CN111363040A

CN111363040A - 抗ox40的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN111363040A
Application number: CN201811593852.0A
Authority: CN
Inventors: 黄莺; 张发明; 席甘
Original assignee: Hangzhou Hansi Biomedical Co ltd
Current assignee: Hangzhou Hansi Biomedical Co ltd
Priority date: 2018-12-25
Filing date: 2018-12-25
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2038-12-25
Also published as: CN111363040B

Abstract

本发明提供了抗OX40的抗体或其抗原结合片段，以及相应的分离的多核苷酸、表达载体、重组细胞、药物组合物及其应用。应用该抗体可以治疗癌症或者自身免疫性疾病。

Description

抗OX40的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体的，本发明涉及一种抗OX40的单克隆抗体及其应用。

背景技术

OX40，又称CD134、TNFRSF4，属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factorreceptor，TNFR)超家族成员，OX40只表达在活化的CD4+T、CD8+T细胞表面。人的OX40是分子质量47～51kDa的I型跨膜糖蛋白，由249个氨基酸组成，其膜外区、跨膜区、膜内区分别由188、24、37个氨基酸组成，相应基因定位于人染色体1p36。OX40信号可以激活下游的NF-kB、PI3K和PKB通路，这些通路的持续激活最终能够延长T细胞的存活时间，并扩展T细胞记忆，促进T细胞的细胞杀伤能力；另外，OX40还能通过抑制调节性T细胞(Treg)的分化和活性，改善肿瘤微环境中的免疫抑制作用，进一步增强效应T细胞的功能。

OX40作为靶点进行治疗还有待进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种抗OX40的单克隆抗体。本发明提供的OX40抗体，能够被用于增强免疫响应以治疗癌症和传染性疾病，或者作为癌症疫苗的佐剂。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种抗OX40的抗体或其抗原结合片段，包括如下至少之一：(1)具有氨基酸序列为GFTFSDYY、ISDGGSNT和ARRGTGTGFGY的重链可变区，以及具有氨基酸序列ENIYST、AAT和QHFWGIPWT的轻链可变区；(2)具有氨基酸序列为GYTFTNYD、IYPEDGST和ARDTRGYFDY的重链可变区，以及具有氨基酸序列为SSVNY、YTS和QQFTSSPWT的轻链可变区；(3)具有氨基酸序列为GDSITSGY、ISFSGNT和ARYPYSYSNWDYAMDY的重链可变区；以及具有氨基酸序列为QFLLYSSSQKNY、WAS和HQYYSYPLT的轻链可变区；(4)具有氨基酸序列为GDSITIGF、INYSGSS和ARSGTDLDY的重链可变区，以及具有氨基酸序列为QSLLDSDGKTY、LVS和WQGTHFPRT的轻链可变区；(5)与(1)～(4)相比，具有一个以上保守氨基酸突变的氨基酸序列。根据本发明的实施例，所述与(1)～(4)相比，具有一个以上保守氨基酸突变的氨基酸序列优选为具有一个保守氨基酸突变的氨基酸序列，具有两个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或者具有三个保守氨基酸突变的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段可以进一步包括：(a)具有SEQID NO:1所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链；(b)具有SEQ IDNO:3所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链；(c)具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的轻链；(d)具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的轻链；(e)与以上(a)～(d)除所述重链可变区和所述轻链可变区之外的氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸突变。根据本发明的实施例，所述与(a)～(d)除所述重链可变区和所述轻链可变区之外的氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸突变可以为具有一个保守氨基酸突变，具有两个保守氨基酸突变或者具有三个保守氨基酸突变。

根据本发明的实施例，所述抗体为单克隆抗体。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的实施例，所述多核苷酸具有下列之一所述的核苷酸序列：SEQ IDNO:9所述的核苷酸序列和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；SEQ ID NO:11所述的核苷酸序列和SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；SEQ ID NO:13所述的核苷酸序列和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；SEQ ID NO:15所述的核苷酸序列和SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明第二方面所述的多核苷酸。所述表达载体包含了所述多核苷酸，所述表达载体可以为质粒，例如是能够将所述多核苷酸连接如其中的环形的双链DNA环；所述表达载体还可以是病毒载体，可以将所述多核苷酸连接入病毒基因组中。某些表达载体能够被引入宿主细胞中自主复制，某些表达载体可以在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。

根据本发明的实施例，以上所述表达载体可以进一步附加如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述表达载体进一步包括：控制元件，所述控制元件与所述多核苷酸可操纵地连接，用于控制所述多核苷酸在宿主细胞中的表达。“可操纵地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体轻链和重链的多核苷酸，可以分别独立的***到不同载体上，更常见的是***到同一载体上。

在本发明的一些实施例中，所述控制元件包括下列至少之一：启动子、增强子和终止子。

在本发明的一些实施例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞，包含本发明第三方面任一实施例所述的表达载体。本文中，所述重组细胞指的是经表达载体引入其中的细胞。应该理解的是，该重组细胞不仅指特定对象的细胞，而且也指这种细胞的子代细胞。因为突变或者环境的影响而在随后的传代中可能发生某些变动，所以这样的子代细胞可能事实上与亲代细胞不完全相同，但是仍然包含在本文所称的重组细胞的范围内。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种制备本发明第一方面任一实施例所述的抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法包括培养本发明第四方面所述的重组细胞。

根据本发明的第六方面，本发明提供了一种多核苷酸、表达载体、或重组细胞在制备抗体或其抗原结合片段的用途，所述抗体与OX40特异性结合。根据本发明的实施例，所述多核苷酸为根据本发明第二方面所述的多核苷酸，所述表达载体为根据本发明三方面所述的表达载体，所述重组细胞为根据本发明第四方面所述的重组细胞。

根据本发明的第七方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，选自下列中的至少一种：杂交瘤细胞HX011-9C12，保藏编号为C2018197，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年09月27日；杂交瘤细胞HX011-1D9，保藏编号为C2018198，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年09月27日。

根据本发明的第八方面，本发明提供了杂交瘤细胞在制备抗OX40的单克隆抗体中的用途，所述杂交瘤细胞为根据本发明第七方面所述的杂交瘤细胞。

根据本发明的第九方面，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段、多核苷酸、表达载体、重组细胞或杂交瘤细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗自身免疫性疾病或者癌症。所述药物能够用于抑制肿瘤细胞的生长，肿瘤细胞包括但不限于乳腺癌、***癌、结直肠癌或B细胞淋巴瘤的细胞。而且所述药物还能用来治疗自身免疫性疾病，这些自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、克罗恩氏病、炎性肠并、溃疡性结肠炎、乳糜泻、银屑病、增生性狼疮性肾炎、肉芽肿性肌病和多发性肌炎等。

根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段为根据本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段，所述多核苷酸为根据本发明第二方面所述的多核苷酸，所述表达载体为根据本发明三方面所述的表达载体，所述重组细胞为根据本发明第四方面所述的重组细胞，所述杂交瘤细胞为根据本发明第七方面所述的杂交瘤细胞。

根据本发明的第十方面，本发明提供了一种药物组合物，包括一种抗体或抗原结合片段、多核苷酸、表达载体、重组细胞或杂交瘤细胞。根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段为根据本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段，所述多核苷酸为根据本发明第二方面所述的多核苷酸，所述表达载体为根据本发明第三方面所述的表达载体，所述重组细胞为根据本发明第四方面所述的重组细胞，所述杂交瘤细胞为根据本发明第七方面所述的杂交瘤细胞。

本文提供的抗OX40抗体可以掺入适合受试者施用的药物组合物中。通常，这些药物组合物包括本文提供的抗OX40抗体以及药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。

例如，本发明的抗体可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。

根据本发明的第十一方面，本发明提供了一种用于鉴定能够与OX40结合的药物的方法，包括：在候选药物存在时，使本发明第一方面任一实施例所述的抗体或其抗原结合片段与抗原接触，并且确认所述抗体或其抗原结合片段与所述抗原的第一结合量；以及在不存在所述候选药物时，使本发明第一方面任一实施例所述的抗体或其抗原结合片段与抗原接触，并且确定所述抗体或其抗原结合片段与所述抗原的第二结合量；其中，所述抗原为OX40或其片段，所述第二结合量大于所述第一结合量是所述候选药物能够与OX40结合的指示。通过在不存在候选药物时，检测确定抗体与抗原的结合量，然后加入候选药物，检测确定抗体与抗原的结合量，比较两次确定的结合量的差值，如果当加入候选药物时，抗体与抗原的结合量降低，说明候选药物能够竞争性地与OX40抗原结合，从而可以鉴定得到能够与OX40结合的药物。

根据本发明的第十二方面，本发明提供了一种药物联合，包括：(1)一种抗体或抗原结合片段，多核苷酸，表达载体，重组细胞，杂交瘤细胞；以及(2)与(1)不同的免疫增强药物，其中所述抗体或抗原结合片段为根据本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段，所述多核苷酸为根据本发明第二方面所述的多核苷酸，所述表达载体为根据本发明第三方面所述的表达载体，所述重组细胞为根据本发明第四方面所述的重组细胞，所述杂交瘤细胞为根据本发明第七方面所述的杂交瘤细胞。

根据本发明的实施例，所述与(1)不同的免疫增强药物选自下列的至少之一：抗PD1抗体、LAG-3抗体、CTLA-4抗体、Tim3抗体或者PD-L1抗体。这些免疫增强药物可以同特定靶标结合，通过这些免疫增强药物和抗OX40抗体组合或者联合使用，组合治疗可以在较低剂量下即可以发挥治疗效果。

根据本发明的第十三方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用本发明第一方面任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的实施例，以上所述用于治疗癌症的方法中，所述癌症选自：乳腺癌、***癌、卵巢癌、结直肠癌或B细胞淋巴瘤。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明的实施例提供的9C12抗体动力学参数结果图。

图2是根据本发明的实施例提供的8A7抗体动力学参数结果图。

图3是根据本发明的实施例提供的种属特异性结合ELISA结果图。

图4是根据本发明的实施例提供的FACS方法检测9C12与OX40的结合活性的结果图。

图5是根据本发明的实施例OX40抗体刺激原代CD4+T细胞分泌IFN-γ结果图。

图6是根据本发明的实施例提供的OX40的Jurkat-NFκB-OX40报告基因法检测OX40抗体活性结果图。

图7是根据本发明的实施例提供的实验动物荷瘤体积变化图。

生物保藏

杂交瘤细胞HX011-9C12，保藏编号为C2018197，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间为2018年09月27日，地址为：中国武汉市武汉大学。

杂交瘤细胞HX011-1D9，保藏编号为C2018198，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间为2018年09月27日，地址为：中国武汉市武汉大学。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

为了提高OX40作为靶点的治疗效果，本发明提供了一种抗OX40抗体以及该抗体在药物治疗中的用途。通过本发明提供的抗OX40抗体可以治疗自身免疫性疾病或者癌症。本文中，抗OX40抗体也可以根据需要表述为OX40抗体或者也可以表述为分离的抗OX40抗体。

本文中，术语“单克隆抗体”是指从基本上同源的抗体的群获得的抗体，包括但不限于，利用杂交瘤或者重组DNA的方法制备得到单克隆抗体。本文中“抗OX40抗体”有时也称为“OX40抗体”。

本文中，术语“抗体”是由四个多肽链通过二硫键内部链接的两个重链和两个轻链组成的免疫球蛋白分子。每个重链由重链可变区和重链恒定区组成。每个轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成。重链可变区和轻链可变区可进一步包括互补决定区，也称高变区或者超变区(CDR)。

术语抗体的“抗原结合片段”包括保持特异性结合抗原(hOX40)能力的抗体片段。

具体地，本文中所述癌症可以为肺癌、***癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、***、子宫癌、卵巢癌、肝癌、血液***癌症或者任何特征在于不受控细胞生长的其它疾病或病症。

本文中，所述自身免疫性疾病可以为类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、银屑病、增生性狼疮性肾炎、肉芽肿性肌病和多发性肌炎等。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种抗OX40的抗体或其抗原结合片段，包括下列至少之一：(1)具有氨基酸序列为GFTFSDYY、ISDGGSNT和ARRGTGTGFGY的重链可变区，以及具有氨基酸序列ENIYST、AAT和QHFWGIPWT的轻链可变区；(2)具有氨基酸序列为GYTFTNYD、IYPEDGST和ARDTRGYFDY的重链可变区，以及具有氨基酸序列为SSVNY、YTS和QQFTSSPWT的轻链可变区；(3)具有氨基酸序列为GDSITSGY、ISFSGNT和ARYPYSYSNWDYAMDY的重链可变区；以及具有氨基酸序列为QFLLYSSSQKNY、WAS和HQYYSYPLT的轻链可变区；(4)具有氨基酸序列为GDSITIGF、INYSGSS和ARSGTDLDY的重链可变区，以及具有氨基酸序列为QSLLDSDGKTY、LVS和WQGTHFPRT的轻链可变区；(5)与(1)～(4)相比，具有一个以上保守氨基酸取代的氨基酸序列。

其中“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是该取代不破坏OX40的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者用极性氨基酸例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。

根据本发明的实施例，本发明提供了一种抗OX40的抗体，其重链可变区具有含有如下氨基酸序列的三个高变区：CDRH1(GFTFSDYY)，CDRH2(ISDGGSNT)，CDRH3(ARRGTGTGFGY)；轻链可变区具有含有如下氨基酸序列的三个高变区：CDRL1(ENIYST)，CDRL2(AAT)，CDRL3(QHFWGIPWT)。

在本发明的一种具体实施例方式中，所述抗体为9C12，其重链氨基酸序列(SEQ IDNO:1)为：Q V Q L Q Q S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S D Y Y M YW V R Q T P E K R L E W V A T I S D G G S N T Y Y P D S V K G R F T I S R D NA K N N L Y L Q M S S L K S E D T A T Y Y C A R R G T G T G F G Y W G Q G T LV T V S A；其轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：D I V L T Q T T AS L S V S V G E T VT I T C R A S E N I Y S T L A W Y Q Q K Q G K S P Q L L V Y A A T N L V AG VP S R F S G S G S G T Q Y S L K I N S L Q S E D F G S Y Y C Q H F W G I P W TF G G G T K L E I K。其中下划线处标示出了抗体重链和轻链上的高变区序列。

根据本发明的具体实施例，编码SEQ ID NO:1所示重链氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)为：

CAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAATGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGAAGTAACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCCGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGACGAGGGACTGGGACGGGGTTTGGTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA；

根据本发明的具体实施例，编码SEQ ID NO:2所示轻链氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)为：

GACATTGTGCTGACCCAGACTACAGCCTCCCTATCTGTTTCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTACTTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACAAACTTAGTAGCTGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTATTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA。

根据本发明的实施例，本发明提供了又一种抗OX40的抗体，其重链可变区具有含有如下氨基酸序列的三个高变区：CDRH1(GYTFTNYD)，CDRH2(IYPEDGST)，CDRH3(ARDTRGYFDY)，其轻链可变区具有含有如下氨基酸序列的三个高变区：CDRL1(SSVNY)，CDRL2(YTS)，CDRL3(QQFTSSPWT)。

在本发明的一种具体实施方式中，所述抗体为1D9，其重链氨基酸序列(SEQ IDNO:3)：E V Q L Q Q S G P E L V K P G A L V K I S C K A S G Y T F T N Y D I N WV K Q R P G Q G L E W I G W I Y P E D G S T K Y N E K F K G K A T L T A D K SS S T A Y M Q L S S L T S E N S A V Y F C A R D T R G Y F D Y W G Q G T T L TV S S；其轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:4)为：D I V M T Q T T A I M S A S L G E K V TM S C R A S S S V N Y I Y W Y Q Q K S D A S P K L W I Y Y T S N L A P G V P AR F S G S G S G N S Y S L T I S S M E G E D A A T Y Y C Q Q F T S S P W T F GG G T K L E F K R。其中下划线处标示出了抗体重链和轻链上的高变区序列。

根据本发明的实施例，编码SEQ ID NO:3所示重链氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO:11)为：

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGTTGGTGAAACCTGGGGCTTTAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTCACAAACTACGATATAAACTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGAAGATGGTAGTACTAAGTACAATGAGAAATTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACTTCTGAGAACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGACACACGTGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA；

根据本发明的实施例，编码SEQ ID NO:4所示轻链氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO:12)为：

GACATTGTGCTCACACAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGAAGGTCACCATGAGCTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATATACTGGTACCAGCAGAAGTCAGATGCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATTACACATCCAACCTGGCTCCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAACTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGGTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTTTACTAGTTCCCCATGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAATTCAAACGG。

根据本发明的实施例，本发明提供了另一种抗OX40的抗体，其重链可变区具有含有如下氨基酸序列的三个高变区：CDRH1(GDSITSGY)，CDRH2(ISFSGNT)，CDRH3(ARYPYSYSNWDYAMDY)，其轻链可变区具有含有如下氨基酸序列的三个高变区：CDRL1(QFLLYSSSQKNY)，CDRL2(WAS)，CDRL3(HQYYSYPLT)。

在本发明的一种具体实施方式中，所述抗体为8A7，其重链氨基酸序列(SEQ IDNO:5)为：Q V Q L Q E S G P S H V K P S Q T L S L T C S V T G D S I T S G Y W NW I R K F P G N K L E Y L G Y I S F S G N T Y Y N P S L K S R I S I I R D T SK N Q Y Y L Q L N S V T T E D T A T Y Y C A R Y P Y S Y S N W D Y A M D Y W GQ G T S V T V S S；其轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:6)为：D I V M T Q S P S S L V V SV G E K V T M S C K S S Q F L L Y S S S Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q S P Q L LI Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S V K A E D L A V YY C H Q Y Y S Y P L T F G A G T K L E L K。其中下划线处标示出了抗体重链和轻链上的高变区序列。

根据本发明的具体实施例，能够编码SEQ ID NO:5所示重链氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)为：

CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCAGGACCTAGCCACGTGAAACCTTCTCAGACTCTGTCCCTCACCTGTTCTGTCACTGGCGACTCCATCACCAGTGGTTACTGGAACTGGATCCGGAAATTCCCAGGAAATAAACTTGAGTATTTGGGGTACATAAGCTTCAGTGGTAACACTTACTACAATCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATCATTCGAGACACATCCAAGAACCAGTATTATTTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGATATCCTTACTCCTATAGTAACTGGGACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACTTCAGTCACCGTCTCCTCA；

根据本发明的具体实施例，能够编码SEQ ID NO:6所示轻链氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:14)为：

GATATTGTGATGACACAATCTCCATCCTCCCTAGTTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGTTCCTTTTATATAGTAGCAGTCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTCAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCACCAATATTATAGCTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA。

根据本发明的实施例，本发明提供了又一种抗OX40的抗体，其重链可变区具有含有如下氨基酸序列的三个高变区：CDRH1(GDSITIGF)，CDRH2(INYSGSS)，CDRH3(ARSGTDLDY)，其轻链可变区具有含有如下氨基酸序列的三个高变区：CDRL1(QSLLDSDGKTY)，CDRL2(LVS)，CDRL3(WQGTHFPRT)。

在本发明的一种具体实施方式中，所述抗体为9D7，其重链氨基酸序列(SEQ IDNO:7)：E V K L E E S G P S L V K P S Q T L S L T C S V S G D S I T I G F W N WI R K F P G N K L E Y M G Y I N Y S G S S Y Y N P S L K S R I S I T R D T S KN Q Y Y L Q L N S V T P E D T A T Y Y C A R S G T D L D Y W G Q G T T L T V SS；其轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:8)：D I V L T Q S P L T L S V T I G Q P A S I S CK S S Q S L L D S D G K T Y L N W L L Q R P G Q S P K R L I Y L V S K L D S GV P D R F T G S G S G T D F T L K I S R V E A E D L G V Y Y C W Q G T H F P R T F G G G T K L E I K R。其中下划线处标示出了抗体重链和轻链上的高变区序列。

根据本发明的实施例，编码SEQ ID NO:7所示重链氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO:15)为：

GAGGTGAAGCTGGAGGAGTCAGGACCTAGCCTCGTGAAACCTTCTCAGACTCTGTCCCTCACCTGTTCTGTCTCTGGCGACTCCATCACCATTGGTTTCTGGAACTGGATCCGGAAATTCCCAGGAAATAAACTTGAGTACATGGGATACATAAACTACAGTGGTAGCAGTTACTACAATCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTATTACCTGCAGTTGAATTCTGTGACTCCTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGATCTGGGACGGACCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA；

根据本发明的实施例，编码SEQ ID NO:8所示轻链氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO:16)为：

GATATTGTGCTCACACAGTCTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG。

根据本发明的实施例，所述抗OX40抗体还可以为与抗体9C12、1D9、8A7和9D7的氨基酸序列具有90％以上同源性的序列，优选为具有95％以上同源性的序列，更优选为98％以上同源性的序列，更优选为99％以上同源性的序列。例如可以表现为与抗体9C12、1D9、8A7和9D7的氨基酸序列相比，具有一个保守氨基酸取代、两个氨基酸保守取代、或者三个保守氨基酸取代、甚至更多。

本文中的抗OX40抗体还可以根据需要被制成试剂盒或者其他诊断性试剂的一部分。试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗OX40抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗OX40抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。这种相关疾病可包括OX40相关疾病，例如各种癌症、炎性症状或者自身免疫性疾病等等。当然本文提供的抗体也可以用于癌症的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。

实施例1 OX40杂交瘤细胞株的建立

根据hOX40的全长氨基酸序列，根据分子生物学方法制备具有下列氨基酸序列的人源融合蛋白hOX40-HIS：

LSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAHHHHHH(SEQ ID NO:17)。

然后利用制备的hOX40-HIS融合蛋白作为抗原，辅以佐剂，免疫小鼠，获得能够与hOX40蛋白特异性结合的单克隆抗体以及杂交瘤细胞株。其方法如下：

1.小鼠免疫及细胞融合

用制备得到的hOX40-HIS融合蛋白作为抗原，溶解在PBS中得到蛋白溶液。取适量的蛋白溶液，利用弗氏完全佐剂(Sigma)混匀乳化，取4周龄的BALB/c雌鼠，皮下多点注射抗原。2周后，取适量的蛋白溶液与弗氏不完全佐剂(Sigma)混匀乳化，在小鼠的皮下，进行第二次免疫。以后每隔3周，进行第三、四次免疫。第四次免疫后3天，取脾脏进行细胞融合。

待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价，高特异性的细胞株。

对于筛选得到的细胞株进行亚克隆，从而筛选得到分泌与hOX40蛋白特异性结合的单克隆稳定细胞株。

得到稳定细胞株后，用含10％的低IgG胎牛血清对稳定细胞株进行培养，在培养7～10天后收集细胞培养上清利用Hi-Trap protein A HP(GE Healthcare)亲和层析柱进行抗体纯化得到相应的杂交瘤抗体。纯化后的杂交瘤抗体直接用于后续实验。

所述杂交瘤抗体经过氨基酸序列测定包括如下四种，分别为：

第一种为：抗体9C12，其重链氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其轻链氨基酸序列为SEQID NO:2；

第二种为：抗体1D9，其重链氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其轻链氨基酸序列为SEQID NO:4；

第三种为：抗体8A7，其重链氨基酸序列为SEQ ID NO:5，其轻链氨基酸序列为SEQID NO:6；

第四种为：抗体9D7，其重链氨基酸序列为SEQ ID NO:7，其轻链氨基酸序列为SEQID NO:8。

实施例2 hOX40杂交瘤细胞株cDNA序列的获得

利用Trizol(Invitrogen)法提取杂交瘤细胞株的总RNA，然后用oligo-dT引物和SuperScript ⅡReverse Transcriptase(lnvitrogen，货号：18064-014)反转录成cDNA。经PCR扩增获得实施例1中不同抗体重链和轻链的DNA片段，连于克隆载体，挑取克隆进行测序。比对测序结果，获取正确序列。

其中，经过PCR扩增所获得的抗体9C12的重链核苷酸序列为SEQ ID NO:9；轻链核苷酸序列为SEQ ID NO:10；

经过PCR扩增所获得的抗体1D9的重链核苷酸序列为SEQ ID NO:11，轻链核苷酸序列为SEQ ID NO:12；

经过PCR扩增所获得的抗体8A7的重链核苷酸序列为SEQ ID NO:13；轻链核苷酸序列为SEQ ID NO:14；

经过PCR扩增所获得的抗体9D7的重链核苷酸序列为SEQ ID NO:15；轻链核苷酸序列为SEQ ID NO:16。

实施例3 ELISA方法检测hOX40特异性抗体

针对实施例1制备获得的杂交瘤抗体，检测不同抗体与hOX40的特异性结合，具体步骤如下：

1)包被抗原：配制hOX40-HIS抗原浓度为0.6μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜；

2)利用1％BSA(PBS稀释)在37℃封闭2小时，1×PBST(Tween-20，1％)洗涤3次，轻轻拍干；

3)加入一抗：将四种抗体的浓度分别配制成2μg/ml，以2μg/ml作为起始浓度，按照1:5梯度稀释，稀释为7个梯度浓度(即浓度分别为2μg/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.64ng/ml、0.128ng/ml)，空白对照组为PBS，然后分别加入配制好的一抗，37℃孵育1小时；

4)加入二抗：PBST洗涤3次，轻轻拍干，加入1:5000稀释的HRP酶标羊抗鼠IgG(H+L)二抗，每孔100μl，37℃孵育1小时；

5)显色：PBST洗涤3次，轻轻拍干；加入TMB显色剂，每孔100μl，室温反应5～15min；

6)显色终止：按照50μl/孔加入2M H₂SO₄溶液终止显色反应；

7)读数：在酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。

其中ELISA检测结果如表1所示。其中，EC₅₀值代表半最大效应浓度，即能够引起50％最大效应的浓度。从表1可以看出，4种单克隆抗体均与hOX40特异性结合，结合力从10.8nM到0.017nM。且相比较于1D9抗体来说，9C12抗体、8A7抗体和9D7抗体的特异性结合的效果更好。

表1单克隆抗体与hOX40结合ELISA结果图

实施例4使用ProteOn XPR分子相互作用仪测定OX40抗体动力学参数

利用ProteOn XPR分子相互作用仪可以检测不同药物和多种不同靶蛋白之间的相互作用的动力学和亲和力常数。将250nM的hOX40-HIS抗原(组蛋白修饰的hOX40抗原)固定于GLM芯片表面，在PBST中平衡后，与抗体9C12结合，9C12抗体用PBST两倍稀释，浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125、0nM，于PBST中解离。用同样的检测方法对8A7抗体进行检测，8A7抗体的浓度分别为308、154、77、38.5、19.25、0nM。

实验测得9C12、8A7动力学参数见表2，结果图见图1和图2。

表2不同抗体的动力学参数

其中，表2中ka(1/Ms)代表的是结合速率常数，kd代表的是解离速率常数，KD代表的是平衡常数，Rmax代表的是芯片表面的最大结合容量，Chi²代表的是卡方检验值。其中结合速率常数和解离速率常数代表抗原与抗体的结合的难易程度。

从以上数值可以看出，9C12抗体相比较于8A7抗体，更易和hOX40-HIS抗原结合。

实施例5 OX40抗体的种属特异性研究

分别包被人源OX40抗原、猴源OX40抗原以及鼠源OX40抗原，检测OX40抗体是否与不同种属的OX40蛋白交叉反应，具体步骤如下：

1)包被抗原：分别配制人源OX40抗原、猴源OX40抗原以及鼠源OX40抗原的浓度为0.25μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜；

2)利用1％BSA(PBS稀释)，在37℃封闭2小时，1×PBST(Tween-20，1％)洗涤3次，轻轻拍干；

3)加入一抗：将抗体9C12的浓度配制为2μg/ml，然后以2μg/ml作为起始浓度，按照1:5梯度稀释，稀释为7个梯度浓度(即浓度分别为2μg/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.64ng/ml、0.128ng/ml)，空白对照组为PBS，然后分别加入配制好的一抗，37℃孵育1小时；

6)显色终止：按照50μl/孔加入2M H₂SO₄溶液终止显色反应；

7)读数：在酶标仪上，用吸光度450nm检测各孔的吸光值。

结果见表3和图3，9C12抗体与人源OX40抗原、猴源OX40抗原结合，亲和力相当，与鼠源OX40抗原不交叉反应。

表3：种属特异性结合ELISA结果图

实施例6使用FACS(流式细胞荧光分选技术)方法检测9C12与hOX40的结合活性

本试验采用293T-OX40稳定转染细胞株细胞作为实验细胞，采用FACS方法检测9C12与细胞膜表面hOX40蛋白的结合情况。具体方法如下：

将表达hOX40的293T细胞消化下来，配成最终浓度为10⁶细胞/ml。每组取100μl的细胞混悬液到1.5ml的EP管中。加入配好的各浓度的9C12抗体(10000ng/ml、4000ng/ml、2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、200ng/ml、20ng/ml、2ng/ml)，冰上孵育1小时。1小时后，用HBSS洗涤一次。每组加入配好的APC羊抗人IgG二抗，冰上避光孵育20min后，用HBSS洗涤一次，最终用200μl的HBSS混悬，细胞上机检测。

通过FACS方法检测9C12与细胞膜表面hOX40的结合活性情况，结果如图4和下表4所示。

表4 FACS方法检测9C12与hOX40的结合活性的结果

由图4和上表的统计结果可知，9C12抗体与细胞膜表面hOX40的结合EC₅₀为2.84nM。

实施例7 OX40抗体体外共刺激人原代CD4+T细胞的研究

抽取人的新鲜血液40ml，利用淋巴细胞分离液分离人的PBMC，先用CD14磁珠(Miltenyi，货号：130-050-201)阳选出CD14单核细胞，剩下的细胞经CD4阴选磁珠(Miltenyi，货号：130-096-533)分离出CD4+T细胞。CD4+T细胞加入2μg/ml的PHA-L(Sigma)和200IU/ml的人重组IL-2(R&D)，用PBMC完全培养基(90％RPMI 1640(Hyclone)+10％FBS(四季青))，1x10⁶个细胞/ml铺入六孔板，放入37℃5％CO₂培养箱中培养48小时。

次日，96孔板每孔加入100μl含有2μg/ml的羊抗鼠Fcγ特异性IgG(Jackson)(或者2μg/ml的羊抗鼠Fcγ特异性IgG加上2μg/ml的羊抗人Fcγ特异性IgG(Jackson))的PBS溶液(Hyclone)。置入冰箱4℃包被过夜。第二天移去上清，用PBS洗涤。每孔再加入100μl含1％BSA的PBS溶液，放入37℃5％CO₂培养箱中封闭90min。完成后每孔再次吸出上清，加入200μl的PBS溶液清洗后待用。

重新回收CD4+T细胞并1800rpm离心5min后用PBMC完全培养基重悬，将细胞浓度调整到1 x 10⁶个细胞/ml。按照每孔100μl加入到包被好的孔中，每孔再加入50μl CD3抗体OKT3(2ng/ml，Biolegend)和50μl不同浓度(从1μg/ml按10倍稀释至1ng/ml)的OX40抗体或者50μl的PBMC完全培养基混匀。放入37℃5％CO₂培养箱中培养72小时。

72小时后收获上清，利用IFN-γELISA检测试剂盒(达优，货号：DKW12-1000-096)检测上清中IFN-γ的表达。

结果如图5所示，OX40抗体具有刺激人原代CD4+T细胞的能力，能促进IFN-γ的表达。

实施例8基于2-细胞的荧光素酶报告基因法检测OX40抗体生物活性作用

在该实施例中，使用一组2-细胞报告基因进行生物活性测定，来评估OX40抗体通过人OX40信号传导的能力。通过能够响应于NFκB信号传导途径的刺激，来产生荧光素酶的过度表达，来测量T细胞活化的量。即通过OX40抗体刺激NFκB信号传导途径，来发生Jurkat-NFκB荧光素酶报告。NFκB信号传导发生在OX40的下游，并可以与T细胞活化的其它测量(如增殖和细胞因子释放)相关。可通过检测荧光素酶的量来测量T细胞活化的量。

具体通过如下过程：

利用慢病毒分别构建能够稳定表达CD32A的293T细胞(293T-CD32A)和能够稳定表达人OX40和含有受NFκB信号通路调控的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)基因的Jurkat细胞(Jurkat-NFκB-OX40)。293T-CD32A细胞经胰酶消化后用完全培养基重悬并调节细胞浓度为2×10⁶个细胞/ml。Jurkat-NFκB-OX40细胞经1800rpm离心5min后用完全培养基重悬并调节细胞浓度为2×10⁶个细胞/ml。

在96孔中，每孔中分别加入50μl的293T-CD32A细胞和Jurkat-NFκB-OX40细胞悬液混匀。再加入100μl不同浓度的的OX40抗体(9C12抗体和1D9抗体，其浓度分别为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml)或者100μl的含有1μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的Jurkat细胞完全培养基混匀。放入37℃5％CO₂培养箱中过夜培养20小时。

次日1800rpm离心5min弃上清，每孔加入100μl的萤火虫荧光素酶检测试剂盒(厂家：碧云天，货号：RG005)裂解液，常温摇床震荡30min使细胞裂解荧光素酶释放。再次2000rpm离心5min后每孔取出90μl上清，加入到白色不透明的96孔板(Costar)中。每孔上清加入100μl显色液后，置入全功能微孔板检测仪(PerkinElmer，型号：EnVison)检测其自发光强度。

结果如图6所示，结果表明无论是9C12抗体还是1D9抗体对表达人OX40的Jurkat-NFκB-OX40报告细胞有明显的刺激作用。

实施例9 OX40抗体在MC38小鼠结直肠癌B-hOX40人源化小鼠模型中的抗肿瘤作用

具体如下：

MC38细胞为源自C57BL/6小鼠的鼠源结肠癌细胞，购自于舜冉上海生物科技有限公司。B-hOX40人源化小鼠是经过基因工程技术，将C57BL/6小鼠体内与OX40L蛋白分子相互作用的鼠源OX40蛋白分子部分替换为人源蛋白的小鼠模型，购自于百奥赛图江苏基因生物科技有限公司。

将PBS重悬的MC38细胞以5×10⁵个/0.1mL浓度，0.1mL/只体积接种于B-h OX40人源化小鼠的右侧皮下。当平均肿瘤体积达到100-150mm³时，挑选肿瘤体积、体重适中的小鼠入组，平均分配到4个实验组中，每组5只，分组当天开始给药，具体给药方案见下表，其中G1组给予PBS作为对照组。

表5：药效学实验设计

注：a：给药体积依实验动物体重按10μL/g计算；

b：BIW指每周给药2次。

各治疗组荷瘤鼠的肿瘤生长抑制情况见表6。

表6：肿瘤生长抑制效果

表6中TGI(The tumor growth inhibition value)代表肿瘤体积抑制率，用来评价动物体内药物对于肿瘤生长的抑制作用。该TGI值按照如下进行计算：

TGI值(％)＝(1-实验组相对肿瘤体积/对照组相对肿瘤体积)*100％

其中相对肿瘤体积为经过一段时间药物治疗后，肿瘤体积的变化值。

以G2组为例，该TGI值的计算如下：以第23天的G2组的肿瘤体积的变化值除以对照组第23天的肿瘤体积的变化值，得到差值，然后用1减去该差值，即得到TGI值。

从表6可以看出，无论是采用8A7抗体，还是1D9抗体或者是9C12抗体，均表现出良好的肿瘤抑制率。尤其是9C12抗体表现出更高的肿瘤抑制率，具有更好的治疗效果。

图7中示出了不同时间测定的荷瘤鼠的肿瘤体积，即经过不同药物处理的小鼠的肿瘤生长曲线。从图7可以看出，相比较于PBS对照组，采用8A7抗体给药处理、或者1D9抗体给药处理、或者9C12抗体给药处理均表现出明显的小鼠的肿瘤体积的抑制。而且相比较于8A7抗体来说，1D9抗体以及9C12抗体表现出更高的肿瘤抑制效果。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州翰思生物医药有限公司

<120> 抗OX40的单克隆抗体及其应用

<130> PIDC3183947

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链氨基酸

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链氨基酸

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Thr Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Val Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链氨基酸

<400> 3

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asn Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Thr Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

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Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链氨基酸

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser Ser Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Phe Lys Arg

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<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链氨基酸

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser His Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Leu

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Ile Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Tyr Pro Tyr Ser Tyr Ser Asn Trp Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

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<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链氨基酸

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Phe Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

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Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

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Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链氨基酸

<400> 7

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ile Gly

20 25 30

Phe Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Thr Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链氨基酸

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 9

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链编码序列

<400> 9

caagttcagc tgcagcagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattgggt tcgccagact 120

ccggaaaaga ggctggaatg ggtcgcaacc attagtgatg gtggaagtaa cacctactat 180

ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtccgaggac acagccacat attactgtgc aagacgaggg 300

actgggacgg ggtttggtta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链编码序列

<400> 10

gacattgtgc tgacccagac tacagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtactttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagtagctgg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 240

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ttccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 11

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链编码序列

<400> 11

gaggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ttggtgaaac ctggggcttt agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta caccttcaca aactacgata taaactgggt gaaacagagg 120

cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttatcctg aagatggtag tactaagtac 180

aatgagaaat tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac ttctgagaac tctgcagtct atttctgtgc aagagacaca 300

cgtggctact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351

<210> 12

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链编码序列

<400> 12

gacattgtgc tcacacagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga gaaggtcacc 60

atgagctgca gggccagctc aagtgtaaat tacatatact ggtaccagca gaagtcagat 120

gcctccccca aactctggat ttattacaca tccaacctgg ctcctggagt cccagctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gaactcttat tctctcacaa tcagcagcat ggagggtgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagttt actagttccc catggacgtt cggtggaggc 300

accaagctgg aattcaaacg g 321

<210> 13

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链编码序列

<400> 13

caggttcagc tgcaagagtc aggacctagc cacgtgaaac cttctcagac tctgtccctc 60

acctgttctg tcactggcga ctccatcacc agtggttact ggaactggat ccggaaattc 120

ccaggaaata aacttgagta tttggggtac ataagcttca gtggtaacac ttactacaat 180

ccatctctca aaagtcgaat ctccatcatt cgagacacat ccaagaacca gtattatttg 240

cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag atatccttac 300

tcctatagta actgggacta tgctatggac tactggggtc aaggaacttc agtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 14

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链编码序列

<400> 14

gatattgtga tgacacaatc tccatcctcc ctagttgtgt cagttggaga gaaggttact 60

atgagctgca agtccagtca gttcctttta tatagtagca gtcaaaagaa ctacttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct caactgctga tttactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcaccaata ttatagctat 300

ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339

<210> 15

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链编码序列

<400> 15

gaggtgaagc tggaggagtc aggacctagc ctcgtgaaac cttctcagac tctgtccctc 60

acctgttctg tctctggcga ctccatcacc attggtttct ggaactggat ccggaaattc 120

ccaggaaata aacttgagta catgggatac ataaactaca gtggtagcag ttactacaat 180

ccatctctca aaagtcgaat ctccatcact cgagacacat ccaagaacca gtattacctg 240

cagttgaatt ctgtgactcc tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag atctgggacg 300

gaccttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345

<210> 16

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链编码序列

<400> 16

gatattgtgc tcacacagtc tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120

ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcct 300

cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339

<210> 17

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 17

Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser

1 5 10 15

Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser

20 25 30

Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly

35 40 45

Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp

50 55 60

Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr

65 70 75 80

Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser

85 90 95

Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser

100 105 110

Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala

115 120 125

Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys

130 135 140

Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro

145 150 155 160

Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr

165 170 175

Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala

180 185 190

Val Ala His His His His His His

195 200

Claims

1.一种抗OX40的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括下列至少之一：

(1)具有氨基酸序列为GFTFSDYY、ISDGGSNT和ARRGTGTGFGY的重链可变区，以及具有氨基酸序列为ENIYST、AAT和QHFWGIPWT的轻链可变区；

(2)具有氨基酸序列为GYTFTNYD、IYPEDGST和ARDTRGYFDY的重链可变区，以及具有氨基酸序列为SSVNY、YTS和QQFTSSPWT的轻链可变区；

(3)具有氨基酸序列为GDSITSGY、ISFSGNT和ARYPYSYSNWDYAMDY的重链可变区；以及具有氨基酸序列为QFLLYSSSQKNY、WAS和HQYYSYPLT的轻链可变区；

(4)具有氨基酸序列为GDSITIGF、INYSGSS和ARSGTDLDY的重链可变区，以及具有氨基酸序列为QSLLDSDGKTY、LVS和WQGTHFPRT的轻链可变区；

(5)与(1)～(4)相比，具有一个以上保守氨基酸取代的氨基酸序列；

任选地，包括下列至少之一：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链；

(b)具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链；

(c)具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的轻链；

(d)具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的轻链；

(e)与以上(a)～(d)除所述重链可变区和所述轻链可变区之外的氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代；

任选地，所述抗体为单克隆抗体；

任选地，所述抗体或其抗原结合片段为与(a)～(d)具有90％以上同源性的序列，任选为具有95％以上同源性的序列，更优选为98％以上同源性的序列，更优选为99％以上同源性的序列。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段；

任选地，所述多核苷酸具有下列之一所述的核苷酸序列：

SEQ ID NO:9所述的核苷酸序列和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:11所述的核苷酸序列和SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:13所述的核苷酸序列和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:15所述的核苷酸序列和SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的多核苷酸；

任选地，进一步包括：

控制元件，所述控制元件与所述多核苷酸可操纵地连接，用于控制所述多核苷酸在宿主细胞中的表达；

任选地，所述控制元件包括下列至少之一：启动子、增强子和终止子；

任选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

4.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求3所述的表达载体。

5.一种制备权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，包括培养权利要求4所述的重组细胞。

6.一种杂交瘤细胞，其特征在于，选自下列中的至少一种：

杂交瘤细胞HX011-9C12，保藏编号为C2018197，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年09月27日；

杂交瘤细胞HX011-1D9，保藏编号为C2018198，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年09月27日。

7.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的表达载体、或权利要求4所述的重组细胞或权利要求6所述的杂交瘤细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗自身免疫性疾病或者癌症。

8.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求1所述的抗体或抗原结合片段、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的表达载体、权利要求4所述的重组细胞或权利要求6所述的杂交瘤细胞。

9.一种用于鉴定能够与OX40结合的药物的方法，其特征在于，包括：

在候选药物存在时，使权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段与抗原接触，并且确认所述抗体或其抗原结合片段与所述抗原的第一结合量；以及

在不存在所述候选药物时，使权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段与抗原接触，并且确定所述抗体或其抗原结合片段与所述抗原的第二结合量；

其中，所述抗原为OX40或其片段，所述第二结合量大于所述第一结合量是所述候选药物能够与OX40结合的指示。

10.一种药物联合，其特征在于，包括：

(1)权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求2所述的多核苷酸，权利要求3所述的表达载体，权利要求4所述的重组细胞或权利要求6所述的杂交瘤细胞；以及

(2)与(1)不同的免疫增强药物；

任选地，所述与(1)不同的免疫增强药物选自下列的至少之一：

抗PD1抗体、LAG-3抗体、CTLA-4抗体、Tim3抗体或者PD-L1抗体。