CN111349673A - 一种单链dna的合成及错误纠正方法 - Google Patents

一种单链dna的合成及错误纠正方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种单链DNA的合成及错误纠正方法，涉及基因合成领域，具体涉及单链DNA的合成及合成中的错误纠正方法。本发明要能够剔除DNA合成中的错误片段，提高单链DNA合成片段的正确率。本发明提供一种单链DNA合成的方法，通过在目标序列的两端设计酶切位点和形成发夹结构，通过限制性内切酶和错配特异性内切酶进行错误纠正，得到正确的DNA片段。

Description

一种单链DNA的合成及错误纠正方法
技术领域
本发明涉及基因合成领域，具体涉及一种单链DNA的合成及错误纠正方法。
背景技术
DNA合成过程中会随机的发生碱基突变、缺失和***的现象，会影响下游的应用。因此对合成的DNA进行纠错处理，降低其内在的突变率，对提高下游的基因合成和文库构建的质量可以起到关键作用。至目前为止，有很多DNA纠错的方法被开发出来(ErrorCorrection in Gene Synthesis Technology,Trends Biotechnol.2012Mar；30(3):147–154.)，但是这些方法都是对双链DNA进行纠错，并没有对单链DNA进行纠错的方法。
随着CRISPR技术的发展，对gRNA文库构建需求越来越大，芯片引物由于其通量高单个引物的价格低廉，成为gRNA文库构建的首选，但芯片引物由于其技术的局限性，在合成过程中其突变率较高，因此开发一种降低引物突变率的基因合成方法是未来研发人员努力的方向。
发明内容
为了解决现有技术中单链DNA合成过程中突变率高的问题，本发明提供一种新的DNA设计方式，通过此种方式可以对DNA进行错误纠正，提高DNA有效区域的正确率。
本发明提供一种单链DNA合成的方法，所述方法包含步骤：(1)在目标DNA的3’端连接酶切位点序列，并生成反向互补序列；(2)通过一段辅助序列连接(1)中的两条序列并合成；(3)退火使(2)中序列形成包含发夹结构的双链DNA；(4)加入限制性内切酶切割发夹结构；(5)加入错配特异性内切酶进行错误纠正；其中，所述辅助序列自身能够形成发夹结构；所述错配特异性内切酶是指能够识别并裂解含有因碱基突变、***或缺失导致的DNA双链中碱基错配的酶。
本发明的一些实施方案中，所述错误纠正是将由于碱基突变、***或缺失而导致不完全互补的双链DNA结构进行切割。
本发明的另一些实施方案中，所述限制性内切酶能够识别双链DNA中的酶切位点并将双链DNA进行酶切产生粘性末端或平末端。
本发明的一些实施方案中，所述目标DNA包含5-200个碱基；优选5-100；更优选5-60；再优选5-30；最优选10-30。
本发明的一些实施方案中，所述目标DNA包含的碱基数选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30的任意值。
本发明的再一些实施方案中，所述辅助序列包含任意数量的碱基；优选4-100；更优选4-20；再优选4-10；最优选4-6。
本发明的一些实施方案中，所述辅助序列包含碱基数选自4、5、6、7、8、9中的任意值；优选4、5、6；更优选4、6；最优选4。
本发明的一些实施方案中，在错配特异性内切酶进行错误纠正后还包含变性的步骤，通过变性使双链DNA双链打开得到目标单链DNA。
本发明的另一些实施方案中，在目标DNA序列连接酶切位点序列前还包含在目标DNA序列的两端连接包含8-40个碱基序列的步骤，并在错误纠正步骤完成后，以所述8-40个碱基序列为引物进行PCR得到富集的目标DNA。
本发明的一些实施方案中，所述限制性内切酶和错配特异性内切酶在不影响彼此发挥作用的前提下，可以同时加入。
本发明的一些实施方案中，所述的错配特异性内切酶选自但不限于Nuclease S。
本发明的另一些实施方案中，错误纠正是指将含错配碱基的双链DNA切割，保留正确的DNA双链结构。
在本发明的又一些实施方案中，限制性内切酶是可以切出平末端的酶，在错配特异性内切酶将含错配碱基的双链DNA切割后，正确的双链DNA被保留，此时通过变性即可得到目标DNA的单链结构。
本发明的再一些实施方案中，限制性内切酶是可以切出粘性末端的酶，通过设计与目标DNA匹配的引物序列对目标DNA的富集扩增，可以将粘性末端的多余碱基去除。
本发明的一些实施方案中，当目标DNA序列包含的碱基数很少，又需要通过PCR进行富集时，在序列设计阶段可以在目标DNA的两端连接包含8-40碱基的序列，并将该序列作为引物以完成PCR，获得目标DNA片段的富集。
本发明的一些实施方案中，将需要合成的单链DNA设计成能够形成发夹的序列，通过缓慢退火，使其自身形成发夹结构；再加入限制性内切酶将发夹结构切割；下一步加错配特异性内切酶将含错配碱基的DNA进行切割；将切割后产物作为模板，加入引物扩增得到目标区域，这里的引物可以在设计目标DNA序列时加入一段引物序列，使双链DNA能够与相应的引物序列结合完成扩增反应。
本发明的一个实施方案中，包括如下步骤：(1)在目标DNA的3’端加入限制性酶切位点，该序列记为序列A，将A序列进行反向互补得到A’序列；将A与A’序列结合起来，中间用一段辅助序列连接，得到最终需要合成的DNA序列A-辅助序列-A’；(2)将对应的序列通过芯片或者普通引物合成仪进行合成，得到合成混合物，这时正确的片段和错误的片段混合在一起；(3)将合成的DNA混合物进行退火，让单链DNA退火形成自身发夹结构，如果DNA合成中出现碱基突变或者缺失、***，则形成的发夹结构为不能完全碱基互补配对；如没有碱基的突变、缺失或***则发卡结构中A和A’形成互补双链，酶切位点也形成双链的互补配对序列；(4)同时加入限制性内切酶和错配特异性内切酶将发夹结构和含错配碱基的双链切割。
本发明的一些实施方案中，退火得到的产物中，加入限制性内切酶如EcoRI和错配特异性内切酶如Nuclease S，对含错配碱基的双链结构进行切割，加入引物对目标区域进行PCR富集，或者直接对序列进行克隆。加入对应引物，以正确的双链DNA为模板进行PCR扩增，进一步将正确的DNA序列富集，或者直接对序列进行克隆。
本发明还提供一种单链DNA合成中的错误纠正方法，所述方法包含步骤：(1)在目标DNA的3’端连接酶切位点序列，并生成反向互补序列；(2)通过一段辅助序列连接(1)中的两条序列并合成；(3)退火使(2)中序列形成包含发夹结构的双链DNA；(4)加入限制性内切酶切割发夹结构；(5)加入错配特异性内切酶进行错误纠正；其中，所述辅助序列自身能够形成发夹结构；所述错配特异性内切酶是指能够识别并裂解含有因碱基突变、***或缺失导致的双链DNA中碱基错配的酶。
本发明的一些实施方案中，所述错误纠正是将由于碱基突变、***或缺失而导致不完全互补的双链DNA结构进行切割。
本发明的另一些实施方案中，所述限制性内切酶能够识别双链DNA中的酶切位点并将双链DNA进行酶切产生粘性末端或平末端。
本发明的一些实施方案中，所述目标DNA包含5-200个碱基；优选5-100；更优选5-60；再优选5-30；最优选10-30。
本发明的一些实施方案中，所述目标DNA包含的碱基数选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30的任意值。
本发明的再一些实施方案中，所述辅助序列包含任意数量的碱基；优选4-100；更优选4-20；再优选4-10；最优选4-6。
本发明的一些实施方案中，所述辅助序列包含碱基数选自4、5、6、7、8、9中的任意值；优选4、5、6；更优选4、6；最优选4。
本发明的一些实施方案中，在错配特异性内切酶进行错误纠正后还包含变性的步骤，通过变性使双链DNA双链打开得到目标单链DNA。
本发明的另一些实施方案中，在目标DNA序列连接酶切位点序列前还包含在目标DNA序列的两端连接包含8-40个碱基序列的步骤，并在错误纠正步骤完成后，以所述8-40个碱基序列为引物进行PCR得到富集的目标DNA。
本发明的一些实施方案中，所述限制性内切酶和错配特异性内切酶在不影响彼此发挥作用的前提下，可以同时加入。
本发明的一些实施方案中，所述的错配特异性内切酶选自但不限于Nuclease S。
本发明的另一些实施方案中，错误纠正是指将含错配碱基的双链DNA切割，保留正确的DNA双链结构。
在本发明的又一些实施方案中，限制性内切酶是可以切出平末端的酶，在错配特异性内切酶将含错配碱基的双链DNA切割后，正确的双链DNA被保留，此时通过变性即可得到目标DNA的单链结构。
本发明的再一些实施方案中，限制性内切酶是可以切出粘性末端的酶，通过设计与目标DNA匹配的引物序列对目标DNA的富集扩增，可以将粘性末端的多余碱基去除。
本发明的一些实施方案中，当目标DNA序列包含的碱基数很少，又需要通过PCR进行富集时，在序列设计阶段可以在目标DNA的两端连接包含8-40碱基的序列，并将该序列作为引物以完成PCR，获得目标DNA片段的富集。
本发明的一些实施方案中，将需要合成的单链DNA设计成能够形成发夹的序列，通过缓慢退火，使其自身形成发夹结构；再加入限制性内切酶将发夹结构切割；下一步加错配特异性内切酶将含错配碱基的DNA进行切割；将切割后产物作为模板，加入引物扩增得到目标区域，这里的引物可以在设计目标DNA序列时加入一段引物序列，使双链DNA能够与相应的引物序列结合完成扩增反应。
本发明的一个实施方案中，包括如下步骤：(1)在目标DNA的3’端加入限制性酶切位点，该序列记为序列A，将A序列进行反向互补得到A’序列；将A与A’序列结合起来，中间用一段辅助序列连接，得到最终需要合成的DNA序列A-辅助序列-A’；(2)将对应的序列通过芯片或者普通引物合成仪进行合成，得到合成混合物，这时正确的片段和错误的片段混合在一起；(3)将合成的DNA混合物进行退火，让单链DNA退火形成自身发夹结构，如果DNA合成中出现碱基突变或者缺失、***，则形成的发夹结构为不能完全碱基互补配对；如没有碱基的突变、缺失或***，则发卡结构中A和A’形成互补双链，酶切位点也形成双链的互补配对序列；(4)同时加入限制性内切酶和错配特异性内切酶将发夹结构和含错配碱基的双链切割。
本发明的一些实施方案中，退火得到的产物中，加入限制性内切酶如EcoRI和错配特异性内切酶如Nuclease S，对含错配碱基的双链结构进行切割，加入引物对目标区域进行PCR富集，或者直接对序列进行克隆。加入对应引物，以正确的双链DNA为模板进行PCR扩增，进一步将正确的DNA序列富集，或者直接对序列进行克隆。
术语
术语“单链DNA”指仅由一条脱氧核醣核酸链组成的核酸。
术语“双链DNA”指由两条脱氧核醣核酸链组成，其中大部分脱氧核醣核酸根据碱基配对规则为A与T而C与G配对，氢键结合两条分开的脱氧核醣核酸链的含氮碱基以形成双链DNA。双链也容许错配。如果位于相对链中相同位置处的两个脱氧核醣核酸不遵循碱基配对规则，则在双链内发生错配。在给定双链内容忍的错配数由双链的长度、碱基组成、温度和缓冲液条件(例如，盐浓度)决定，这些参数如何影响双链形成是本领域熟知的。本文中的“双链DNA”和“DNA双链”表达相同的含义。
术语“辅助序列”在本文中的含义是能够使目标DNA形成带有发夹结构的双链结构，该辅助序列自身形成发夹结构的部分。本文实施例中的“锚定碱基”与“辅助序列”表达相同的含义。
术语“酶切位点”指DNA上一段碱基的特定序列，限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将DNA序列切成两段。
术语“反向互补序列”指方向相反且能够通过碱基互补配对形成双链结构的两条序列，如p表示5'端的那个磷酸，是标记方向用的，也可写作例如5'-AGATTAAGCC-3'，反向互补序列是3'-TCTAATTCGG-5'，也可写作pGGCTTAATCT。
术语“退火”是指单链DNA通过缓慢冷却到40℃-70℃左右，使具有互补碱基的单链DNA片段配对，形成双链分子的过程。
术语“发夹结构”是指具有双链“茎”区域和单链“环”区域的核酸，其中茎区域和环区域由具有以下部分的单链核酸组成：(1)基本上互补的两个区域，以便形成包含茎的双链区段(也即，通过互补碱基配对)和(2)在两个互补的区域之间***的第三区域，其形成环。发夹结构描述于，例如，Varani，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24：379-404，1995。
术语“限制性内切酶”，指可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。本文中“限制性内切酶”也可以称作“限制性核酸内切酶”、“核酸限制性内切酶”、“内切酶”、“限制酶”，其表示相同的含义。限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列，有些酶的切割位点在回文的一侧(如EcoR I、BamH I、Hind等)，因而可形成粘性末端，另一些酶如Alu I、BsuR I、Bal I、HalⅢ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端或称平末端。
术语“错配”是指由于碱基突变、***或缺失导致的DNA双链中的碱基不能完全互补配对。
术语“错配特异性内切酶”是指能够裂解含有因碱基突变、***或缺失导致的所有类型的DNA双链错配的酶。
术语“错误纠正”是指将含错配碱基的双链DNA裂解。
术语“聚合酶链式反应(PCR)”是分子生物学中用于跨过几个数量级扩增一段DNA的单个或几个拷贝，产生数千到数百万拷贝的特定DNA序列的生物化学技术。
术语“引物”指在合适的缓冲液中，在适当的温度和条件下，能充当模板定向核酸合成的起始点的多核苷酸。引物(primer)本质上是人工合成的短DNA片段，一般不超过50个碱基(通常18-25个)，它们与所要扩增的DNA片段的起始和终止区域完全互补。在“黏合”时引物结合于DNA模板的起始和终止点，DNA聚合酶结合到这两个位置，开始合成新的DNA链。
有益效果
本发明的方法通过合成可形成发夹结构的DNA，通过退火形成发夹结构并经过错误纠正，可以有效地提高合成DNA的正确率，经过实验发现可以将正确率提高20％。
具体实施方式
除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。
实施例1：设计包含突变的DNA序列
选择GCGTGACATATATCGCGGGT为目标序列，在其5’端添加上序列F，在其3’端添加上序列R，因此序列为：
ATGACCGTAGCTTATGAGGCGCGTGACATATATCGCGGGTACAGTAAGTTACGGGCGTTT
其中，
F：5’-ATGACCGTAGCTTATGAGGC-3’
R：5’-ACAGTAAGTTACGGGCGTTT-3’
在其3’端添加上EcoRI限制性内切酶位点序列gaattc得到最终的序列，将其命名为A，利用软件将最终序列进行反向互补并命名为A’。
A：ATGACCGTAGCTTATGAGGCGCGTGACATATATCGCGGGTACAGTAAGTTACGGGCGTTTgaattc
A’：gaattcAAACGCCCGTAACTTACTGTACCCGCGATATATGTCACGCGCCTCATAAGCTACGGTCAT
使用4bp的锚定碱基ACAC将A与A’连接起来，因此序列为：
Figure BDA0001914348120000051
该序列除了锚定碱基外，可以完全进行互补配对，形成发夹结构。
同时，设计了目标序列不能完全互补配对的几个序列来模拟芯片引物合成中的碱基突变、***等方式。以下为碱基突变的DNA序列：
无突变引物(perfect)
ATGACCGTAGCTTATGAGGCGCGTGACATATATCGCGGGTACAGTAAGTTACGGGCGTTTgaattcACACgaattcAAACGCCCGTAACTTACTGTACCCGCGATATATGTCACGCGCCTCATAAGCTACGGTCAT
1bp***
ATGACCGTAGCTTATGAGGCGCGTGACATgATATCGCGGGTACAGTAAGTTACGGGCGTTTgaattcACACgaattcAAACGCCCGTAACTTACTGTACCCGCGATATATGTCACGCGCCTCATAAGCTACGGTCAT
2bp***
ATGACCGTAGCTTATGAGGCGCGTGACATtgATATCGCGGGTACAGTAAGTTACGGGCGTTTgaattcACACgaattcAAACGCCCGTAACTTACTGTACCCGCGATATATGTCACGCGCCTCATAAGCTACGGTCAT
3bp***
ATGACCGTAGCTTATGAGGCGCGTGACATtgcATATCGCGGGTACAGTAAGTTACGGGCGTTTgaattcACACgaattcAAACGCCCGTAACTTACTGTACCCGCGATATATGTCACGCGCCTCATAAGCTACGGTCAT
G-A突变
ATGACCGTAGCTTATGAGGCGCGTGACATgTATCGCGGGTACAGTAAGTTACGGGCGTTTgaattcACACgaattcAAACGCCCGTAACTTACTGTACCCGCGATATATGTCACGCGCCTCATAAGCTACGGTCAT
G-T突变
ATGACCGTAGCTTATGAGGCGCGTGACATAgATCGCGGGTACAGTAAGTTACGGGCGTTTgaattcACACgaattcAAACGCCCGTAACTTACTGTACCCGCGATATATGTCACGCGCCTCATAAGCTACGGTCAT
实施例2：将DNA序列进行合成
将上述的6条DNA序列交由基因合成公司进行合成，纯化方式为PAGE纯化。
实施例3：将6条DNA混合后进行退火形成发夹结构
将合成的DNA加入TE buffer稀释至25μM，使用Nanodrop测定其实际浓度，通过专业软件计算出每条DNA片段的分子量，再计算出实际摩尔浓度。将6条DNA片段等摩尔混合，稀释至一定浓度。配制退火体系：10*NEB 2.1buffer 0.2μl，DNA片段终浓度为0.1μM，无菌水至20μl。退火程序为：95℃5min，85℃2min(-1℃/sec)，25℃2min(-0.1℃/sec)，4℃Hold。
实施例4：同时加入限制性内切酶和错配限制性内切酶将锚定碱基和含错配的碱基切割
为了在后续富集过程中扩增得到的产物是目标产物，需要将退火形成的双链末端切断，即把锚定碱基去除。同时，错配限制性内切酶是一种可以识别异源双链结构并在突变位点的3’端进行切割的核酸限制性内切酶，因此如果DNA合成如果发生错误，退火后的双链为异源双链结构，会被错配限制性内切酶切割。具体的操作如下：直接在20μl中添加1μlEcoRI(NEB,Inc.)和1μl Nuclease S(IDT,Inc.)，放置于37℃水浴锅孵育30min。反应产物作为下一轮富集PCR的模板。
实施例5：加入DNA对目标区域进行PCR富集
由于我们在目标序列两端添加了F和R，因此可以利用其作为引物进行PCR扩增，富集得到完全正确的片段。引物F序列：ATGACCGTAGCTTATGAGGC；引物R序列：AAACGCCCGTAACTTACTGT。PCR反应体系：5*HF Buffer 10μl、dNTPs(10mM each)1μl、引物F(25μM)1μl、引物R(25μM)1μl、错误纠正后退火产物10μl Phusion(2U/μl,NEB Inc.)0.5μl、无菌水至50μl。反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，64℃退火10s，72℃延伸20s，25个循环；最后72℃延伸反应5min。
富集后的产物进行电泳，切胶回收，将产物进行平端连接，将对应的克隆进行Sanger测序，确定经过错误纠正后，其正确率是否有提高。统计结果如表1。
表1经过错误纠正与未经过错误纠正的DNA合成片段正确率对比
Figure BDA0001914348120000071

Claims (9)

1.一种单链DNA合成的方法，所述方法包含步骤：(1)在目标DNA的3’端连接酶切位点序列，并生成反向互补序列；(2)通过一段辅助序列连接(1)中的两条序列并合成；(3)退火使(2)中序列形成包含发夹结构的双链DNA；(4)加入限制性内切酶切割发夹结构；(5)加入错配特异性内切酶进行错误纠正；其中，所述辅助序列自身能够形成发夹结构；所述错配特异性内切酶是指能够识别并裂解含有因碱基突变、***或缺失导致的双链DNA中碱基错配的酶。
2.权利要求1所述的方法，所述错误纠正是将由于碱基突变、***或缺失而导致不完全互补的双链DNA进行切割。
3.权利要求1-2任一项所述的方法，所述限制性内切酶能够识别双链DNA中的酶切位点并将双链DNA进行酶切产生粘性末端或平末端。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，所述目标DNA包含5-200个碱基；优选5-100；更优选5-60；再优选5-30；最优选10-30。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，所述辅助序列包含任意数量的碱基；优选4-100；更优选4-20；又优选4-10；再优选4-6，最优选4。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，在错配特异性内切酶进行错误纠正后还包含变性的步骤，得到目标单链DNA。
7.权利要求1-5任一项所述的方法，在目标DNA序列连接酶切位点序列前还包含在目标DNA序列的两端连接包含8-40个碱基序列的步骤，并在错误纠正后，以所述8-40个碱基序列为引物进行PCR得到富集的目标DNA。
8.权利要求1-7任一项所述的方法，所述限制性内切酶和错配特异性内切酶可以同时加入。
9.一种单链DNA合成中的错误纠正方法，所述方法包含步骤：(1)在目标DNA的3’端连接酶切位点序列，并生成反向互补序列；(2)通过一段辅助序列连接(1)中的两条序列并合成；(3)退火使(2)中序列形成包含发夹结构的双链DNA；(4)加入限制性内切酶切割发夹结构；(5)加入错配特异性内切酶进行错误纠正；其中，所述辅助序列自身能够形成发夹结构；所述错配特异性内切酶是指能够识别并裂解含有因碱基突变、***或缺失导致的双链DNA中碱基错配的酶。
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