CN111363835A - 在种水平上鉴定样本中双歧杆菌的方法及其专用引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在种水平上鉴定样本中双歧杆菌的方法及其专用引物。本发明保护一种特异引物对，由序列1所示引物F1和序列2所示引物R1组成。本发明还保护一种特异引物组，由引物对甲和引物对乙组成；引物对甲由序列8所示引物F2和序列9所示引物R2组成；引物对乙由序列10所示引物F3和序列11所示引物R3组成。本发明还保护所述特异引物对或所述特异引物组的应用，为在种水平上鉴定样本中双歧杆菌。本发明为市场上相关乳制品的监管提供了新的思路，也为鉴定肠道样本或其他样本中具体的双歧杆菌提供了新的方法。

Description

在种水平上鉴定样本中双歧杆菌的方法及其专用引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在种水平上鉴定样本中双歧杆菌的方法及其专用引物。

背景技术

如今，全球食品市场上功能性乳制品层出不穷，人们对于新型益生菌乳制品的需求日益增长。双歧杆菌因其对人体健康具有生物屏障作用、营养作用、抗肿瘤作用、免疫调节作用、改善胃肠道功能和抗衰老等多种重要的生理功能，成为目前国内外研究极为热门的代表性益生菌。

自1899年法国巴黎巴斯德研究所首次从母乳喂养的婴儿肠道菌群中分离出双歧杆菌，目前已发现双歧杆菌共57种(亚种)。然而，随着乳制品的大规模生产，用类似双歧杆菌代替获批双歧杆菌或乳制品中双歧杆菌添加比例与标识不符等乱象层出不穷。因此，为了维护消费者的合法权益，快速、准确地鉴定双歧杆菌至关重要。同时，这也对识别复杂肠道菌群中双歧杆菌的种类及丰度具有重要意义。

传统的双歧杆菌鉴定方法是基于伯杰氏手册中细菌的表型特征，但对于一些表型特征相似，理化性质一致的种很难区分。随着分子生物学的发展，细菌的16S rDNA基因的全长序列已经成为菌种鉴定的金标准，但是由于片段过长(约1.5Kb)不能进行二代高通量测序。如果要用16S全长鉴定环境中的双歧杆菌，就需要将环境中全部细菌的16S rDNA的全长PCR产物克隆到质粒载体上再测序，该方法需要耗费大量的人力、物力。若双歧杆菌在环境中的丰度很低，利用该方法检测到双歧杆菌的概率会呈指数倍降低。而且16S高变区(如V3区、V3V4区等)虽然适用于二代高通量测序，但序列比较保守，片段过短，结果只能在属水平上区分菌种，对于亲缘性较近的菌种分辨率不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种在种水平上鉴定样本中双歧杆菌的方法及其专用引物。

本发明保护一种特异引物对，由引物F1和引物R1组成；引物F1如序列表的序列1所示；引物R1如序列表的序列2所示。引物F1和引物R1的具体摩尔比例为1:1。

本发明还保护一种特异引物组，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由引物F2和引物R2组成，引物F2如序列表的序列8所示，引物R2如序列表的序列9所示；所述引物对乙由引物F3和引物R3组成，引物F3如序列表的序列10所示，引物R3如序列表的序列11所示。引物F2和引物R2的具体摩尔比例为1:1。

本发明还保护所述特异引物对或所述特异引物组的应用，为在种水平上鉴定样本中双歧杆菌。

本发明还保护所述特异引物对或所述特异引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌。

本发明还保护一种PCR制剂，含有所述特异引物对或所述特异引物组。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述特异引物对或所述特异引物组或所述PCR制剂。

本发明还保护所述PCR制剂或所述试剂盒的应用，为在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌。

本发明还保护一种在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌的方法，依次包括如下步骤：

(1)提取样本的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增；

(3)回收PCR扩增产物并测序；

(4)将测序结果在数据库中进行BLAST比对，根据数据库中的最相似菌株判断样本中是否含有双歧杆菌以及含有哪种双歧杆菌。

所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，引物F1和引物R1的具体摩尔比例为1:1。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，引物F1和引物R1的浓度均为10μM。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，模板DNA的含量为50-100ng。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的退火温度具体可为54℃。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

所述最相似菌株即数据库中与某一测序结果序列同一性最高且同一性为90％以上序列所属的菌。

所述数据库具体可为NCBI。

本发明还保护一种在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌的方法，依次包括如下步骤：

(1)提取样本的基因组DNA；

(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用所述引物对甲进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；

(3)以步骤(2)得到的PCR扩增产物为模板，采用所述引物对乙进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；

(4)将多个样本步骤(3)得到的PCR扩增产物混合后进行高通量测序，获得各个样本的测序结果，将各个样本的测序结果在数据库中进行BLAST比对，根据数据库中的最相似菌株判断样本中是否含有双歧杆菌以及含有哪种双歧杆菌。

所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，引物F2和引物R2的具体摩尔比例为1:1。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，引物F2和引物R2的浓度均为10μM。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，模板DNA的含量为50-100ng。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的退火温度具体可为54℃。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

高通量测序具体采用Illumina HiSeq2500测序平台。

所述最相似菌株即数据库中与某一测序结果序列同一性最高且同一性为90％以上序列所属的菌。

所述数据库具体可为NCBI。

以上任一所述样本为生物样本、生物代谢物、生物加工品。

以上任一所述样本为粪便样本、奶制品。所述奶制品可为酸奶。

以上任一所述双歧杆菌为双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、青春双歧杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.Infantis)或长双歧杆菌长亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.Longum)。

本发明提供了一种快速、准确地在种水平上鉴定环境样本中双歧杆菌的方法。通过本发明提供的方法，可以对目前市面上的乳制品、人肠道中益生菌的种类进行鉴定，快速准确、应用范围广且限制少。一方面本发明能够有效地监管乳制品市场的乱象，使消费者买到真正有效的产品。另一方面本发明通过对人肠道双歧杆菌种类的鉴定，能够及时补充所需要的益生菌。本发明为市场上相关乳制品的监管提供了新的思路，也为鉴定肠道样本或其他样本中具体的双歧杆菌提供了新的方法。

附图说明

图1为实施例2的电泳图。

图2为实施例3的电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、特异引物对的获得

一、双歧杆菌菌种鉴定专用引物的设计与合成

通过大量序列比对、序列获得，引物设计、引物性能比较，获得一个特异引物对。

特异引物对由引物F1和引物R1组成。

F1(序列表的序列1)：5’-GTSACCGTYGARGACAACAAC-3’；

R1(序列表的序列2)：5’-ACGGCGCAGGASTTGAAVGTG-3’；

引物中，S表示C或G，Y表示C或T，R表示A或G，V表示A或G或C。

该特异引物对可以在核酸水平上实现对双歧杆菌菌种的分类鉴定。

实施例2、特异引物对的效果验证

供试菌株：菌株1.5043、菌株1.2226、菌株1.2190、菌株1.2202和菌株1.5014。各个菌株均获自CGMCC(中国普通微生物菌种保藏管理中心，China General MicrobiologicalCulture Collection Center,CGMCC)，编号均为在CGMCC中的编号。

菌株1.5043属于双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)。菌株1.2226属于动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)。菌株1.2190属于青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)。菌株1.2202属于长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.Infantis)。菌株1.5014属于长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.Longum)。

1、提取供试菌株的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1设计的特异引物对进行PCR扩增。

反应体系(25μL)：KAPA HiFi GC Buffer(5×)5μL、KAPA HiFi HotStart DNAPolymerase 0.5μL、KAPA dNTP Mix 0.5μL、引物F1 0.5μL、引物R1 0.5μL、基因组DNA 10μL，灭菌水8μL。反应体系中，引物F1的浓度为10μM，引物R1的浓度为10μM，模板DNA的含量为50-100ng。

KAPA HiFi GC Buffer(5×)、KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase、KAPA dNTPMix均为美国KAPA Biosystems公司产品。

反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

3、完成步骤2后，PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳(采用100bp DNA Marker；100V，60min)。PCR产物电泳结果见图1。

4、完成步骤2后，用磁珠纯化回收扩增片段，然后进行测序。

扩增片段均处于305±25bp范围。

菌株1.5043的测序结果如序列表的序列3所示。在NCBI中进行BLAST比对，最接近的序列为CP022723.1，同一性为99％。

菌株1.2226的测序结果如序列表的序列4所示。在NCBI中进行BLAST比对，最接近的序列为CP031154.1，同一性为99％。

菌株1.2190的测序结果如序列表的序列5所示。在NCBI中进行BLAST比对，最接近的序列为CP010437.1，同一性为99％。

菌株1.2202的测序结果如序列表的序列6所示。在NCBI中进行BLAST比对，最接近的序列为CP010411.1，同一性为100％。

菌株1.5014的测序结果如序列表的序列7所示。在NCBI中进行BLAST比对，最接近的序列为KX922701.1，同一性为100％。

结果表明，5株供试菌株的比对结果与实际菌种信息符合，序列同一性均达到99％以上，这说明设计的专一性引物能够用于双歧杆菌种水平上的鉴定。

实施例3、利用特异引物对鉴定生物样本中含有哪些双歧杆菌以及各类双歧杆菌的丰度

人群A为健康新生儿人群(由10个新生儿组成，依次命名为样本1-1至样本1-10；此处的新生儿指的是出生6个月以内的婴儿；均征得了监护人同意)。

人群B为健康产妇人群(由4个产妇组成，依次命名为样本2-1至样本2-4；此处的产妇指的是生产6个月以内的妇女；均为知情同意的志愿者)。

人群C为普通成人人群(由6个正常人组成，依次命名为样本3-1至样本3-6；均为非孕妇且非产妇；均为知情同意的志愿者)。

人群D为普通成人人群(由8个正常人组成，依次命名为样本4-1至样本4-8；均为非孕妇且非产妇；均为知情同意的志愿者)。

1、取各个个体的粪便，作为样本，采用天根公司的粪便基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增。F2(序列8)：

R2(序列9)：

引物中，S表示C或G，Y表示C或T，R表示A或G，V表示A或G或C。

反应体系(25μL)：KAPA HiFi GC Buffer(5×)5μL、KAPA HiFi HotStart DNAPolymerase 0.5μL、KAPA dNTP Mix 0.5μL、引物F2 0.5μL、引物R2 0.5μL、基因组DNA 10μL，灭菌水8μL。反应体系中，引物F2的浓度为10μM，引物R2的浓度为10μM，模板DNA的含量为50-100ng。

KAPA HiFi GC Buffer(5×)、KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase、KAPA dNTPMix均为美国KAPA Biosystems公司产品。

反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

3、完成步骤2后，用磁珠纯化回收扩增片段。

4、以步骤3回收的扩增片段为模板，采用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增。F3(序列10)：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNTCGTCGGCAGCGTCAG-3’；R3(序列11)：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGG-3’。

引物中，N代表A或T或C或G。

引物中，下划线标注的若干个N组成样本标签，每个样本具有唯一的样本标签。

5、完成步骤4后，PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳(采用100bp DNA Marker；100V，60min)。

PCR产物电泳结果见图2。图2中，A、B、C、D、F、I、J代表人群A中的部分个体，E、G、H代表人群B中的部分个体。可以看出，设计的专一性引物能够扩增粪便样本中的双歧杆菌。

6、将所有样本步骤4得到的PCR扩增产物纯化并回收(进行定量和质检)，然后混合，然后进行高通量测序(采用Illumina HiSeq2500测序平台，进行双端250bp测序。扩增片段均处于441bp±25bp范围。

7、根据样本标签，将原始测序结果归属于各个样本，然后将测序结果在NCBI中进行BLAST比对(长度阈值设定为250)，根据NCBI中的最相似菌株(最相似菌株即在NCBI中与某一测序结果序列同一性最高且同一性为90％以上序列所属的菌)是否为双歧杆菌进一步为哪种双歧杆菌来判断样本中具有哪种双歧杆菌，根据测序结果中某种双歧杆菌的序列数量与双歧杆菌总序列数量来确定该双歧杆菌的相对丰度。

人群A中各个个体的粪便中的双歧杆菌在NCBI中的最相似菌株以及该双歧杆菌的相对丰度的结果见表1和表2。

表1

表2

人群B中各个个体的粪便中的双歧杆菌在NCBI中的最相似菌株以及该双歧杆菌的相对丰度的结果见表3。

表3

人群C中各个个体的粪便中的双歧杆菌在NCBI中的最相似菌株以及该双歧杆菌的相对丰度的结果见表4。

表4

人群D中各个个体的粪便中的双歧杆菌在NCBI中的最相似菌株以及该双歧杆菌的相对丰度的结果见表5和表6。

表5

表6

实验结果表明，本发明所建立的方法不仅能够快速、准确地在种水平上鉴定双歧杆菌，而且适用范围广，可以应用于肠道中和益生菌产品中的双歧杆菌菌种检测，具有很好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 在种水平上鉴定样本中双歧杆菌的方法及其专用引物

<130> GNCYX182073

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gtsaccgtyg argacaacaa c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

acggcgcagg asttgaavgt g 21

<210> 3

<211> 323

<212> DNA

<213> Bifidobacterium bifidum

<400> 3

ccaagcggat cttgttcagg atgagggtcg gcagcgcctc gccgtcgacg tcctcggcga 60

tgatcagcag cggcttgccg gacttcatga cgagctcggc gatgtggacg acgtcctgct 120

ggctggaaac cttgccggag gtcaggagga tgtacggatc ctcaagaacc gcggtctggt 180

cgtccgcgtt ggtcacgaag tacggggcga tgtagccctt gtcgaaacgc atgccctcgg 240

tgaactcaag gtcaaggccg aagcggttgt tgtcttcaac ggtcacctgt ctcttataca 300

catctgacgc tgccgacgag aca 323

<210> 4

<211> 323

<212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis

<400> 4

cctacggatg ttgttgagaa tcagcgtggg cagtgcctcg ccatcgacat cctcggccac 60

gatcagcaac ggcttgccgg tcttcatcac cagttcggcg atgtggacca catcctgctg 120

cgaggagacc ttgctcgagg tgagcagaat gtacgggtcg tcgagcacgg ccgtctggtc 180

ttccgcattg gtgacgaagt agggggaaat ataacccttg tcgaagcgca tgccctcggt 240

gaaatcgaga tcgaggccga agcggttgtt gtcttcaacg gtcacctgtc tcttatacac 300

atctgacgct gccgacgaaa caa 323

<210> 5

<211> 324

<212> DNA

<213> Bifidobacterium adolescentis

<400> 5

cctagcggat gttgttcaga atcagggtcg gcagagcctc gccgtcaacg tcctcagcga 60

tgatcagcag cggcttgccg gtcttcataa ccaactcggc gatgtggacg acatcctgct 120

gggagctcag cttgccggag gtcaggagga tgtacggatc ctcgagaacg gcggtctggt 180

cctcggcgtt ggtcacgaag tacggagcga tgtagccctt gtcgaagcgc atgccctcgg 240

tgaagtcaag gtcaagaccg aagcggttgt tgtcttcaac ggtcacctgt ctcttataca 300

catctgacgc tgccgacgaa acaa 324

<210> 6

<211> 323

<212> DNA

<213> Bifidobacterium longum subsp. Infantis

<400> 6

cctacggatg ttgttcagga tcagggtcgg cagtgcttcg ccatcgacgt cctcagcgat 60

gatcagcagc ggcttgccgg tcttcatgac cagctcggcc acgtgcacga tgtcctgctg 120

ggaggagacc ttgccggagg tcagcagaat gtacggatct tcgagcactg cggtctggtc 180

gtcagcgttg gtgacgaagt acggggcgat gtagcccttg tcgaaacgca tgccctcggt 240

gaagtcgagg tccaggccga agcggttgtt gtcttcaacg gtcacctgtc tcttatacac 300

atctgacgct gccgacgaaa caa 323

<210> 7

<211> 321

<212> DNA

<213> Bifidobacterium longum subsp. Longum

<400> 7

cctacggatg ttgttcagga tcaaggtcgg cagtgcttcg ccgtcgacgt cctcagcgat 60

gatcagcagc ggcttgccgg tcttcatgac cagctcggcc acgtgcacga tgtcctgctg 120

ggatgagacc ttgccggagg tcagcagaat gtacggatct tcgagcactg cggtctggtc 180

gtcagcgttg gtgacgaagt acggggcgat gtagcccttg tcaaaacgca tgccctcggt 240

gaagtcgagg tccaggccga agcggttgtt gtcttcaacg gtcacctgtc tcttatacac 300

atctgacgct gccgaagaaa c 321

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggtsaccg tygargacaa caac 54

<210> 9

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagacggcg caggasttga avgtg 55

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(37)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnntcg tcggcagcgt cag 53

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 11

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtctcgtg ggctcgg 47

Claims (9)

1.特异引物对，由引物F1和引物R1组成；引物F1如序列表的序列1所示；引物R1如序列表的序列2所示。

2.特异引物组，由引物对甲和引物对乙组成；

所述引物对甲由引物F2和引物R2组成；引物F2如序列表的序列8所示；引物R2如序列表的序列9所示；

所述引物对乙由引物F3和引物R3组成；引物F3如序列表的序列10所示；引物R3如序列表的序列11所示。

3.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述特异引物组的应用，为在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌。

4.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述特异引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌。

5.一种PCR制剂，含有权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述特异引物组。

6.一种试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述特异引物组或权利要求4所述PCR制剂。

7.权利要求5所述PCR制剂或权利要求6所述试剂盒的应用，为在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌。

8.一种在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌的方法，依次包括如下步骤：

(1)提取样本的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，采用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增；

(3)回收PCR扩增产物并测序；

(4)将测序结果在数据库中进行BLAST比对，根据数据库中的最相似菌株判断样本中是否含有双歧杆菌以及含有哪种双歧杆菌。

9.一种在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取样本的基因组DNA；

(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用权利要求2中所述的引物对甲进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；

(3)以步骤(2)得到的PCR扩增产物为模板，采用权利要求2中所述的引物对乙进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；

(4)将多个样本步骤(3)得到的PCR扩增产物混合后进行高通量测序，获得各个样本的测序结果，将各个样本的测序结果在数据库中进行BLAST比对，根据数据库中的最相似菌株判断样本中是否含有双歧杆菌以及含有哪种双歧杆菌。

Images