP的浓度较低，尤其是dGTP浓度较低，通过浓度限制整合速率，可以促进从CCC区域区分信号。结果是，多聚腺苷酸区域具有高尖峰信号特征，而多聚肌氨酸区域具有低谷信号特征，这很容易区分。峰和谷可用于以所示的简单方式对0/1二进制数据进行编码，其中0由多聚肌氨酸tract编码，并从持续时间为几秒钟的高峰值信号中读取，1由CCC tract编码，并从特征为持续了几秒钟的中低谷读取。
使用本公开的传感器来测量DNA分子的可区别特征要求在产生相关信号的过程中，向聚合酶提供带引物的单链模板DNA分子作为用于互补链聚合的底物。在合成DNA分子中编码信息的情况下，这些模板分子可以是完全化学合成的，因此可以具有超出天然DNA的化学或结构修饰或特性，以用于实现或增强可识别性地生成用于各种实施例的信号。天然或工程突变体的聚合酶可以接受许多此类DNA修饰或类似形式的底物，其中许多是分子生物学领域的技术人员众所周知的。对模板DNA的此类修饰的使用可用于产生具有可识别信号的特征。
在各种实施方式中，作为模板提供给聚合酶的DNA包含某种形式的引物(双链/单链转录)位点，以作为聚合酶的起始位点。在各种实施方式中，为了在DNA中存储数字数据，该引物将被预组装到编码分子中，从而不需要进一步的样品制备来引发DNA模板分子。
由于DNA模板中的二级结构可能会干扰聚合酶的加工作用，因此减少、避免或消除DNA数据读取器传感器中使用的DNA数据编码模板分子中的二级结构可能是有利的。分子生物学领域的技术人员已知减少二级结构干扰的许多方法。减少、避免或消除二级结构的方法包括但不限于：使用具有强大二级结构置换能力的聚合酶，例如Phi29或Bst或T7，无论是天然形式还是突变形式；向缓冲液中添加甜菜碱、DMSO、乙二醇或1,2-丙二醇等溶剂；降低缓冲液的盐浓度；提高溶液温度；以及加入单链结合蛋白或简并结合寡核苷酸以沿单链杂交。诸如此类的方法可以具有减少对加工编码DNA的聚合酶的二级结构干扰并产生适当信号的有益效果。
根据本公开的可用于减少对于读取DNA数据的不需要的二级结构的其他方法包括为通过合成化学产生的DNA分子增加特性。例如在本公开的一些实施方式中，编码DNA分子本身的数据可以由还原二级结构的碱基类似物合成，例如使用脱氮基G(7-脱氮基-2'-脱氧鸟苷)代替G，这会削弱G/C碱基配对，或者通过在链中使用锁定的核酸(LNA)来增强骨架，从而减少二级结构。核酸化学领域的技术人员已知具有此类作用的多种此类类似物。
在本公开中可用其他方法来减少DNA数据读取传感器的不需要的二级结构，因为DNA数据编码方案确定了模板序列，因此有可能选择编码方案以避免倾向于二级结构的序列。因此，这种避免二级结构(“SSA”)编码方案是本公开的有益方面。通常，对于本文所述的使用可识别的信号序列特征作为编码元素的编码方案，在选择编码方案时可以选择的范围是，可以考虑所有此类替代方案，并且产生较少(或至少)二级结构的方案将更适合使用。相对于特定的数字数据有效载荷来评估替代方案，或者在代表性的此类要编码的数据有效载荷的总体上对替代方案进行评估。
例如在传感器提供三个可识别的信号序列特征AAAAA、TTTTT和CCCCC的实施方式中，说明了SSA编码的重要性。如果将所有三个特征都用于同一条链(或其他条链)中的编码，则AAAAAA和TTTTT编码元件具有互补性，很可能在链内或DNA之间杂交并产生二级结构。因此，如果改为完全通过以下方案对数据进行编码，即位0编码为AAAAA，位1编码为CCCCC(即完全忽略TTTTT的使用)，则可以避免所有潜在的二级结构。因此，这种编码方式(或其他SSA选择，编码为TTTTT的位0和编码为CCCCC的位1)比使用自互补序列的方案更可取，即使通过放弃三种方式之一可用的编码元素来降低信息密度。因此，通常当存在编码选项并且有可能形成DNA二级结构时，可以使用SSA代码。如该示例所示，用于减少DNA二级结构所需的SSA代码可能比理论上可识别的信号状态具有的信息密度小。但是，这种折衷可以避免与DNA二级结构有关的数据丢失，从而导致信息密度的净增加，或相关的总体成本或速度的提高。
在各种实施方式中，用于减少二级结构的方法包括使用结合寡核苷酸来保护单链，其中选择具有优先结合编码特征的序列或序列组成的寡核苷酸。这样的结合寡核苷酸可以更有效地保护单链和一般的简并寡核苷酸。例如，在上述具有三个可识别信号序列特征AAAAA、TTTTT和CCCCC的情况下，所有这三个都可以用作编码特征，并且可以通过将模板与寡核苷酸TTTTT、AAAAA和GGGGG、或它们的增强结合类似物(例如RNA、LNA或PNA形式，而不是DNA)结合而以单链形式对其进行保护。因此，使用优先结合编码特征的结合寡核苷酸是减少不希望的二级结构影响的另一种方法，尽管这种结合寡核苷酸必须与置换链的聚合酶一起使用，例如Klenow、Bst或Phi29的天然或突变形式，使得寡核苷酸本身不会干扰。避免二级结构的另一种方法是制备主要以双链形式编码DNA的信息，在引物位点具有裂口或缺口以引发聚合酶，而其余分子呈双链形式(带有或不带有发夹弯曲))，以使DNA分子以基本上双链体的形式存在于溶液中，没有由于分子内或分子间单链相互作用而形成的二级结构。
在各种实施方式中，可以利用便于读取过程以及编码和解码过程的体系结构来制备用于编码信息以供同源分子传感器读取的DNA分子。图17说明了DNA体系结构的各种实施方式。图示了有引物的单链DNA模板的代表性物理形式(在图的顶部)，以及在数字数据存储***中使用的信息编码分子信息的逻辑形式。示例性形式可包括左衔接子和右衔接子(显示为“L ADAPTOR”和“R ADAPTOR”)，以促进编码DNA分子信息的操作，引物(例如预引物或自引物，示为“PRIMER”)、缓冲区段(显示为“L-BUFFER”和“R-BUFFER”)以及数据有效负载段(“DATA PAYLOAD”)。
继续参考图17，衔接子可以包括例如用于通用扩增过程的引物、用于复制存储的数据，或者可以包含杂交捕获位点或其他选择性结合靶标，用于从池中靶向选择分子。在各种实施方式中，引物区段包含引物靶/结构，L缓冲区段区段可以包含用于阅读器的信号校准序列，或数据荷载区段之前的缓冲序列，其包含存储编码序列和相关的纠错序列的信息，例如校验位，以及用于存储方法的元数据，例如与将此信息组合成更大的字符串有关。在各个方面，R缓冲区段可以包含另外的校准序列，以及缓冲序列，其防止聚合酶在读取数据时太靠近模板的末端。在各种实施方式中，L衔接子和R衔接子可以是与相关DNA区段的存储或操作有关的序列元件，例如用于外部引物的衔接子以进行PCR扩增或基于杂交的选择，或代表用于***物的周围载体DNA。该***物包括作为载体的宿主生物基因组中的***物。在各种实施方式中，衔接子可以包含周围或载体DNA，例如在DNA数据分子存储在活宿主基因组中的情况下，例如在细菌质粒或其他活生物体的基因组组分中。
进一步参考图17，L缓冲区段和R缓冲区段可以包含支持聚合酶结合足迹的DNA区段，或者所述区段可以包含用于帮助解释来自数据有效载荷区域的信号的各种校准或起始序列。这些缓冲区段可能包含分子条形码序列，该序列用于区分独特的分子，或识别源自同一原始单分子的复制分子。DNA寡核苷酸合成技术人员已知的一种此类条形码方法包括添加短的随机长度为N的序列，通常长1至20个碱基，例如，通过使用简并的碱基混合物而不是特异性的碱基进行合成步骤而制备。
继续参考图17，DNA逻辑结构包括其中编码特定数据的数据有效载荷区段。在各种实施方式中，数据有效载荷段包括与存储方法的元数据一起存储的实际初步数字数据，其可以包括与将这样的信息区段正确地组装成更长串的相关数据，和/或与错误检测和校正有关的数据，例如校验位、校验和或其他此类高架数据。
在本公开的各个方面中，感兴趣的DNA数据有效载荷被聚合酶传感器多次处理以提供来自DNA存储的数字数据的更鲁棒的恢复。在其他方面，将这样的有效载荷的集合平均处理一些期望次数的多次。这些示例受益于通过汇总多个观测值而对编码可识别特征进行更准确的估计。多重处理还具有克服基本泊松采样统计变异性的优势，以确保以高置信度对目标数据有效载荷进行至少一次或至少一些所需的最小次数的采样和观测。
在各种实施方式中，这种重复询问的次数在1至大约1000次的范围内，或在大约10至100次的范围内。这样的多个观测可以包括：(i)通过聚合酶传感器观察相同的物理DNA分子，和/或(ii)一个或多个聚合酶传感器，其处理承载相同数据有效载荷的多个物理上不同的DNA分子。在后一种情况下，具有相同数据有效负载的多个物理上不同的DNA分子可以是通过相同的批量合成反应产生的DNA分子，从不同合成反应获得针对相同数据有效载荷的分子，也可以是通过扩增或复制方法(例如PCR、T7扩增、滚环扩增或分子生物学技术人员已知的其他复制形式)产生复制分子。可以通过许多方法来完成这些多重观测的汇总，例如平均或投票、最大似然估计、贝叶斯估计、隐马尔可夫方法、图论或优化方法或深度学习神经网络方法。
在本公开的各种实施方式中，以高速率读取存储在DNA中的数字数据，以诸如每秒接近1GB用于数字数据的恢复，这对于大规模磁带存储***是可能的。由于聚合酶的最大处理速度在每秒100-1000个碱基的范围内(具体取决于类型)，因此基于聚合酶的传感器的位恢复速率受限为相当的速度。因此，在各种实施方式中，以具有成本效益的格式布置了数百万个传感器，以实现期望的数据读取能力。
在各种实施例中，多个独立的分子传感器布置在CMOS传感器像素阵列芯片上的大规模传感器阵列中，这是最具成本效益的半导体芯片制造工艺。图18示出了可用于在芯片上创建分子传感器的大规模平行阵列的制造堆栈的实施方式。在此示例中，传感器测量电路被布置为可扩展像素阵列(如CMOS芯片)、纳米级光刻工艺用于制造纳米电极，溶液中的分子自组装化学反应用于在传感器阵列中建立每个纳米电极上的分子复合物。该制造堆栈的结果是完成的DNA读取传感器阵列芯片，显示在图18的底部。在各种实施方式中，使用高分辨率CMOS节点(例如28nm、22nm、20nm、16nm、14nm、10nm、7nm或5nm节点，以利用CMOS芯片制造的经济性进行纳米级的光刻。对照而言，像素电子器件可以在更适合于混合信号器件的较粗节点处完成，例如180nm、130nm、90nm、65nm、40nm、32nm或28nm。或者，可以通过纳米加工领域的技术人员已知的多种其他制造方法中的任何一种来制造纳米电极，例如电子束光刻、纳米压印光刻、离子束光刻或先进的光刻方法，例如极紫外(Extreme UV)或深紫外(Deep UV)光刻，多重图案化或相移掩模的任何组合。
图19在附图的左侧更详细地示出了用于DNA读取器的高级CMOS芯片像素阵列架构的实施方式。CMOS芯片像素阵列架构包括可扩展的传感器像素阵列、以及相关的电源和控制电路以及主要模块，例如偏置、模数转换器和时序。图中的插图将单个传感器像素显示为代表单个聚合酶分子传感器的小桥接结构，并且该单个电子传感器位于像素阵列中。图19还示出了(在图的右侧)阵列中的聚合酶分子电子传感器电路像素的实施方式的细节。如图所示，完整的传感器电路包括跨阻放大器、可偏置电压的源极、漏极和(可选)栅极以及一个复位开关，以及电连接在源极和漏极之间的聚合酶(具有或不具有桥和/或臂分子)。所示的反馈电容器是可选的，以提高放大器的稳定性。在该实施例中，像素电路的输出(可测量的电子参数)是电流，该电流被监测以寻找与聚合酶活性有关的扰动。也就是说，从跨阻放大器输出的电流是此传感器像素的可测量电参数，将对其进行监测。应当注意，两个电极之一可以接地，在这种情况下，在电极之间提供可偏置的电压。
图20示出了带注释的芯片设计布局文件和用于比较的相应成品芯片的实施方式。图20的左侧(A)是具有256个像素的图19的CMOS像素阵列的实施方式的完成设计，其被注释以示出芯片的偏压190、阵列191和解码192区域的位置。设计布局还包括测试结构193区域。在图20中，右图(B)是基于最终设计的相应成品芯片的光学显微镜图像图，该芯片是在台积电公司半导体铸造厂(加利福尼亚州圣何塞)使用台积电180nm CMOS生产的最终设计，没有钝化层。
图21示出了图20的完成CMOS芯片200(256像素阵列，2mm×2mm)的扫描电子显微镜(SEM)图像，其清楚地示出了80μm像素201的亚光学表面特征，并且尤其是可以通过后处理沉积纳米电极的裸露通孔(源极、栅极和漏极)，如图19右侧所示，可以电连接到放大电路中。图21中最右的100nm SEM图像202示出了电子束光刻制造的一对间隔开的纳米电极，其具有适当的分子复合物。图21右下方的草图203是包括聚合酶分子复合物207的过程酶分子电子传感器的图示，所述聚合酶分子复合物隔开的电极204和205，每个电极用金点接触标记，其中电极间隙206为约10nm。
在DNA读取设备的各种实施方式中，使用CMOS芯片装置并结合纳米级别制造技术，最终产生了非常低的成本、高产出、快速和可扩展的***。例如，像这样的传感器可以每秒处理10个或更多碱基的DNA模板，比当前的光学测序仪快100倍或更多倍。CMOS芯片技术的使用确保了大规模生产模式的可扩展性和较低的***成本，并利用了半导体行业的庞大基础设施。如上所述，DNA传感器中可能存在任何错误模式或精度限制，或者可能以更快的读取速度出现(例如通过修改酶或缓冲液或温度或环境因素，或以较低的时间分辨率进行采样的数据)，在描述的整个编码器/解码器—读取器—写入器框架中进行补偿。
在本公开的各种实施方式中，此处使用DNA读取器芯片包括至少一百万个传感器、至少一千万个传感器、至少一亿个传感器或至少十亿个传感器。认识到典型的传感器数据采样率为10kHz，并且每次测量记录1个字节，一亿个传感器芯片以每秒1TB的速率生成原始信号数据。考虑单个芯片上需要多少个传感器时，一个关键的考虑因素是与所需的数字数据读取速率相比，这种芯片可以解码存储在DNA中的数字数据的速率。例如，期望以高达每秒约1G的速率读出数字数据。应注意，鉴于用于存储此信息的信号使用功能的特性，编码为DNA的数字数据的每一位都需要进行多次信号测量才能恢复，所以所测量信号的原始信号数据产生率将远高于编码数字数据的恢复率。例如，如果需要10次信号测量来恢复1位存储的数字数据，而每个测量都是8位字节，即要80位信号数据才能恢复1位存储的数字数据。因此，数字数据读取速率预计比传感器原始信号数据采集速率慢100倍的量级。为此原因，要达到1GB/秒的理想数字数据读取速率，将需要近0.1TB/秒的可用原始信号数据。此外，鉴于并非单个芯片中的所有传感器都可产生可用数据，所以基于从以DNA形式存储的数据中获得的理想最终数字数据恢复率，需要对产生高达1TB/秒原始数据的芯片的需求来满足需要。在各种实施方式中，这样的恢复率对应于一亿个传感器像素芯片。
在本公开的各种实施方式中，在读取器***内布置多个芯片以实现期望的***级别数字数据读取速率。在各种实施例中，图18的DNA数据读取器芯片布置为用于读取存储在DNA中的数字数据的完整***的一部分。
图22中示出了完整***实施方式的特征。在各个方面，参见图22，完整的数字数据读取***包括母板，该母板具有用于多个芯片阵列的暂存区，以便提供超出了单芯片限制的数据读取吞吐量。这样的芯片被单独地容纳在流通池中，并具有控制传感器***液体试剂的添加和去除的射流液体处理***。此外，流体***以溶液形式接收来自数据存储库源DNA编码数据。母板还将包括合适的第一级数据处理单元，其能够以很高的速率接收和减少原始信号数据，例如每秒超过1TB、每秒超过10TB或每秒超过100TB(指示为主要的信号处理器)。该主处理器可以包括FPGA、GPU或DSP设备或定制信号处理芯片的一个、多个或组合，并且可以可选地在其后跟随各级类似的此类信号处理器，以用于处理管线。该主要管道的数据输出通常被传输到快速数据存储缓冲区(例如固态驱动器)，来自此处的数据将在基于CPU的子***中进行进一步的处理或解码，然后将数据从中缓冲到较低的速度大容量存储缓冲区，例如硬盘驱动器或固态驱动器或此类驱动器的阵列。从那里将其传输到辅助数据传输计算机子***，该子***负责将解码数据随后传输到目的地。所有这些***操作都在辅助控制计算机的高级控制下，该计算机监测、协调和控制这些功能单元和处理间的相互作用。
在各种实施方式中，可在特定的工作循环(例如24小时至48小时)之后弃置或更换读出***内的芯片。在其他实施例中，芯片可在这样的使用周期之后被修复，由此去除分子复合物和可能的轭合基团，然后通过一系列化学溶液暴露被更换成新的这种部件。去除过程可包括：使用施加于电极的电压以驱动去除，例如采用施加于电极的高电压、施加于电极的交流电压、或电压扫描。该处理还可包括：使用使这种基团变性、溶解或解离、或以其他方式消除的化学物质，例如：高摩尔浓度脲、或胍或其他促溶盐、蛋白酶(例如蛋白酶K)、酸(例如HCl)、碱(例如KOH或NaOH)、或者在分子生物学和生物化学中用于这种目的的公知的其他试剂。这种处理还可包括：使用所施加的温度或光驱动所述去除，例如采用高温或与光结合的分子复合物中能够光裂解的基团或轭合基团。
图23示出了基于云的DNA数据档案存储***的实施方式，其中，诸如图22中概述的完整读取器***以聚集格式布置，以提供整个档案存储和检索***的云DNA读取器服务器。图23显示了具有标准存储格式(左上方)的云计算***。如图所示，这种标准的云计算***具有DNA档案数据存储功能。基于云的DNA合成***可以从云计算机接收二进制数据，并产生编码DNA分子的物理数据。该服务器将输出分子存储的DNA数据存储档案中(图示在图的右下部)，编码数据的物理DNA分子通常可以干燥或冻干的形式存储在溶液中，或在环境温度下冷却或冷冻存储。当要检索数据时，从该档案库中将档案库中的DNA样本提供给DNA数据读取器服务器，该服务器将解码后的二进制数据输送回主云计算机***。该DNA数据读取器服务器可以由图22中所示类型的多种基于DNA读取器芯片的***所驱动，并与将DNA衍生数据最终解码回到云存储***的原始数据格式的其他计算机组合。
图24、25和26示出了其他单分子DNA阅读器的相关用途，该阅读器可以支持无扩增的阅读，并且在传感器中包含聚合酶(或其他进行性酶)。图26以截面图示出了零模式波导聚合酶光学传感器。
在各种实施方式中，分子电子传感器包括图24所示的构造。在这种情形下，通过纳米孔离子电流传感器进行基本的电子测量，该传感器包括膜两侧的电极、位于膜两侧的孔和位于孔两侧的水溶液相。在该实施方式中，孔调节离子电流的通过(由虚线箭头和“i”表示)。所述孔可包含天然的或突变的生物蛋白质纳米孔，并且所述膜可包含脂质膜或其合成的类似物。该述孔还可以包括固态孔，而且所述膜包括由诸如SiN或特氟龙(Teflon)的实体材料组成的薄膜。孔可以具有相同极性或如图所示相反极性的电极。如图24所示，聚合酶分子进一步与孔复合，作为分子复合物的一部分，该分子复合物包括作为孔的一部分嵌入穿过膜的少量分子并提供与聚合酶的轭合。当聚合酶处理DNA模板时，通过孔的离子电流受到此活性的调节，从而产生与不同序列特征相对应的可识别信号特征。除了纳米电测量的不同几何形状之外，其他考虑因素与本文已经复述的那些相同。即基于聚合酶的DNS数字数据读取器的纳米孔电流传感器形式在此具有类似的用途。在各种实施方式中，聚合酶直接且特异性地轭合至孔，并且其中修饰的dNTP用于从DNA序列特征产生可识别的信号。为了在纳米孔传感器中产生信号，这样的dNTP修饰可包含在dNTP的γ磷酸酯上的基团，当dNTP通过聚合酶掺入时，该基团可以堵塞孔，从而导致电流抑制特征。在各种实施方式中，此类修饰包括将三磷酸酯链延伸至4、5、6或至多12个磷酸酯，并在2位或更多位置上添加末端磷酸酯基团或在任何磷酸基上添加基团，其通过聚合酶掺入而除去，这些基团包括可通过进入孔而堵塞孔的聚合物，例如包含PEG聚合物或DNA聚合物。聚合酶轭合到孔的可以包括任何一种可能的轭合反应，例如分子链系或基于侦探—侦探捕获蛋白的轭合***等。
在各种实施方式中，用于读取DNA的分子电子传感器包括碳纳米管。如图25中所示，桥分子包含碳纳米管(由图25中的粗体水平条表示，其桥接正负极之间的间隙)。在各个方案中，碳纳米管桥包括单壁或多壁的碳纳米管，并在特定位点使用多种可行的轭合化学方法中的任一种在特定位点轭合至聚合酶分子。这样的轭合例如可包括芘联结体(其通过纳米管上的芘的π堆叠而链接到纳米管)，或者可包括连接物(其连接到位于碳纳米管中的缺陷部位)。在这种情况下，已知通过碳纳米管分子线的电流对周围环境中的其他分子高度敏感。进一步知道，流过碳纳米管的电流对适当地结合至该纳米管的酶分子(包括聚合酶)的活性敏感。对于该特定实施方式，如前所述的本公开内容的所有方案适用于这种情况，以提供一种用于读取存储在DNA分子中的数字数据的基于碳纳米管的传感器，包括相关的有益方面、编码方案、芯片格式、***和基于云的DNA数字数据存储***。
产生光学信号的可替代的传感器是零模式波导传感器，例如图26中所示的传感器。这样的传感器可包括：如图所示的单个多聚酶，其轭合到金属井底部，采取全内反射模式施加于薄基底的激发场的瞬逝区中。多聚酶具有引发模板和dNTP，其中染料标记在可裂解的磷酸基团上。当掺入这样的dNTP时，染料标签保持在瞬逝场中，并被激发发射对应染料能谱或颜色的光子。结果是：在适合条件下，这样的传感器产生所示的能够辨别的光学信号，可用于将数字信息编码到DNA分子中。能够辨别的信号在此可为不同能量分布或颜色的光子发射、或具有不同的能够辨别的频谱的发射、或频谱随时间的不同的持续时间或强度或形状、或产生可辨别的特征的这种元素的任意组合。对于图26中所示的这种零模式波导传感器的实施例，在上面各种实施方式公开的所有方法也适用于此情况，以提供用于读出存储于DNA分子中的数字数据的基于零模式波导的传感器，并且相关的有益方面、编码方案、芯片格式(在该情形下，光学传感器芯片，例如基于云的DNA数字数据存储***)也适用于这样的传感器。
其他实施方式
在各种实施方式中，无扩增DNA档案存储***包括：(i)用于写入DNA数据分子的无扩增子***；(ii)用于管理DNA数据分子的免扩增子***；以及(iii)用于读取DNA数据分子的免扩增子***。
在各种实施方式中，减少扩增的DNA档案存储***包括用于写入DNA数据分子的无扩增子***。
在各种实施方式中，减少扩增的DNA档案存储***包括用于管理DNA数据分子的无扩增子***。
在各种实施方式中，减少扩增的DNA档案存储***包括用于读取DNA数据分子的无扩增子***。
在各种实施方式中，用于写入DNA数据分子的无扩增子***包括使用单独的局部亚磷酰胺合成反应。
在各种实施方式中，用于管理DNA数据分子的无扩增子***包括取等分试样以进行而无需扩增的复制。
在各种实施方式中，用于管理DNA数据分子的无扩增子***包括使用杂交来选择体积或搜索数据，而不进行扩增。
在各种实施方式中，用于读取DNA数据分子的无扩增子***包括使用单分子DNA测序***。
在各种实施方式中，用于读取DNA数据分子的无扩增子***包括使用进行DNA的单分子分析的分子电子传感器。
在各种实施方式中，用于读取DNA数据分子的无扩增子***包括使用包含聚合酶的分子电子传感器，并进行DNA的单分子分析。
在各种实施方式中，用于读取DNA数据分子的无扩增子***包括使用多个分子电子传感器，这些分子电子传感器设置为CMOS传感器像素芯片上的传感器阵列。
在各种实施例中，基于云的DNA数据存储信息***包括上述任何无扩增或减少扩增的子***。
在各种实施方式中，用于在无扩增DNA数据存储和检索***中检索数据的方法包括：a.从DNA分子存储档案中获取样品；以及b.使用无扩增阅读器从样品中读取DNA数据。
在各种实施方式中，一种无扩增DNA数据存储的方法包括：a.使用无扩增方法写入DNA数据；b.使用无扩增方法处理档案；以及c.使用无扩增DNA读取器读取DNA数据。
在各种实施例中，使用基于云的***来实施以上各种方法。
在各种实施方式中，用于在无扩增DNA数据存储***中检索数据的设备包括用于读取编码在DNA分子中的数据的无扩增DNA读取器设备。
在各种实施方式中，用于无扩增DNA数据存储的装置包括：a.用无扩增方法写入DNA数据的设备；b.用无扩增方法处理档案的设备；和c.用无扩增阅读器读取DNA数据的装置。
提供了无扩增的DNA信息存储方法、装置和***。对“各种实施方式”、“一个实施方式”、“实施方式”，“示例性实施方式”等的引用表示所描述的实施方式可以包括特定的特征、结构或特性，但是每个实施方式可以不必包括特定特征、结构或特征。此外，这样的短语不一定指相同的实施方式。此外，当结合实施方式的特定特征、结构或特性时，认为无论是否明确描述，结合其他实方式影响这些特征、结构或特性是在本领域技术人员的知识范围内。在阅读了说明书之后，对于相关领域的技术人员而言将显而易见的是，如何在替代实施方式中实现本公开。
已经参照特定实施方式描述了益处、其他优点和问题的解决方案。然而，益处、优点、问题的解决方案以及可能导致任何益处、优点或解决方案的出现或变得更加显著的任何要素均不应被解释为本公开的关键、必需或必要特征或要素。因此，本公开的范围仅受所附权利要求书的限制，在所附权利要求书中，除非明确地如此指出，否则以单数形式提及元件并不旨在表示“一个且仅一个”，而是“一个或多个”。此外，在权利要求书或说明书中使用类似于“A、B和C'中的至少一个”或“A、B或C'中的至少一个”的短语时，意图将该短语解释为意味着在一个实施方式中可以单独存在A，在一个实施方式中可以单独存在B，在一个实施方式中可以单独存在C，或者在一个单独的实施方式中可以存在元素A、B和C的任何组合；例如A和B、A和C、B和C、或A与B和C。
本领域普通技术人员已知的上述各种实施方式的元件的所有结构、化学和功能等同物通过引用明确地并入本文，并且意在被本权利要求书所涵盖。此外，设备或方法不必解决本公开寻求解决的每个问题，因为其被本权利要求书所涵盖。此外，无论在权利要求书中是否明确叙述了本发明的元素、组件或方法步骤，都不旨在将其献给公众。没有任何主张的元件旨在引用35U.S.C.112(f)，除非使用短语“针对……”明确引用了该元素。如本文所使用的，术语“包括”、“包含”或其任何其他变体旨在覆盖非排他性的包含物，使得包括一系列元素的分子、组合物、过程、方法或装置能够不仅包括那些元素，还可以包括未明确列出或此类分子、组合物、过程、方法或装置所固有的其他元素。

Claims (15)

1.一种归档信息的方法，所述方法包括：
使用编码方案将所述信息转换成一个或多个核苷酸，所述核苷酸被预先确定以在分子电子传感器的可测量电参数中产生与所述信息有关的可识别信号；
将所述一个或多个核苷酸组装成核苷酸序列；和
在不扩增DNA分子的情况下合成复制DNA分子池，其中，每个复制DNA分子均包含所述核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述信息包括二进制数据串。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述编码方案将所述二进制数据串内的二进制数据的一个或多个0/1位转换成包括多于一个核苷酸的序列基序。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，转换所述信息的步骤包括：将所述二进制数据串划分为区段，其中，每个区段编码一个序列基序。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述二进制数据的位0编码A的均聚物，并且所述二进制数据的位1编码C的均聚物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个核苷酸中的至少一个核苷酸包含修饰的核苷酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个核苷酸包括与相同核苷酸的变体相比抵制所述复制DNA分子中的二级结构形态的核苷酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述编码方案包括：BES1、BES2、BES3、BES4、BES5和BES6中的任何一个或组合。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括：
将所述复制DNA分子中的至少一个复制DNA分子暴露于所述分子电子传感器，而无需事先扩增所述DNA分子；
产生所述可识别信号；和
将所述可识别信号转换为所述信息，
其中，所述分子电子传感器包括一对间隔开的电极和附着于每个电极以形成传感器电路的分子传感器复合物，其中，所述分子传感器复合物包括电连接至所述一对间隔开的电极中的每个电极的桥分子和与所述桥分子轭合的探针分子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，将所述复制DNA分子中的至少一个复制DNA分子暴露于所述分子电子传感器的步骤包括将所述DNA分子池悬浮在缓冲液中，取所述缓冲液的等分试样，并将所述等分试样提供给所述传感器。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述缓冲溶液包含修饰的dNTP。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述传感器的所述可测量电参数包括在所述隔开的电极之间并且通过所述分子传感器复合物的源极-漏极电流。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，所述探针分子包含聚合酶，并且其中，在处理所述复制DNA分子中的任一分子时通过所述聚合酶的酶促活性来调节所述传感器的所述可测量电参数。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述聚合酶包含大肠杆菌聚合酶I的Klenow区段，并且其中，所述桥分子包含双链DNA分子。
15.一种在无扩增DNA信息存储和检索***中归档和检索二进制数据串的方法，所述方法包括：
将所述二进制数据串划分为至少一个二进制位的区段；
指定每个区段给序列基序，每个序列基序包含至少两个核苷酸，所述序列基序被预先确定以在分子电子传感器的可测量电参数中产生可识别信号；
将所述序列基序组装成核苷酸序列；
使用无扩增DNA写入方法在固相支持体上合成复制DNA分子池，每个复制DNA分子均包含所述核苷酸序列；
将所述DNA分子池悬浮在缓冲液中；
取所述缓冲液的等分试样；
将所述等分试样提供给所述传感器，而无需事先扩增所述DNA分子；
产生所述可识别信号；和
将所述可识别信号转换为所述二进制数据串，
其中，所述传感器包括一对间隔开的电极和附着于每个电极以形成分子电子电路的分子传感器复合物，其中，所述分子传感器复合物包括电连接至所述一对间隔开的电极中的每个电极的桥分子和与所述桥分子轭合的探针分子。
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