CN111366736A - 指征健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种指征健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物及应用，该血清蛋白质标志物有193个，关键通路包括12个上调通路和4个下调通路。本发明首次提出了新的指示血液健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物。通过测定这些血清蛋白质标志物的变化，能综合评价人体内与健康衰老相关通路的变化，进而评估老年个体非健康衰老的风险，为后续干预与应对提供理论支撑。

Description

指征健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物及应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体地说，涉及一种指征健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物及应用。

背景技术

我国人口的老龄化速度是西方国家的2倍以上，其中65岁以上的老人将从2010年1.19亿增加到2050年3.6亿(占总人口25.6％)。老龄化进程的加剧及老年疾病的高发严重影响了国人生活质量，加重家庭、社会负担。但如果老人健康每年比上一年相对改善1％，那么我国2050年家庭照料总成本将节省22,100亿元。如加上医疗费用，健康衰老化所可能节省的开支将更加惊人。考虑到老年病发生后往往难以治愈，且治疗过程中仍会消耗大量社会资源和成本，因此从机理上评估老龄人口的健康衰老特征，将是以后健康衰老的研究方向。

健康衰老是一个复杂的多因素的生物学过程，除了长寿基因FOXO3及APOE等的知识外，还发现了大量能促进健康衰老的关键通路。这些已知的通路包括：IGF信号通路,mTOR信号通路，DNA损伤修复,核糖体合成，自噬通路，线粒体功能，免疫***，衰老细胞分泌表型等。以目前技术手段，评估每一个通路变化的技术手段都非常复杂，涉及到大量精确的实验手段，无法进行产业化和流程化运行。而目前尚没有评估健康衰老相关的一个或多个关键通路的技术手段。因此，急需尽快开发针对健康衰老相关通路的新技术。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种指征健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物及应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于血清蛋白质标志物的指征健康衰老关键通路，包括12个上调通路和4个下调通路，其中，上调的通路有：损伤修复；止血，凝血和纤维蛋白凝块的形成；体液免疫反应；细菌防御反应；急性炎症反应；通过清除受体的配体绑定和摄取；轴突发育；骨骼生长；骨化作用；血管发育；轴突再生；下调的通路有：通过IGF绑定蛋白调控的IGF转运；止血的负调控；胆固醇的生物合成过程；PI3K-Akt信号通路。

本发明还公开了一种指示上述的健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物，包括158个上调表达的血清蛋白质标志物和35个下调表达的血清蛋白质标志物，其中，158个上调表达的血清蛋白质标志物为：α-2巨球蛋白，血浆蛋白酶C1抑制剂，胶原蛋白α-1(I)链，胶原蛋白α-2(I)链，胶原蛋白α-1(V)链，软骨寡聚基质蛋白，肌萎缩蛋白，A型肝配蛋白受体4，凝血因子VIII，颗粒蛋白前体，腱生蛋白，胰岛素生长因子绑定蛋白1，层粘连蛋白亚基β-2，半乳凝素1，蛋白LOX，蛋白LRP1，细胞表明糖蛋白MUC18，蛋白REG3A，抗胰蛋白酶，血管舒缓素6，受体型酪氨酸受体磷酸酶F，受体型酪氨酸受体磷酸酶S，胰石蛋白1-α，骨桥蛋白，组织因子途径抑制剂，金属蛋白酶抑制剂1，黏着斑蛋白，血管性血友病因子，丝氨酸/苏氨酸激酶24，骨膜蛋白，肿瘤坏死因子受体超家族成员12A，CD109抗原，α-1B糖蛋白，抗胰凝乳蛋白酶，补体因子D，含有富含亮氨酸重复蛋白的免疫球蛋白超家族，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4，α-1酸性糖蛋白1，激活蛋白原，维甲酸受体应答蛋白2，胸腺素β4，蛋白质FAM3C，蛋白VTI1B，分泌粒蛋白3，内皮细胞选择性粘附分子，酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型底物1，补体C1r亚基，补体C1s亚基，补体亚基C6，补体亚基C7，补体亚基C9，嗜铬粒蛋白A，C反应蛋白，补体衰退加速因子，血液结合素，免疫球蛋白重链恒定区α1，免疫球蛋白重链恒定区γ1，蛋白IGLC3，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，溶菌酶C，磷脂酶A，磷脂酶A2膜相关，蛋白SLPI，脊椎蛋白2，丝氨酸蛋白酶抑制剂kazal-5型，V-set和免疫球蛋白域蛋白4，免疫球蛋白重链变量区3-72，内凝集素1，β2微球蛋白，碳酸酐酶3，单核细胞分化抗原CD14巨噬细胞甘露糖受体1，子宫珠蛋白，血管细胞粘附蛋白，脂联素，缺乏夜蛋白，富亮氨酸α-2糖蛋白，可溶性清道夫受体富含半胱氨酸域蛋白SSC5D，双链RNA特异编辑酶1，干扰素α/β受体2，丝氨酸蛋白酶HTRA1，核糖核酸酶胰，白细胞介素-6受体β亚基，癌抑素M特异性受体β亚基，清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M130，补体因子H相关蛋白3，利尿钠肽A，C-C基序趋化因子，C-C基序趋化因子18，脑信号蛋白7A，组织蛋白酶Z，主朊病毒蛋白，脊椎蛋白1，粘连蛋白2，细胞粘附分子1，白细胞介素18结合蛋白，CRA_a亚型，钙网蛋白，组织蛋白酶B，细胞间粘附分子3，胶原凝素12，CD166抗原，蛋白AMBP，胶原蛋白α2(IV)链，缺氧上调蛋白1，叶酸受体β，叶酸基底膜特异性硫酸肝素蛋白多糖核心蛋白受体β，14-3-3蛋白γ，跨高尔基网络整合膜蛋白2，囊泡整合膜蛋白VIP36，含硫氧还蛋白域的蛋白5，胰蛋白酶1，钴胺传递蛋白2，钙粘素2，钙粘素11，EPH受体B4，亚型CRA_b，层粘连蛋白亚基α2，神经细胞粘附分子1，神经细胞粘附分子2，神经丛蛋白B1，颤蛋白，受体型酪氨酸蛋白磷酸酶ζ，神经纤毛蛋白2，神经细胞粘附分子l1样蛋白，蛋白ROBO4，软骨酸性蛋白1，CDO的兄弟蛋白，巨噬细胞集落刺激因子1，成纤维细胞生长因子受体1，外核肽焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员2，血小板反应蛋白4，跨膜糖蛋白NMB，胶原蛋白α-1(VI)链，胶原蛋白α-3(VI)链，胶原蛋白α-1(XII)链，层粘连蛋白亚基β-1，层粘连蛋白亚基γ-1，肌纤蛋白，胶原蛋白α-1(XVIII)链，接触蛋白1，72kDa型胶原酶，蛋白激酶c结合蛋白NELL2，几丁质酶3样蛋白，胶原蛋白α-1(XV)链，硫酸软骨素蛋白聚糖4，神经源性位点切迹同源蛋白3，转化生长因子受体3型，蛋白RECK，血管生成素关联蛋白3，蛋白NENF，ATP依赖DNA解旋酶DDX11，核孔复合体蛋白Nup155，腓骨蛋白5，脱唾液酸糖蛋白受体2，多能蛋白聚糖核心蛋白，γ—亚麻酸基质蛋白，骨调蛋白，腱蛋白样蛋白1；下调表达的35个血清蛋白包含：α-2HS糖蛋白，血清白蛋白，载脂蛋白AI，载脂蛋白AII，载脂蛋白B-100，抗凝血酶III，凝血酶原，纤连蛋白，血浆α-L岩藻糖苷酶，肝素辅因子2，***1，***2，***结合蛋白复合体酸不稳定亚基，***结合蛋白3，***结合蛋白5，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H2，激肽原1，血纤维蛋白溶酶原，维生素K依赖蛋白C，血清铁传递蛋白，载脂蛋白L1，胞外丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶FAM20C，载脂蛋白A-V，磷脂酰肌醇多糖特异性磷脂酶D，凝血因子XI，凝血因子XII，脯氨酰肽链内切酶FAP，血浆激肽释放酶，血小板衍生生长因子B亚基，α-2抗纤维蛋白溶酶，玻连蛋白，载脂蛋白A-IV，受体酪氨酸蛋白激酶，生长激素受体，整合素α2。

本发明还公开了一种上述的健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物在制备人类健康衰老预测产品中的应用，所述预测产品包含一种或多种血清蛋白质标志物的试剂，所述试剂通过检测受试者体内的一种或多种血清蛋白质标志物的蛋白质丰度，预测评估受试者是否是健康衰老。

可选地，具体是检测受试者血液中的一种或多种标志物的蛋白质丰度。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

目前没有针对能指示健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物，本发明首次提出了新的指示血液健康衰老关键功能富集或通路的蛋白质分子。通过测定这些蛋白分子的变化，能综合评价人体内与健康衰老相关通路的变化，进而评估老年个体非健康衰老的风险，为后续干预与应对提供理论支撑。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，实施例不应解释为进一步限制。如具体实施方式中需获取血清中特定蛋白质含量的信息，既可用基于质谱的蛋白组定量方法，也可用其它任何能够获取血清蛋白质表达含量的测量方法。参选以下本发明的实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

本发明的立题依据为：健康衰老的天然模型的百岁老人，其寿命不但远长于普通人群，还能延缓甚至规避衰老相关重大疾病的困扰。因此通过对我国现有百岁老人不同特征的研究，可以发现真正促进健康衰老的关键通路及其关键因子。而在血液里的生物分子中，蛋白质作为生物体功能的直接行使者，能快速反应生命活动的细微变化。本发明正是基于这一点，通过比较分析百岁老人血清蛋白质分子特征，发掘能指针健康衰老关键通路及其蛋白分子。本发明可直接应用于测量普通老龄人当前状态下健康衰老相关通路的变化，评估其健康衰老的状态，为后续干预提供理论基础。

实施例1基于血清蛋白标志物的健康衰老的关键通路

通过对海南省119个长寿老人(95～111岁，中位数100岁)及151个同地区的老年对照人群(32～80岁，中位数61岁)血清蛋白组的质谱定量数据分析，本发明提供了一种基于血清蛋白的健康衰老的关键通路及指示健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物，其中，基于血清蛋白的健康衰老的关键通路包括12个上调通路和4个下调通路：

a)、上调的通路有：

损伤修复(wound healing)；止血(Hemostasis)，凝血和纤维蛋白凝块的形成(blood coagulation,fibrin clot formation)；体液免疫反应(humoral immuneresponse)；细菌防御反应(defense response to bacterium)；急性炎症反应(acuteinflammatory response)；通过清除受体的配体绑定和摄取(Binding and Uptake ofLigands by Scavenger Receptors)；轴突发育(axon development)；骨骼生长(bonegrowth)；骨化作用(ossification)；血管发育(blood vessel development)；轴突再生(axon regeneration)。

b)、下调的通路有：

通过IGF绑定蛋白调控的IGF转运(Regulation of Insulin-like Growth Factor(IGF)transport and uptake by Insulin-like Growth Factor Binding Proteins)；止血的负调控(negative regulation of hemostasis)；胆固醇的生物合成过程(cholesterol biosynthetic process)；PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signalingpathway)。

上述16个健康衰老相关关键通路的变化及其对健康衰老的贡献如表1所示，分别表明了这些通路对应的上调或下调有利于健康衰老的关系。

表1关键富集功能或通路及其对健康衰老的贡献

实施例2指示实施例1中的健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物

本发明还提供了一类全新的指征健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物，这类标志物可以单独或两种或两种以上的组合来评估健康衰老关键通路的变化情况，包括193个，其中，上调表达的158个血清蛋白质标志物包含：

α-2巨球蛋白(A2，M Alpha-2-macroglobulin)，血浆蛋白酶C1抑制剂(SERPING1，Plasma protease C1 inhibitor)，胶原蛋白α-1(I)链(COL1A1，Collagen alpha-1(I)chain)，胶原蛋白α-2(I)链(COL1A2，Collagen alpha-2(I)chain)，胶原蛋白α-1(V)链(COL5A1，Collagen alpha-1(V)chain)，软骨寡聚基质蛋白(COMP，Cartilage oligomericmatrix protein)，肌萎缩蛋白(DAG1，Dystroglycan)，A型肝配蛋白受体4(EPHA4，Ephrintype-A receptor 4)，凝血因子VIII(F8，Coagulation factor VIII)，颗粒蛋白前体(GRN，Granulins)，腱生蛋白(TNC，Tenascin)，胰岛素生长因子绑定蛋白1(IGFBP1，Insulin-likegrowth factor-binding protein 1)，层粘连蛋白亚基β-2(LAMB2，Laminin subunitbeta-2)，半乳凝素1(LGALS1，Galectin-1)，蛋白LOX(LOX，Protein-lysine 6-oxidase)，蛋白LRP1(LRP1，Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1)，细胞表明糖蛋白MUC18(MCAM，Cell surface glycoprotein MUC18)，蛋白REG3A(REG3A，Regeneratingislet-derived protein 3-alpha)，抗胰蛋白酶(SERPINA1，Alpha-1-antitrypsinα-1)，血管舒缓素6(KLK6，Kallikrein-6)，受体型酪氨酸受体磷酸酶F(PTPRF，Receptor-typetyrosine-protein phosphatase F)，受体型酪氨酸受体磷酸酶S(PTPRS，Receptor-typetyrosine-protein phosphatase S)，胰石蛋白1-α(REG1A，Lithostathine-1-alpha)，骨桥蛋白(SPP1，Osteopontin)，组织因子途径抑制剂(TFPI，Tissue factor pathwayinhibitor)，金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1，Metalloproteinase inhibitor 1)，黏着斑蛋白(VCL，Vinculin)，血管性血友病因子(VWF，von Willebrand factor)，丝氨酸/苏氨酸激酶24(STK24，Serine/threonine-protein kinase 24)，骨膜蛋白(POSTN，Periostin)，肿瘤坏死因子受体超家族成员12A(TNFRSF12A，Tumor necrosis factor receptor superfamilymember 12A)，CD109抗原(CD109，CD109 antigen)，α-1B糖蛋白(A1BG，Alpha-1B-glycoprotein)，抗胰凝乳蛋白酶(SERPINA3，Alpha-1-antichymotrypsinα-1)，补体因子D(CFD，Complement factor D)，含有富含亮氨酸重复蛋白的免疫球蛋白超家族(ISLR，Immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat protein)，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3(ITIH3，Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3)，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4(ITIH4，Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4)，α-1酸性糖蛋白1(ORM1，Alpha-1-acid glycoprotein 1)，激活蛋白原(PSAP，Prosaposin)，维甲酸受体应答蛋白2(RARRES2，Retinoic acid receptor responder protein 2)，胸腺素β4(TMSB4X，Thymosin beta-4)，蛋白质FAM3C(FAM3C，Protein FAM3C)，蛋白VTI1B(VTI1B，Vesicle transport through interaction with t-SNAREs homolog 1B)，分泌粒蛋白3(SCG3，Secretogranin-3)，内皮细胞选择性粘附分子(ESAM，Endothelial cell-selectiveadhesion molecule)，酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型底物1(SIRPA，Tyrosine-proteinphosphatase non-receptor type substrate 1)，补体C1r亚基(C1R，Complement C1rsubcomponent)，补体C1s亚基(C1S，Complement C1s subcomponent)，补体亚基C6(C6，Complement component C6)，补体亚基C7(C7，Complement component C7)，补体亚基C9(C9，Complement component C9)，嗜铬粒蛋白A(CHGA，Chromogranin-A)，C反应蛋白(CRP，C-reactive protein)，补体衰退加速因子(CD55，Complement decay-acceleratingfactor)，血液结合素(HPX，Hemopexin)，免疫球蛋白重链恒定区α1(IGHA1，Immunoglobulinheavy constant alpha 1)，免疫球蛋白重链恒定区γ1(IGHG1，Immunoglobulin heavyconstant gamma 1)，蛋白IGLC3(IGLC3，Immunoglobulin lambda constant 3)，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(LCN2，Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)，溶菌酶C(LYZ，Lysozyme C)，磷脂酶A(PLA2G1B，Phospholipase A(2))，磷脂酶A2膜相关(PLA2G2A，Phospholipase A2,membrane associated)，蛋白SLPI(SLPI，Antileukoproteinase)，脊椎蛋白2(SPON2，Spondin-2)，丝氨酸蛋白酶抑制剂kazal-5型(SPINK5，Serine protease inhibitor Kazal-type 5)，V-set和免疫球蛋白域蛋白4(VSIG4，V-set and immunoglobulin domain-containing protein 4)，免疫球蛋白重链变量区3-72(IGHV3-72，Immunoglobulin heavy variable 3-72)，内凝集素1(ITLN1，Intelectin-1)，β2微球蛋白(B2M，Beta-2-microglobulin)，碳酸酐酶3(CA3，Carbonicanhydrase 3)，单核细胞分化抗原CD14(CD14，Monocyte differentiation antigenCD14)，巨噬细胞甘露糖受体1(MRC1，Macrophage mannose receptor 1)，子宫珠蛋白(SCGB1A1，Uteroglobin)，血管细胞粘附蛋白(VCAM1，Vascular cell adhesion protein1)，脂联素(ADIPOQ，Adiponectin)，缺乏夜蛋白(NOCT，Nocturnin)，富亮氨酸α-2糖蛋白(LRG1，Leucine-rich alpha-2-glycoprotein)，可溶性清道夫受体富含半胱氨酸域蛋白SSC5D(SSC5D，Soluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containingprotein SSC5D)，双链RNA特异编辑酶1(ADARB1，Double-stranded RNA-specific editase1)，干扰素α/β受体2(IFNAR2，Interferon alpha/beta receptor 2)，丝氨酸蛋白酶HTRA1(HTRA1，Serine protease HTRA1)，核糖核酸酶胰(RNASE1，Ribonuclease pancreatic)，白细胞介素-6受体β亚基(IL6ST，Interleukin-6receptor subunit beta)，癌抑素M特异性受体β亚基(OSMR，Oncostatin-M-specific receptor subunit beta)，清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M130(CD163，Scavenger receptor cysteine-rich type 1 proteinM130)，补体因子H相关蛋白3(CFHR3，Complement factor H-related protein 3)，利尿钠肽A(NPPA，Natriuretic peptides A)，C-C基序趋化因子(CCL14，C-C motif chemokine)，C-C基序趋化因子18(CCL18，C-C motif chemokine 18)，脑信号蛋白7A(SEMA7A，Semaphorin-7A)，组织蛋白酶Z(CTSZ，Cathepsin Z)，主朊病毒蛋白(PRNP，Major prionprotein)，脊椎蛋白1(SPON1，Spondin-1)，粘连蛋白2(NECTIN2，Nectin-2)，细胞粘附分子1(CADM1，Cell adhesion molecule 1)，白细胞介素18结合蛋白，CRA_a亚型(IL18BP，Interleukin 18 binding protein,isoform CRA_a)，钙网蛋白(CALR，Calreticulin)，组织蛋白酶B(CTSB，Cathepsin B)，细胞间粘附分子3(ICAM3，Intercellular adhesionmolecule 3)，胶原凝素12(COLEC12，Collectin-12)，CD166抗原(ALCAM，CD166 antigen)，蛋白AMBP(AMBP，Protein AMBP)，胶原蛋白α2(IV)链(COL4A2，Collagen alpha-2(IV)chain)，缺氧上调蛋白1(HYOU1，Hypoxia up-regulated protein 1)，叶酸受体β(FOLR2，Folate receptor beta)，叶酸基底膜特异性硫酸肝素蛋白多糖核心蛋白受体β(HSPG2，Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein)，14-3-3蛋白γ(YWHAG，14-3-3protein gamma)，跨高尔基网络整合膜蛋白2(TGOLN2，Trans-Golginetwork integral membrane protein 2)，囊泡整合膜蛋白VIP36(LMAN2，Vesicularintegral-membrane protein VIP36)，含硫氧还蛋白域的蛋白5(TXNDC5，Thioredoxindomain-containing protein 5)，胰蛋白酶1(PRSS1，Trypsin-1)，钴胺传递蛋白2(TCN2，Transcobalamin-2)，钙粘素2(CDH2，Cadherin-2)，钙粘素11(CDH11，Cadherin-11)，EPH受体B4，亚型CRA_b(EPHB4，EPH receptor B4,isoform CRA_b)，层粘连蛋白亚基α2(LAMA2，Laminin subunit alpha-2)，神经细胞粘附分子1(NCAM1，Neural cell adhesionmolecule 1)，神经细胞粘附分子2(NCAM2，Neural cell adhesion molecule 2)，神经丛蛋白B1(PLXNB1，Plexin-B1)，颤蛋白(RELN，Reelin)，受体型酪氨酸蛋白磷酸酶ζ(PTPRZ1，Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta)，神经纤毛蛋白2(NRP2，Neuropilin-2)，神经细胞粘附分子l1样蛋白(CHL1，Neural cell adhesion molecule L1-like protein)，蛋白ROBO4(ROBO4，Roundabout homolog 4)，软骨酸性蛋白1(CRTAC1，Cartilage acidic protein 1)，CDO的兄弟蛋白(BOC，Brother of CDO)，巨噬细胞集落刺激因子1(CSF1，Macrophage colony-stimulating factor 1)，成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1，Fibroblast growth factor receptor 1)，外核肽焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员2(ENPP2，Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2)，血小板反应蛋白4(THBS4，Thrombospondin-4)，跨膜糖蛋白NMB(GPNMB，Transmembraneglycoprotein NMB)，胶原蛋白α-1(VI)链(COL6A1，Collagen alpha-1(VI)chain)，胶原蛋白α-3(VI)链(COL6A3，Collagen alpha-3(VI)chain)，胶原蛋白α-1(XII)链(COL12A1，Collagen alpha-1(XII)chain)，层粘连蛋白亚基β-1(LAMB1，Laminin subunit beta-1)，层粘连蛋白亚基γ-1(LAMC1，Laminin subunit gamma-1)，肌纤蛋白(MYOC，Myocilin)，胶原蛋白α-1(XVIII)链(COL18A1，Collagen alpha-1(XVIII)chain)，接触蛋白1(CNTN1，Contactin-1)，72kDa型胶原酶(MMP2，72kDa type IV collagenase)，蛋白激酶c结合蛋白NELL2(NELL2，Protein kinase C-binding protein NELL2)，几丁质酶3样蛋白(CHI3L1，Chitinase-3-like protein 1)，胶原蛋白α-1(XV)链(COL15A1，Collagen alpha-1(XV)chain)，硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，Chondroitin sulfate proteoglycan 4)，神经源性位点切迹同源蛋白3(NOTCH3，Neurogenic locus notch homolog protein 3)，转化生长因子受体3型(TGFBR3，Transforming growth factor beta receptor type 3)，蛋白RECK(RECK，Reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs)，血管生成素关联蛋白3(ANGPTL3，Angiopoietin-related protein 3)，蛋白NENF(NENF，Neudesin)，ATP依赖DNA解旋酶DDX11(DDX11，ATP-dependent DNA helicase DDX11)，核孔复合体蛋白Nup155(NUP155，Nuclear pore complex protein Nup155)，腓骨蛋白5(FBLN5，Fibulin-5)，脱唾液酸糖蛋白受体2(ASGR2，Asialoglycoprotein receptor 2)，多能蛋白聚糖核心蛋白(VCAN，Versican core protein)，γ—亚麻酸基质蛋白(MGP，Matrix Gla protein)，骨调蛋白(OMD，Osteomodulin)，腱蛋白样蛋白1(CHRDL1，Chordin-like protein 1)。

下调表达的35个血清蛋白包含：α-2HS糖蛋白(AHSG，Alpha-2-HS-glycoprotein)，血清白蛋白(ALB，Serum albumin)，载脂蛋白AI(APOA1，Apolipoprotein A-I)，载脂蛋白AII(APOA2，Apolipoprotein A-II)，载脂蛋白B-100(APOB，Apolipoprotein B-100)，抗凝血酶III(SERPINC1，Antithrombin-III)，凝血酶原(F2，Prothrombin)，纤连蛋白(FN1，Fibronectin)，血浆α-L岩藻糖苷酶(FUCA2，Plasma alpha-L-fucosidase)，肝素辅因子2(SERPIND1，Heparin cofactor 2)，***1(IGF1，Insulin-like growthfactor I)，***2(IGF2，Insulin-like growth factor II)，***结合蛋白复合体酸不稳定亚基(IGFALS，Insulin-like growth factor-bindingprotein complex acid labile subunit)，***结合蛋白3(IGFBP3，Insulin-like growth factor binding protein 3isoform b)，***结合蛋白5(IGFBP5，Insulin-like growth factor-binding protein5)，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H2(ITIH2，Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2)，激肽原1(KNG1，Kininogen-1)，血纤维蛋白溶酶原(PLG，Plasminogen)，维生素K依赖蛋白C(PROC，VitaminK-dependent protein C)，血清铁传递蛋白(TF，Serotransferrin)，载脂蛋白L1(APOL1，Apolipoprotein L1)，胞外丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶FAM20C(FAM20C，Extracellularserine/threonine protein kinase FAM20C)，载脂蛋白A-V(APOA5，Apolipoprotein A-V)，磷脂酰肌醇多糖特异性磷脂酶D(GPLD1，Phosphatidylinositol-glycan-specificphospholipase D)，凝血因子XI(F11，Coagulation factor XI)，凝血因子XII(F12，Coagulation factor XII)，脯氨酰肽链内切酶FAP(FAP，Prolyl endopeptidase FAP)，血浆激肽释放酶(KLKB1，Plasma kallikrein)，血小板衍生生长因子B亚基(PDGFB，Platelet-derived growth factor subunit B)，α-2抗纤维蛋白溶酶(SERPINF2，Alpha-2-antiplasmin)，玻连蛋白(VTN，Vitronectin)，载脂蛋白A-IV(APOA4，Apolipoprotein A-IV)，受体酪氨酸蛋白激酶(EGFR，Receptor protein-tyrosine kinase)，生长激素受体(GHR，Growth hormone receptor)，整合素α2(ITGA2，Integrin alpha-2)。

本发明指示健康衰老的关键通路以及血清蛋白质标志物如表2所示，表明指征健康衰老的关键通路变化方向及其对应蛋白；血清蛋白质标志物的信息如表3所示，表明蛋白质在蛋白数据库Uniport的识别号及对应健康衰老的表达变化方向。

表2关键富集功能或通路及其对应蛋白

表3 193个指征健康衰老的蛋白分子信息

实施例3以骨骼生长(bone growth)这一通路进行健康衰老的评估：

具体实施方法如下：

1、由专业的医护人员抽取至少3个受试者血液(计算蛋白平均丰度需要至少3个样本)，经离心获取血清样本，放入-80℃保存；

2、测量血清样本中载脂蛋白L1的表达丰度：如通过基于质谱平台(Q-Exactive)的相对定量方法——TMT，来获取骨骼生长这一功能富集里面所包含4个蛋白：COL6A1,COL6A3,COL12A1,COMP的表达丰度，详细步骤如下：

a).蛋白提取：血清样品从－80℃取出，4℃，12000g离心10分钟，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，用Thermo公司生产的试剂盒参照Pierce^TM Top 12 AbundantProtein Depletion Spin Columns Kit说明书去除高丰度蛋白。利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。

b).胰酶酶解：蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2M。以1:50的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，37℃酶解过夜。再以1:100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，继续酶解4h。

c).TMT标记：胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥。以0.5M TEAB溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段。简单的操作如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。

d).HPLC分级：肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent 300Extend C18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)。操作如下：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、pH 9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为18个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。

e).液相色谱-质谱联用分析：肽段用液相色谱流动相A相(0.1％(v/v)甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相***进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0～50min，7％-24％B；50～67min，24％-35％B；67～71min，35％-80％B；71～75min，80％B，流速维持在400nL/min。肽段经由超高效液相***分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QExactiveTM HF-X质谱进行分析。离子源电压设置为2.0kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1600m/z，扫描分辨率设置为120,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，二级扫描分辨率设置为30,000。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用28％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为1E5，信号阈值设置为83000ions/s，最大注入时间设置为60ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒避免母离子的重复扫描。

f).数据库搜索：二级质谱数据使用Maxquant进行检索，检索参数设置：数据库为Human_UniProt(去污染库)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化,蛋白N端的乙酰化,脱酰胺化(NQ)。定量方法设置为TMT-11plex，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。

3、利用第2步(f)获取的蛋白表达信息，从实施例1提及的151个老年群体中抽取3个个体：受试者a，受试者b，受试者c，他们骨骼生长功能富集通路包含蛋白质的相对表达值分别为：COL6A1：a为1.268,b为1.202，c为0.916；COL6A3：a为0.095，b为0.080，c为0.099；COL12A1：a为0.459，b为0.378，c为0.457；COMP：a为1.599，b为1.333，c为1.405。可计算这3个受试者蛋白表达的参考水平，既表达值的算术平均值分别为：COL6A1参考水平为1.129，COL6A3参考水平为0.091，COL12A1参考水平为0.431，COMP参考水平为1.446。对于单一受试者a，其COL6A1(1.268>1.129)，COL6A3(0.095>0.091)，COL12A1(0.459>0.431)，COMP(1.599>1.446)蛋白表达水平都高于参考水平，代表它们表达上调，其对应骨骼生长功能上调。最后查表1可推测该个体a具有更高健康衰老的可能。

实施例4通过IGF信号通路下游通路——PI3K-Akt信号通路来进行健康衰老评估：

受试者PI3K-Akt信号通路所包含的7个下调表达蛋白：EGFR,FN1,GHR,IGF1,ITGA2,PDGFB,VTN表达丰度测量同实施例2中的第2步(a-f)，从实施例1提及的151个老年群体中抽取3个个体：受试者d，受试者e，受试者f，其7个蛋白质相对表达值分别为：EGFR：d为2.516，e为2.639，f为2.531；FN1：d为0.042，e为0.051，f为0.047；GHR：d为2.615，e为2.869，f为2.677；IGF1：d为0.547，e为1.050，f为1.071；ITGA2：d为缺失值，e为缺失值，f为缺失值；PDGFB：d为0.320，e为0.439，f为0.469；VTN：d为0.264，e为0.222，f为0.225。可计算这3个受试者蛋白表达的参考水平，既表达值的算术平均值分别为：EGFR参考水平为2.562，FN1参考水平为0.047，GHR参考水平为2.720，IGF1参考水平为0.889，ITGA2参考水平为缺失值(在此实施例中，因ITGA2在所选3个受试者中没获得表达值，所以用其它6个有表达数据的蛋白进行判断)，PDGFB参考水平为0.409，VTN参考水平为0.237。对于受试者d，此通路包含的6个蛋白中5个蛋白的表达量都低于参考水平，包括EGFR(2.516<2.562)，FN1(0.042<0.047)，GHR(2.615<2.720)，IGF1(0.547<0.889)，PDGFB(0.320<0.409)。这5个蛋白的下调表达，则其对应通路PI3K-Akt信号通路功能下调，通过查询表1可推测该个体d具有更高健康衰老的可能。对于一个通路包含多个蛋白，但实际实施过程中可能出现部分蛋白上调表达，部分蛋白下调表达的情况，取超过半数蛋白所代表的表达方向为通路表达方向。如在此实施例4，通路共包含6个有表达数据的蛋白，其中5个蛋白表达上调(大于一半数量——3个蛋白)，可知该通路表达上调。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.基于血清蛋白质标志物的指征健康衰老关键通路，其特征在于，包括12个上调通路和4个下调通路，其中，上调的通路有：损伤修复；止血，凝血和纤维蛋白凝块的形成；体液免疫反应；细菌防御反应；急性炎症反应；通过清除受体的配体绑定和摄取；轴突发育；骨骼生长；骨化作用；血管发育；轴突再生；下调的通路有：通过IGF绑定蛋白调控的IGF转运；止血的负调控；胆固醇的生物合成过程；PI3K-Akt信号通路。

2.指示权利要求1所述的健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物，其特征在于，包括158个上调表达的血清蛋白质标志物和35个下调表达的血清蛋白质标志物，其中，158个上调表达的血清蛋白质标志物为：α-2巨球蛋白，血浆蛋白酶C1抑制剂，胶原蛋白α-1(I)链，胶原蛋白α-2(I)链，胶原蛋白α-1(V)链，软骨寡聚基质蛋白，肌萎缩蛋白，A型肝配蛋白受体4，凝血因子VIII，颗粒蛋白前体，腱生蛋白，胰岛素生长因子绑定蛋白1，层粘连蛋白亚基β-2，半乳凝素1，蛋白LOX，蛋白LRP1，细胞表明糖蛋白MUC18，蛋白REG3A，抗胰蛋白酶，血管舒缓素6，受体型酪氨酸受体磷酸酶F，受体型酪氨酸受体磷酸酶S，胰石蛋白1-α，骨桥蛋白，组织因子途径抑制剂，金属蛋白酶抑制剂1，黏着斑蛋白，血管性血友病因子，丝氨酸/苏氨酸激酶24，骨膜蛋白，肿瘤坏死因子受体超家族成员12A，CD109抗原，α-1B糖蛋白，抗胰凝乳蛋白酶，补体因子D，含有富含亮氨酸重复蛋白的免疫球蛋白超家族，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4，α-1酸性糖蛋白1，激活蛋白原，维甲酸受体应答蛋白2，胸腺素β4，蛋白质FAM3C，蛋白VTI1B，分泌粒蛋白3，内皮细胞选择性粘附分子，酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型底物1，补体C1r亚基，补体C1s亚基，补体亚基C6，补体亚基C7，补体亚基C9，嗜铬粒蛋白A，C反应蛋白，补体衰退加速因子，血液结合素，免疫球蛋白重链恒定区α1，免疫球蛋白重链恒定区γ1，蛋白IGLC3，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，溶菌酶C，磷脂酶A，磷脂酶A2膜相关，蛋白SLPI，脊椎蛋白2，丝氨酸蛋白酶抑制剂kazal-5型，V-set和免疫球蛋白域蛋白4，免疫球蛋白重链变量区3-72，内凝集素1，β2微球蛋白，碳酸酐酶3，单核细胞分化抗原CD14巨噬细胞甘露糖受体1，子宫珠蛋白，血管细胞粘附蛋白，脂联素，缺乏夜蛋白，富亮氨酸α-2糖蛋白，可溶性清道夫受体富含半胱氨酸域蛋白SSC5D，双链RNA特异编辑酶1，干扰素α/β受体2，丝氨酸蛋白酶HTRA1，核糖核酸酶胰，白细胞介素-6受体β亚基，癌抑素M特异性受体β亚基，清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M130，补体因子H相关蛋白3，利尿钠肽A，C-C基序趋化因子，C-C基序趋化因子18，脑信号蛋白7A，组织蛋白酶Z，主朊病毒蛋白，脊椎蛋白1，粘连蛋白2，细胞粘附分子1，白细胞介素18结合蛋白，CRA_a亚型，钙网蛋白，组织蛋白酶B，细胞间粘附分子3，胶原凝素12，CD166抗原，蛋白AMBP，胶原蛋白α2(IV)链，缺氧上调蛋白1，叶酸受体β，叶酸基底膜特异性硫酸肝素蛋白多糖核心蛋白受体β，14-3-3蛋白γ，跨高尔基网络整合膜蛋白2，囊泡整合膜蛋白VIP36，含硫氧还蛋白域的蛋白5，胰蛋白酶1，钴胺传递蛋白2，钙粘素2，钙粘素11，EPH受体B4，亚型CRA_b，层粘连蛋白亚基α2，神经细胞粘附分子1，神经细胞粘附分子2，神经丛蛋白B1，颤蛋白，受体型酪氨酸蛋白磷酸酶ζ，神经纤毛蛋白2，神经细胞粘附分子l1样蛋白，蛋白ROBO4，软骨酸性蛋白1，CDO的兄弟蛋白，巨噬细胞集落刺激因子1，成纤维细胞生长因子受体1，外核肽焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员2，血小板反应蛋白4，跨膜糖蛋白NMB，胶原蛋白α-1(VI)链，胶原蛋白α-3(VI)链，胶原蛋白α-1(XII)链，层粘连蛋白亚基β-1，层粘连蛋白亚基γ-1，肌纤蛋白，胶原蛋白α-1(XVIII)链，接触蛋白1，72kDa型胶原酶，蛋白激酶c结合蛋白NELL2，几丁质酶3样蛋白，胶原蛋白α-1(XV)链，硫酸软骨素蛋白聚糖4，神经源性位点切迹同源蛋白3，转化生长因子受体3型，蛋白RECK，血管生成素关联蛋白3，蛋白NENF，ATP依赖DNA解旋酶DDX11，核孔复合体蛋白Nup155，腓骨蛋白5，脱唾液酸糖蛋白受体2，多能蛋白聚糖核心蛋白，γ—亚麻酸基质蛋白，骨调蛋白，腱蛋白样蛋白1；下调表达的35个血清蛋白包含：α-2HS糖蛋白，血清白蛋白，载脂蛋白AI，载脂蛋白AII，载脂蛋白B-100，抗凝血酶III，凝血酶原，纤连蛋白，血浆α-L岩藻糖苷酶，肝素辅因子2，***1，***2，***结合蛋白复合体酸不稳定亚基，***结合蛋白3，***结合蛋白5，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H2，激肽原1，血纤维蛋白溶酶原，维生素K依赖蛋白C，血清铁传递蛋白，载脂蛋白L1，胞外丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶FAM20C，载脂蛋白A-V，磷脂酰肌醇多糖特异性磷脂酶D，凝血因子XI，凝血因子XII，脯氨酰肽链内切酶FAP，血浆激肽释放酶，血小板衍生生长因子B亚基，α-2抗纤维蛋白溶酶，玻连蛋白，载脂蛋白A-IV，受体酪氨酸蛋白激酶，生长激素受体，整合素α2。

3.权利要求2所述的健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物在制备人类健康衰老预测产品中的应用，其特征在于，所述预测产品包含一种或多种血清蛋白质标志物的试剂，所述试剂通过检测受试者体内的一种或多种血清蛋白质标志物的蛋白质丰度，预测评估受试者是否是健康衰老。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具体是检测受试者血液中的一种或多种标志物的蛋白质丰度。

5.一种健康衰老诊断组合物，其特征在于，包括权利要求2所述的健康衰老血清蛋白质标志物中的一种或几种。