CN111351943A - 一种基于适配体识别-hcr反应的牛早孕快速检测方法及应用 - Google Patents

一种基于适配体识别-hcr反应的牛早孕快速检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于适配体识别‑HCR反应的牛早孕快速检测方法及应用。所述检测方法包含可以特异性结合牛妊娠相关糖蛋白的两条核酸适配体，以适配体1作为捕获探针，以适配体2作为检测探针进行检测，同时适配体2又包含一段引发链，可与发夹探针H1和H2发生杂交链式反应，通过杂交链上的发光物质或生物素直接或间接信号放大，定性定量检测bPAG蛋白，以实现对bPAG的快速、高灵敏、低成本检测。

Description

一种基于适配体识别-HCR反应的牛早孕快速检测方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于适配体识别-HCR反应的牛早孕快速检测方法及应用。更具体的，涉及以牛血清、全血、血浆、乳汁为样品快速判定牛是否妊娠的检测方法。
背景技术
在奶牛养殖中，繁殖问题严重影响了奶牛养殖业的发展，由于发情观察不准确、受精失败、繁殖疾病等因素，导致产犊间隔延长，产奶量下降等一系列问题，增加了非繁殖期饲养管理时间及饲养成本，影响了牧场养殖的经济效益（Inchaisri 等, 2010；张春刚等,2015）。而对配种后家畜准确的早期妊娠诊断，是提高奶牛繁殖效率和经济效益的根本要求和重要手段。
目前奶牛妊娠诊断方法主要包括：（1）直肠触诊法，（2）超声波检查法，（3）孕酮（P4）检测法等。直肠触诊法是目前最常用的方法，但该法一般在配种后 45-60d 方可进行检查，且对于操作者的技术水平要求较高，无法满足早期妊娠诊断要求。超声波诊断法可在配种后30d进行诊断，准确率较高，但仪器价格较高。孕酮检测法主要通过检测奶中或血液中孕酮的含量高低来判断是否怀孕，但该法是通过孕酮含量高低而不是有无来判断，测定结果可疑率较高。
牛妊娠相关糖蛋白 ( bovine pregnancy-associated glycoproteins，bPAG)由胎盘滋养层细胞表达产生（Xie 等，1994；Hughes 等，2000），在胚胎附植后进入母体血液，在整个妊娠期的表达和分泌，呈现时空特异性（Green 等，2000； Wooding 等，2005；Telugu等；2009），常作为一种标志物用于家畜早期妊娠诊断（Zoli 等 1992；Friedrich 等，2010；Reese 等，2018）。目前，基于免疫分析方法对血液或奶样中PAG的检测，已成为国际上应用最广泛的早期妊娠检测方法（Dufour 等，2017；Kaya 等，2016；Commun 等，2016），可对授精后28d的家畜进行早期妊娠诊断，诊断准确率达到90%以上（年Ricci 等，2015；张春刚等人，2015；Karen 等，2015）。目前商品化的PAG检测试剂盒已应用于生产，如美国爱德士（IDEXX）公司开发的基于酶联免疫反应原理的牛快速可视检测试剂盒，可检测牛血清或EDTA血浆中的PAG，但国内市场上销售的爱德士快速检测试剂盒价格颇高，限制了在国内大规模推广应用。
目前，基于免疫分析的PAG检测其识别分子均为抗体，但抗体的制备需经历动物实验，时间比较长，成本高。近些年，核酸适配体（Aptamer）作为新型识别分子逐渐成为研究热点，其本质是一段单链寡核苷酸折叠成发夹、茎环、假结体及G-四链体等二级或三级结构，通过氢键、范德华力等与靶分子相互作用而形成稳定的复合物，其空间结构的多样性几乎可以与所有种类的靶分子发生结合。与传统的抗体相比，具有适应范围广；高亲和力和高特异性，不受免疫条件和免疫原性限制；制备简单，可体外人工合成；变性与复性可逆，稳定性高；易于改造、标记和保存等优点。因此，核酸适配体作为一种理想的分子探针在分析检测、疾病诊断及治疗等领域得到广泛应用。
目前，还未见到基于适配体识别的家畜早孕妊娠诊断的研究报道。
发明内容
针对现有牛妊娠诊断技术的不足，本发明提出了基于适配体识别-HCR反应的牛早孕快速检测方法，实现牛的简单、快速、高灵敏、低成本早孕诊断。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
一种基于适配体识别-HCR反应的牛早孕快速检测方法及应用，包括以下步骤：
（1）合成用于杂交链式反应体系的发夹探针：
根据杂交链式反应原理，合成用于杂交链式反应的发夹探针H1和发夹探针H2的序列，其中，发夹探针H1包括a、b、c三个部分，a的部分序列与c序列互补成双链作为发夹探针H1发夹结构的茎部，b序列与引发链d序列互补；发夹探针H2包括a’、 b’、c’三部分，其中a’的部分序列和c’序列互补成双链作为发夹探针H2发夹结构的茎部，发夹探针H1的a序列与发夹探针H2的a’序列互补，发夹探针H2的c’序列与发夹探针H1的c序列互补；
（2）合成牛妊娠相关糖蛋白（bPAG）适配体1，作为捕获探针；
（3）合成牛妊娠相关糖蛋白（bPAG）适配体2，作为检测探针，其中，适配体2包含与发夹探针H1的部分序列互补的d序列；
（4）牛妊娠相关糖蛋白（bPAG）检测：
将步骤（2）中的适配体1附着到支持载体上，加入待测标靶牛妊娠相关糖蛋白，孵育，加入步骤（3）的适配体2，孵育，形成双适配体夹心结构，再加入发夹探针H1和发夹探针H2，适配体2包含的引发链引发杂交链式反应（HCR），生长形成dsDNA长链，通过dsDNA长链上标记的发光物质或生物素直接或间接实现信号放大，实现对bPAG蛋白的定性定量检测。
进一步的，所述牛妊娠相关糖蛋白适配体1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-TTGAAGTGACTCCCACCCACCGTCCACCGTATTTCACCGTCCATTGCATAGCAGGT-3’；
所述牛妊娠相关糖蛋白适配体2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-TTGAAGTGaCGCCAGGGTGGGGGGGTGGGTGTTGGCGTACACTTCGCATAGCAGGTAAAAAAAATGGAGTGAAGGCGCATACCTCTTT -3’；
所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：
5’-GAAGGCGCATACCTCTTTAATTGGAAAGAGGTATGCGCCTTCACTCCA-3’；
所述发夹探针H2核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：
5’-CCAATTAAAGAGGTATGCGCCTTCTGGAGTGAAGGCGCATACCTCTTT-3’。
进一步的，所述步骤（4）中的支持载体为聚苯乙烯板或磁纳米材料，支持载体表面包被有链霉亲和素，包被溶液为10mM 的PBS缓冲液（pH7.4）；所述发夹探针H1和H2上标记的发光物质为荧光标记物质、纳米发光材料、酶、地高辛、生物素。
进一步的，所述步骤（4）中杂交缓冲液为10 mM PBS（pH7.4），孵育时间为30~60min，H1: H2的摩尔比为1:1，杂交反应时间为1~2 h。
上述基于适配体识别-HCR反应的牛早孕快速检测方法在检测牛血清、全血、血浆、乳汁中妊娠相关糖蛋白含量或早期妊娠诊断产品中的应用。
本发明具有以下有益效果：
（1）成本低：适配体及杂交链可体外人工合成，克服了抗体制备周期长、成本高的缺点，降低了生产成本。
（2）灵敏度高：经过杂交链式反应信号放大效应，更大限度地提高了检测灵敏度。
（3）操作简单：不需昂贵的仪器，全过程在恒温条件下进行，检测步骤较少，操作简单。
附图说明
图1为本发明实施例1的bPAG检测原理意图。
图2 为本发明实施例1检测牛妊娠相关糖蛋白9的标准曲线图。
图3为本发明实施例2检测牛妊娠相关糖蛋白6的标准曲线图。
图4 为基于实施例1方法可视化检测奶牛妊娠结果。-为阴性对照，+为阳性对照，1-6为怀孕奶牛血清检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对发明进一步阐述，以便本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定而不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所用适配体、引发链、发夹DNA均由上海生物工程技术有限公司合成。
实施例1：
基于适配体识别-HCR信号放大检测bPAG9，包括如下具体步骤：
（1）链霉亲和素（SA）包被于酶标板：每孔加100μL含有 SA（2μg/mL）的PBS（10 mM，pH7.4）溶液，4℃孵育过夜，PBS洗涤液3~5次，拍干；
（2）封 闭：每孔加入200μL含有1%牛血清白蛋白（BSA） 的PBS缓冲液，37℃孵育1h，PBS洗涤后烘干备用；
（3）生物素化适配体1（bio-apt1）固定于酶标板：用10mM PBS缓冲液将bio-apt1稀释成100nM，每孔加入50μL，37℃温育30min，PBS洗涤3~5次，拍干；
（4）加样：加入100 μL不同浓度的bPAG9（0、0.01、0.1、1、10、50、100、500、1000ng/mL），37 ℃孵育20 min， PBS洗涤，拍板；加入100 μL 100nM适配体2（apt2），37 ℃孵育20 min，PBS洗涤，拍板；取浓度为1 μM 生物素化的发夹探针H1（Bio-H1）和发夹探针H2（Bio-H2），沸水加热5分钟，室温冷却后，各取50 μL加入反孔，室温杂交反应1 h，PBS洗涤，拍干；
（5）显色：加入100 μL 链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）（0.05 U/mL）溶液，室温反应15 min，PBS洗涤，拍干；
（6）终止反应：每孔加入100 μL TMB显色液，避光显色10 min；加入100μL 终止液（2.0M H2SO4），酶标仪450 nm测吸光值；
（7）标准曲线的建立：以bPAG9浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作图，利用软件绘制标准曲线，建立回归方程，图2为该方法测定的标准曲线：y=0.448＋0.375x, R= 0.996，线性范围为0.1-500 ng/mL。
实施例2：
基于适配体识别-HCR信号放大的磁分离比色检测bPAG6，包括如下具体步骤：
（1）链霉亲和素-磁珠（SA-MB）偶联：取羧50 μL基化的磁珠（10 mg/mL），PBS洗涤，取0.1M NHS+0.4M EDC混合溶液（v/v，1:1）50 μL加入到磁珠中，震荡反应20 min；活化完毕，磁分离，PBS洗涤，加入NaAC（10 mM, pH5.0）和SA（0.5 mg/mL），震荡反应60 min；偶联结束，磁分离，PBS洗涤后，加入100 μL的乙醇胺（1.0 M, pH8.5)，震荡反应20 min；磁分离，PBS洗涤，磁珠重悬于PBS中，4℃保存备用；
（2）生物素化适配体1（Bio-apt1）修饰磁性纳米颗粒：取5 μL SA-MB和50 μL 100 nM的Bio-apt1加入酶标板中，混合，37℃反应30min，磁分离，200 μL PBS清洗3次，去除多余的适配体，加入200 μL含有1%BSA的PBS缓冲液，37℃孵育1h，封闭未结合的非特异性位点，磁分离，PBS洗3次，重悬于50μL PBS 缓冲液中。
（3）检测：取50 μL不同浓度的bPAG6（0、0.05、0.1、1、5、10、50、100、250、500 ng/mL）加入到步骤（2）中，37 ℃孵育20 min，磁分离，PBS洗涤，加入50μL 100 nM适配体2，37℃孵育20 min，磁分离，PBS洗涤；取浓度为1 μM 生物素化的发夹探针H1（Bio-H1）和发夹探针H2（Bio-H2），沸水加热5分钟，室温冷却后，各取50 μL加入反孔，室温杂交反应 1 h，磁分离，PBS洗涤。加入100 μL SA-HRP（0.05 U/mL）溶液，室温反应15 min，磁分离，PBS洗涤，每孔加入100 μL TMB，避光显色10 min，加入100 μL 终止液（2.0 mol/L 的H2SO4），酶标仪450nm测吸光值；
（4）标准曲线的建立：以bPAG6浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标作图，利用软件绘制标准曲线，建立回归方程，图3为该方法测定的标准曲线：y=0.424＋0361, R= 0.990，线性范围为0.1-100 ng/mL。
上述实施例1和实施例2在奶牛早期妊娠诊断中的应用：
（1）待测样品制备：选择怀孕 28天荷斯坦奶牛98头，静脉采集血液，血样置于冰上在3h内运送到实验室，2000×g 离心10 min，上层血清转移至离心管中，备用，长时间存放-20℃保存；
（2）样品检测：
基于实施例1方法检测样品：取实施例1中包被有链霉亲和素的酶标板数条，加入100 μL 100 nM 的bio-apt1溶液，37℃温育30min，PBS洗涤3~5次，拍干；加入100 μL血清样品，同时加入bPAG9蛋白和双蒸水，分别作为阳性和阴性对照，37℃孵育20 min，PBS洗涤，拍板；然后加入100 μL 100 nM适配体2，37 ℃孵育20 min，PBS洗涤，拍板；取浓度为1 μM 生物素化的发夹探针H1（Bio-H1）和发夹探针H2（Bio-H2），沸水加热5分钟，室温冷却后，各取100μL加入反孔，室温杂交反应1 h，PBS洗涤，拍干；加入100 μL SA-HRP（0.05 U/mL）溶液，室温反应15 min，PBS洗涤，拍干；每孔加入100 μL TMB显色液，避光显色10 min；加入100μL 终止液（2.0 M H2SO4）。
基于实施例2方法检测样品：取5 μL SA-MB和100 μL生物素化适配体1（Bio-apt1）加入酶标板中，混合，37 ℃ 反应30 min，磁分离，200 μLPBS清洗3次，去除多余的适配体；加入200 μL含有0.1%BSA 的PBS缓冲液，37℃孵育1h，封闭未结合的非特异性位点；磁分离，PBS洗3次，重悬于100 μL PBS 缓冲液中。加入50 μL血清样品，37 ℃孵育20 min，磁分离，PBS洗涤，加入100 μL适配体2，37 ℃孵育20 min，磁分离，PBS洗涤；取浓度为1 μM 生物素化的发夹探针H1（Bio-H1）和发夹探针H2（Bio-H2），沸水加热5分钟，室温冷却后，各取50 μL加入反孔，室温杂交反应 1 h，磁分离，PBS洗涤；加入100 μL SA-HRP（0.05 U/mL）溶液，室温反应15 min，磁分离，PBS洗涤，每孔加入100 μL TMB，避光显色10 min，加入100 μL 终止液（2.0 mol/L 的H2SO4）。
（3）结果判定：可通过目视观测颜色变化以判定是否怀孕，样品孔中颜色等同或接近阳性对照的判定为阳性，即怀孕，无色为阴性，即未孕。图4为基于实施例1方法检测部分样品的比色结果。在奶牛配种后第30天用超声波检查和第45 天用直肠触诊法对本发明检测结果进行确诊，经计算，本发明实施例1和实施2的方法准确率为97.8%和95.4%，结果见表1。
表1 本发明实施例妊娠诊断结果准确率比较
诊断方法 诊断头数 阳性头数 确诊妊娠头数 准确率%
实施例1 97 43 44 97.8
实施例2 97 42 44 95.4
序列表
<110> 长江师范学院
<120> 一种基于适配体识别-HCR反应的牛早孕快速检测方法及应用
<130> 2020.03.03
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 1
ttgaagtgac tcccacccac cgtccaccgt atttcaccgt ccattgcata gcaggt 56
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
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ttgaagtgac gccagggtgg gggggtgggt gttggcgtac acttcgcata gcaggtaaaa 60
aaaatggagt gaaggcgcat acctcttt 88
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 3
gaaggcgcat acctctttaa ttggaaagag gtatgcgcct tcactcca 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 4
ccaattaaag aggtatgcgc cttctggagt gaaggcgcat acctcttt 48

Claims (5)

1.一种基于适配体识别-HCR反应的牛早孕快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
合成用于杂交链式反应体系的发夹探针：
根据杂交链式反应原理，合成用于杂交链式反应的发夹探针H1和发夹探针H2的序列，其中，发夹探针H1包括a、b、c三个部分，a的部分序列与c序列互补成双链作为发夹探针H1发夹结构的茎部，b序列与引发链d序列互补；发夹探针H2包括a’、 b’、c’三部分，其中a’的部分序列和c’序列互补成双链作为发夹探针H2发夹结构的茎部，发夹探针H1的a序列与发夹探针H2的a’序列互补，发夹探针H2的c’序列与发夹探针H1的c序列互补；
（2）合成牛妊娠相关糖蛋白适配体1，作为捕获探针；
（3）合成牛妊娠相关糖蛋白适配体2，作为检测探针，其中，适配体2包含与发夹探针H1的部分序列互补的d序列；
（4）牛妊娠相关糖蛋白检测：
将步骤（2）中的适配体1附着到支持载体上，加入待测标靶牛妊娠相关糖蛋白，孵育，加入步骤（3）的适配体2，孵育，形成双适配体夹心结构，再加入发夹探针H1和发夹探针H2，适配体2包含的引发链引发杂交链式反应，生长形成dsDNA长链，通过dsDNA长链上标记的发光物质或生物素直接或间接实现信号放大，实现对bPAG蛋白的定性定量检测。
2.根据权利要求1所述的基于适配体识别-HCR反应的牛早孕快速检测方法，其特征在于：所述牛妊娠相关糖蛋白适配体1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-TTGAAGTGACTCCCACCCACCGTCCACCGTATTTCACCGTCCATTGCATAGCAGGT-3’；
所述牛妊娠相关糖蛋白适配体2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-TTGAAGTGaCGCCAGGGTGGGGGGGTGGGTGTTGGCGTACACTTCGCATAGCAGGTAAAAAAAATGGAGTGAAGGCGCATACCTCTTT -3’；
所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：
5’-GAAGGCGCATACCTCTTTAATTGGAAAGAGGTATGCGCCTTCACTCCA-3’；
所述发夹探针H2核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：
5’-CCAATTAAAGAGGTATGCGCCTTCTGGAGTGAAGGCGCATACCTCTTT-3’。
3.根据权利要求1所述的基于适配体识别-HCR反应的牛早孕快速检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中的支持载体为聚苯乙烯板或磁纳米材料，支持载体表面包被有链霉亲和素，包被溶液为10 mM 的PBS缓冲液；所述发夹探针H1和H2上标记的发光物质为荧光标记物质、纳米发光材料、酶、地高辛、生物素。
4.根据权利要求1所述的基于适配体识别-HCR反应的牛早孕快速检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中杂交缓冲液为10 mM PBS，孵育时间为30~60 min，H1: H2的摩尔比为1:1，杂交反应时间为1~2 h。
5.如权利要求1～4任一项所述基于适配体识别-HCR反应的牛早孕快速检测方法在检测牛血清、全血、血浆、乳汁中妊娠相关糖蛋白含量或早期妊娠诊断产品中的应用。
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