CN111363765A

CN111363765A - 发酵制备乳酸的方法

Info

Publication number: CN111363765A
Application number: CN202010465504.6A
Authority: CN
Inventors: 佟毅; 李义; 周卫强; 魏超; 王小艳; 彭超; 陈博; 陶进
Original assignee: Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Jilin COFCO Bio Chemical Co Ltd; Cofco Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Jilin COFCO Bio Chemical Co Ltd; Cofco Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2020-05-28
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-05-28
Also published as: CN111363765B

Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，公开了一种发酵制备乳酸的方法，其特征在于，该方法包括：将乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）接种到发酵培养基中，接种后往发酵体系中通入微量含氧气体进行预发酵，直至发酵体系中乳酸片球菌的含量达到OD₆₀₀=8‑13；然后停止通入含氧气体，继续发酵至发酵体系中的五碳糖消耗量达到45‑55重量%；其中，接种前所述发酵培养基中含有40‑100g/L的葡萄糖和15‑45g/L的五碳糖，所述含氧气体的通气量以氧气计为0.005‑0.05vvm。采用本发明提供的方法进行乳酸发酵，可以将目前具有巨大产能的纤维素原料加以利用，为实现乳酸发酵的低成本、高转化率的规模工业化生产提供参考。

Description

发酵制备乳酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地涉及一种发酵制备乳酸的方法。

背景技术

聚乳酸是以乳酸为主要原料聚合得到的生物可降解性生物基材料，在全球禁塑的背景下，越来越受到关注，且每年的消费量都在不断增加。目前，乳酸工业生产方式主要是微生物发酵法，其中以乳酸细菌为菌种的同型发酵的理论糖酸转化率能达到100%，发酵过程属于兼性厌氧或者微耗氧状态，过程搅拌和通气水平较为温和，应用较为广泛。

在通过微生物发酵法大规模生产乳酸时，为实现产量增加、纯度提高、成本降低、效益提高、菌体耐受性增强等目标，需要进行生物工程上中下游的***性优化，比如菌株改造、廉价原料替代和分离提取的工艺提升，从乳酸生产工艺的多个环节不断挖掘潜力，提高生产效率。目前乳酸发酵过程主要使用淀粉作为原料，经由液化、糖化得到葡萄糖，并将获得的葡萄糖作为最常用的乳酸发酵碳源。

然而，纤维素作为自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上，年产量高达1500亿吨以上，在乳酸发酵生产中却难以直接被利用。因此，亟待开发一种以纤维素为原料的乳酸发酵工艺，将分布广泛而又价格低廉的纤维素利用起来，实现乳酸生产低成本高转化率的目的。

发明内容

本发明基于纤维素的巨大产能，为了实现乳酸生产低成本高转化率的目的，提供一种发酵制备乳酸的方法。采用本发明提供的方法，在乳酸发酵生产过程中，总糖酸转化率能够达到79±2%水平。

为了实现上述目的，本发明提供了一种发酵制备乳酸的方法，其特征在于，该方法包括：将乳酸片球菌接种到发酵培养基中，接种后往发酵体系中通入含氧气体进行预发酵，直至发酵体系中乳酸片球菌的含量达OD₆₀₀=8-13；然后停止通入含氧气体，继续发酵至发酵体系中的五碳糖消耗量达到45-55重量%，其中，接种前所述发酵培养基中含有30-100g/L的葡萄糖和15-45g/L的五碳糖，所述含氧气体的通气量以氧气计为0.005-0.05vvm。

通过上述技术方案，可以将价格低廉，产能巨大的纤维素作为原料应用于乳酸发酵生产中，降低了乳酸发酵生产的成本，并在小试和中试水平验证了本发明提供的方法能够实现低成本高转化的乳酸发酵，为工业化规模乳酸生产工艺提供了参考。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供了一种发酵制备乳酸的方法，该方法包括：将乳酸片球菌接种到发酵培养基中，接种后往发酵体系中通入含氧气体进行预发酵，直至发酵体系中乳酸片球菌的浓度达到OD₆₀₀=8-13；然后停止通入含氧气体，继续发酵至发酵体系中的五碳糖消耗量达到45-55重量%，其中，接种前所述发酵培养基中含有30-100g/L的葡萄糖和15-45g/L的五碳糖，所述含氧气体的通气量以氧气计为0.005-0.05vvm。单位“vvm”是指L/(L·min)。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述乳酸片球菌可以选用保藏编号为CGMCCNo.16833的乳酸片球菌。该乳酸片球菌已在CN109536409A公开。

接种前所述发酵培养基中除含有五碳糖外，还可以含有40-100g/L的葡萄糖。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养基中的碳源由纤维素酶解液提供。

优选地，以所述发酵体系为基准，所述发酵培养基中纤维素酶解液的加入量为10-30体积%。

更优选地，所述纤维素酶解液为所述发酵培养基提供25-50g/L的碳元素。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述五碳糖包括木糖和/或***糖。所述五碳糖可以通过本领域任意常规方式获得，例如可以直接购买商业产品获得，或者通过将任意含五碳糖的原料进行处理获得。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述五碳糖由纤维素酶解液提供，所述纤维素酶解液通过将纤维素原料依次进行酸解、汽爆、酶解和固液分离获得。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述纤维素原料可以为任意本领域常用纤维素原料。

优选的，所述纤维素原料选自秸秆、玉米芯、硬木、软木、果壳、草、纸、树叶、棉籽絮、柳枝和燕麦壳中的至少一种。

更优选地，所述纤维素原料选择秸秆和燕麦壳中的至少一种。

其中，所述秸秆可以包括任意含纤维素的农作物秸秆。优选为玉米秸秆、小麦秆、棉秆、高粱秆和水稻秸秆中的至少一种。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述酸解的方式可以为本领域任意的酸解方式，只要能够达到使木质纤维素结构松散、暴露程度增加的目的即可。

优选地，所述酸解的方式为：将经粉碎的纤维素原料与稀硫酸溶液接触一段时间，然后将所得物料进行脱水得到湿物料。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述经粉碎的纤维素原料的粒度可以为10-100mm。所述稀硫酸溶液的浓度为1-2重量%。所述经粉碎的纤维素原料与所述稀硫酸溶液的重量比为0.03-0.08：1。所述接触时间为0.5h以上，优选为0.6-0.8 h。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述脱水的方式可以为本领域内任意常用脱水方式，只要达到去除接触后物料中的水分的目的即可。

优选地，所述脱水的方式可以为挤压脱水。其优点在于设备简单，降低能耗，一次性脱水处理更为彻底。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述汽爆的目的在于实现纤维素、半纤维素和木质素的组分分离。只要能够达到上述目的的任意本领域常用汽爆方式均可适用于本发明提供的方法。

优选地，所述汽爆的方式为：将所述湿物料置于密闭设备中进行蒸汽***处理，获得汽爆产物。所述汽爆的条件包括：饱和蒸汽***处理的温度为160-170℃，时间为40-60min。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述酶解的方式为：将所述汽爆产物与酶进行接触。

优选地，所述酶选自纤维素酶、半纤维素酶，淀粉酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的至少一种。

更优选地，所述淀粉酶可以包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶中的至少一种。

更优选地，所述蛋白酶可以包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的至少一种。

进一步优选地，为了确保酶解效果，所述纤维素酶可以为纤维二糖酶、半纤维素酶和葡聚糖内切酶组成的复合体系。其中各种酶的配比可以根据纤维素原料的特性不同而进行不同的调整。例如，可以选用市售诺维信公司的Cellic CTec3纤维素复合酶。

进一步优选地，为了确保酶解效果，所述淀粉酶可以为α-淀粉酶和β-淀粉酶组成的复合体系。其中各种酶的配比可以根据纤维素原料的特性不同而进行不同的调整。例如，可以选用夏盛食品级α-淀粉酶与β-淀粉酶混合制成的复合酶体系，混合比例为1：0.15-0.25（重量比）。

进一步优选地，为了确保酶解效果，所述蛋白酶可以为木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的混合物。其中各种酶的配比可以根据纤维素原料的特性不同而进行不同的调整。例如，可以选用市售诺维信公司的Protamax复合蛋白酶。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述固液分离的原因在于，将上清液作为发酵培养基原料可以减轻后处理负担，从而降低后处理成本。任意本领域常规固液分离方式均可适用于本发明提供的方法。

优选地，所述固液分离的方式包括：板框过滤、离心分离或者自然沉降中的至少一种。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养基中的氮源由玉米浆提供。

优选地，以所述发酵培养基总体积为基准，其中所述玉米浆的加入量为3-8体积%。

更优选地，所述玉米浆为所述发酵培养基提供0.8-2.3g/L的氮元素。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养基中还可根据需要添加无机盐。所述无机盐的作用在于维持渗透压、作为功能蛋白酶的激活物质等。

优选地，所述无机盐可以包括：磷酸盐、可溶性镁盐和可溶性锰盐。例如KH₂PO₄、NaH₂PO₄、MgSO₄、MgCl₂、MnSO₄和MnCl₂等。

更优选地，所述无机盐的添加量为0.25-1.0 g/L。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述乳酸片球菌的接种方式可以包括：将乳酸片球菌制备成为种子液后接种至培养基中。

优选地，所述种子液的制备方法包括：将低温冻存的乳酸片球菌菌株接种于活化培养基中进行活化培养，过夜培养后制成新鲜种子液。其中，所述活化培养基可以是任意能使低温冻存的乳酸片球菌菌株复苏的培养基。例如，可以是MRS液体培养基和M17培养基中的任意一种。所述活化培养的条件可以包括：温度33-48℃，转速150-200rpm。

更优选地，所述种子液中所述乳酸片球菌的浓度为OD₆₀₀=7-12。

进一步优选地，以所述培养基体积为基准，所述种子液的接种量为1-10体积%。

本发明的发明人在研究的过程中发现，在预发酵过程中适量通入氧气，可以使菌种数量扩增速度加快，从而缩短乳酸发酵周期。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述含氧气体可以选用任意包含氧气的气体。

优选地，出于降低成本和便于操作的目的，所述含氧气体为空气。

更优选地，所述含氧气体的通入量以氧气计为0.005-0.05vvm。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述预发酵的条件包括：温度为35-48℃，pH值为5.3-6.5，时间为10-30h，搅拌转速为50-200rpm。

更优选地，所述预发酵的条件包括：温度为37-45℃，pH值为5.5-6.2，时间为15-25h，搅拌转速为70-150rpm。

本发明的发明人在研究的过程中发现，当培养基中的五碳糖消耗量达到特定范围时，一定周期内的乳酸的产率达到最高，此时继续进行发酵对于乳酸的产率和生产强度并没有提高。因此，为了避免无意义地延长发酵时间，可以在培养基中五碳糖消耗量达到特定范围时停止发酵，从而缩短发酵周期，提高生产效率。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养基中的五碳糖含量的检测方式为高效液相色谱法。

根据本发明的优选实施方式，当发发酵体系中的五碳糖消耗量为45-55重量%，乳酸发酵产量达到最大，可以停止发酵。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述继续发酵的条件与预发酵的条件可以相同或不同。所述继续发酵的条件包括：温度为37-45℃，pH值为5.3-6.5，时间为30-50h，搅拌转速为50-200rpm。

更优选地，所述继续发酵的条件包括：温度为37-45℃，pH值为5.7-6.2，时间为35-35h，搅拌转速为70-150rpm。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述预发酵和/或发酵过程中的pH通过加入中和剂的方式进行调节。根据本发明的优选实施方式，所述中和剂包括：石灰乳、氢氧化钠、碳酸钙、氨水、柠檬酸钾和柠檬酸钠中的至少一种。

优选地，所述中和剂为柠檬酸钾和/或柠檬酸钠。本发明的发明人在研究的过程中发现，将柠檬酸钾和/或柠檬酸钠作为中和剂时，具有在调节pH的同时能够兼顾补充碳源的优点，能够进一步提高乳酸产量。

根据本发明的优选实施方式，其中，出于最大化降低成本和提高糖酸转化率的目的，所述方法可以包括：将乳酸片球菌接种到发酵培养基中，接种后往发酵体系中通入含氧气体进行预发酵，直至发酵体系中的乳酸片球菌的浓度达到OD₆₀₀=10-13；然后停止通入含氧气体，继续发酵至发酵体系中的五碳糖消耗量达到48-53重量%。其中，接种前所述发酵培养基中含有60-80g/L的葡萄糖和25-35 g/L的五碳糖，所述含氧气体的通气量以氧气计为0.008-0.05vvm。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法在中试水平的糖酸转化率可以达到80%以上。其中，所述中试水平为采用100 L以上发酵罐进行发酵生产乳酸的水平。

优选地，所述发酵罐具有低剪切、高传质和高混合的特点。

以下将通过具体实施例来对本发明进行进一步的解释和说明。应当能够理解的是，以下实施例仅用于解释和说明本发明，而不用于限制本发明。

在以下实施例中，在无特殊说明的情况下，采用的菌株为保藏编号为CGMCC No.16833的乳酸片球菌，具体参见CN109536409A。-80℃超低温冰箱保存，甘油管每隔1-3个月活化复培一次。

在以下实施例中，所述乳酸片球菌新鲜种子液的配制方法为：将低温冻存的乳酸片球菌菌株接种于MRS液体培养基中，所述菌株的接入量以1-10体积%为宜。温度40±2℃，转速170±30rpm条件下过夜培养，得到新鲜种子液。

所述MRS液体培养基的配制方法为：葡萄糖 200 g/L，酵母提取物 5 g/L，固含40%的玉米浆10ml/L，乙酸钠 2 g/L，KH₂PO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，MnSO₄·H₂O 0.25g/L，吐温 1 mL/L。

在以下实施例中，所述纤维素酶解液的制备方式包括：将纤维素原料经粉碎、硫酸（浓度为1.6重量%）酸解、蒸汽汽爆（条件160℃，40 min）和纤维素酶（诺维信公司的CellicCTec3纤维素复合酶）酶解后，经滤布挤压制成。具体制备方式如下：

1、将木质纤维素原料粉碎至粒度为50±10mm，投入螺旋喂料器，对其进行挤压脱水至干物含量40±5重量%，形成致密的料塞，在保证纤维素原料不断进入处理容器的同时还能抵御容器内的蒸汽外泄；

2、将所述料塞从螺旋喂料器处理后，向其中混入硫酸，以所述料塞的重量为基准，所述硫酸的加入量为2±1重量%，在酸混合罐中混合后得到酸性纤维素原料；

3、将酸性纤维素原料在蒸煮处理容器中与蒸汽进行接触，条件为压力0.6MPa，时间50min。然后按照连续排料的方式排出容器；

4、将所得产物进行水洗，调节pH至5±0.1，加热至50℃后，加入纤维素酶，以每克产物的干重计，所述纤维素酶的添加量为0.15g。在50℃下保温搅拌72h，获得纤维素酶解液。

在以下实施例中，所述玉米浆为购自中粮生化榆树公司的玉米浓浆产品。KH₂PO₄、MgSO₄•7H₂O、MnSO₄•H₂O购自国药试剂公司。所述纤维素酶为购自诺维信公司的CellicCTec3纤维素复合酶产品。未做特殊说明时，采用的发酵罐为赛多利斯公司的Bio-Stat型号的2-5L发酵罐。

在以下实施例中，糖酸转化率的计算方式为：发酵结束时刻的乳酸总重量/初始的葡萄糖和五碳糖总重量。五碳糖包括：木糖和***糖。葡萄糖含量的测定方式为：生物传感分析仪（采用山东省科学院生物研究所SBA-40D型号的生物传感分析仪）。高温灭菌的条件为120℃，20 min。

在以下实施例中，所述五碳糖含量的测定方法为高效液相色谱法，其条件参照刘建伟. HPLC法测定木糖母液的组成[J]. 安徽农业科学, v.37(05):1881-1882。

在以下实施例中，所述乳酸的测定方式为高效液相色谱法，其条件如下所述：

仪器设备：Agilent Technologies 1260 Infinity II；

检出器：RID；

分离柱：Aminex HPX-87H Column 300×7.8 mm；

柱温：55℃

流动相：0.005M硫酸；

流量：0.5 mL/min；

进样量：20μL；

乳酸保留时间为14min左右。

实施例1

采用2L的发酵罐进行小试水平实验。

培养基制备：所述纤维素原料为秸秆。按照30体积%纤维素酶解液作为碳源，8体积%的玉米浆液作为氮源，并进一步添加无机盐KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、MnSO₄·H₂O 0.25 g/L，余量为水，高温灭菌后冷却至40℃待用。其中，五碳糖的含量为44 g/L，葡萄糖的含量为100 g/L。

预发酵：将1.2 L培养基加入发酵罐后，将乳酸片球菌新鲜种子液按照5体积%接种量接入发酵罐（浓度为OD₆₀₀=0.45），温度控制42℃，发酵转速为150 r/min，开启微量通气通入空气，通气量以氧气记为0.05vvm。以氢氧化钠溶液（浓度4重量%）为中和剂，在发酵过程中流加并控制pH为6。

继续发酵：当发酵体系中乳酸片球菌的含量达到OD₆₀₀=10时，停止通气，继续以42℃，发酵转速为150 r/min，以氢氧化钠溶液（浓度4重量%）为中和剂，在发酵过程中流加并控制pH为6的条件进行乳酸发酵。

结果：总发酵时间为75h，其中，预发酵时间为15 h，继续发酵时间为60h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为48%。总糖酸转化率达到78%，乳酸产量可达到95 g/L。

实施例2

采用2L的发酵罐进行小试水平实验。

培养基制备：所述纤维素原料为秸秆。按照10体积%纤维素酶解液作为碳源，3体积%的玉米浆液作为氮源，并进一步添加无机盐KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、MnSO₄·H₂O 0.25 g/L，余量为水，高温灭菌后冷却至40℃待用。其中，五碳糖的含量为15 g/L，葡萄糖的含量为36 g/L。

预发酵：将1.2 L培养基加入发酵罐后，将乳酸片球菌新鲜种子液按照1体积%接种量接入发酵罐（浓度为OD₆₀₀=0.09），温度控制37℃，发酵转速为150 r/min，开启微量通气通入空气，通气量以氧气记为0.05vvm。以氢氧化钠溶液（浓度4重量%）为中和剂，过程中流加并控制pH为6.2。

继续发酵：当发酵体系中乳酸片球菌的含量达到OD₆₀₀=10时，停止通气，继续以37℃，发酵转速为150 r/min，以氢氧化钠溶液（浓度4重量%）为中和剂，过程中流加并控制pH为6.2 的条件进行乳酸发酵。

结果：总发酵时间为48h，其中，预发酵时间为8 h，继续发酵时间为40 h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为53 %。总糖酸转化率达到80%，乳酸产量可达到35g/L。

实施例3

采用2L的发酵罐进行小试水平实验。

培养基制备：所述纤维素原料为秸秆。按照20体积%纤维素酶解液作为碳源，5体积%的玉米浆液作为氮源，并进一步添加无机盐KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、MnSO₄·H₂O 0.25 g/L，余量为水，高温灭菌后冷却至40℃待用。其中，五碳糖的含量为30g/L，葡萄糖的含量为70g/L。

预发酵：将1.2 L培养基加入发酵罐后，将乳酸片球菌新鲜种子液按照3体积%接种量接入发酵罐（浓度为OD₆₀₀=0.27），温度控制39℃，发酵转速为150 r/min，开启微量通气通入空气，通气量以氧气记为0.05vvm。以氢氧化钠溶液（浓度4重量%）为中和剂，过程中流加并控制pH为6.5。

继续发酵：当发酵体系中乳酸片球菌的含量达到OD₆₀₀=10时，停止通气，继续以39℃，发酵转速为100 r/min，以氢氧化钠溶液（浓度4重量%）为中和剂，过程中流加并控制pH为6.5的条件进行乳酸发酵。

实验结果：总发酵时间为66h，其中，预发酵时间为15h，继续发酵时间为51 h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为47%。总糖酸转化率达到79%，乳酸产量可达到66 g/L。

实施例4

采用5L的发酵罐进行小试水平实验。

培养基制备：所述纤维素原料为燕麦壳。按照15 体积%纤维素酶解液作为碳源，4体积%的玉米浆液作为氮源，并进一步添加无机盐KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、MnSO₄·H₂O 0.25 g/L，余量为水，高温灭菌后冷却至45℃待用。其中，五碳糖的含量为20 g/L，葡萄糖的含量为55 g/L。

预发酵：将3.0 L培养基加入发酵罐后，将乳酸片球菌新鲜种子液按照7体积%接种量接入发酵罐（浓度为OD₆₀₀=0.63），温度控制45℃，发酵转速为50r/min，开启微量通气通入空气，通气量以氧气记为0.008vvm。以氢氧化钠溶液（浓度4重量%）为中和剂，过程中流加并控制pH为5.3。

继续发酵：当发酵体系中乳酸片球菌的含量达到OD₆₀₀=10时，停止通气，继续以45℃，发酵转速为70 r/min，以氨水溶液（浓度14重量%）为中和剂，过程中流加并控制pH为5.3的条件进行乳酸发酵。

结果：总发酵时间为55 h，其中，预发酵时间为12h，继续发酵时间为43h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为51%。总糖酸转化率达到78 %，乳酸产量可达到51g/L。

实施例5

采用2L的发酵罐进行小试水平实验。

培养基制备：所述纤维素原料为玉米芯。按照25体积%纤维素酶解液作为碳源，7体积%的玉米浆液作为氮源，并进一步添加无机盐KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、MnSO₄·H₂O 0.25 g/L，余量为水，高温灭菌后冷却至40℃待用。其中，五碳糖的含量为35g/L，葡萄糖的含量为85 g/L。

预发酵：将1.2L培养基加入发酵罐后，将乳酸片球菌新鲜种子液按照5体积%接种量接入发酵罐（浓度为OD₆₀₀=0.45），温度控制40℃，发酵转速控制120 r/min，开启微量通气通入空气，通气量以氧气记为0.01vvm。以氨水溶液（浓度12重量%）为中和剂，过程中流加并控制pH为6.5。

继续发酵：当发酵体系中乳酸片球菌的含量达到OD₆₀₀=10时，停止通气，继续以40℃，发酵转速为120 r/min，以氢氧化钠溶液（浓度4重量%）为中和剂，过程中流加并控制pH为6.5 的条件进行乳酸发酵。

结果：总发酵时间为75h，其中，预发酵时间为18 h，继续发酵时间为57h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为52 %。总糖酸转化率达到81 %，乳酸产量可达到84g/L。

实施例6

采用100L的发酵罐进行中试水平实验，所述发酵罐为上海保兴生物工程有限公司的BIOTECH-100JS型号的100L发酵罐。

培养基制备：所述纤维素原料为秸秆。按照20体积%纤维素酶解液作为碳源，6体积%的玉米浆液作为氮源，并进一步添加无机盐KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、MnSO₄·H₂O 0.25 g/L，余量为水，高温灭菌后冷却至45℃待用。其中，五碳糖的含量为30 g/L，葡萄糖的含量为70 g/L。

预发酵：将57 L培养基加入发酵罐后，将乳酸片球菌新鲜种子液按照5体积%接种量接入发酵罐（浓度为OD₆₀₀=9），温度控制42℃，发酵转速控制80 r/min，开启微量通气通入空气，通气量以氧气记为0.01vvm。以氨水溶液（浓度14%）为中和剂，过程中流加并控制pH为6.0。

继续发酵：当发酵体系中乳酸片球菌的含量达到OD₆₀₀=10时，停止通气，继续以42℃，发酵转速为50 r/min，以氨水溶液（浓度14重量%）为中和剂，过程中流加并控制pH为6的条件进行乳酸发酵。

结果：总发酵时间为62 h，其中，预发酵时间为14h，继续发酵时间为48h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为46 %。总糖酸转化率达到78%，乳酸产量可达到65g/L。

实施例7

按照实施例1的方式，不同之处在于，采用柠檬酸钠溶液（浓度为11重量%）作为中和剂。

结果：总发酵时间为80 h，其中，预发酵时间为20 h，继续发酵时间为60 h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为49 %。总糖酸转化率达到80 %，乳酸产量可达到97 g/L。

实施例8

按照实施例1的方式，不同之处在于，采用如下方式进行继续发酵：

当发酵体系中乳酸片球菌的含量达到OD₆₀₀=8时，停止通气，继续以42 ℃，发酵转速为150 r/min，以氢氧化钠溶液（浓度4重量%）为中和剂，在发酵过程中流加并控制pH为6的条件进行乳酸发酵。

结果：总发酵时间为70h，其中，预发酵时间为12h，继续发酵时间为58h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为48%。总糖酸转化率达到72%，乳酸产量可达到90g/L。

实施例9

当发酵体系中乳酸片球菌的含量达到OD₆₀₀=13时，停止通气，继续以42 ℃，发酵转速为150 r/min，以氢氧化钠溶液（浓度4重量%）为中和剂，在发酵过程中流加并控制pH为6的条件进行乳酸发酵。

结果：总发酵时间为72h，其中，预发酵时间为16h，继续发酵时间为56h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为50%。总糖酸转化率达到77%，乳酸产量可达到93g/L。

对比例1

采用实施例1的方式，不同之处在于，采用全程厌氧发酵的方式，即，预发酵和继续发酵过程中均不通入空气。

结果：总发酵时间为90 h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为42 %。总糖酸转化率达到73%，乳酸产量可达到86 g/L。

对比例2

采用实施例1 方式，不同之处在于，预发酵过程中通气量以氧气记为0.1vvm。

结果：总发酵时间为72 h，其中，预发酵时间为12 h，继续发酵时间为60 h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为52%。总糖酸转化率达到66 %，乳酸产量可达到81g/L。

对比例3

采用实施例1的方式，不同之处在于，接种的乳酸片球菌的种子液接种量为1 体积‰。

结果：总发酵时间为90 h，其中，预发酵时间为20 h，继续发酵时间为70 h。发酵结束后，无葡萄糖残留，五碳糖消耗量为33%。总糖酸转化率达到66%，乳酸产量可达到76 g/L。

对比例4

采用实施例1的方式，不同之处在于，当培养基中的五碳糖消耗达到60%再停止发酵。

结果：总发酵时间为120 h，其中，预发酵时间为15 h，继续发酵时间为105 h。发酵结束后，无葡萄糖残留，五碳糖消耗量为60%。总糖酸转化率达到69 %，乳酸产量可达到87g/L。

对比例5

采用实施例1的方式，不同之处在于，预发酵后，发酵体系内乳酸片球菌生物量OD₆₀₀≥20 。

结果：总发酵时间为68 h，其中，预发酵时间为18 h，继续发酵时间为50 h。发酵结束后，无葡萄糖残留，五碳糖消耗量为49%。总糖酸转化率达到66%，乳酸产量可达到80 g/L。

对比例6

采用实施例1的方式，不同之处在于，在预发酵和继续发酵过程中均通入空气，即采用全程通气的方式通入空气。

结果：总发酵时间为66h，其中，预发酵时间为14h，继续发酵时间为52h。发酵结束后，无明显葡萄糖残留，五碳糖消耗量为56%。总糖酸转化率达到54%，乳酸产量可达到67 g/L。

通过实施例1与对比例1的结果对比可以看出，采用本发明提供的优选实施方式，即在预发酵阶段通入空气的方式，在乳酸生产应用中的总发酵时间更少，节约了时间成本。同时，发酵培养基中的五碳糖消耗量、糖酸转化率和乳酸产量均有所增加，提高了生产效率。

通过实施例1与对比例2的结果对比可以看出，虽然氧气通入量增加可以略微减少总发酵时间和培养基中五碳糖的消耗量，但是其糖酸转化率和乳酸产量明显下降。从这个结果可以看出，增加的五碳糖消耗并非用于乳酸发酵，而是更多供应菌体生长，对于乳酸发酵生产的生产效率无益。

通过实施例1与对比例3的结果对比可以看出，当乳酸片球菌的接种量低于本发明优选的接种量范围时，在乳酸发酵生产过程中的总发酵时间增加，培养基中五碳糖的消耗量、糖酸转化率和乳酸产量均有所下降。总体的生产效率降低，不利于工业化规模生产应用。

通过实施例1与对比例4的结果对比可以看出，当培养基中五碳糖的消耗量超过本发明优选的消耗量范围时，随着总发酵时间的增加，糖酸转化率和乳酸产量并没有相应增加。并且造成总体的生产效率较低，不利于工业化规模生产应用。

通过实施例1与对比例5的结果对比可以看出，当预发酵阶段结束时发酵体系内乳酸片球菌过多时，虽然总发酵时间有所降低，但是其中的预发酵时间相应增加，且总糖酸转化率和乳酸产量均有所下降，总体的生产效率降低。结合五碳糖的消耗量有所增加的结果看，可能是发酵体系中的营养成分更多供应了菌体生长而非乳酸生产。

通过实施例1与对比例6的结果对比可以看出，虽然发酵时间有所减少，但是总糖酸转化率和乳酸产量均有所下降。根据五碳糖消耗量的对比看，全程通气的条件下，发酵体系中的营养成分更多供应了菌体生长而非乳酸生产，造成生产效率下降，不利于工业化规模生产应用。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型。包括各个具体技术特征以任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。但这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种发酵制备乳酸的方法，其特征在于，该方法包括：将乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）接种到发酵培养基中，接种后往发酵体系中通入含氧气体进行预发酵，直至发酵体系中乳酸片球菌的含量达OD₆₀₀=8-13；然后停止通入含氧气体，继续发酵至发酵体系中的五碳糖消耗量为45-55重量%；

其中，接种前所述发酵培养基中含有30-100g/L的葡萄糖和15-45g/L的五碳糖，所述含氧气体的通气量以氧气计为0.005-0.05vvm。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述乳酸片球菌的保藏编号为CGMCC No.16833；

和/或，所述五碳糖包括木糖和/或***糖。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述五碳糖由纤维素酶解液提供，所述纤维素酶解液通过将纤维素原料依次进行酸解、汽爆、酶解和固液分离获得。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述纤维素原料选自秸秆、玉米芯、硬木、软木、果壳、草、纸、树叶、棉籽絮、柳枝和燕麦壳中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述酸解的方式为：将经粉碎的纤维素原料与稀硫酸溶液接触，然后将所得物料进行脱水得到湿物料；

和/或，所述汽爆的方式为：将所述湿物料置于密闭设备中进行蒸汽***处理，条件包括：饱和蒸汽***处理的温度为160-170℃，时间为40-60min，得到汽爆产物；

和/或，所述酶解的方式为：将所述汽爆产物与酶进行接触，所述酶选自纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述经粉碎的纤维素原料的粒度为10-100mm，所述稀硫酸溶液的浓度为1-2重量%，所述经粉碎的纤维素原料与所述稀硫酸溶液的重量比为0.03-0.08：1，所述接触时间为0.5h以上。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于发酵体系，所述乳酸片球菌的接种量使得其终浓度为OD₆₀₀=0.07-1.2；

和/或，所述乳酸片球菌以种子液形式接种，所述种子液中所述乳酸片球菌的浓度为OD₆₀₀=7-12，相对于所述发酵体系，所述种子液的接种量为1-10体积%。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含氧气体为空气。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预发酵的条件包括：温度为35-48℃，pH值为5.3-6.5，时间为10-30h，搅拌转速为50-200rpm。

10.根据权利要求1或9所述的方法，其中，所述继续发酵的条件与预发酵的条件相同或不同，包括：温度为35-48℃，pH值为5.3-6.5，时间为30-50h，搅拌转速为50-200rpm。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括：将乳酸片球菌接种到发酵培养基中，接种后往发酵体系中通入含氧气体进行预发酵，直至发酵体系中乳酸片球菌的浓度达到OD₆₀₀=10-13；然后停止通入含氧气体，继续发酵至发酵体系中的五碳糖消耗量达到48-53重量%；

其中，接种前所述发酵培养基中含有60-80g/L的葡萄糖和25-35 g/L的五碳糖，所述含氧气体的通气量以氧气计为0.008-0.05vvm。