CN111349179B

CN111349179B - 禽呼肠孤病毒基因工程疫苗

Info

Publication number: CN111349179B
Application number: CN202010445812.2A
Authority: CN
Inventors: 曹文龙; 孔迪; 滕小锘; 易小萍; 张大鹤
Original assignee: Suzhou Shinuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Womei Biology Co ltd
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: CN111349179A

Abstract

本发明揭示了一种禽呼肠孤病毒新型基因工程疫苗，其包含编码基因序列如SEQ ID NO:1所示的融合蛋白。该疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对禽类没有致病性，并且该疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

Description

禽呼肠孤病毒基因工程疫苗

技术领域

本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种禽呼肠孤病毒基因工程疫苗，其制备方法与应用，属于动物免疫药物技术领域。

背景技术

禽呼肠孤病毒（Avian Reovirus，ARV）是禽病毒性关节炎（Avian ViralArthritis）和腱鞘炎的主要病原之一，属于呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属的一种，该毒株自1954年首次分离得到。ARV可引起鸡的运动障碍性传染病，该病呈全球性分布，病鸡主要表现为跛行或不愿运动，部分鸡生长受阻，增重明显下降；ARV还可引起除病毒性关节炎和腱鞘炎以外的疾病，如吸收不良、肠道紊乱、心肝病损、蓝翅病和呼吸道病等，各年龄的鸡均易感，感染时鸡龄越小，发病几率越高。ARV的感染常常引起其他疾病的继发感染，造成巨大的经济损失。

ARV属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属的成员，无囊膜，由双层核衣壳包裹，其基因组为双股RNA(dsRNA)，由大(L1、L2、L3)、中(M1、M2、M3)和小(S1、S2、S3、S4)3组共10个节段基因组成，其中σB蛋白为S3基因所编码，拥有367个氨基酸，是病毒外衣壳蛋白重要成分（Martinez-Costas J, Gonzalez-Lopez C, Vakharia VN, Benavente J. Possibleinvolvement of the double-stranded RNA-binding core protein sigma A in theresistance of avian reovirus to interferon. Journal of virology, 2000, 74(3):1124-1131.），σB蛋白携带有群特异型中和抗原决定簇，能够诱导宿主细胞融合，并使宿主产生群特异性中和抗体。σC蛋白为S1基因的第三个开放阅读框(ORF)所编码，是病毒外衣壳蛋白中最小的一个蛋白，它是一种病毒吸附蛋白，分子量为34.9kDa，以单体和三聚体的形式存在。σC蛋白目前已知的主要功能是携带有ARV的特异性中和反应的表面抗原和具有细胞吸附的功能（Ni Y，Kemp M C.A comparative study of avian reoviruspathogenicity：virus Spread and replication and induction or lesion[J]．AvianDisease, 1995, 39: 554-566.; Meanger J, Wickramasinghe R．Association betweenthe protein of avian reovirus and virus induced fusion of cell [J]. Archivesof Virology, 1999, 144: 193-197），σC蛋白对宿主细胞的吸附作用会被纯化的病毒粒子竞争性抑制，并且病毒粒子的吸附作用也会被预先加入的σC蛋白竞争性抑制（ Grande A,Benavente J. Optimal conditions for the growth, purification and storage ofthe avian reovirus S1133. Journal of Virological Methods, 2000, 85(1-2): 43-54）。因此，σC蛋白在ARV感染和致病中有重要作用。

尽管如CN103642758A、CN107384942A等文献也提出了一些禽呼肠孤病毒基因工程亚单位疫苗，但其中大多为单独表达σB蛋白或σC蛋白以及混合表达σB/σC蛋白作为疫苗，虽然σB、σC等蛋白具有很好的保护效果，然而使用的都是某一个血清型病毒的结构蛋白作为疫苗抗原，由于σC蛋白容易突变，交叉保护不好，往往导致免疫失败。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种禽呼肠孤病毒基因工程疫苗，其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种融合蛋白，包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明实施例还提供了所述融合蛋白的编码基因。

进一步的，所述编码基因包括序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ IDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子。

本发明实施例还提供了包含所述编码基因的重组基因载体、重组杆状病毒或昆虫细胞。

本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其包括：所述的融合蛋白；以及，药学上可接受的载体。

本发明实施例还提供了一种制备所述融合蛋白的方法，其包括：

S1、将所述融合蛋白的编码基因克隆到杆状病毒表达***转移载体上，获得重组表达载体；

S2、将所述重组杆状病毒转移载体与杆状病毒基因组质粒共转染昆虫细胞，筛选获得重组杆状病毒；

S3、将所述重组杆状病毒接种昆虫细胞，获得所述融合蛋白。

本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备禽呼肠孤病毒的检测试剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在生产用于在受试动物中诱导针对禽呼肠孤病毒抗原的免疫反应的药剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在生产用于预防动物受禽呼肠孤病毒感染的药剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备禽呼肠孤病毒基因工程疫苗中的用途。

相应的，本发明实施例提供了一种禽呼肠孤病毒基因工程疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含药学上可接受的载体。

本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组基因载体、重组杆状病毒或昆虫细胞在生产用于检测动物受禽呼肠孤病毒感染的试剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组基因载体、重组杆状病毒或昆虫细胞在生产用于在受试动物中诱导针对禽呼肠孤病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组基因载体、重组杆状病毒或昆虫细胞在生产用于预防动物受禽呼肠孤病毒感染的药剂的用途。

较之现有技术，本发明实施例基于禽呼肠孤病毒σC蛋白的主要保护性抗原表位，通过将其与σB蛋白抗原表位串联，构建了一种新型融合蛋白（可命名为SBC融合蛋白），该融合蛋白具有广泛的保护能力，几乎能保护所有不同毒株病毒的攻击，利用其制备的禽呼肠孤病毒疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对禽类没有致病性，并且可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是实施例1中SBC基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.0kbp位置出现目的条带。

图2是实施例1中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.0kbp位置出现目的条带。

图3是实施例1中含有目的基因的转移载体pVL-SBC的结构示意图。

图4是实施例3所获细胞培养物的SDS-PAGE检测图谱，其中在分子量约36kDa附近出现目的条带。

图5是实施例4中SDS-PAGE电泳后产物的Western Blot检测图谱。

图6是实施例5中的间接免疫荧光检测图谱。

图7是实施例7中蛋白纯化后的图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明实施例的一个方面提供的一种融合蛋白包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

进一步的，所述融合蛋白包含串联的σC蛋白主要保护性抗原表位以及σB蛋白抗原表位，其中σC蛋白主要保护性抗原表位包含常见流行毒株的表位，使其几乎能保护所有不同毒株病毒的攻击，并且因为σC蛋白抗原表位的串联，使得抗体激发能力大幅增强，抗体水平有显著提高，以及，通过融合σB 蛋白抗原表位，表达群特异性中和抗体（group specificneutralizing antibodies），进一步增加了广泛的保护能力。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述融合蛋白的编码基因，其包括序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子。

本发明实施例的另一个方面还提供了一类重组基因载体，其中包含有所述融合蛋白的编码基因。

本发明实施例的另一个方面还提供了一类重组杆状病毒，其中包含有所述融合蛋白的编码基因。

本发明实施例的另一个方面还提供了一类昆虫细胞，其中包含有所述融合蛋白的编码基因。

进一步的，所述昆虫细胞可以是用包含所述融合蛋白的编码基因的重组杆状病毒基因组质粒转染而形成。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种免疫组合物，其包括：所述的融合蛋白；以及，药学上可接受的载体。进一步的，所述药学上可接受的载体包括白油、硬脂酸铝、司本、吐温中的任意一种或者两种以上的组合，且不限于此。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种制备所述融合蛋白的方法，其包括：

进一步的，所述杆状病毒表达***转移载体包括但不限于pFastBac1、pVL1393中的任意一种，优选为pVL1393。

进一步的，所述昆虫细胞包括但不限于Sf9、High Five或 Sf21 细胞，优选为Sf9细胞。

在本发明的以上实施例中，通过采用杆状病毒昆虫细胞表达***，并使用悬浮培养Sf9细胞等昆虫细胞进行表达，表达水平较高，蛋白免疫原性好。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备禽呼肠孤病毒的检测试剂中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在生产用于在受试动物中诱导针对禽呼肠孤病毒抗原的免疫反应的药剂中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在生产用于预防动物受禽呼肠孤病毒感染的药剂中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备禽呼肠孤病毒基因工程疫苗中的用途。

相应的，本发明实施例的另一个方面提供了一种禽呼肠孤病毒基因工程疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含药学上可接受的载体。

本发明实施例的另一个方面还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组基因载体、重组杆状病毒或昆虫细胞在生产用于检测动物受禽呼肠孤病毒感染的试剂的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组基因载体、重组杆状病毒或昆虫细胞在生产用于在受试动物中诱导针对禽呼肠孤病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组基因载体、重组杆状病毒或昆虫细胞在生产用于预防动物受禽呼肠孤病毒感染的药剂的用途。

相应的，本发明实施例的另一个方面也涉及一种诱导针对禽呼肠孤病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试禽类动物施用所述禽呼肠孤病毒基因工程疫苗。

相应的，本发明实施例的另一个方面也涉及一种保护受试动物免受禽呼肠孤病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试禽类动物施用所述禽呼肠孤病毒基因工程疫苗。

本发明实施例的另一个方面还提供一种适用于在受试禽类动物中产生针对禽呼肠孤病毒的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的融合蛋白以及佐剂分子。

进一步的，所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方式中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

进一步的，所述佐剂可以优选采用苏州世诺生物技术有限公司生产的相关佐剂，以提高疫苗效果。

1.定义.

本说明书所用的术语仅仅是出于描述具体实施方式的目的而并不旨在限制。如在说明书和所述权利要求中所使用，除上下文另外明确规定之外，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。

对于本说明书所列举的数值范围，明确涵盖了在有相同精密度之间的每个***的数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。

如本说明书所用的“佐剂”意指被添加到本说明书所述的疫苗中来增强由下文所述编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。

如本说明书所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。

如本说明书所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

如本说明书所用的“互补体”或“互补”意指核酸可以指在核苷酸或核酸分子的核苷酸类似物之间的Watson-Crick (例如，A-T/U和C-G)或者Hoogsteen碱基配对。

如本说明书所用的“共有”或“共有序列”意指基于分析特定禽呼肠孤病毒抗原的一队列的多个亚型的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含蛋白的疫苗可以被用来诱导针对特定禽呼肠孤病毒抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫，所述疫苗包含编码这些蛋白的共有序列和/或核酸分子。

如本说明书可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。

如本说明书所用的相对于核酸序列的“片段”意指编码能够在与全长野生型病毒株禽呼肠孤病毒抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽的核酸序列或其一部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。

就多肽序列来说，“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长野生型病毒株禽呼肠孤病毒抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽。蛋白的片段可以包含蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方式中，蛋白的片段可以包含蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。

如本说明书所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本说明书所用的术语“表达形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有可操作地连接至编码蛋白的编码序列的必须的调控元件，以使得当存在于所述个体的细胞中时，编码序列将表达。

如本说明书所用的术语“同源性”是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。至少部分抑制完全互补序列杂交于靶标核酸的部分互补序列是使用功能术语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时，如本说明书所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。当关于单链核酸序列使用时，如本说明书所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即，是单链核酸模板序列的互补序列)。

在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，如本说明书所用的“相同”或“同一性”意指在指定区域中序列具有相同残基的指定百分比。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。

如本说明书所用的“免疫反应”意指响应于抗原如禽呼肠孤病毒共有抗原的引入，宿主的免疫***(例如动物的免疫***)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。

如本说明书所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂而基本地或区别地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMVIE启动子。

“信号肽”和“前导序列”是指可以被连接在本说明书所述的禽呼肠孤病毒蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白的位置。本说明书所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白的剩余部***解，所述蛋白在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白。信号肽/前导序列连接在所述蛋白的N端。

“严格的杂交条件”意指在所述条件下如在核酸的复杂混合物中第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)进行杂交。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。严格的条件在限定的离子强度pH下可以被选择为比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5-10℃。所述Tm可以是这样的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)，在所述温度下与靶标互补的50％的探针与靶序列在平衡状态下进行杂交(因为靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占用)。严格条件可以是那些条件，即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子，如在pH 7.0至8.3下约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的探针(例如，约10-50个核苷酸)为至少约30℃且对于长的探针(例如，大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格的条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择的或特定的杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格的杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。

如本说明书所用的“基本上互补”意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补体至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者意指两个序列在严格的杂交条件下进行杂交。

如本说明书所用的“基本上相同”意指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸区域内是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补，则第一序列和第二序列也这样相同。

“亚型”或“血清型”：如本说明书交换使用的并且关于禽呼肠孤病毒，意指禽呼肠孤病毒的基因变体，以使得一个亚型被免疫***识别而从不同的亚型中分离。

本说明书就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸；或者(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

就肽或多肽而言的“变体”通过氨基酸的***、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上不同，但是保留至少一种生物活性。变体还意指具有与参考蛋白基本上相同的氨基酸序列的蛋白，所述参考蛋白具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来识别。凯特(Kyte)等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)157:105-132(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白功能。在一个方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。

如本说明书所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA载体。

2.疫苗

本发明的疫苗可被设计来控制受试动物中针对一种或多种禽呼肠孤病毒血清型的免疫反应的程度或强度。疫苗可包含抑制它整合至染色体中的元件或试剂。疫苗可为编码禽呼肠孤病毒结构蛋白的RNA。可将RNA疫苗引入细胞中。本发明的疫苗可包含禽呼肠孤病毒结构蛋白。禽呼肠孤病毒结构蛋白是通过诱导1)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应、2)T辅助细胞反应以及/或3)B细胞反应，或优选所有以上提及的反应，以达成交叉递呈来进行的免疫介导的病毒清除的靶标。

所述抗原可以包含使它们特别有效地作为免疫原的蛋白表位，可针对所述免疫原诱导抗禽呼肠孤病毒免疫反应。禽呼肠孤病毒抗原可以包括全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。

一些实施方式涉及编码免疫原性蛋白的与本说明书核酸编码序列具有95％同源性的核酸分子。一些实施方式涉及编码免疫原性蛋白的与本说明书核酸编码序列具有96％同源性的核酸分子。一些实施方式涉及编码免疫原性蛋白的与本说明书核酸编码序列具有97％同源性的核酸分子。一些实施方式涉及编码免疫原性蛋白的与本说明书核酸编码序列具有98％同源性的核酸分子。一些实施方式涉及编码免疫原性蛋白的与本说明书核酸编码序列具有99％同源性的核酸分子。在一些实施方式中，具有与本说明书所公开的蛋白的编码序列同源的本说明书所公开的编码序列的核酸分子包含编码IgE前导序列的连接至编码本说明书所公开的同源蛋白序列的编码序列的5’末端的序列。

在一些实施方式中，所述核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方式中，所述核酸序列不含编码IgE前导物的编码序列。

一些实施方式涉及SEQ ID NO:1的片段。片段可以是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的SEQ ID NO:1。片段可与SEQ ID NO:1的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。片段可与SEQ ID NO:1的片段至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方式中，片段包含编码前导序列的序列，例如免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方式中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方式中，片段不含编码前导序列，例如像IgE前导物的编码序列。

一些实施方式涉及与SEQ ID NO:2同源的蛋白。一些实施方式涉及与如SEQ IDNO:2中所述的蛋白序列具有95％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方式涉及与如SEQ IDNO:2中所述的蛋白序列具有96％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方式涉及与如SEQ IDNO:2中所述的蛋白序列具有97％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方式涉及与如SEQ IDNO:2中所述的蛋白序列具有98％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方式涉及与如SEQ IDNO:2中所述的蛋白序列具有99％同源性的免疫原性蛋白。

一些实施方式涉及与SEQ ID NO:2相同的蛋白。一些实施方式涉及具有在如SEQID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上80％、85％、91％、92％、93％、95、97％、98％或99%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。

在一些实施方式中，蛋白不含前导序列。在一些实施方式中，蛋白不含IgE前导物。蛋白的片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的蛋白。可提供SEQ ID NO:2的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2。在一些实施方式中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方式中，片段不含前导序列。在一些实施方式中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2的免疫原性片段同源的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQID NO:2 95％同源的蛋白。一些实施方式涉及与本说明书蛋白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方式涉及与本说明书蛋白序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方式涉及与本说明书蛋白序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方式涉及与本说明书蛋白序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方式中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE前导物。在一些实施方式中，片段不含前导序列。在一些实施方式中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2的免疫原性片段相同的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的在SEQID NO:2中所述的氨基酸序列的整个长度上80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的蛋白。在一些实施方式中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方式中，片段不含前导序列。在一些实施方式中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

3.疫苗构建体和质粒

疫苗可包括编码所述禽呼肠孤病毒融合蛋白的核酸构建体或质粒。本说明书提供可以包含编码本说明书所公开的禽呼肠孤病毒融合蛋白的核酸序列的遗传构建体。所述遗传构建体可以作为功能性染色体外的分子而存在。所述遗传构建体可以是包括着丝粒、端粒或质粒或粘粒的线性微型染色体。

所述遗传构建体还可以是重组病毒载体的基因组的一部分，所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。遗传构建体可以是在减毒的活微生物或活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。

所述遗传构建体可以包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多聚腺苷酸化信号。

核酸序列可组成可以是载体的遗传构建体。所述载体能够以在动物中有效引发免疫反应的量在动物的细胞中表达抗原。所+述载体可以是重组体。所述载体可以包含编码抗原的异源核酸。所述载体可以是质粒。所述载体可以适用于用编码抗原的核酸来转染细胞，所述转化的宿主细胞在其中发生抗原表达的条件下培养并维持。

所述编码序列可以被优化来用于表达的稳定性和高水平。在一些情况下，选择密码子来减少RNA二级结构的形成，如由于分子内键而形成的二级结构。

所述载体可以包含编码抗原的异源核酸，并且可以进一步包含可以在抗原编码序列的上游的起始密码子和可以在抗原编码序列的下游的终止密码子。起始密码子和终止密码子可以与抗原编码序列在框中。所述载体还包含可操作地连接至抗原编码序列的启动子。可操作地连接至抗原编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、鸟类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、爱巴二氏(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因的启动子，所述人基因如人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。所述启动子还可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。

所述载体还可以包含多聚腺苷酸化信号，所述多聚腺苷酸化信号可以在禽呼肠孤病毒核心蛋白编码序列的下游。所述多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白多聚腺苷酸化信号。所述SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen，San Diego，CA)的多聚腺苷酸化信号。

所述载体也可包含在共有禽呼肠孤病毒核心蛋白编码序列或共有禽呼肠孤病毒表面抗原蛋白编码序列的上游的增强子。所述增强子对于DNA表达是必须的。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、HA、RSV或者EBV的一种增强子。

所述载体还可以包含动物的复制起点，以便将载体维持在染色体外并在细胞中产生载体的多个拷贝。所述载体可以是来自Invitrogen(San Diego，CA)的pVAX1、pCEP4或者pREP4，其可以包含爱巴二氏病毒的复制起点和核抗原EBNA-1编码区域，这可以在没有整合的情况下产生高拷贝附加型复制。所述载体可以是具有变化的pVAX1或者pVax1变体，如本说明书所述的变体质粒。所述变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen，CarlsbadCA)的2998碱基对变体。所述CMV启动子位于碱基137-724处。T7启动子/引发位点位于碱基664-683处。多克隆位点位于碱基696-811处。牛GH多聚腺苷酸化信号是在碱基829-1053处。卡那霉素(Kanamycin)抗性基因是在碱基1226-2020处。pUC起点是在碱基2320-2993处。

所述载体可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白。所述载体可以是pYES2(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae strain)中产生蛋白。所述载体还可以具有MAXBACTM完整的杆状病毒表达***(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白。所述载体还可以是pcDNA I或者pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，Calif.)，其可用于在动物细胞如Sf9细胞系中产生蛋白。所述载体可以是通过常规技术和容易可得的起始物质来产生蛋白的表达载体或***，所述技术和物质包括Sambrook等，Molecular Cloning and Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor(1989)。

本发明中禽呼肠孤病毒SBC融合蛋白的蛋白序列可以是原始序列，增加以及截短的序列。

本发明中重组杆状病毒载体中的杆状病毒表达***转移载体包括但不限于pFastBac1、pVL1393、pFastBac dual等，并优选采用 pVL1393。其中的启动子可以选自但不限于P10启动子、PH启动子、对虾β-actin基因启动子、OpIE启动子等，还有可能是其他的杆状病毒启动子。其中的转录终止信号可以选自但不限于SV40 polyA转染终止信号、HSV tkpolyA转染终止信号或者OpIE poly A终止信号中的任一个，而还可能是其他转录终止信号。其中的昆虫细胞系可以选自但不限于Sf9、High Five、S2 或 Sf21 细胞，优选的用Sf9。本发明所述的动物，主要是指禽类。

本发明的原理在于通过构建一个重组杆状病毒穿梭质粒，该质粒上包含表达禽呼肠孤病毒融合蛋白的表达基因。所述禽呼肠孤病毒融合蛋白的编码基因可以使用P10启动子、PH启动子、对虾β-actin基因启动子、OpIE启动子等，而相应的转录终止信号可以是SV40polyA转染终止信号、HSV tk polyA转染终止信号、OpIE poly A终止信号等。进而，可以构建该穿梭质粒与杆状病毒基因组质粒共转染昆虫细胞，通过筛选获得重组杆状病毒，该重组杆状病毒接种Sf9细胞，能够同时表达禽呼肠孤病毒融合蛋白。

具体的，可以先将设计的密码子优化的融合蛋白编码基因克隆到pVL1393质粒载体的BamH Ⅰ、Pst Ⅰ酶切位点处，构建重组穿梭载体。再将构建后的重组穿梭载体与杆状病毒基因组质粒共转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒。

通过使用杆状病毒和Sf9细胞表达融合蛋白，所获的所述融合蛋白抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对禽类没有致病性，并且本发明的疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本，可以大规模批量生产，质控容易，安全性高，免疫原性好，批次间稳定。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Thirdedition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Thirdedition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1转移载体pVL-SBC的构建与鉴定

1、SBC基因的扩增在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的SBC基因（SEQ ID NO:1）并克隆到pMD19载体上，得到pMD19-SBC质粒载体。以pMD19-SBC作为模板，SBC-F（SEQ ID NO:3）、SBC-R作为引物（SEQ ID NO:4）进行PCR扩增，具体扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45 秒，60℃复性45秒，72℃延伸30秒，共30个循环。接着是72℃延伸10 分钟，4℃保藏。

表1 SBC基因的扩增体系

2、SBC基因与pVL1393质粒的连接凝胶回收纯化PCR产物（相应表征结果参见图1），将pVL1393质粒载体和纯化的PCR产物使用BamHⅠ、Pst Ⅰ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2。然后分别使用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化，将纯化酶切过的质粒和PCR产物使用T4连接酶16℃水浴中连接过夜，具体连接反应体系见表3。

表2 SBC基因与pVL1393质粒酶切反应体系

表3 SBC基因与pVL1393质粒连接体系

3、连接产物的转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl LB培养基。37℃培养1小时，将1ml菌液浓缩成100μl涂布于含有100μg/ml氨苄西林的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

4、重组质粒的提取挑取平板上4个单菌落于含有Amp^r抗性的1ml培养基中培养2小时，以菌液作为模板，SBC-F和SBC-R引物进行菌落PCR。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45 秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；然后72℃延伸10分钟，4℃保藏。将PCR产物凝胶电泳，EB染色，紫外灯下查看电泳胶。待检样品出现一条分子量约为1.0kb的DNA带（相应表征结果参见图2），判为阳性；反之，判为阴性。鉴定出的阳性克隆进行测序，选择序列以及连接方向正确的菌株保藏。构建的含有目的基因的转移载体pVL-SBC其示意图如图3。

实施例2重组杆状病毒rBac-SBC的构建和获得

1 Sf9细胞的转染在6cm的组织培养皿中接种2×10⁶个Sf9细胞，细胞汇合度为50-70%。待细胞贴壁后（大约15 分钟），移除培养基，加1ml的转染缓冲液A（BD生物科学公司（BDbioscience.com），货号554740）。将0.5ug的BD BaculoGold Linearized BaculovirusDNA和2ug的pVL-SBC质粒在无菌EP管中混匀放置5min，加入1ml转染试剂B（BD生物科学公司（BDbioscience.com），货号554740），混合均匀。然后吸取1ml的转染试剂B/DNA混合物滴加到组织培养皿中，27℃孵育4 小时。移除转染复合物后使用细胞培养基洗三次，加入3ml新鲜培养基，27℃培养观察细胞病变情况并收获重组杆状病毒。

2 重组病毒的纯化（蚀斑实验）在6cm的组织培养皿中接种2～2.5×10⁶个Sf9细胞，室温下放置5分钟。梯度稀释（稀释比例：10^-4～10^-7）上述共转染病毒上清。然后在每一个培养皿中加入1ml稀释的病毒，室温下放置1小时，每过15 分钟适当震荡，使病毒充分感染。

用无菌水配置2%的低浓度琼脂糖，微波加热到60℃，使其充分融化。然后放入42℃水浴锅中恒温，再加入1体积的2× Grace培养基，混合均匀。

吸走细胞培养皿中培养液上清，在细胞表面覆盖4ml的1%琼脂糖，同时吸走所有的气泡，10-15分钟后琼脂糖凝固。将培养皿放置在湿润的环境中，27℃培养7日，观察噬斑。在培养皿上标记噬斑，使用枪头挑取噬斑，接种于700ul SFM培养基中，4℃下摇晃过夜。收获细胞培养物，获得的重组病毒即为F0代病毒，可用于病毒的扩增以及生产。

另外按照上面的实施例方法构建如下（表4、表5）蛋白的重组杆状病毒：

表4

表5

实施例3SDS-PAGE检测

将实施例2中收获的细胞培养物进行SDS-PAGE检测，同时使用感染空杆状病毒的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loadingbuffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶（12%浓度凝胶）电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。如图4所示，在分子量约36kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

实施例4Western Blot鉴定

将实施例3中SDS-PAGE电泳后的产物转印到NC（硝酸纤维素）膜上，用5%脱脂牛奶封闭2小时，鸡源抗ARV阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗鸡多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。如图5所示，重组杆状病毒表达样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在 Sf9 细胞中得到正确表达。

实施例5间接免疫荧光检测

向 96 孔细胞培养板中加入转染过rBac-SBC的Sf9细胞悬液，100µl/孔（细胞浓度为2.5×10⁵～4.0×10⁵个/mL），接种4孔，27℃静置15分钟，使Sf9细胞贴于培养板底壁，然后每孔加入10µl稀释10倍的毒种。同时设空白细胞对照。接种后细胞置27℃恒温培养箱中培养72~96小时，弃培养液，冷甲醇/丙酮（1:1）固定。首先与鸡源抗ARV多抗血清反应，然后与FITC标记的羊抗鸡IgG反应，倒置荧光显微镜观察结果。如图6所示，接种空杆状病毒Sf9细胞不能观察到荧光，而接种了重组杆状病毒Sf9细胞能够观察到荧光，说明目的抗原蛋在Sf9细胞中得到正确表达，重组杆状病毒构建正确。

实施例6昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养

在1000ml摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3-4天，待浓度长到3-5×10⁶cell/mL，活力大于95%时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3-8×10⁵cell/mL。当细胞浓度达到3-55×10⁶cell/mL时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为3-55×10⁶cell/mL，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-85×10⁶cell/mL时，接种重组杆状病毒rBac-SBC，反应器培养条件为pH值6.0-6.5、温度25-27℃、溶氧30-80%、搅拌速度100-180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧50%、搅拌速度100-180 rpm。在感染之后继续培养5-9天后，加入千分之一终浓度BEI（二乙烯亚胺，CAS号109-97-7），37℃作用48 h后，加千分之二终浓度Na₂S₂O₃终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2-8℃保存原液。

实施例7蛋白纯化

1．将收获的原液使用阳离子交换层析法进行纯化

使用强阳粒子层析填料POROS 50HS进行粒子交换层析，填料使用前使用0.5MNaOH进行消毒。然后用微滤缓冲液（20 mM PBS，pH=7.4）在室温平衡，然后将疫苗原液以125mL/min的速率上柱，然后用漂洗buffer A（0.05 M MOPS(钠盐)，pH=7.0，0.5M NaCl）洗脱8个柱体积。然后线性梯度进行洗脱，从0% buffer B到100% buffer B(0.05 M MOPS(钠盐)，pH=7.0，1.5M NaCl)，其中线性洗脱一共洗脱了10个柱体积，然后分别收获这10个柱体积的洗脱物。线性洗脱完后，再用buffer B洗脱2个柱体积，并分别收集。将每个柱体积的洗脱物进行SDS-PAGE检测，将含有较高浓度目的蛋白的收集的样品合并后放在2 L的无菌的塑料瓶中放置在4℃，定义为样品1。然后将最后一个洗脱峰（A280）下收集的组份无菌过滤储存在4℃，定义为样品2。

2．羟基磷灰石疏水层析

使用预装羟基磷灰石柱（CHT™ Ceramic Hydroxyapatite Type II Media），首先使用50 mM MOPS(钠盐)，pH=7.0，1.25M NaCl进行平衡，然后将上面的样品1以90 cm/h进行上样，上完样后先使用8体积的平衡液（50 mM MOPS(钠盐)，pH=7.0，1.25M NaCl）进行洗脱直至UV值为零，然后使用洗脱液（0.2 M 磷酸盐，pH=7.0，1.25 M NaCl）进行梯度洗脱，洗脱液浓度从0%到100%，速度仍然是90 cm/h，洗脱体积是4个柱体积，分别收获并检测洗脱物，根据SDS-PAGE检测结果确定含有目的蛋白的洗脱物，从而纯化得到目的蛋白。

将纯化的目的蛋白使用BCA总蛋白定量，然后结合灰度扫描确定目的蛋白纯度，纯化后的蛋白如图7所示，目的蛋白浓度为312 μg/mL，纯度为92%。

实施例8琼扩检测

使用琼扩方法检测表达的重组SBC蛋白效价。

检测一：在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入ARV S1133株阳性血清，周围分别加入稀释了2的1、2、3、4、5、6次方的重组SBC蛋白。倒置孵育72 h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。琼扩效价检测结果如下：SBC蛋白琼扩效价为1:64。

检测二：在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入稀释了2的5次方的重组SBC蛋白，周围分别加入S1133株、LN02株、1733株、138株以及916株阳性血清。倒置孵育72 h后观察沉淀线。结果显示：每个阳性血清与抗原孔之间都出现一条清晰的沉淀线。

检测三：在3块琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入重组SBC-A、SBC-B或SBC-E融合蛋白，每块板周围都分别加入S1133株、LN02株、1733株、138株以及916株阳性血清。倒置孵育72 h后观察沉淀线。结果如表6所示。

表6 琼扩效价检测结果

检测四：在2块琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入ARV-σB或ARV-σC，每块板周围都分别加入S1133株、LN02株、1733株、138株以及916株阳性血清。倒置孵育72 h后观察沉淀线。结果如表7所示。

表7 琼扩效价检测结果

实施例9疫苗的制备

取实施例7中表达的重组蛋白原液，使用生理盐水进行稀释，使得抗原蛋白的浓度达到使用S1133株阳性血清检测琼扩效价1:4，然后将稀释好的疫苗原液与油佐剂按照2:3的比例配置成油乳剂疫苗。具体的，每1L的混合疫苗原液加入白油1429g，司本70.2g，硬脂酸铝8.43g以及吐温53.3g。然后用乳化破碎机破碎乳化制备成油乳佐剂灭活苗，质检合格后置于4℃保存。

实施例10免疫试验

试验一：用21~28日龄SPF鸡15只，10只各肌肉注射实施例9中制备的疫苗0.2ml，另5只作为对照。免疫后28日，每只鸡分别采血，分离血清，使用IDEXX公司抗体ELISA试剂盒进行抗体检测。免疫组ELISA抗体全部为阳性，对照组全部为阴性。

试验二：实施例2中制备的7种重组杆状病毒感染Sf9细胞获得的细胞培养物上清使用生理盐水进行稀释，分别将上述稀释蛋白等比例混合或者单独加入到白油佐剂中，使用高速剪切乳化机乳化混匀，置于4℃保存。

取21~28日龄SPF鸡270只，随机分为9组，每组30只，第一组颈背部皮下接种本专利重组融合蛋白SBC制备的疫苗 0.2mL/只，后七组分别接种不同抗原蛋白SBC-A、SBC-B、SBC-C、SBC-D、SBC-E、S1133株ARV-σB以及S1133株ARV-σC所制备的疫苗0.2mL/只，第9组作为阴性对照，免疫接种空杆状病毒收获的Sf9细胞培养物乳化制备的疫苗。所有鸡免疫后28日采血，分离血清，进行ELISA抗体效价测定，检测结果如表8所示。

将采血后的8组鸡每组分为3小组，每小组10只，各小组分别脚垫攻击中国药品监察所标准强毒AV2311、138株以及916株，剂量为1×10^4.0ELD₅₀/只，观察7日，记录存活比例见表8。

表8 鸡免疫攻毒的抗体效价和存活比例

应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 禽呼肠孤病毒新型基因工程疫苗

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

ggatccatga tctccgctag cctgcaggac atgacccaca cactggacga cgttaccgct 60

aacctggacg gtctgcgcac caccgtgacc gccctgcaga tctccgctaa cctccaggac 120

atgacccaca ccctggacga cgtgaccgct aacctcgacg gcctgcgcac caccgtgaca 180

gccctgcaga tctccgctaa cctgcaggac atgactcaca tcctggacga cgtgaccgcc 240

aacctggacg gcctgcgtac caccgtgacc gctctgcaga tctctgctga cctgcagaac 300

gtgacccgtg ccctcgacga cgtgacagct aacctggacg gtatgcgtgt gactatcact 360

accctgcagg aatccgactt gcagggagtg gtgagcagcc tgggtcaggc taacagcacc 420

ctgaccgaac tgagcaagga actgcgtcag ctgagctccc tcctggacca gtacgctgtg 480

gctctagaaa gcatcgctga ccactacgac gaaatctcac agcgtatggt ggacgaacct 540

gaaaacgacg aagtggctcc tctggacatc gtcacccgca ctgaatccat ccgctctgac 600

aagaccgttg accctgactt ctggacatac cctctagaac gccgtagcga tgatagccgc 660

cgtgacatcg ctgccagctg ttggcgtatg atcgacgcta gcagccgtag cctgaccctg 720

cctaactgtc tcgtgagccc tagcctgcac tcccgtagcg tgttcggcca gatgcagaca 780

accaccacca tctacgacgt ggccgctagc ggcaaggctg tgaagttctc ccctatggtg 840

gccaccctga gccagcgtga cgctggtcct gtgaagctgg ctaacgctga ccctgctgaa 900

ggcgtgtact ccttctggac ctcccacttc gctttctccc ctctgatcgg cggtgtgggt 960

atcaccggcc agtacgctcg tgaaagctga taagaattc 999

<210> 2

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

Met Ile Ser Ala Ser Leu Gln Asp Met Thr His Thr Leu Asp Asp Val

1 5 10 15

Thr Ala Asn Leu Asp Gly Leu Arg Thr Thr Val Thr Ala Leu Gln Ile

20 25 30

Ser Ala Asn Leu Gln Asp Met Thr His Thr Leu Asp Asp Val Thr Ala

35 40 45

Asn Leu Asp Gly Leu Arg Thr Thr Val Thr Ala Leu Gln Ile Ser Ala

50 55 60

Asn Leu Gln Asp Met Thr His Ile Leu Asp Asp Val Thr Ala Asn Leu

65 70 75 80

Asp Gly Leu Arg Thr Thr Val Thr Ala Leu Gln Ile Ser Ala Asp Leu

85 90 95

Gln Asn Val Thr Arg Ala Leu Asp Asp Val Thr Ala Asn Leu Asp Gly

100 105 110

Met Arg Val Thr Ile Thr Thr Leu Gln Glu Ser Asp Leu Gln Gly Val

115 120 125

Val Ser Ser Leu Gly Gln Ala Asn Ser Thr Leu Thr Glu Leu Ser Lys

130 135 140

Glu Leu Arg Gln Leu Ser Ser Leu Leu Asp Gln Tyr Ala Val Ala Leu

145 150 155 160

Glu Ser Ile Ala Asp His Tyr Asp Glu Ile Ser Gln Arg Met Val Asp

165 170 175

Glu Pro Glu Asn Asp Glu Val Ala Pro Leu Asp Ile Val Thr Arg Thr

180 185 190

Glu Ser Ile Arg Ser Asp Lys Thr Val Asp Pro Asp Phe Trp Thr Tyr

195 200 205

Pro Leu Glu Arg Arg Ser Asp Asp Ser Arg Arg Asp Ile Ala Ala Ser

210 215 220

Cys Trp Arg Met Ile Asp Ala Ser Ser Arg Ser Leu Thr Leu Pro Asn

225 230 235 240

Cys Leu Val Ser Pro Ser Leu His Ser Arg Ser Val Phe Gly Gln Met

245 250 255

Gln Thr Thr Thr Thr Ile Tyr Asp Val Ala Ala Ser Gly Lys Ala Val

260 265 270

Lys Phe Ser Pro Met Val Ala Thr Leu Ser Gln Arg Asp Ala Gly Pro

275 280 285

Val Lys Leu Ala Asn Ala Asp Pro Ala Glu Gly Val Tyr Ser Phe Trp

290 295 300

Thr Ser His Phe Ala Phe Ser Pro Leu Ile Gly Gly Val Gly Ile Thr

305 310 315 320

Gly Gln Tyr Ala Arg Glu Ser

325

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

ataggatcca tgatctccgc tagcctgcag gacatgac 38

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

atagaattct tatcagcttt cacgagcgta ctggc 35

<210> 5

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

ggatccatga tctccgctag cctgcaggac atgacccaca cactggacga cgttaccgct 60

aacctggacg gtctgcgcac caccgtgacc gccctgcaga tctccgctaa cctccaggac 120

atgacccaca ccctggacga cgtgaccgct aacctcgacg gcctgcgcac caccgtgaca 180

gccctgcaga tctccgctaa cctgcaggac atgactcaca tcctggacga cgtgaccgcc 240

aacctggacg gcctgcgtac caccgtgacc gctctgcaga tctctgctga cctgcagaac 300

gtgacccgtg ccctcgacga cgtgacagct aacctggacg gtatgcgtgt gactatcact 360

accctgcagc tcctggacca gtacgctgtg gctctagaaa gcatcgctga ccactacgac 420

gaaatctcac agcgtatggt ggacgaacct gaaaacgacg aagtggctcc tctggacatc 480

gtcacccgca ctgaatccat ccgctctgac aagaccgttg accctgactt ctggacatac 540

cctctagaac gccgtagcga tgatagccgc cgtgacatcg ctgccagctg ttggcgtatg 600

atcgacgcta gcagccgtag cctgaccctg cctaactgtc tcgtgagccc tagcctgcac 660

tcccgtagcg tgttcggcca gatgcagaca accaccacca tctacgacgt ggccgctagc 720

ggcaaggctg tgaagttctc ccctatggtg gccaccctga gccagcgtga cgctggtcct 780

gtgaagctgg ctaacgctga ccctgctgaa ggcgtgtact ccttctggac ctcccacttc 840

gctttctccc ctctgatcgg cggtgtgggt atcaccggcc agtacgctcg tgaaagctga 900

taagaattc 909

<210> 6

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

ggatccatga tctccgctag cctgcaggac atgacccaca cactggacga cgttaccgct 60

aacctggacg gtctgcgcac caccgtgacc gccctgcaga tctccgctaa cctccaggac 120

atgacccaca ccctggacga cgtgaccgct aacctcgacg gcctgcgcac caccgtgaca 180

gccctgcaga tctccgctaa cctgcaggac atgactcaca tcctggacga cgtgaccgcc 240

aacctggacg gcctgcgtac caccgtgacc gctctgcagg aatccgactt gcagggagtg 300

gtgagcagcc tgggtcaggc taacagcacc ctgaccgaac tgagcaagga actgcgtcag 360

ctgagctccc tcctggacca gtacgctgtg gctctagaaa gcatcgctga ccactacgac 420

gaaatctcac agcgtatggt ggacgaacct gaaaacgacg aagtggctcc tctggacatc 480

gtcacccgca ctgaatccat ccgctctgac aagaccgttg accctgactt ctggacatac 540

cctctagaac gccgtagcga tgatagccgc cgtgacatcg ctgccagctg ttggcgtatg 600

atcgacgcta gcagccgtag cctgaccctg cctaactgtc tcgtgagccc tagcctgcac 660

tcccgtagcg tgttcggcca gatgcagaca accaccacca tctacgacgt ggccgctagc 720

ggcaaggctg tgaagttctc ccctatggtg gccaccctga gccagcgtga cgctggtcct 780

gtgaagctgg ctaacgctga ccctgctgaa ggcgtgtact ccttctggac ctcccacttc 840

gctttctccc ctctgatcgg cggtgtgggt atcaccggcc agtacgctcg tgaaagctga 900

taagaattc 909

<210> 7

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

ggatccatga tctccgctag cctgcaggac atgacccaca cactggacga cgttaccgct 60

aacctggacg gtctgcgcac caccgtgacc gccctgcaga tctccgctaa cctccaggac 120

atgacccaca ccctggacga cgtgaccgct aacctcgacg gcctgcgcac caccgtgaca 180

gccctgcaga tctctgctga cctgcagaac gtgacccgtg ccctcgacga cgtgacagct 240

aacctggacg gtatgcgtgt gactatcact accctgcagg aatccgactt gcagggagtg 300

gtgagcagcc tgggtcaggc taacagcacc ctgaccgaac tgagcaagga actgcgtcag 360

ctgagctccc tcctggacca gtacgctgtg gctctagaaa gcatcgctga ccactacgac 420

gaaatctcac agcgtatggt ggacgaacct gaaaacgacg aagtggctcc tctggacatc 480

gtcacccgca ctgaatccat ccgctctgac aagaccgttg accctgactt ctggacatac 540

cctctagaac gccgtagcga tgatagccgc cgtgacatcg ctgccagctg ttggcgtatg 600

atcgacgcta gcagccgtag cctgaccctg cctaactgtc tcgtgagccc tagcctgcac 660

tcccgtagcg tgttcggcca gatgcagaca accaccacca tctacgacgt ggccgctagc 720

ggcaaggctg tgaagttctc ccctatggtg gccaccctga gccagcgtga cgctggtcct 780

gtgaagctgg ctaacgctga ccctgctgaa ggcgtgtact ccttctggac ctcccacttc 840

gctttctccc ctctgatcgg cggtgtgggt atcaccggcc agtacgctcg tgaaagctga 900

taagaattc 909

<210> 8

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

ggatccatga tctccgctag cctgcaggac atgacccaca cactggacga cgttaccgct 60

aacctggacg gtctgcgcac caccgtgacc gccctgcaga tctccgctaa cctgcaggac 120

atgactcaca tcctggacga cgtgaccgcc aacctggacg gcctgcgtac caccgtgacc 180

gctctgcaga tctctgctga cctgcagaac gtgacccgtg ccctcgacga cgtgacagct 240

aacctggacg gtatgcgtgt gactatcact accctgcagg aatccgactt gcagggagtg 300

gtgagcagcc tgggtcaggc taacagcacc ctgaccgaac tgagcaagga actgcgtcag 360

ctgagctccc tcctggacca gtacgctgtg gctctagaaa gcatcgctga ccactacgac 420

gaaatctcac agcgtatggt ggacgaacct gaaaacgacg aagtggctcc tctggacatc 480

gtcacccgca ctgaatccat ccgctctgac aagaccgttg accctgactt ctggacatac 540

cctctagaac gccgtagcga tgatagccgc cgtgacatcg ctgccagctg ttggcgtatg 600

atcgacgcta gcagccgtag cctgaccctg cctaactgtc tcgtgagccc tagcctgcac 660

tcccgtagcg tgttcggcca gatgcagaca accaccacca tctacgacgt ggccgctagc 720

ggcaaggctg tgaagttctc ccctatggtg gccaccctga gccagcgtga cgctggtcct 780

gtgaagctgg ctaacgctga ccctgctgaa ggcgtgtact ccttctggac ctcccacttc 840

gctttctccc ctctgatcgg cggtgtgggt atcaccggcc agtacgctcg tgaaagctga 900

taagaattc 909

<210> 9

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

ggatccatga tctccgctaa cctccaggac atgacccaca ccctggacga cgtgaccgct 60

aacctcgacg gcctgcgcac caccgtgaca gccctgcaga tctccgctaa cctgcaggac 120

atgactcaca tcctggacga cgtgaccgcc aacctggacg gcctgcgtac caccgtgacc 180

gctctgcaga tctctgctga cctgcagaac gtgacccgtg ccctcgacga cgtgacagct 240

aacctggacg gtatgcgtgt gactatcact accctgcagg aatccgactt gcagggagtg 300

gtgagcagcc tgggtcaggc taacagcacc ctgaccgaac tgagcaagga actgcgtcag 360

ctgagctccc tcctggacca gtacgctgtg gctctagaaa gcatcgctga ccactacgac 420

gaaatctcac agcgtatggt ggacgaacct gaaaacgacg aagtggctcc tctggacatc 480

gtcacccgca ctgaatccat ccgctctgac aagaccgttg accctgactt ctggacatac 540

cctctagaac gccgtagcga tgatagccgc cgtgacatcg ctgccagctg ttggcgtatg 600

atcgacgcta gcagccgtag cctgaccctg cctaactgtc tcgtgagccc tagcctgcac 660

tcccgtagcg tgttcggcca gatgcagaca accaccacca tctacgacgt ggccgctagc 720

ggcaaggctg tgaagttctc ccctatggtg gccaccctga gccagcgtga cgctggtcct 780

gtgaagctgg ctaacgctga ccctgctgaa ggcgtgtact ccttctggac ctcccacttc 840

gctttctccc ctctgatcgg cggtgtgggt atcaccggcc agtacgctcg tgaaagctga 900

taagaattc 909

<210> 10

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 10

atggaggtac gtgtgccaaa ctttcactcg ttcgttgaag gaataacatc tagctatttg 60

aagactcctg cttgctggaa tgcacagaca gcctgggaca ctgtgacttt tcacgtccct 120

gatgtaatta gagttggcaa tgcgtattgt tgctctcaat gttgtggtgt actttattac 180

gggactctgc ccgcggatgg aaattacttc cctcatcaca aatgccatca gcaacagtac 240

aggaccgata ccccactgct ccggtatgtg cgaattggca gaacgactga gcatctgttg 300

gaccaatatg ctgttgcgct ggagtctatt gctgatcact atgatgaaat cagtcaacgc 360

atggtcgatg agccagagaa cgatgaagtc gcgccccttg acattgtaac gcgtactgaa 420

tctatccgaa gtgataagac ggttgacccg gacttttgga cttacccgct tgagcgacgt 480

tctgatgatt ctcgtcgaga catcgccgca tcatgctgga gaatgattga tgcatcatca 540

cgtagtctca ctcttccaaa ttgtcttgtg tccccgtctt tgcattctcg ttccgtcttt 600

ggtcaaatgc aaacgaccac caccatatac gatgttgcgg cgtcgggaaa ggccgttaaa 660

ttttctccga tggtggctac actatcgcaa cgtgatgctg gccctgtaaa gcttgcgaat 720

gctgacccag cggaaggtgt atattcattt tggacgtcgc acttcgcctt ctcaccgctc 780

attggtggag ttgggattac gggacagtac gctcgtgagt cataccatca cgtgggtcat 840

ccagtgattg ggagtggtaa gaaggcgtca cactacaaaa atctgtttat ggaatcatgg 900

cgtgggtggt caaagtcagc tttcgcatgc gctacaggaa tggagccagc tgaatgtgaa 960

tctcgtctga ggggacatgc tcgcactatg cttggacgct ctctgccgaa cgtctgtgac 1020

gacgaggttg ctcagcagtc tggcgccgtg ctaacgtccc tgcagaagac taccaagttc 1080

actgttgtgg agtgtggttg gtaa 1104

<210> 11

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 11

atggcgggtc tcaatccatc gcagcgaaga gaggtcgtca gcttgatact gtcattgact 60

tcgaacgtga ctataagtca tggcgatttg acgccgatct atgaacggct gaccaatcta 120

gaagcgtcta cggagttatt acatcgctcc atttccgata tatccactac tgtctcaaat 180

atttctgcaa gtttacaaga catgacccat accttggatg atgtaactgc taatttagac 240

ggtttgagga ccactgttac tgcacttcag gattccgtct ccattctgtc tacaaatgtg 300

actgacttaa cgaacacatc ctctgcgcac gcggcgacac tatcttcact tcaaactacg 360

gttgacggaa acttcactgc catctccaat ttgaagagtg atgtatcgtc gaacggttta 420

gctattacag atctgcagga tcgtgttaaa tcattggagt ctaccgcgag tcatggtcta 480

tctttttcgc ctccacttag tgtcgctgac ggcgtggttt cattagacat ggacccctac 540

ttctgttctc aacgagtttc tttaacatca tactcggcgg aggctcaact aatgcaattt 600

cggtggatgg cacggggtac taacggatca tctgatacca ttgacatgac cgttaacgct 660

cactgtcatg gaagacgcac tgattatatg atgtcgtcca cgggaaatct cacggtcact 720

agtaacgtcg tgttattaac cttcgattta agttacataa cgcctatccc atcagaccta 780

gcacgtcttg ttcccagtgc gggattccaa gctgcgtcgt tccctgtgga cgtatcattc 840

acccgcgatt ctgcgactca tgcgtaccaa gcgtatgggg tgtactcgag ctcacgtgtc 900

ttcacaatta ctttcccaac cggaggtgat ggtgcagcga acattcgttc cttgaccgtg 960

cgtaccggca tcgacaccta a 981

Claims

1.一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述融合蛋白的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

4.包含权利要求2或3所述编码基因的重组基因载体或重组杆状病毒。

5.一种免疫组合物，其特征在于包括：权利要求1所述的融合蛋白；以及，药学上可接受的载体。

6.如权利要求5所述的免疫组合物，其特征在于：所述药学上可接受的载体包括白油、硬脂酸铝、司本、吐温中的任意一种或者两种以上的组合。

7.如权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于包括：

S1、将所述融合蛋白的编码基因克隆到杆状病毒表达***转移载体上，获得重组杆状病毒转移载体；

S2、将重组杆状病毒转移载体与杆状病毒基因组质粒共转染昆虫细胞，筛选获得重组杆状病毒；

S3、将所述重组杆状病毒接种昆虫细胞，获得所述融合蛋白；

所述杆状病毒表达***转移载体包括pFastBac1、pVL1393中的任意一种；

所述昆虫细胞包括Sf9、High Five或 Sf21 细胞。

8.如权利要求1所述融合蛋白或权利要求5或6所述免疫组合物在生产用于在受试动物中诱导针对禽呼肠孤病毒抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受禽呼肠孤病毒感染的药剂中的用途。

9.如权利要求1所述融合蛋白或权利要求5或6所述免疫组合物在制备禽呼肠孤病毒基因工程疫苗中的用途。