CN111349046A

CN111349046A - 一种生物碱、晶体、制备方法及应用

Info

Publication number: CN111349046A
Application number: CN202010179121.2A
Authority: CN
Inventors: 曹朵; 尉亚辉; 郭斌; 高静; 李翠华
Original assignee: Northwestern University
Current assignee: Northwestern University
Priority date: 2020-03-13
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2040-03-13
Also published as: CN111349046B

Abstract

本发明涉及手性拆分方法和应用。首先采用酸提碱沉法从石杉科植物千层塔(Huperzia Serrata)的全株中获得生物碱Serratinine，再次采用单晶培养法对该化合物进行手性拆分，最后得到手性相反的异构体SerratinineA和B。SerratinineA的分子式(一)为(1R，4S，5S，6S，8S，9S)‑5，8‑二羟基‑6‑甲基‑13‑氮杂四环[7.7.0.01,13.04,9]十六烷‑2‑酮；SerratinineB的分子式(二)为(1S，4R，5R，6R，8R，9R)‑5,8‑二羟基‑6‑甲基‑13‑氮杂四环[7.7.0.01,13.04,9]十六烷‑2‑酮。经体外活性实验表明该化合物SerratinineB能够更好的缓解神经炎症从而达到改善阿尔茨海默病的作用。

Description

一种生物碱、晶体、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及天然药物化学领域，具体涉及从植物千层塔中分离得到生物碱Serratinine，特别是一种生物碱、晶体、制备方法及应用。

背景技术

阿尔茨海默氏病是一种年龄依赖性神经退行性疾病，其特征在于神经元丢失，突触变性，老年斑和神经原纤维缠结。阿尔茨海默病患者在受影响的大脑区域还观察到活化的小胶质细胞和星形胶质细胞的积累增加，表明存在持续的炎症过程。随着神经炎症触发外周免疫***的激活，许多研究已经分析了循环炎症生物标志物

千层塔为石杉科蛇足石杉属植物。全株可入药，分布于东北、长江流域地区及福建、广东、广西、贵州、云南及湖北等地。其含有的现已上市的石杉堿甲，这种生物碱通过抑制乙酰胆碱酯酶活性从而可以治疗阿尔茨海默病。味苦、微甘，性平。归肺、大肠、肝、肾经，用于跌打损伤，瘀血肿痛，内伤吐血；外用治痈疖肿毒，毒蛇咬伤，烧烫伤。对该属植物的研究发现其富含多种类型的生物碱类化合物。本发明首次从千层塔中大量分离得到生物碱Serratinine并对其进行手性拆分，并发现该化合物异构体中Serratinine B具有较好的抗神经炎作用

发明内容

本发明的目的在于，提供一种生物碱或晶体，该生物碱或晶体为手性化合物，同时其中一个手性化合物具有良好的抑制神经炎症效用。

本发明的目的在于，提供一种生物碱或晶体的制备方法，该方法简单、经济，能够大量富集目标生物碱或晶体。

本发明的目的在于，提供一种生物碱或晶体用于制备治疗阿尔茨海默症药物的应用。

一种生物碱，具有式(一)或式(二)的结构；

一种生物碱，分子式(一)为(1R，4S，5S，6S，8S，9S)-5，8-二羟基-6-甲基-13-氮杂四环[7.7.0.01,13.04,9]十六烷-2-酮；

或者，分子式(二)为(1S，4R，5R，6R，8R，9R)-5,8-二羟基-6-甲基-13-氮杂四环[7.7.0.01,13.04,9]十六烷-2-酮。

可选的，所述式(一)化合物具有P2₁2₁2₁空间群，晶胞参数为：

α(°)＝90.00，β(°)＝90.00，γ(°)＝90.00；

所述式(二)化合物具有P2₁空间群，晶胞参数为：

α(°)＝90.00，β(°)＝100.375(5)，γ(°)＝90.00。

可选的，所述式(一)化合物具有包含2θ(°)选自约9.8、约12.6、约13.9、约14.9、约15.5、约17.0、约18.4和约20.1的X射线粉末衍射图；所述式(二)化合物具有包含2θ(°)选自约11.4、约12.9、约15.2、约16.8、约18.3约19.5和约22.9的X射线粉末衍射图。

可选的，所述式(一)化合物的2θ(°)X射线粉末衍射图见附图16；所述式(二)化合物的2θ(°)X射线粉末衍射图见图17。

本发明的第二个目的是，提供具有(1R，4S，5S，6S，8S，9S)-5，8-二羟基-6-甲基-13-氮杂四环[7.7.0.01,13.04,9]十六烷-2-酮的晶体；或者，具有(1S，4R，5R，6R，8R，9R)-5,8-二羟基-6-甲基-13-氮杂四环[7.7.0.01,13.04,9]十六烷-2-酮的晶体。

可选的，所述的晶体具有P2₁2₁2₁空间群，晶胞参数为：

α(°)＝90.00，β(°)＝90.00，γ(°)＝90.00；或者，所述晶体具有有P2₁空间群，晶胞参数为：

α(°)＝90.00，β(°)＝100.375(5)，γ(°)＝90.00。

可选的，所述晶体具有包含2θ(°)选自约9.8、约12.6、约13.9、约14.9、约15.5、约17.0、约18.4和约20.1的X射线粉末衍射图；或者，所述晶体具有包含2θ(°)选自约11.4、约12.9、约15.2、约16.8、约18.3、约19.5和约22.9的X射线粉末衍射图。

本发明的另一个目的是，提供一种生物碱的制备方法，以千层塔植株粉末为提取对象，依次采用有机溶剂提取、大孔树脂吸附分离及溶剂结晶法得到本发明所述的生物碱或者得到本发明所述的晶体；

所述的大孔树脂为：AB-8；

所述溶剂结晶法中选用的溶剂为甲醇和水体系。

具体的，AB-8为大孔树脂填料，吸附样品的浓度、柱层析流速及柱体积分别为4.30mg/mL、2BV/h和10BV；溶剂结晶法中选用的溶剂为：以质量比计，甲醇：水＝7：3；分别得到正方体晶体220mg和六边形苯环状晶体300mg。

可选的，有机溶剂提取包括：以甲醇加热回流提取4次，每次2小时，合并提取液，提取液减压回收甲醇，加水分散后加pH＝2～3的盐酸水溶液并加乙酸乙酯萃取，酸水溶液加pH＝10～11的NaOH水溶液调节pH至8，用等体积的氯仿萃取得到氯仿相；

大孔树脂吸附分离包括：有机溶剂提取后得到的氯仿相经AB-8大孔树脂柱层析，水：甲醇(100:0～0:100)，薄层色谱检视，合并为5个组分(1～5)，展开剂为甲醇：氯仿＝1：8，显色剂为固体碘(斑点为黄色)，具体见图1。

本发明所述的生物碱或者本发明所述的晶体用于制备治疗阿尔茨海默症药物的应用。

本发明的生物碱或晶体经过体外实验研究发现，该化合物能够起到缓解LPS对人小胶质细胞炎症损伤作用，能够用于制备治疗阿尔茨海默症药物。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制：

图1为本发明薄层色谱检视5个组分结果示意图；

图2为本发明的Serratinine A的三维分子结构图；

图3为本发明的SerratinineB的三维分子结构图；

图4为本发明分离得到的Serratinine A和SerratinineB的晶体照片图；

图5为大孔树脂吸附能力、解析能力及解析率结果图；

图6为本发明Serratinine A的核磁氢谱图；

图7为本发明Serratinine A的核磁碳谱图

图8为本发明SerratinineB的核磁氢谱图；

图9为本发明SerratinineB的核磁碳谱图；

图10为本发明Serratinine A的晶体衍射图谱；

图11本发明SerratinineB的晶体衍射图谱；

图12为SerratinineA和B的XRD衍射衍射归一化图谱；

图13为LPS刺激人小胶质细胞系HMC3在不同时间点对IL-1β,IL-6及TNF-α的影响(A)qRT-PCR法分析细胞中炎症因子IL-1β,IL-6及TNF-α的mRNA表达水平(B)ELISA法分析细胞中炎症因子IL-1β,IL-6及TNF-α的表达水平；

图14为LPS刺激人小胶质细胞系HMC3后给与药物Serratinine A后对的影响(A)qRT-PCR方法分析细胞中炎症因子IL-1β,IL-6及TNF-α的mRNA表达水平(B)ELISA法分析细胞中炎症因子IL-1β,IL-6及TNF-α的表达水平；

图15为LPS刺激人小胶质细胞系HMC3后给予药物SerratinineB后对IL-1β,IL-6及TNF-α的影响(A)qRT-PCR方法分析细胞中炎症因子IL-1β,IL-6及TNF-αmRNA表达水平(B)ELISA法分析细胞中炎症因子IL-1β,IL-6及TNF-α的表达水平；

图16为Serratinine A的XRD粉末衍射图谱；

图17为SerratinineB的XRD粉末衍射图谱；

图18为水迷宫小鼠轨迹；

图19水迷宫空间探索实验小鼠轨迹；

图20为水迷宫空间探索实验小鼠目标穿越次数；

图21为小鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α和ROS水平；

图22为小鼠脑组织海马区GFAP蛋白和Iba-1蛋白表达情况。

具体实施方式

名词解释：(下文中所用的比例均为体积比)

千层塔为蕨类植物门，石松纲，石松目，石杉科石杉属蛇足石杉组植物。本发明所使用千层塔于2016年采集于陕西汉中，将新鲜的千层塔全株经日光风干后粉碎成100目粗粉进行提取。

本发明从千层塔中分离得到生物碱Serratinine并对其进行手性拆分，命名为Serratinine A(220mg)和Serratinine B，其化学结构式如下：

三维分子结构式分别见图2图3；

SerratinineA的晶体数据：(C₁₆H₂₇NO_4,含有一个水分子)(M＝297.38g/mol):正交晶系,空间群P212121(no.19),

Z＝4,T＝296.15K,μ(MoKα)＝0.089mm-1,Dcalc＝1.255g/cm3,8469reflectionsmeasured(4.216°≤2Θ≤52.574°),3162unique(Rint＝0.0195,Rσ＝0.0252)在所有的计算中.最终的R1为0.0410(I>2σ(I))和wR2为0.1065.

Serratinine B的晶体数据：(C₁₆H₂₅NO₃)(M＝279.37g/mol):单斜晶系,空间群P21(no.4),

β＝100.375(5)°,体积

Z＝2,T＝296.15K,μ(MoKα)＝0.085mm-1,Dcalc＝1.251g/cm3,3948reflections measured(3.81°≤2Θ≤52.332°),2591unique(Rint＝0.0289,R＝0.0509).最终的R1为0.0447(I>2σ(I))和wR2为0.1137.

下述实验采用的仪器参数见表1；

表1

大孔树脂购于浙江争光实业股份有限公司。

石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和甲醇等试剂购自天津科密欧化学试剂有限公司。

Serratinine A和B的制备方法研究：

将千层塔(Huperzia Serrata)干燥粗粉，以甲醇加热回流提取4次，每次2小时，合并提取液，提取液减压回收甲醇，加水分散后加pH＝2～3的盐酸水溶液并加乙酸乙酯萃取，酸水溶液加pH＝10～11的NaOH水溶液调节pH至8，用等体积的氯仿采取四次后并合并得到氯仿相(生物碱主要集中在氯仿层)

树脂筛选：选择不同性质大孔树脂X-5、D101、HPD-100、HPD-450、HPD-600、HPD-750、AB-8、DM301、NKA-9和S-8进行筛选其对石松类生物碱的吸附解析作用(上述大孔树脂的物理性质见表2)。结果显示弱极性的AB-8为最佳填料。吸附样品的浓度、柱层析流速及柱体积分别为4.30mg/mL，2BV/h和10BV。

吸附能力计算公式:

解析能力计算公式:

解析率计算公式:

与其他树脂对比，AB-8具有较高的吸附能力(164.5mg/g)和解析能力(142.0mg/g)，解析率为86.3％，结果显示AB-8为最佳填料(具体见表3和图5)。

表2

表3

分离：将(2)中得到的氯仿相经AB-8大孔树脂柱层析，水：甲醇(100:0～0:100)，薄层色谱检视，合并为5个组分(1～5)，展开剂为甲醇：氯仿＝1：8，显色剂为固体碘(黄色斑点)具体见图1；

组分3再经大孔树脂AB-8柱层析后得到混合物Serratinine白色粉末。洗脱条件为：甲醇：水(v\v)＝30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、70:1、80:1。

晶体培养法手性拆分条件筛选：选择不同比列的甲醇-丙酮、甲醇-氯仿、丙酮-氯仿、丙酮-水、甲醇-水体系进行重结晶筛分异构体，结果显示甲醇-水体系且甲醇：水＝7：3时可得到SerratinineA(正方体晶体，220mg)和Serratinine B(六边形苯环状，300mg)晶体，具体见图4。由于样品可完全溶解于甲醇、氯仿、丙酮溶液，因此选择单一溶剂及两两混合溶剂进行试验，且这个三种溶剂挥发度也适中。遗憾的是任何比例的有机溶剂均未能将异构体拆分，得到白色粉末状固体混合物，推测由于样品在以上三种溶剂中溶解度较大难以形成晶体析出。因此尝试甲醇中添加难挥发的溶剂水后(甲醇：水＝7：3，样品在水中难熔解)，逐渐形成无色透明正方体和六边形形状晶体。X-衍射显示为手性相反异构体。由图10和11可见，SerratinineA与水分子形成分子间氢键，提示水是该异构体拆分必要条件。

晶体培养方法：取白色粉末约1.5g放入三角瓶中，将溶剂缓慢加入样品瓶中同时不断样品瓶，使样品与溶剂充分接触，让样品缓慢溶解，持续加入溶解直到恰好达到澄清透明状态(过饱和溶液)。封口膜密封样品瓶后同时留有孔使溶解挥发，至于20℃下待晶体形成。具体溶剂体系选择和结果见表4：

表4

实施例一、Serratinine A和B的制备：

将千层塔(Huperzia Serrata)干燥粗粉，以甲醇加热回流提取4次，每次2小时，合并提取液，提取液减压回收甲醇，加水分散后加pH＝2～3的盐酸水溶液并加乙酸乙酯萃取，酸水溶液加pH＝10～11的NaOH水溶液调节pH至8，依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取分别得到氯仿相、乙酸乙酯相和正丁醇相。

将氯仿相经大孔树脂柱层析，水：甲醇(100:0～0:100,v/v)，薄层色谱检视：展开剂为甲醇：氯仿＝1：8，显色剂为固体碘(黄色斑点)，合并为5个组分(1～5)。组分3经反复晶体培养，甲醇-水***(7：3,v/v)，得到Serratinine A(220mg)和Serratinine B(300mg)。核磁数据见表5，核磁图谱见图6-9。

表5 Serratinine A和B的¹H和¹³C NMR数据

^a1H and ¹³C NMR data were measured at 500 and 125MHz(DMSO-d₆),respectively；chemical shifts are in ppm.

具体见表6和表7

Crystal Data for SerratinineA(C₁₆H₂₇NO₄,含有一个水分子)(M＝297.38g/mol):正交晶系,空间群P212121(no.19),

Z＝4,T＝296.15K,μ(MoKα)＝0.089mm-1,D_计算＝1.255g/cm3,8469reflections measured(4.216°≤2Θ≤52.574°),3162unique(Rint＝0.0195,R_σ＝0.0252).最终R1为0.0410(I>2σ(I))和wR2为0.1065.

Crystal Data for Serratinine B(C₁₆H₂₅NO₃)(M＝279.37g/mol):单斜晶系,空间群P21(no.4),

β＝100.375(5)°,

Z＝2,T＝296.15K,μ(MoKα)＝0.085mm-1,D_计算＝1.251g/cm3,3948reflections measured(3.81°≤2Θ≤52.332°),2591 unique(Rint＝0.0289,R_σ＝0.0509).最终R1 was 0.0447(I>2σ(I))和wR2为0.1137.

表6SerratinineA.的晶体数据和结构参数

表7 SerratininB.的晶体数据和结构参数

还进行了XRD衍射检视，XRD衍射图谱见图16-17；归一化后的图谱见图12。SerratininA化合物具有包含2θ(°)选自约9.8、约12.6、约13.9、约14.9、约15.5、约17.0、约18.4和约20.1的X射线粉末衍射图；SerratininB化合物具有包含2θ(°)选自约11.4、约12.9、约15.2、约16.8、约18.3约19.5和约22.9的X射线粉末衍射图；这里所说的“约”，基本的波动范围为±0.2。

神经炎症的实验：(以下若无特殊说明，％表示的是体积浓度)

用10％胎牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100U/mL的DMEM培养基，在37℃，5％CO₂饱和湿度的孵箱中培养，待进入对数生长期的HMC3细胞达到70％至80％融合，用0.25％胰酶消化约2min，镜下观察细胞呈圆形,细胞部分悬起，立即加入与胰酶等体积MEM完全培养基终止消化，用吸管吹打细胞至培养瓶壁上细胞全部吹打下来，用吸管转移入15mL尖头离心管，1200r/min离心5min，弃去上清液，MEM培养基重悬细胞，以1:2的比例传代。用细胞计数器调节HMC3浓度约1×10⁵个/mL，每孔80μL接种于96孔板37℃，5％CO₂温箱中培养。

对照组：24小时后换无血清培养基培养

模型组：24小时后换无血清培养基培养，每孔加入1μg/mL的LPS，收集不同时间点(0,3,6,12,24小时)上清用于检测炎症因子IL-1β，IL-6及TNF-α在mRNA水平及ELISA水平的变化情况。结果显示在LPS刺激后的6小时发生显著变化。

对照组：24小时后换无血清培养基培养，加入浓度为1μg/mL的LPS处理6小时，加入空白溶媒DMSO 2h后检测。

给药组：24小时后换无血清培养基培养，LPS刺激6小时后加入已配的药物20μM 2小时后收集上清用于检测炎症因子IL-1β，IL-6及TNF-α在mRNA水平及ELISA水平的变化情况。结果显示药物可显著下调炎症因子，达到缓解炎症的作用。每个实验组均设3个复孔。

图13：LPS刺激人小胶质细胞时间曲线研究：qRT-PCR检测结果表明，与0小时比较，qRT-PCR检测表明在LPS刺激6小时时炎症因子IL-1β，IL-6及TNF-α在mRNA水平表达明显上调，ELISA法分析细胞中炎症因子IL-1β,IL-6及TNF-α的含量变化趋势与mRNA表达水平变化趋势一致。

图14：LPS刺激人小胶质细胞6小时时给与化合物SerratinineA处理，qRT-PCR检测结果表明，与对照组比较，模型组(LPS+DMSO)炎症因子IL-1β，IL-6及TNF-α在mRNA水平表达明显上调，给药后炎症因子的mRNA表达显著下调9(A)；ELISA法分析细胞中炎症因子IL-1β,IL-6及TNF-α的含量变化趋势与mRNA表达水平变化趋势一致。表明化合物Serratinine B可以显著下调炎症因子从而达到缓解炎症的作用(B)。

图15：LPS刺激人小胶质细胞6小时时给与化合物Serratinine B处理，qRT-PCR检测结果表明，与对照组比较，模型组(LPS+DMSO)炎症因子IL-1β，IL-6及TNF-α在mRNA水平表达明显上调，给药后炎症因子的mRNA表达显著下调(A)；ELISA法分析细胞中炎症因子IL-1β,IL-6及TNF-α的含量变化趋势与mRNA表达水平变化趋势一致。表明化合物Serratinine B可以显著下调炎症因子从而达到缓解炎症的作用(B)。

结果显示化合物Serratinine A和Serratinine B均对人小胶质细胞有显著的下调炎症因子的作用，Serratinine B较A能更明显的缓解炎症作用，因此选择Serratinine B进行后续研究。

研究一、小鼠体内实验：

体重20-25g的雄性KM小鼠，适应性喂养一周后，将所有动物随机分为4组(n＝8)：正常对照组，LPS模型组，药物+LPS组及溶剂+LPS组。实验第一天，麻醉小鼠后，在小鼠左侧脑室内微量注射器注射脂多糖LPS(2ug/ul,2ul,速度2ul/min)，对照组小鼠在同一位置注射生理盐水。手术后，给予操作的小鼠青霉素-G 200,000IU/mL(0.2mL/小鼠。恢复三天后，给药组接受药物溶液治疗(ip，30mg/kg，溶于20％DMSO，连续15天。

分组：正常对照组：生理盐水；LPS模型组：LPS，2ug/ul；药物(Serratinine B)+LPS组：30mg/kg，溶于20％DMSO；

溶剂+LPS组：20％DMS

研究二、水迷宫实验：

水迷宫水池注水，加热；实验动物准备；SMART V3.0软件参数设置；水迷宫实验：分为定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验共5天，每天在固定时间段测试，每只小鼠每天从不同象限入水训练4次，每次历时2min，每两次训练之间间隔15-30min；(技术重复1次)。空间探索实验在第5天定位航行实验结束后，撤除平台，进行空间探索实验，选离平台最远的象限作为小鼠入水点。

ELISA检测炎症因子：

1)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉；

2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

3)加酶：每孔加入酶标试剂50ul，空白孔除外；

4)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

5)配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用；

6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

7)显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min；

8)终止：每孔加终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)；

9)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

免疫组化检测：

1)固定：根据实验需要取材后置于甲醛中固定48h；

2)洗涤与脱水：将固定后的组织用流水冲洗，去除残留的固定液和杂质。不同浓度的乙醇逐级脱水，50％，70％，85％，95％直至无水乙醇，每级2h；

3)透明：50％酒精+50％二甲苯浸泡2h，再用纯二甲苯浸泡2h，再一次醇二甲苯浸泡2h；

4)浸蜡：先把组织材料块置于融化的石蜡和二甲苯的等量混合液中1～2h，再先后置于2个熔化的石蜡液中各3h左右；

5)包埋：将浸好蜡的组织块放入装有蜡液的容器中，摆好组织块位置。待石蜡凝固后将周围多余的石蜡去除，准备切片；

6)切片：切片前将蜡块置于-20℃冰箱中至少30min，以增加硬度。将切片刀装在刀片机的刀架上并固定，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5°角，调整切片机上的切片厚度4～7μm，然后切片；

7)烤片和脱蜡：将玻片置于65℃恒温烘箱中烤片30min，置于二甲苯Ⅰ中浸泡15min，再置于二甲苯Ⅱ中浸泡15min；

8)水化：将脱蜡后的切片经100％，95％，85％，75％酒精分别浸泡5min，自来水冲洗10min；9)抗原修复：采用高压修复，大火加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液至沸腾，将组织切片置于染色架上，放在已沸腾的柠檬酸修复液中，盖锅盖，扣压力阀，达到工作温度(126℃)后开始计时1～2min，切断压力锅电源，稍置数分钟后，用自来水冲淋以冷却，去阀门打开盖，室温放置40min自然冷却，取出玻片，PBS冲洗3次，每次5min；

9)加入GFPA/Iba-1抗体，4℃过夜避光孵育。

10)第二天复温30min，PBS洗3次，5分钟/次；

11)每组分别加入PE标记荧光二抗，37℃培养30min；

12)PBS洗3次，5min/次；

13)在荧光显微镜上观察。

体内实验结果：

水迷宫实验：由图18和19可以看出，LPS模型组小鼠各时间点的潜伏期明显高于对照组，给予药物治疗后，小鼠潜伏期减少。在水迷宫空间探索试验中(图20)，LPS模型组小鼠平台穿越次数明显低于对照组，给予药物治疗后，小鼠平台穿越次数增加。表明药物有助于LPS模型小鼠脑功能的恢复。

ELISA检测：图21显示LPS模型组小鼠脑组织的ROS、IL-6、TNF-α、IL-1β水平明显高于对照组，药物治疗小鼠ROS、IL-6、TNF-α、IL-1β降低。这表明药物有助于LPS模型小鼠脑组织炎症消退、氧化应激水平降低。

GFAP和Iba-1检测小鼠脑组织中的星形胶质细胞和小胶质细胞：图22表明LPS模型组小鼠脑组织海马区的GFAP蛋白表达明显高于对照组，药物治疗小鼠GFAP蛋白表达降低。这表明药物治疗后，LPS模型小鼠脑组织星形胶质细胞激活减弱。LPS模型组小鼠脑组织海马区的Iba-1蛋白表达明显高于对照组，药物治疗小鼠Iba-1蛋白表达降低。这表明药物治疗后，LPS模型小鼠脑组织小胶质细胞激活减弱。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims

1.一种生物碱，其特征在于，具有式(一)或式(二)的结构；

2.一种生物碱，其特征在于，分子式(一)为(1R，4S，5S，6S，8S，9S)-5，8-二羟基-6-甲基-13-氮杂四环[7.7.0.01,13.04,9]十六烷-2-酮；

3.根据权利要求1或2所述的生物碱，其特征在于，所述式(一)化合物具有P2₁2₁2₁空间群，晶胞参数为：

α(°)＝90.00，β(°)＝90.00，γ(°)＝90.00；

所述式(二)化合物具有P2₁空间群，晶胞参数为：

α(°)＝90.00，β(°)＝100.375(5)，γ(°)＝90.00。

4.根据权利要求1或2所述的生物碱，其特征在于，所述式(一)化合物具有包含三个或者更多个2θ(°)选自约9.8、约12.6、约13.9、约14.9、约15.5、约17.0、约18.4和约20.1的处特征峰的X射线粉末衍射图；

所述式(二)化合物具有包含三个或者更多个2θ(°)选自约11.4、约12.9、约15.2、约16.8、约18.3、约19.5和约22.9处的特征峰的X射线粉末衍射图。

5.根据权利要求1或2所述的生物碱，其特征在于，所述式(一)化合物的2θ(°)X射线粉末衍射图见附图16；

所述式(二)化合物的2θ(°)X射线粉末衍射图见图17。

6.具有(1R，4S，5S，6S，8S，9S)-5，8-二羟基-6-甲基-13-氮杂四环[7.7.0.01,13.04,9]十六烷-2-酮的晶体；

或者，具有(1S，4R，5R，6R，8R，9R)-5,8-二羟基-6-甲基-13-氮杂四环[7.7.0.01,13.04,9]十六烷-2-酮的晶体。

7.根据权利要求6所述的晶体，其特征在于，所述的晶体具有P2₁2₁2₁空间群，晶胞参数为：

α(°)＝90.00，β(°)＝90.00，γ(°)＝90.00；

或者，所述晶体具有有P2₁空间群，晶胞参数为：

α(°)＝90.00，β(°)＝100.375(5)，γ(°)＝90.00。

所述晶体具有包含2θ(°)选自约9.8、约12.6、约13.9、约14.9、约15.5、约17.0、约18.4和约20.1的处的X射线粉末衍射图；

或者，所述晶体具有包含2θ(°)选自约11.4、约12.9、约15.2、约16.8、约18.3、约19.5和约22.9处的X射线粉末衍射图。

8.一种生物碱的制备方法，其特征在于，以千层塔植株粉末为提取对象，依次采用有机溶剂提取、大孔树脂吸附分离及溶剂结晶法得到权利要求1-5任一权利要求所述的生物碱或者得到权利要求6-7任一所述的晶体；

所述的大孔树脂为：AB-8；

所述溶剂结晶法中选用的溶剂为甲醇和水体系。

9.一种生物碱的制备方法，其特征在于，以千层塔植株粉末为提取对象，依次采用有机溶剂提取、大孔树脂吸附分离及溶剂结晶法得到权利要求1-5任一权利要求所述的生物碱或者得到权利要求6-7任一所述的晶体；

AB-8为大孔树脂填料，吸附样品的浓度、柱层析流速及柱体积分别为4.30mg/mL，2BV/h和10BV；

溶剂结晶法中选用的溶剂为：以质量比计，甲醇：水＝7：3；

分别得到正方体晶体220mg和六边形苯环状晶体300mg。

10.权利要求1-5任一权利要求所述的生物碱或者权利要求6-7任一所述的晶体用于制备治疗阿尔茨海默症药物的应用。