CN111363014A - 用于治疗创伤性脑损伤的多肽及其用途和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种分离的抑制N‑甲基D‑天冬氨酸受体2B亚型活性的肽、包含其的组合物、其在创伤性脑损伤后抑制神经细胞损伤中的用途、以及其固相合成方法。本发明的肽能够容易地跨血脑屏障以及神经细胞膜从而更好地治疗创伤性脑损伤。同时，本发明的固相合成方法不仅简单易行，而且收率高、污染少并且适于大规模生产。
Description
技术领域
本申请一般性涉及用于在创伤性脑损伤后减轻皮质损伤和促进功能恢复的多肽及其制备方法。
背景技术
在美国，每年发生150万级别从轻微到严重不等的创伤性脑损伤(traumaticbrain injury,TBI)事件。该数目是多发性硬化、脊髓损伤、AIDS和乳腺癌案例总数的6倍。此外，据估计，***和阿富汗战争中有300,000以上的美国退伍军人由于受到战时***物冲击而患有长期TBI。TBI是一种严重的公共健康问题。令人遗憾的是，很少措施可以用来反转由创伤所引起的初始脑损伤。由于严重受损并且可利用的治疗方法有限，TBI是儿童和年轻人的主要死亡原因之一，而幸存者也患有运动性残疾、认知缺损和癫痫症等后遗症。
TBI的神经、经济和社会后果对于患者、患者家庭和整个社会而言都是破坏性的。据估计，在美国仅在2000年TBI的成本就高达6千万美元。Bilmes和Stiglitz(2006)估计，***战争给政府所带来的脑损伤治疗成本在2015年将达到一千四百万美元(Bilmes L,Stiglitz,J.The economic costs of the Iraq war:an appraisal three years afterthe beginning of the conflict.Cambridge,MA:National Bureau of Economicresearch；2006.)。据不完全统计，在中国因颅脑损伤致残者累计有150-200万,每年新增8-10万；每年有20万人因伤致死。在全部死亡者中约60％-80％是因颅脑损伤致死，17％因颅脑损伤致残。脊髓伤致残者累计有50-60万,每年新增23万,由此造成的医疗消耗高达2000-3000亿元/年。这些统计数据表明，对于提高创伤后功能恢复的有效治疗方法存在迫切的需求。
据不完全统计，在中国因颅脑损伤致残者累计有150-200万，每年新增8-10万；每年有20万人因伤致死。在全部死亡者中约60％-80％是因颅脑损伤致死，17％因颅脑损伤致残。脊髓伤致残者累计有50-60万，每年新增23万，由此造成的医疗消耗高达2000-3000亿元/年。这些统计数据表明，对于提高创伤后功能恢复的有效治疗手段存在迫切的需求。
中国专利申请CN103230581A描述了一种采用短肽序列治疗创伤性脑损伤的方法。该短肽能够有效降低创伤性脑损伤后坏死性神经细胞死亡。
在本领域中，对于能够容易地跨血脑屏障以及神经细胞膜从而治疗创伤性脑损伤的短肽序列存在需求。对于简单易行、收率高、污染少并且适于大规模生产的多肽合成方法也存在需求。
发明内容
在一个方面中，本申请提供了一种抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽。在一个实施方案中，本申请的抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽包括或由SEQ IDNO:1(YGRKKRRQRRRKKNRNKLRRQHSY)所示的序列组成。
在一个实施方案中，本发明的肽能够解偶联NR2B与死亡相关蛋白激酶(DAPK1)的结合。在一个方面中，本发明的肽通过结合DAPK1而抑制NR2B磷酸化。
在一个实施方案中，本发明的肽可包含SEQ ID NO:1或其功能等效变体，所述变体具有1、2或3个保守氨基酸取代、添加或删除。本发明的肽可选自与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。
在一个实施方案中，本发明的肽可被化学修饰。
在一个方面中，本申请提供治疗创伤性脑损伤对象的方法，所述方法包括步骤：向对象施用治疗有效量的抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽，由此所述对象的至少一个神经细胞得以抑制。
在一个方面中，本申请提供抑制创伤性脑损伤后神经细胞损伤的方法，包括将至少一个神经细胞暴露于有效量的抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽，由此所述对象的至少一个神经细胞得以抑制。
在一个实施方案中，将至少一个神经细胞暴露于有效量的本发明的肽或向对象施用有效量的本发明的肽的步骤在遭受创伤性脑损伤后一段短的时间内进行。在一个示例性实施方式中，肽的施用在创伤性脑损伤后一周内，优选72小时、更优选48小时、仍更优选24小时或更少，例如，18、12、8、6、4、2或1小时内。
在一个方面中，本申请提供了有效量的抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽在制备用于在创伤性脑损伤后抑制神经细胞损伤的药物中的用途。
在一个方面中，本申请提供了有效量的抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽在制备用于在创伤性脑损伤后治疗对象的药物中的用途。优选地，所述对象是哺乳动物，优选人。
在一个方面中，本申请提供了用于在创伤性脑损伤后治疗神经损伤的组合物，所述组合物包含本发明的肽和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明的肽的治疗有效量在0.1-1000mg/kg体重的范围内，优选1-100mg/kg体重、更优选10-50mg/kg体重。
在一个方面中，本申请提供了一种的肽的固相合成方法。本发明的方法简单易行、最终收率高、污染少，并且适合于大规模生产。
附图描述
图1a和1b示例性出了本发明的合成工艺流程。
图2显示了根据本发明的一个实施方案得到的肽的MS图谱。
图3显示了根据本发明的一个实施方案得到的肽的HPLC图谱。
具体实施方案
为了促进对本发明原理的理解的目的，现参考在附图中举例说明的实施方案，并且将具体描述所述实施方案。然而，将理解的是，这些描述并不旨在对本发明的范围进行任何限制。
本申请的公开内容提供治疗神经损伤的各种组合物、方法和用途。在本发明的各种实施方案中，损伤可以由创伤性脑损伤引起。
定义
如本文所使用，术语“哺乳动物”是指任何分类为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农畜、以及动物园动物、体育动物或玩赏动物，诸如狗、猫、牛、马、羊、猪、山羊、兔等。
如本文所使用，术语“药学上可接受的载体”包括可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其对于接触所使用的剂量和浓度的细胞或哺乳动物而言是无毒的。生理学可接受的载体可以是含水pH缓冲溶液。生理学可接受的载体的实例包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、及其他糖类,包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露糖醇或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如
聚乙二醇(PEG)和
如本文所使用，术语“治疗有效量”是指有效“治疗”对象或哺乳动物中神经受损或损伤的分子、多肽、死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)结合寡肽、DAPK1-结合有机分子、N-甲D-天冬氨酸受体(NMDAR)或其它药物的量。在创伤性脑损伤的情况下，治疗有效量的“药物”可降低神经细胞死亡或损伤的水平；减少神经组织损坏区域；和/或在一定程度上减轻与创伤性脑损伤有关的一个或多个症状。在一个实施方式中，治疗有效量包括但不限于约0.1-1000mg/kg体重、优选1-100mg/kg体重、更优选10-50mg/kg体重。
N-甲基D-天冬氨酸受体(NMDAR)
分子克隆法迄今已经鉴定出许多NMDAR亚型，其分类为三个亚族：NR1、NR2(A–D)和NR3(A和B)。大多数天然NMDAR是由两个必需NR1亚型和一个或多个调控NR2亚型(最通常为NR2A和/或NR2B)构成的四聚体复合物。含NR2A的NDMA受体传导突触传递。它的活化刺激神经元存活信号传导复合物(SSC)以促进基础突触传递下的神经元存活，而含NR2B的NDMA受体主要位于突触外。在疾病状况下，增加的谷氨酸胞外浓度导致突触谷氨酸溢流和突触外的NMDAR(主要为含NR2B的NMDAR)的兴奋性毒性激活，其进一步激活死亡相关蛋白激酶(DAPK)。活性DAPK被募集，并结合和磷酸化NR2B，其继而阻断突触SSC活性并促进神经元死亡。由于NMDAR在突触生理学中具有重要作用，包括突触可塑性，并且还调节存活和死亡通路两者，因此，无选择性地阻断它的活性的拮抗剂可导致显著的不期望的副作用。
抑制神经损伤的方法
在本发明的至少一个实施方案中，神经损伤可通过将抑制剂引至NMDAR而治疗。例如，本发明的用于抑制神经细胞损伤的方法可包括步骤：将至少一个神经细胞暴露于有效量的通过将NMDAR 2B亚型与DAPK 1的结合解偶联而抑制NR28亚型活性的药物，由此该至少一个神经细胞的损伤被抑制。尽管NMDAR可包括NR1、NR2(A–D)和NR3(A和B)亚型的一个或多个，在一个示例性实施方案中，NMDAR包括NR2B亚型。另外，该方法的药物可包括肽、核苷酸或分子。任选地，药物还可包含药学上可接受的载体。
根据本发明的治疗创伤性脑损伤对象的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的抑制NR2B活性的肽，由此所述对象的至少一个神经细胞得以抑制。在一个实施方式中，所述肽可通过解偶联NR2B与DAPK 1的结合而起作用。在至少一个实施方式中，所述对象可以是哺乳动物，例如人。此外，施用治疗有效量的肽可通过选自下列的途径进行：静脉注射、肌内注射、皮下注射、逆行静脉注射、动脉注射、经皮施用、吸入和手术植入。在一个示例性实施方式中，本发明的治疗创伤性脑损伤对象的方法降低了所述对象的运动协调受损水平以及提高了其学习和记忆能力。
根据本发明的方法，将至少一个神经细胞暴露于有效量的本发明的肽或向对象施用有效量的本发明的肽的步骤在遭受创伤性脑损伤后一段短的时间内进行。在一个示例性实施方式中，肽的施用在创伤性脑损伤后一周内，优选72小时、更优选48小时、仍更优选24小时或更少，例如，18、12、8、6、4、2或1小时内。
本发明的肽
在一个示例性实施方案中，适合于本发明的肽包括具有SEQ ID NO:1(YGRKKRRQRRRKKNRNKLRRQHSY)的肽或与其具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％同一性的序列。
SEQ ID NO:1的结构可如下所示：
在一个示例性实施方式中，适合于本发明的肽包括具有SEQ ID NO:1或由SEQ IDNO:1组成的肽的功能等效变体。优选地，所述变体具有1、2或3个保守氨基酸取代、添加或删除并且表现出与本发明的肽实例具有基本相似的体内或体外活性。
本文所公开的肽的变体也处于本发明的范围内。肽变体指一个或更多个氨基酸被改变的氨基酸序列。变体可以具有“保守”改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如以异亮氨酸取代亮氨酸。备选地，变体可以具有“非保守”改变，例如以色氨酸取代甘氨酸。类似的较少改变还可包括氨基酸缺失或者***，或者两者。特定形式的“变体”肽是“功能等效的”肽，即表现出与本发明的肽实例具有基本相似的体内或体外活性的肽。可以使用本领域众所周知的计算机程序，例如DNASTAR软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)找到确定哪些氨基酸残基可以被替代、***或缺失而不丧失生物学或免疫学活性的指导。此外，在下面提供特定的指导，包括在所引用参考文献内提供那些，所述参考文献通过参考并入本文。
在另外的实施方案中，所命名残基的特定位置可以稍微变化而仍然存在于肽的结构和功能类似位置上(参见Chang，Y.，等，Biochemistry 37:3258-3271(1998))。
本发明的肽合成方法
本发明提供了一种肽的固相合成方法。
在一个实施方案中，本发明的合成方法以王树脂或者CTC树脂为载体。在缩合试剂作用下，按照序列合成肽树脂，用酸性裂解液将肽树脂裂解后，可得粗肽。本发明的方法可用于合成本发明的肽。
本发明提供了一种肽的固相合成方法，所述方法包括以下步骤：
以王树脂或CTC树脂为载体，在缩合试剂的作用下，将所述肽的序列中的氨基酸依次连接在树脂上，合成相应的肽树脂；
在裂解试剂的作用下，将所述肽树脂从树脂上裂解下来，并过滤；和
将滤液在沉降试剂中沉降并分离，以获得所述肽。
在一个实施方案中，所述缩合试剂是选自包括DIC、DCC、EDC、HCL、HBTU、HCTU、HATU、PYBOP、HOBt、DIEA和NMM的组中的一种或多种的缩合体系。
在一个实施方案中，所述裂解试剂选自包括三佛乙酸、苯甲硫醚、苯甲醚、间甲酚、1,2-乙二硫醇(EDT)、水和其任何组合的组。
在一个实施方案中，所述沉降试剂为***和甲基叔丁基醚的组合。
本发明的合成工艺示意如下：
本发明的更加具体的示例性合成工艺流程如图1所示。
在实施例1中采用的载体树脂、缩合试剂、裂解试剂和沉降试剂的具体组合是特别优选的。实施例1以及图2和3显示，本发明的方法不仅简单易行，而且最终收率高、污染少，并且适合于大规模生产。
下列实施例仅用于示例性阐述本发明而不是限制本发明。
实施例1本发明的多肽的制备
物料缩写备注如下表所示：
以0.5mmol的合成规模为例。
1.Fmoc-Tyr(tBu)-CTC-Resin的合成
取1g CTC树脂(替代度：0.968mmol/g)加入多肽玻璃反应住，用5ml DCM溶胀5分钟。称取0.44g Fmoc-Tyr(tBu)-OH放入小烧杯，用5ml DMF溶解，待完全溶解后，加入反应柱，再加入0.2ml DIEA，反应2小时。
反应结束后，用DMF洗三次，加入配好的封闭液l，对树脂封闭2次，每次10ml，每次15分钟。
封闭液配比：DCM：甲醇：DIEA＝17：2：1
封闭结束后，用DMF洗涤六次，每次5mi.
Fmoc-Tyr(tBu)-CTC-Resin替代度的测定
方法：精确称取3份抽干后的Fmoc-AA-Resin各5-10mg分别置于Ep管中，加入1mL25％Pip，置振荡器上振荡约15min。
另取四支10ml比色管，分别贴上标签:空白、样品1、样品2和样品3。在空白管中加入5mL DMF和100μL 25％Pip溶液，置于混合器上使两种液体混和均匀。在样品1、样品2和样品3中分别加入5mL DMF。待EP管振荡时间结束时用移液枪各移取100μl上清液于对应的比色管中，摇匀。
将紫外分光光度计打开，波长调至290nm。取一支比色皿用空白液润洗后倒掉，再取空白液至比色管约2/3处，放入光槽中，显示空白值，按归零键。取另一支比色皿按同样的方法放入第二个光槽中以校正第二个光路。显示0.000表明两个光路误差为0。将第二个比色皿中的空白液体倒掉，按上述同样的方法先后装入样品1溶液，样品2溶液和样品3，放入光路中，分别测定其吸收值A1、A2和A3。
使用公式SubX＝51*A290nm/(5.8*W)分别计算样品1、样品2、和样品3的替代度(其中A为290nm处的吸光值，W为取样重量)。取三者平均值根据算得的样品SubX和公式subY＝SubX/[1-SubX*(M-X)/1000]，算得SubY。
SubX＝当下肽树脂实测替代度
本次测定如下表格：
2 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶联
取0.8g Fmoc-Tyr(tBu)-CTC-Resin，加入多肽玻璃反应住，用5mlDCM溶胀10分钟。
加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。
脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.58g Fmoc-Ser(tBu)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
3 Fmoc-His(Trt)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.93g Fmoc-His(Trt)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次用量5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
4.Fmoc-Gln(Trt)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.92g Fmoc-Gln(Trt)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
5.Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.97g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
6.Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5ml DBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.97g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
7.Fmoc-Leu-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.53g Fmoc-Leu-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mL DIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
8.Fmoc-Lys(Boc)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.70gFmoc-Lys(Boc)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
9.Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.92g Fmoc-Asn(Trt)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
10.Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.97g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
11.Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.92g Fmoc-Asn(Trt)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
12.Fmoc-Lys(Boc)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.70gFmoc-Lys(Boc)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
13.Fmoc-Lys(Boc)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.70gFmoc-Lys(Boc)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
14.Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.97g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
15.Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.97g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
16.Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.97g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
17.Fmoc-Gln(Trt)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.92g Fmoc-Gln(Trt)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
18.Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.97g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
19.Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.97g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
20.Fmoc-Lys(Boc)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.70gFmoc-Lys(Boc)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
21.Fmoc-Lys(Boc)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.70gFmoc-Lys(Boc)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
22.Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.97g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
23.Fmoc-Gly-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.45g Fmoc-Gly-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mL DIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
24.Fmoc-Tyr(tBu)-OH的偶联
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色则继续实验。
取0.69g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(1.5mmol,3eq)、0.20g HOBt(1.5mmol,3eq)；0.57gHBTU(1.5mmol,3eq)置于小烧杯中，用5ml DMF/DCM＝1:1的比例溶解后，滴加0.31mLDIEA(1.8mmol,3.6eq)进行活化，活化温度0-10℃，时长5分钟。
然后将活化液倒入多肽反应柱中进行反应，反应柱控温在30±5℃，反应时间2个小时。
30±5℃下反应2个小时后，用DMF洗涤三次，每次5ml。用小玻璃管取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂无色透明。证明此氨基酸偶联完全。
茚检结果为无色后，加5mlDBLK溶液脱保护2遍(10min+15min)。脱完保护后，用适量DMF冲洗6遍，每次5ml，并取少量树脂滴加凯瑟试剂茚检，树脂显蓝色或者紫黑色.
然后用甲醇收缩树脂两次，每次五分钟，将树脂真空抽干。称量得树脂3.2g。
25.裂解肽树脂
取肽树脂进行裂解，肽树脂：裂解液(m:v)＝1:10
将肽树脂和32mL裂解液(冷冻的)置于200mL烧瓶中，加磁力搅拌子搅拌2小时以上。将烧瓶中溶液倒入砂芯漏斗中过滤，滤去树脂。滤液倒入260mL甲基叔丁基醚中(裂解液：甲基叔丁基醚＝1:8)。得到的悬浮液置于离心机中离心3-4次，每次离心都换新的甲基叔丁基醚充分洗涤多肽。离心完后，将多肽置于恒温真空干燥箱中，温度设为35℃，加五氧化二磷作为干燥剂。干燥两个小时左右，得粗肽1.33g。
26.HPLC制备
制备液相使用前的准备：A相为上述制备水溶液，B相为上述制备乙腈溶液，选择C18直径50MM的DAC制备柱，流速为40ML/MIN。柱温为25度。波长为220nm。
将上述环化过滤后粗肽500ML泵入液相进行制备，制备梯度为时间0-7-50(MIN)，浓度为5-29-39(B％),
出峰时间为25-30MIN，出峰是B％浓度为35％。收峰高为＞150MV，为纯品。得到本发明的肽(NH2-YGRKKRRQRRRKKNRNKLRRQHSY-OH)纯品。
所得产品的MS和HPLC图谱见图2和图3。
实施例2本发明多肽的神经保护效应
在本申请中，发明人采用了CN103230581A中的方法比较了本发明的肽与CN103230581A中的肽在TBI之后阻断NR2B S1303磷酸化、抑制兴奋性毒性激活、减少神经元死亡和改善行为结果等方面的神经保护效应。结果表明，本发明的肽在上述方面均表现出至少相当甚至更佳的保护效应(数据未示出)。不受理论束缚，相信本发明的肽的更好保护效应是由于其能够更好地跨血脑屏障和神经细胞膜。
虽然在本文已经非常详细地描述了治疗神经损伤的组合物和方法的各种实施方案，但该实施方案仅仅作为本文描述的公开内容的非限制性实例而提供。因此，本领域技术人员将理解，可以对本发明进行各种变化和改变，而不偏离本发明的范围。实际上，本公开内容不旨在是穷尽性的或旨在限制本发明的范围。
进一步，在代表性实施方案的描述中，本公开内容已经以特定步骤顺序给出本发明的方法和/或过程。然而，该方法或过程不应限于所描述的特定步骤顺序。其它步骤顺序是可能的。因此，本文公开的特定步骤顺序不应解释为对本发明的限制。此外，针对方法和/或过程的公开内容不应限于以所描述的顺序进行它们的步骤。这样的顺序可以变化并且仍在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种分离的抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽，其包含SEQ ID NO:1或其功能等效变体，所述变体具有1、2或3个保守氨基酸取代、添加或删除。
2.根据权利要求2所述的肽，其中所述肽具有选自与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其中所述肽被化学修饰。
4.有效量的根据权利要求1-3任一项所述的肽在制备用于在创伤性脑损伤后抑制神经细胞损伤的药物中的用途。
5.一种用于在创伤性脑损伤后治疗神经损伤的组合物，所述组合物包含权利要求1-3任一项所述的肽和药学上可接受的载体。
6.一种固相合成肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
以王树脂或CTC树脂为载体，在缩合试剂的作用下，将所述肽的序列中的氨基酸依次连接在树脂上，合成相应的肽树脂；
在裂解试剂的作用下，将所述肽树脂从树脂上裂解下来，并过滤；和
将滤液在沉降试剂中沉降并分离，以获得所述肽。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述缩合试剂是选自包括DIC、DCC、EDC、HCL、HBTU、HCTU、HATU、PYBOP、HOBt、DIEA和NMM的组中的一种或多种的缩合体系。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述裂解试剂选自包括三佛乙酸、苯甲硫醚、苯甲醚、间甲酚、1,2-乙二硫醇(EDT)、水和其任何组合的组。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述沉降试剂为***和甲基叔丁基醚的组合。
10.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述肽是根据权利要求1-3任一项所述的肽。
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