CN111344301A - 抗体纯化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从羊乳例如山羊乳中纯化异源抗体的方法。本发明包括基于蛋白A的亲和色谱法,以获得纯化的转基因表达的抗体,特别是不含内源性羊抗体的浓缩物。
Description
技术领域
本发明涉及抗体的纯化,特别是在哺乳动物乳例如山羊(goat)乳中转基因表达和分泌的重组单克隆抗体的纯化。
背景技术
抗体长期以来一直用于研究中,并广泛用于诊断中,最近又作为治疗剂或治疗诊断剂。抗体的研究用途主要包括特定抗原的检测,例如如Western印迹、免疫组织化学、流式细胞术等,或者作为替选地,可涉及特定抗原的分离。诊断类似地依赖于抗原的检测,所述抗原例如疾病特异性抗原,包括致病性抗原,还有自身抗原,例如与癌症或自身免疫病相关的抗原。在过去的几十年中,治疗性抗体变得越来越重要。当前市场上有大量治疗性抗体。这些抗体主要用于干扰特定的抗原功能,例如包括抗体的中和作用,但作为替选地可参与调节免疫***,例如诱导或抑制特定的免疫应答。
在2014年,单克隆抗体(mAb)占投放市场的新分子的20%以上。多克隆抗体的生产相对直接,而单克隆抗体的生产,尤其是以满足包括治疗用途在内的当今需求的量的生产,成本更高且劳动强度更高。尽管单克隆抗体通常源自杂交瘤,但大规模生产通常涉及分离抗体编码序列并在异源体系中重组地表达抗体。最直接的抗体生产体系涉及在细菌中克隆抗体编码序列,所述细菌可以是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌的一个优点是它们缺少外膜,从而有助于将产生的抗体分泌到培养基中。在细菌中产生抗体的一个主要缺点是抗体可能错误折叠,以及由于隔离在包涵体中而缺乏溶解性。另一个缺点是细菌通常加工蛋白质,因此特别是加工重组抗体,这与真核生物和细胞完全不同。特别地,抗体是糖基化的蛋白质,并且功能在某种程度上可取决于适当的糖基化(例如,稳定性和动力学、免疫应答等)。因此,缺乏糖基化或例如在细菌中观察到的不同糖基化模式可有害地影响抗体功能。因此,在真核***中产生抗体的优势在于糖基化模式与天然糖基化更为相似。虽然许多不同类型的真核细胞(包括酵母细胞或其他真菌细胞、原生动物细胞或昆虫细胞)可用于抗体产生;但目前,哺乳动物细胞至少在治疗性抗体生产中是最广泛应用的。
然而,一般而言,抗体是复杂的并且难以产生。其生产成本可为每克100到1000欧元。特别地,例如在体外哺乳动物细胞中大规模抗体生产需要在设备以及消耗品上的大量投资。此外,在生产治疗性抗体中特别重要的是产率和纯度。尽管在人健康方面,较高的成本在某种程度上是可接受的,但是治疗性抗体也可用于动物健康,在这种情况下这种成本可变得无法接受。为了开发用于大型动物的这样的治疗性抗体,有必要将生产成本降低至每克低于50欧元。
近年来,通过产生能够产生重组抗体的转基因动物,出现了抗体生产的替代方法。特别地,重组抗体表达和这种抗体在哺乳动物(例如山羊)的乳中的分泌受到关注。尽管在产生转基因动物方面的投资是可观的,但是一旦获得了转基因动物,抗体的生产成本就会大大降低。然而,抗体的纯化仍然是一个重要的成本。此外,在产率和纯度上仍然存在明显的缺点。
因此,本发明的一个目的是解决这些缺点中的一个或更多个。特别地,本发明的一个目的是提供从哺乳动物乳例如山羊乳中纯化(重组)抗体,特别是治疗性抗体的方法,同时满足市场的调节和经济需求,特别是以最小的成本和/或具有提高的纯度和/或提高的产率。
发明内容
在一方面中,本发明涉及用于分离和/或纯化抗体的方法,其包括:
(a)提供包含异源抗体的羊(caprine)乳清,任选地脱脂羊乳清;
(b)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触;
(c)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离;以及
(d)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体。
在另一方面中,本发明涉及用于分离和/或纯化抗体的方法,其包括:
(a)提供包含异源抗体的羊乳,任选地脱脂羊乳;
(b)从所述乳中去除酪蛋白以获得乳清;
(c)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触;
(d)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离;以及
(e)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体。
在另一方面中,本发明涉及用于分离和/或纯化抗体的方法,其包括:
(a)提供包含异源抗体的羊乳;
(b)对所述乳进行脱脂;
(c)从所述脱脂乳中去除酪蛋白以获得乳清;
(d)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触;
(e)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离;以及
(f)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体。
有利地,本发明的方法可包括用于纯化抗体的色谱法。在某些实施方案中,本发明的方法包括亲和色谱法。在某些实施方案中,该方法包括柱色谱法,例如柱亲和色谱法。在某些实施方案中,该方法包括填充床(柱)色谱法,例如填充床(柱)亲和色谱法。在某些实施方案中,本发明的方法包括连续色谱法,例如连续(填充床柱亲和)色谱法。在某些实施方案中,本发明的方法包括连续填充床(柱)色谱法。
在某些实施方案中,对乳进行脱脂包括从所述乳中去除脂质。在某些实施方案中,对所述乳进行脱脂包括离心。在某些实施方案中,对所述乳进行脱脂包括对所述乳进行加热。在某些实施方案中,对所述乳进行脱脂包括在离心之前对所述乳进行加热。在某些实施方案中,对所述乳进行加热包括将所述乳加热至约30℃至约60℃的温度。已经发现对乳进行加热改善了脂肪去除,同时改善了随后的酪蛋白沉淀。
在某些实施方案中,酪蛋白从所述(脱脂)乳中去除并且包括酪蛋白沉淀。在某些实施方案中,酪蛋白的去除和/或沉淀包括酸沉淀。在某些实施方案中,酪蛋白的去除和/或沉淀包括将pH调节至约3.5至约5.0的pH。在某些实施方案中,通过离心从所述(脱脂)乳或(脱脂)乳清中去除酪蛋白。在某些实施方案中,通过过滤从所述(脱脂)乳或(脱脂)乳清中去除酪蛋白。在某些实施方案中,通过离心和过滤从所述(脱脂)乳或(脱脂)乳清中去除酪蛋白。
在某些实施方案中,对乳进行脱脂是在酪蛋白去除之前进行的。在某些实施方案中,酪蛋白去除在脱脂之前进行。
在某些实施方案中,在使(脱脂)乳或(脱脂)乳清与含有蛋白A的基质接触之前,将乳/乳清和/或含有蛋白A的基质的pH调节至约5.0至8.0的pH。
在某些实施方案中,异源抗体的洗脱包括将pH调节至约3.0至约5.0的pH。在某些实施方案中,异源抗体的洗脱包括将pH调节至约3.0至约4.5的pH。
在某些实施方案中,在洗脱异源抗体之前,将(脱脂)乳或(脱脂)乳清和含有蛋白A的基质的pH调节至约4.5至约5.0的pH。在该pH水平下,已经发现残留的内源性羊抗体可从基质上洗脱下来,因此不会污染随后洗脱的异源抗体。
在某些实施方案中,所述异源抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中,所述异源抗体是重组抗体。在某些实施方案中,所述异源抗体在羊乳中转基因表达。在某些实施方案中,异源抗体不是羊抗体。在某些实施方案中,异源抗体是哺乳动物抗体。在某些实施方案中,异源抗体是鼠抗体、牛抗体、猪抗体、犬抗体、猫抗体、兔抗体、猴抗体、豚鼠抗体、大鼠抗体或马(包括驴和马)抗体。在某些实施方案中,异源抗体是IgG抗体。在某些实施方案中,异源抗体不是IgM或IgA抗体。在某些实施方案中,异源抗体是治疗性抗体。在某些实施方案中,异源抗体用于兽医用途。在某些实施方案中,所述(脱脂)乳或(脱脂)乳清包含内源性羊抗体。
附图说明
图1:乳样品的SDS-PAGE分析。将稀释20倍的10μL样品加载到凝胶上。A.全脂乳。全脂乳主要包含酪蛋白(MW 19kDa至25kDa)、α-乳清蛋白(MW≈18kDa)和β-乳球蛋白(MW≈14Kda)。B.未经Pierce染色的蛋白质分子量标记(Thermo Scientific,Rockford,USA)。C.脱脂乳。脱脂(skimming)过程中去除了一些蛋白质(脂肪蛋白质)。酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白是脱脂乳中的主要蛋白质。D.乳清。从脱脂乳中去除酪蛋白以获得乳清。
图2:乳样品的Western印迹抗狗抗体和SDS-PAGE分析。将稀释4倍的20μL样品加载到凝胶上。表2中示出了样品描述。
图3:pH对山羊乳中异源抗体的影响。将HCl添加至脱脂乳以降低沉淀蛋白质的pH。通过离心去除沉淀的蛋白质。通过ELISA测量上清液中的异源抗体。
图4:pH对山羊乳中总蛋白质含量的影响。将HCl添加至脱脂乳以降低将沉淀蛋白质的pH。通过离心去除沉淀的蛋白质。通过BCA测量上清液中的总蛋白。
图5:pH对山羊乳中总蛋白质含量(右侧条)和异源抗体(左侧条)的影响。将HCl添加至脱脂乳以降低沉淀蛋白质的pH。通过离心去除沉淀的蛋白质。通过BCA测量上清液中的总蛋白。通过ELISA测量上清液中的异源抗体。
图6:通过在脱脂乳中添加硫酸铵进行的酪蛋白沉淀的SDS-PAGE分析。将稀释20倍的10μL上清液加载到凝胶上。孔A.未经Pierce染色的蛋白质分子量标记(ThermoScientific,Rockford,USA)。孔B.脱脂乳。脱脂乳主要包含酪蛋白(MW 19kDa至25kDa)、α-乳清蛋白(MW≈18kDa)和β-乳球蛋白(MW≈14Kda)。孔C:含有20%的硫酸铵的脱脂乳上清液。孔D:含有30%的硫酸铵的脱脂乳上清液。孔E.含有45%的硫酸铵的脱脂乳上清液。孔F.含有60%的硫酸铵的脱脂乳上清液。孔G.含有75%的硫酸铵的脱脂乳上清液。孔H.含有95%的硫酸铵的脱脂乳上清液。
图7:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。示出了级分和级分编号。将样品加载到柱(Praesto,Purolite)上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通(flow through)和洗涤级分中回收。应用pH 6至3的线性梯度,并以15个级分回收洗脱液。
图8:纯化级分的EC分析。从6到11的级分主要包含异源抗体(MW≈150kDa)。
图9:纯化级分的SDS-PAGE(左)和WB分析(右)。将稀释4倍的20μL上清液加载到凝胶上,这是在变性-还原(顶部)、变性(中部)和天然(底部)条件下实现的。孔L.Page RulerPlus预染色梯(Thermo Fischer,Rockland,USA)。孔1.具有异源抗体的在乙酸盐缓冲液中的乳清。孔2.纯化流通和洗涤步骤(Praesto柱,Purolite)。孔3.纯化流通和洗涤步骤(MabSelectSure柱,GE Healthcare)。孔4.洗脱收集物(pool)(Praesto柱,Purolite)。5.洗脱收集物(MabSelectSure柱,GE Healthcare)。孔6.洗脱级分7(Praesto柱,Purolite)。孔7.洗脱级分8(Praesto柱,Purolite)。孔8.洗脱级分6(MabSelectSure柱,GE Healthcare)。孔9,洗脱级分7(MabSelectSure柱,GE Healthcare)。
图10:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将样品加载到柱上,然后用pH6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通和洗涤级分中回收。应用pH 4.8、3.5和3的阶梯梯度。
图11:在两种类型的PA树脂上处理的样品的ELISA结果。在其处理过程中获得的不同样品(即在pH 4.3、pH 6.0下的乳清(有或没有抗体)和在Praesto树脂上纯化期间获得的样品(流通/洗涤、洗脱收集物和主要级分,透析样品)中确定山羊IgG(A)和异源抗体(B)的浓度。
图12:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及电导率分别由如所指示的线表示。标记了级分和级分编号。将山羊乳清样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱,然后用含有500mM NaCl的平衡缓冲液洗涤。将未结合到柱上的蛋白质从流通(FT)和洗涤级分中回收。应用pH 4.7和3的阶梯梯度,以分别洗脱山羊抗体和异源抗体。
图13:纯化级分的SDS-PAGE分析。孔A.2μL加载的样品。山羊乳清主要包含α-乳清蛋白(MW≈18kDa)和β-乳球蛋白(MW≈14Kda)、山羊抗体和异源抗体。孔B.2μL主要包含α-乳清蛋白和β-乳球蛋白的通过流(FT,flow through)。孔C.10μL的未经Pierce染色的蛋白分子量标记(Thermo Scientific,Rockford,USA)。孔D,10μL包含山羊抗体的级分n°19;孔E,10μL包含山羊抗体的收集级分n°19至32;孔E,5μL包含纯化的异源抗体的级分n°43;孔F,5μL包含纯化的异源抗体的级分n°44;孔G,5μL包含纯化的异源抗体的级分n°45;孔H,5μL包含纯化的异源抗体的级分n°46;孔I,5μL包含纯化的异源抗体的级分n°47;孔J,5μL包含纯化的异源抗体的级分n°48;孔K,5μL包含纯化的异源抗体的级分n°49;孔L,5μL包含纯化的异源抗体的级分n°50。
图14:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及电导率分别由如所指示的线表示。还指示了洗脱缓冲液的应用。标记了级分和级分编号。将山羊乳清样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱,然后用含有500mM NaCl的平衡缓冲液洗涤。将未结合到柱的蛋白质从流通(FT)和洗涤级分中回收。应用pH 4.7和3的阶梯梯度,以分别洗脱山羊抗体和异源抗体。
图15:处理样品的ELISA结果。在对照与具有0.1g/l的异源抗体的乳中示出了异源抗体(A)和山羊IgG(B)的回收率。将pH为4.3的乳清分成两部分,将第一部分调整为pH 4.7,第二部分调整为pH 6.0,以均进行纯化,即用在pH 4.7或pH 6.0下的样品加载。对照:左侧条;异源抗体:右侧条。
图16:处理样品的SDS-PAGE/WB结果。示出了从对照(A)和(B)具有抗体的乳中获得的处理样品的天然SDS-PAGE和Western印迹抗异源抗体(B)结果。在每个孔中加载五(5)μg的蛋白质。
图17:处理样品的总蛋白质含量结果。对从对照样品(左侧条)和具有抗体的乳样品(右侧条)二者中获得的所有经处理样品均进行了BCA测定。对应于处理的样品是全脂乳、脱脂乳、pH 4.3的乳清、调节至pH 4.7和pH 6.0的乳清以及相应的纯化级分-流通和洗涤、峰pH 4.7(或在pH 4.7下用于纯化的洗涤的结束),以及在pH 3.0处的峰。还测试了酸沉淀和纯化前pH调节二者之后的沉淀洗涤液。
图18:ELISA结果-纯化优化。测试了不同的平衡缓冲液以确定最佳缓冲液。图中示出了从流通中得到的异源抗体浓度和3种洗脱液(pH 4.8、3.5和3.0)。
图19:ELISA结果-纯化优化。测试了不同的洗脱缓冲液以确定最佳缓冲液。图中示出了从流通中得到的异源抗体浓度和2种洗脱液(pH 4.8和3.5或3.0)。进行山羊IgG/异源抗体的比以鉴定观察到最佳分离的条件。甘氨酸缓冲液:左侧条;乙酸盐缓冲液:中间条;柠檬酸盐缓冲液:右侧条。
图20:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及电导率分别由如所指示的线表示。将羊乳清样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱,然后用含有500mM NaCl的平衡缓冲液洗涤。将未结合到柱的蛋白质从流通(FT)和洗涤级分中回收。应用pH 4.7和3的阶梯梯度。
图21:用于纯化级分的SDS-PAGE分析。孔A.2μL加载样品。绵羊乳清主要包含α-乳清蛋白(MW≈18kDa)和β-乳球蛋白(MW≈14Kda)、绵羊抗体和异源抗体。孔B.10μL未经Pierce染色的蛋白质分子量标记(Thermo Scientific,Rockford,USA)。孔C.2μL主要包含α-乳清蛋白和β-乳球蛋白的通过流;孔D.10μL包含绵羊抗体的级分n°19;孔E.10μL包含绵羊抗体的收集级分n°19至32;孔E.5μL包含纯化的异源抗体的级分n°43;孔F.5μL包含纯化的异源抗体的级分n°44;孔G.5μL包含纯化的异源抗体的级分n°45;孔H.5μL包含纯化的异源抗体的级分n°46;孔I.5μL包含纯化的异源抗体的级分n°47;孔J.5μL包含纯化的异源抗体的级分n°48;孔K.5μL包含纯化的异源抗体的级分n°49;孔L.5μL包含纯化的异源抗体的级分n°50。
图22:处理样品的ELISA结果。示出了4种条件下的异源抗体浓度,即以具有0g/l异源抗体(对照,右侧条)、1g/l、2g/l或3g/l异源抗体(分别为第1至第3个条)的乳开始。用缓冲液洗涤获得的沉淀以得到残留的异源抗体。
图23:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及电导率分别由如所指示的线表示。还指示了洗脱缓冲液的应用。标记了级分和级分编号。将山羊乳清样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱,然后用含有500mM NaCl的平衡缓冲液洗涤。将未结合到柱的蛋白质从流通(FT)和洗涤级分中回收。应用pH 4.7和3的阶梯梯度,以分别洗脱山羊抗体和鼠抗体。
图24:处理样品的ELISA结果。在对照(左侧条)与(右侧条)具有抗体(即具有0.1g/l异源抗体)的乳中示出了山羊IgG(A)和鼠抗体(B)的回收率。将pH 4.3的乳清分成两部分,将第一部分调节为pH 4.7,第二部分调节为pH 6.0,以进行两种纯化,即用在pH 4.7或pH6.0下的样品加载。
图25:处理样品的总蛋白质含量结果。对从对照(左侧条)和(右侧条)具有抗体的乳样品二者中获得的所有处理样品均进行了BCA测定。对应于处理的样品是全脂乳、脱脂乳、pH 4.3的乳清、调节至pH 4.7和pH 6.0的乳清以及相应的纯化级分-流通和洗涤、峰pH4.7(或在pH 4.7下用于纯化的洗涤的结束),以及在pH 3.0处的峰。
图26:处理样品的SDS-PAGE结果。示出了从具有抗体的乳中获得的处理样品的天然SDS-PAGE结果。在每个孔中加载五(5)μg的蛋白质。
图27:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及电导率分别由如所指示的线表示。将山羊乳清样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通(FT)和洗涤级分中回收。在pH 4.7和3下进行洗脱以洗脱抗体。
图28:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及电导率分别由如所指示的线表示。级分和级分编号以红色标记。将山羊乳清样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通(FT)和洗涤级分中回收。在pH 4.7和3下进行洗脱以洗脱抗体。
图29:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及电导率分别由如所指示的线表示。将山羊乳清样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱,然后用含有100mM NaCl的平衡缓冲液洗涤。将未结合到柱的蛋白质从流通(FT)和洗涤级分中回收。在pH 3下进行洗脱以洗脱山羊抗体。
图30:在乳处理的不同步骤中山羊IgG回收率的比较。
图31:SDS-PAGE分析(还原的条件)。表8中报告了所加载样品的描述。
图32:通过使用Praesto AP Minichrom树脂的亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将包含异源抗体n°1的样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通和洗涤级分中回收。应用pH 4.7和3的阶梯梯度,以分别收获山羊IgG(峰保留体积=95ml)和异源抗体n°1(峰保留体积=121ml)。
图33:通过使用Praesto AP Minichrom树脂的亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将包含异源抗体n°2的样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通和洗涤级分中回收。应用pH 4.7和3的阶梯梯度,以分别收获山羊IgG(峰保留体积=95ml)和异源抗体n°2(保留体积=121ml)。
图34:通过使用Praesto AP Minichrom树脂的亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将没有异源抗体的样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通和洗涤级分中回收。应用pH 4.7和3的阶梯梯度,以分别收获山羊IgG(峰保留体积=99ml)和残留的山羊蛋白质(保留体积=122ml)。
图35:异源抗体纯化的SDS-PAGE分析(顶部)和相应的犬Western印迹分析(底部)(未还原的条件)。表9中报告了所加载样品的描述。
图36:通过使用MabSelect PrismA树脂的亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将包含异源抗体的样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通和洗涤级分中回收。应用pH 6至3的线性梯度。山羊IgG的纯化的Western印迹分析报告在图40中。
图37:通过使用MabSelect PrismA树脂的亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将没有异源抗体的样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通和洗涤级分中回收。应用pH 6至3的线性梯度。
图38:通过使用MabSelect PrismA树脂的亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将样品(缓冲液中的异源抗体)加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通和洗涤级分中回收。应用pH 6至3的线性梯度。
图39:通过使用MabSelect PrismA树脂的亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将包含异源抗体的样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通和洗涤级分中回收。应用pH 4.7和3的阶梯梯度。
图40:通过使用MabSelect PrismA树脂的亲和色谱法的纯化的山羊IgG WB分析(非还原的条件)(来自图36和图39的色谱图)。表10中报告了所加载样品的描述。
图41:通过使用MabSelect PrismA树脂的亲和色谱法的纯化的色谱图。将140mg异源抗体加载到5ml柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。应用pH 4.7和3的阶梯梯度。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。
图42:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将缓冲液中的异源抗体加载到柱上,然后用pH4.7的平衡缓冲液洗涤柱。然后,应用pH 4.5、4.3、3.5和3的阶梯梯度。
图43:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将包含异源抗体的样品加载到柱上,然后用pH 4.3的平衡缓冲液洗涤柱。在pH 3.5下进行洗脱。
图44:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将包含异源抗体的样品加载到柱上,然后用pH 4.5的平衡缓冲液洗涤柱。在pH 3.5下进行洗脱。
图45:通过亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及pH分别由如所指出的线表示。将没有异源抗体的样品加载到柱上,然后用pH 4.5的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通和洗涤级分中回收。应用pH 3.5的阶梯梯度。
图46:异源抗体纯化的SDS-PAGE分析(顶部)和相应的山羊IgG Western印迹分析(底部)(未还原的条件)。表11中报告了所加载样品的描述。
图47:通过使用Praesto AP Minichrom树脂的亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及电导率分别由如所指出的线表示。将包含异源抗体+NaCl的样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通和洗涤级分中回收。应用pH4.7和3的阶梯梯度,以分别收获山羊IgG(峰保留体积=90ml)和异源抗体(峰保留体积=116ml)。
图48:通过使用Praesto AP Minichrom树脂的亲和色谱法的纯化的色谱图。在柱出口处在280nm处的吸光度以及电导率分别由如所指出的线表示。将包含异源抗体(无NaCl)的样品加载到柱上,然后用pH 6的平衡缓冲液洗涤柱。将未结合到柱的蛋白质从流通和洗涤级分中回收。应用pH 4.7和3的阶梯梯度,以分别收获山羊IgG(峰保留体积=90ml)和异源抗体(峰保留体积=115ml)。
具体实施方式
在描述本发明的本***和方法之前,应当理解,本发明不限于所描述的特定***和方法或组合,因为这样的***和方法及组合当然可变化。还应理解,本文中使用的术语不旨在限制,因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
如本文所使用的,除非上下文另外明确地指出,否则没有数量词修饰的名词表示一个/种和更多个/种。
本文中使用的术语“包含”和“由……构成”与“包括”或“含有”同义,并且是包含性的或开放式的,并且不排除另外的、未记载的成员、要素或方法步骤。应当理解的是,本文所使用的术语“包含”和“由……构成”包括术语“由……组成”,以及术语“基本上由……组成”。
端点对数值范围的叙述包括在相应范围内纳入的所有的数字和分数,以及所述的端点。
当涉及例如参数、量、时距(temporal duration)等的可测量值时,本文中使用的术语“约”或“大约”意在涵盖指定值的或相对于指定值的+/-20%或更小、优选+/-10%或更小、更优选+/-5%或更小、并且还更优选+/-1%或更小的变化,并且在此范围内这样的变化适合于在所公开的发明中执行。应理解,修饰语“约”或“大约”所指的值是同样具体地且优选地被公开的它本身。
尽管术语“一个或更多个”或“至少一个”(例如一组成员中的一个或更多个或至少一个)本身是清楚的,但通过进一步例证,该术语尤其涵盖对所述成员中的任意一个,或对所述成员中的任意两个或更多个,例如如所述成员中的任意≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等,并且直至全部所述成员的引用。
本说明书中引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。特别地,本文具体参考的所有参考文献的教导均通过引用并入。
除非另有定义,否则用于公开本发明的所有术语,包括技术和科学术语,均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。通过进一步的指导,包括术语定义以更好地理解本发明的教导。
在以下段落中,将更详细地限定本发明的不同方面。除非明确地指出相反,否则如此限定的每个方面可与任何一个或更多个其他方面组合。特别地,指示为优选或有利的任何特征可与指示为优选或有利的任何其他特征组合。
贯穿本说明书中对“一个实施方案”或“实施方案”的提及意指与所述实施方案相关的所描述的特定特征、结构或性质包含在本发明的至少一个实施方案中。因此,在贯穿本说明书中的多个位置中出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不必都(但可以)涉及同一实施方案。此外,在一个或更多个实施方案中,如对于本领域技术人员通过本公开内容变得明显的,特定特征、结构或性质可以以任何合适的方式组合。此外,尽管本文中所述的一些实施方案包含一些特征但不包含包含在另一些实施方案中的其他特征,但如本领域技术人员会理解的,不同实施方案的特征的组合意在处于本发明的范围之内,并且形成不同的实施方案。例如,在所附权利要求书中,任何要求保护的实施方案都可以以任意组合使用。
在本发明的以下详细描述中,对附图进行参考形成本发明的一部分,并且其中仅通过图示示出了可实践本发明的一些特定实施方案。应当理解,在不脱离本发明的范围的情况下,可利用其他实施方案,并且可进行结构或逻辑上的改变。因此,以下详细描述不应被视为限制性的,并且本发明的范围由所附权利要求书限定。
本发明的一些优选陈述(特征)和实施方案在下文中设定。除非清楚地指出相反,否则如此限定的本发明的每个陈述和实施方案可与任何其他陈述和/或实施方案组合。特别地,可将指示为优选或有利的任何特征与指示为优选或有利的任何其他特征或陈述组合。至此,本发明特别地由以下经编号方面和实施方案1至15中的一个或更多个以下的任何一个或任何组合以及任何其他陈述和/或实施方案来体现(capture)。
1.纯化抗体的方法,其包括:
(a)提供包含异源抗体的羊乳清,任选地脱脂羊乳清;
(b)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触;
(c)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离;以及
(d)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体。
2.根据陈述1所述的方法,其包括:
(a)提供包含异源抗体的羊乳,任选地脱脂羊乳;
(b)从所述乳中去除酪蛋白以获得乳清;
(c)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触;
(d)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离;以及
(e)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体。
3.根据陈述1或2所述的方法,其包括:
(a)提供包含异源抗体的羊乳;
(b)对所述乳进行脱脂;
(c)从所述脱脂乳中去除酪蛋白以获得乳清;
(d)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触;
(e)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离;以及
(f)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体。
4.根据陈述1至3中任一项所述的方法,其还包括在洗脱所述异源抗体之前,优选在4.5至5.0的pH下洗脱内源性羊抗体的步骤。
5.根据陈述1至4中任一项所述的方法,其中所述方法包括色谱法,优选填充床(柱)色谱法。
6.根据陈述1至5中任一项所述的方法,其中在与所述乳清孵育之前,所述蛋白A固体基质和/或所述乳清被平衡至pH为5至8,优选6至7。
7.根据陈述1至6中任一项所述的方法,其中洗脱所述异源抗体包括将pH调节至3至5,优选3.5至4.5的pH。
8.根据陈述1至7中任一项所述的方法,其中所述异源抗体不是羊抗体。
9.根据陈述1至8中任一项所述的方法,其中所述异源抗体是用于兽医用途的抗体。
10.根据陈述1至9中任一项所述的方法,其中所述异源抗体是鼠抗体、牛抗体、猪抗体、犬抗体、猫抗体或马抗体。
11.根据陈述1至10中任一项所述的方法,其中所述异源抗体是IgG抗体。
12.根据陈述1至11中任一项所述的方法,其中所述异源抗体是单克隆抗体。
13.根据陈述1至12中任一项所述的方法,其中所述乳清包含天然内源性羊抗体。
14.根据陈述2至13中任一项所述的方法,其中去除酪蛋白包括将pH调节至3.5至5.0,优选4.0至4.5,更优选4.3的pH,随后优选通过过滤和/或离心去除沉淀的酪蛋白。
15.根据陈述3至14中任一项所述的方法,其中对所述乳进行脱脂包括将所述乳加热至30至60℃,优选地45至55℃的温度,随后优选地通过离心去除脂肪。
16.根据陈述1至15中任一项所述的方法,其中在洗脱所述异源抗体之前,内源性羊抗体被洗脱。
17.根据陈述16所述的方法,其中所述内源性羊抗体在高于用于洗脱所述异源抗体的pH的pH下洗脱。
18.根据陈述16或17所述的方法,其中所述内源性羊抗体在比用于洗脱所述异源抗体的pH高至少0.1,优选至少0.3,更优选至少0.5,最优选至少1的pH下洗脱。
19.根据陈述16至18中任一项所述的方法,其中所述内源性羊抗体在高于或等于4.0,优选高于或等于4.3,更优选高于或等于4.5的pH下洗脱。
20.根据陈述16至19中任一项所述的方法,其中所述内源性羊抗体在4.0至5.0,优选4.3至5.0,更优选4.5至5.0的pH下洗脱。
21.根据陈述16至20中任一项所述的方法,其中所述异源抗体在低于或等于4.5,优选低于或等于4.3,更优选高于或等于4.0的pH下洗脱。
22.根据陈述16至21中任一项所述的方法,其中所述异源抗体在4.5至2.0,优选4.3至2.0,更优选4.0至2.0的pH下洗脱。
23.根据陈述16至23中任一项所述的方法,其中所述内源性羊抗体在4.0至5.0,优选4.3至5.0,更优选4.5至5.0的pH下洗脱;其中所述异源抗体在4.5至2.0,优选4.3至2.0,更优选4.0至2.0的pH下洗脱;并且其中所述内源性羊抗体在比用于洗脱所述异源抗体的pH高至少0.1,优选至少0.3,更优选至少0.5,最优选至少1的pH下洗脱。
24.根据陈述16至23中任一项所述的方法,其中所述内源性羊抗体在4.0至5.0的pH下洗脱;其中所述异源抗体在4.0至2.0的pH下洗脱。
25.根据陈述16至23中任一项所述的方法,其中所述内源性羊抗体在4.3至5.0的pH下洗脱;其中所述异源抗体在4.3至2.0的pH下洗脱。
26.根据陈述16至23中任一项所述的方法,其中所述内源性羊抗体在4.5至5.0的pH下洗脱;其中所述异源抗体在4.5至2.0的pH下洗脱。
根据本发明的方法旨在从(脱脂)羊乳或乳清中分离和/或纯化抗体。本发明的方法导致抗体的浓缩和/或抗体与乳或乳清的其他成分的分离。在某些实施方案中,本发明的方法产生具有蛋白质含量的组合物,其中至少80wt%的蛋白质由抗体,特别是异源抗体组成。优选地,至少90wt%的蛋白质由抗体,特别是异源抗体组成。更优选地,至少95wt%的蛋白质由抗体,特别是异源抗体组成。甚至更优选地,至少98wt%的蛋白质由抗体,特别是异源抗体组成。最优选地,至少99wt%的蛋白质由抗体,特别是异源抗体组成,例如99.1wt%、99.2wt%、99.3wt%、99.4wt%、99.5wt%、99.6wt%、99.7wt%、99.8wt%、99.9wt%或更多wt%,优选至少99.5wt%,更优选至少99.9wt%。在某些实施方案中,本发明的方法产生组合物,其中至少80wt%的非水性成分或干物质由抗体,特别是异源抗体组成。优选地,至少90wt%的非水性成分由抗体,特别是异源抗体组成。更优选地,至少95wt%的非水性成分由抗体,特别是异源抗体组成。甚至更优选地,至少98wt%的非水性成分由抗体,特别是异源抗体组成,例如98.5wt%、99.0wt%、99.5wt%或更多wt%。
如本文中所用,术语“乳清”具有其在本领域中的普通含义。通过进一步的指导但不限于此,可通过凝乳(curdling milk)和随后的粗滤(straining)、过滤或离心来获得乳清。本质上,凝结可使得凝聚(coagulating)或沉淀酪蛋白。或者,可通过超滤获得乳清,由此去除酪蛋白,特别是酪蛋白胶束。去除(凝聚或沉淀的)酪蛋白会产生乳清。凝结可涉及向乳添加凝乳酶(rennet)(或等同的酶混合物)。或者,凝结可涉及向乳添加酸。应该理解的是,优选在乳清中基本上所有酪蛋白都被去除。在某些实施方案中,少于10wt%的酪蛋白保留在乳清中。优选小于5wt%的酪蛋白保留在乳清中(基于乳清的总重量或基于酪蛋白的总初始重量)。更优选地,少于3wt%的酪蛋白保留在乳清中。最优选地,少于1wt%的酪蛋白保留在乳清中。应该理解的是,在凝结期间或凝结之后,乳中的某些其他成分可同样地被去除。例如,一定百分比的乳脂可被留在凝乳中,并因此与沉淀的或凝聚的酪蛋白一起被去除。类似地,酪蛋白以外的一定百分比的蛋白质可类似地沉淀或凝聚,并因此与沉淀的或凝聚的酪蛋白一起去除。
在某些实施方案中,通过凝聚、聚集或沉淀然后粗滤、离心或过滤从(脱脂)乳中去除酪蛋白。在某些实施方案中,通过凝结或乳凝结(curding)然后粗滤、离心或过滤,从(脱脂)乳中去除酪蛋白。在某些实施方案中,酪蛋白的去除包括酸性酪蛋白的凝聚、沉淀或聚集。出乎意料地发现,与酪蛋白沉淀和去除的其他方法,例如硫酸铵沉淀的钙沉淀相比,酸沉淀在最终纯度和/或产率方面产生优异的结果。在某些实施方案中,通过调节pH,优选调节至约3.5至约5.0(例如3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0)的pH,而聚集、凝聚或沉淀酪蛋白。在某些实施方案中,通过调节pH,优选调节至约3.7至约4.8的pH而聚集、凝聚或沉淀酪蛋白。在某些实施方案中,通过调节pH,优选调节至约3.9至约4.6的pH而聚集、凝聚或沉淀酪蛋白。在某些实施方案中,通过调节pH,优选调节至约4.1至约4.4的pH而聚集、凝聚或沉淀酪蛋白。在某些实施方案中,通过调节pH,优选调节至约4.3的pH而聚集、凝聚或沉淀酪蛋白。pH的调节可用任何酸进行,例如但不限于柠檬酸、HCl、乙酸、硫酸、硝酸、碳酸、琥珀酸、癸酸、丙酸、丙酮酸。或者,也可使用凝乳酶。可通过立即添加所需量的酸来调节pH。或者,可通过逐渐添加酸来调节pH。调节pH后,在某些实施方案中,将酸化的(脱脂)乳或乳清立即处理(即酪蛋白去除)。或者,在调节pH后,在某些实施方案中,将酸化的(脱脂)乳或乳清孵育至少约3分钟,例如至少4、5、6、7、8、9或10分钟的时间。调节pH后,在某些实施方案中,将酸化的(脱脂)乳或乳清孵育至少约3分钟,例如约3分钟至约120分钟的时间。调节pH后,在某些实施方案中,将酸化的(脱脂)乳或乳清孵育约3分钟至约60分钟的时间。调节pH后,在某些实施方案中,将酸化的(脱脂)乳或乳清孵育约3分钟至约30分钟的时间,例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30分钟的时间。调节pH后,在某些实施方案中,将酸化的(脱脂)乳或乳清孵育约5分钟至约20分钟的时间。调节pH后,在某些实施方案中,将酸化的(脱脂)乳或乳清孵育约10分钟至约20分钟的时间。调节pH后,在某些实施方案中,将酸化的(脱脂)乳或乳清孵育约15分钟的时间。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约20℃至约55℃,例如约20℃至约50℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约20℃至约50℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约20℃至约45℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约20℃至约40℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约20℃至约35℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约20℃至约30℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约25℃至约60℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约25℃至约55℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约25℃至约50℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约25℃至约45℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约25℃至约40℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约25℃至约35℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约25℃至约30℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约30℃至约60℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约30℃至约55℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约30℃至约50℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约30℃至约45℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约30℃至约40℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约30℃至约35℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约35℃至约60℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约35℃至约55℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约35℃至约50℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约35℃至约45℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约35℃至约40℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约40℃至约60℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约40℃至约55℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约40℃至约50℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约40℃至约45℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约45℃至约60℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约45℃至约55℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约45℃至约50℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约50℃至约60℃的温度下。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在约50℃至约55℃的温度下。优选地,在30℃至60℃或30℃至55℃或30℃至50℃的温度下进行乳/乳清的脱脂。在某些实施方案中,在该孵育期间,将温度维持在与脱脂期间的温度相同的温度下。在某些实施方案中,将温度维持在室温下。
在某些实施方案中,可通过粗滤、离心或过滤去除沉淀的、聚集的或凝聚的酪蛋白。酪蛋白的去除基本上可按照乳品行业的惯例进行。在某些实施方案中,沉淀的、聚集的或凝聚的酪蛋白通过离心去除。例如但不限于,可将包含沉淀的、凝聚的或聚集的酪蛋白的(脱脂)乳或乳清在约3000至15000g,例如约5000至13000g,例如约7000g或10000g下离心。在某些实施方案中,可将包含沉淀的、凝聚的或聚集的酪蛋白的(脱脂)乳或乳清离心5至30分钟的时间,例如10至20分钟,例如15分钟的时间。在某些实施方案中,沉淀的、聚集的或凝聚的酪蛋白通过过滤去除。可使用任何类型的过滤手段,包括真空过滤、错流过滤(crossflow filtration)、切向流过滤(tangential flow filtration)、颗粒床过滤、压力过滤、重力过滤、微滤、超滤等。优选的过滤包括压力过滤。应当理解,过滤膜或介质的孔径适合于将沉淀的、聚集的或凝聚的酪蛋白与滤液,即(脱脂)乳清分离。例如但不限于,过滤膜或介质的孔径可为约0.1至约5μm,例如约0.2至约4μm,约0.3至约3μm,约0.3至约2μm,约0.3至约1μm,约0.2至约0.9μm,约0.3至约0.8μm,约0.3至约0.7μm,约0.3至约0.6μm,约0.4至约0.5μm。过滤膜或介质的孔径可为约0.45μm。在某些实施方案中,包括两个单独的过滤步骤,例如如,第一过滤步骤,借助于具有较大孔径(例如1至3μm)的滤器,以及第二过滤步骤,借助于具有较小孔径的滤器(例如,0.1至1μm)。
在某些实施方案中,在粗滤、过滤或离心期间去除酪蛋白的温度可与先前的酸孵育期间的温度相同(即,升高的温度,如其他地方所述)。或者,可降低在粗滤、过滤或离心期间去除酪蛋白的温度,例如降低至室温,例如如10至30℃,例如15至25℃。
如本文中所用,术语“脱脂”具有本领域中的普通含义。通过进一步的指导但不限于此,对乳进行脱脂实质上涉及从乳或乳清中去除脂肪。因此,脱脂乳就是脱脂肪的乳(defatted milk)。同样,脱脂乳清是脱脂肪的乳清。在某些实施方案中,脱脂乳或乳清可通过离心或过滤(例如微滤)获得,其结果是脂肪与其余的乳成分分离。如本领域中已知的,脱脂乳或乳清可在分离器或脱乳脂器(decreamer)中获得。脱脂基本上可按照乳制品行业的惯例进行。例如但不限于,可将乳或乳清在3000至10000g,例如5000至9000g,例如约7000g下离心。在某些实施方案中,可将乳或乳清离心5至20分钟的时间,例如10至20分钟,例如10分钟的时间。在本发明的某些实施方案中,在去除酪蛋白之前对乳进行脱脂。在某些实施方案中,在去除酪蛋白之后对乳进行脱脂。在某些实施方案中,本发明的方法不涉及对乳或乳清进行脱脂,即在本发明的方法中使用非脱脂或非脱脂肪的乳或乳清。应该理解,优选地,在脱脂乳或乳清中基本上所有的脂肪都被去除。在某些实施方案中,少于10wt%的脂肪保留在脱脂乳或乳清中(基于脱脂后的乳或乳清的总重量或基于脂肪的总初始重量)。优选地,少于5wt%的脂肪保留在脱脂乳或乳清中。更优选地,少于3wt%的脂肪保留在脱脂乳或乳清中。最优选地,少于1wt%,优选少于0.8wt%,例如少于0.6wt%的脂肪保留在脱脂乳或乳清中。应当理解,在脱脂期间或脱脂后,乳中的某些其他成分也可同样地去除。例如,在脱脂期间或脱脂后,可去除一定百分比的乳蛋白或糖,或某些脂溶性成分。在某些实施方案中,脱脂等同于脱脂肪或脱乳脂或者基本上脱脂肪或脱乳脂。优选地,与未处理的羊乳相比,脱脂之前或脱脂期间的乳的pH不变。在某些实施方案中,脱脂之前和/或脱脂期间的乳的pH为6.0至7.0,例如6.3至6.7或6.4至6.8。
在某些实施方案中,在升高的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约20℃至约65℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约20℃至约60℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约20℃至约55℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约20℃至约50℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约20℃至约45℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约20℃至约40℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约20℃至约35℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约20℃至约30℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约25℃至约65℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约25℃至约60℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约25℃至约55℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约25℃至约50℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约25℃至约45℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约25℃至约40℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约25℃至约35℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约25℃至约30℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约30℃至约65℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约30℃至约60℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约30℃至约55℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约30℃至约50℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约30℃至约45℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约30℃至约40℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约30℃至约35℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约35℃至约65℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约35℃至约60℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约35℃至约55℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约35℃至约50℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约35℃至约45℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约35℃至约40℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约40℃至约65℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约40℃至约60℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约40℃至约55℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约40℃至约50℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约40℃至约45℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约45℃至约65℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约45℃至约60℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约45℃至约55℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约45℃至约50℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约50℃至约65℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约50℃至约60℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。在某些实施方案中,在约50℃至约55℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。优选地,在20℃至65℃或30℃至60℃或30℃至55℃或30℃至50℃的温度下对乳/乳清进行脱脂。
在某些实施方案中,在离心之后并且在去除脂肪之前将乳冷却,以帮助固化脂肪并因此帮助去除脂肪层。
在某些实施方案中,在脱脂或去除酪蛋白之前储存羊乳或乳清。储存可包括约数小时至约数天或数周的储存。在某些实施方案中,在降低的温度下,例如在低于室温的温度,例如约-40℃至约15℃的温度,例如约-30℃至约-10℃的温度或者约1℃至约10℃的温度下储存。例如,可将羊乳或乳清冷冻(例如,-40℃至-10℃)长至6个月,例如长至5、4、3、2、1个月或更短。例如,可将羊乳或乳清冷藏(例如1℃至10℃)长至2周,例如长至1周或更短。在脱脂或去除酪蛋白之前,可将乳/乳清的温度调节至合适的温度,如本文其他地方所述。
如本文中所用,“羊”涉及牛科羊亚科的成员。举例来说,羊亚科包括羊牛族(Ovibovini)、羊族(Caprini)和羊羚族(Naemorhedini),羊牛族包括:羚牛属(Budocras),其包括羚牛(Takin/Budorcas taxicolor);以及麝牛属(Ovibos),其包括麝牛(Muskox/Ovibos moschatus);羊族包括:蛮羊属(Ammotragus),其包括巴贝里绵羊(Barbary sheep/Ammotragus lervia);***塔尔羊属(Arabitragus),其包括***塔尔羊(Arab tahr/Arabitragus jayakari);山羊属(Capra),其包括西高加索山羊(West Caucasian tur/Capra caucasica)、东高加索山羊(East Caucasian tur/Capra caucasicacylindricoris)、捻角山羊(Markhor/Capra falconeri)、野山羊(Wild goat/Capraaegagrus)、山羊(Domestic goat/Capra aegagrus hircus)、羱羊(Alpine ibex/Capraibex)、努比亚羱羊(Nubian ibex/Capra nubiana)、西班牙羱羊(Spanish ibex/Caprapyrenaica)、西伯利亚羱羊(Siberian ibex/Capra sibirica)、瓦利亚羱羊(Walia ibex/Capra walie);塔尔羊属(Hemitragus),其包括喜马拉雅塔尔羊(Himalayan tahr/Hemitragus jemlahicus);羊属(Ovis),其包括盘羊(Argali/Ovis ammon)、家绵羊(Domestic sheep/Ovis aries)、美洲大角羊(American bighorn sheep/OvisCanadensis)、白大角羊(Dall or thinhorn sheep/Ovis dalli)、欧洲摩弗仑羊(Europeanmouflon/Ovis musimon)、雪山盘羊(Snow sheep/Ovis nivicola)、野绵羊(Wild sheep/Ovis orientalis)、摩弗仑羊(Mouflon/Ovis orientalis orientalis)、东方盘羊(UraI/Ovis orientalis vignei);尼尔吉里塔尔羊属(Nilgiritragus),其包括尼尔吉里塔尔羊(Nilgiri tahr/Nilgiritragus hylocrius);岩羊属(Pseudois),其包括岩羊(Bharal orHimalayan blue sheep/Pseudois nayaur)、矮岩羊(Dwarf blue sheep/Pseudoisschaeferi);羊羚族包括:髭羚属(Capricornis),其包括日本髭羚(Japanese serow/Capricornis crispus)、苏门答腊髭羚(Sumatran serow/Capricomis sumatraensis)、台湾髭羚(Taiwan serow/Capricornis swinhoei)、中国髭羚(Chinese serow/Capricomismilneedwardsii)、赤髭羚(Red serow/Capricomis rubidus)、喜马拉雅髭羚(Himalayanserow/Capricornis thar);斑羚属(Nemorhaedus),其包括赤斑羚(Red goral/Nemorhaedus baileyi)、中国斑羚(Chinese goral/Nemorhaedus griseus)、灰斑羚(Graygoral/Nemorhaedus goral)、长尾斑羚(Long-tailed goral/Naemorhedus caudatus);雪羊属(Oreamnos),其包括雪羊(Mountain goat/Oreamnos americanus);臆羚属(Rupicapra),其包括比利牛斯臆羚(Pyrenean chamois/Rupicapra pyrenaica)、岩羚羊(Chamois/Rupicapra rupicapra)。在某些实施方案中,(脱脂)羊乳或乳清来源于上述族、属或种中的任何一种。在一个优选的实施方案中,(脱脂)羊乳或乳清来源于羊族。在一个更优选的实施方案中,(脱脂)羊乳或乳清来源于山羊属或羊属,优选山羊属,更优选山羊(Capra aegarus(hircus))或家绵羊,优选山羊(Capra aegarus hircus)。因此,在一个优选的实施方案中,(脱脂)羊乳或乳清是(脱脂)山羊乳或乳清。
如本文中所用,术语“抗体”具有其在本领域中的普通含义。通过进一步的指导但不限于此,抗体通常包含在免疫球蛋白中。本文所述的抗体可以是全长抗体或其功能片段,例如Fab、融合蛋白或多聚体蛋白。因此,本文中所用的术语抗体涵盖全长抗体以及抗体片段,特别是功能性抗体片段二者。功能性抗体片段可以是能够结合抗原,特别是针对其产生抗体的抗原的抗体片段。根据本发明,抗体或抗体片段必须能够与蛋白A结合,或者作为替选地,抗体或抗体片段可与能够与蛋白A结合的实体融合。在此使用的术语抗体包括但不限于常规抗体、嵌合抗体、dAb、双特异性抗体、三特异性抗体、多特异性抗体、二价抗体、三价抗体、多价抗体、VHH、纳米抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2scFv、Fv、dAb、Fd、双抗体、三抗体、单链抗体、单结构域抗体、单抗体可变结构域。在本上下文中,术语抗体用于描述天然或者部分或全部工程化的免疫球蛋白。由于抗体可以多种方式修饰,因此术语“抗体”应解释为涵盖任何特异性结合分子或具有对分子对其他成员(即靶分子)具有所需结合特异性的结合结构域的物质,如上定义。因此,该术语涵盖抗体的抗体片段、衍生物、功能等同物和同源物,以及单链抗体、双功能抗体、二价抗体、VHH、纳米抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dAb、Fd、双抗体、三抗体和骆驼科动物抗体,包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽,无论是天然的还是全部或部分工程化的。因此,与另一种多肽融合的包含免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子包括在内。该术语还涵盖具有是抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源的结合结构域的任何多肽或蛋白质,例如抗体模拟物。抗体的实例是免疫球蛋白同种型或类别及其(同种型)亚类,包括IgG(IgG1、IgG2、IgG2(a)、IgG2(b)、IgG3、IgG4)、IgA、IgD、IgM和IgE。因此,本领域技术人员应当理解,本发明还涉及抗体片段,其包含抗原结合结构域,例如VHH、纳米抗体Fab、scFv、Fv、dAb、Fd、双抗体和三抗体。
如本文中所用,术语“异源抗体”是指在羊物种中不天然表达或不天然存在的抗体。因此,异源抗体对于羊物种不是内源的。异源抗体抗体可以是重组或转基因抗体,即重组或转基因表达的抗体。异源抗体可以是嵌合抗体。因此,异源抗体可包含羊序列(例如,包含羊和非羊抗体片段的嵌合抗体),只要它并非完全来源于羊即可。羊抗体或其片段与非羊(蛋白A结合)部分之间的融合蛋白也落入在本文中所述的异源抗体的定义中。可对异源抗体进行密码子优化以在羊物种中表达。可对异源抗体进行工程化以使其在特定物种和/或特定治疗环境中具有最佳功能性(例如,人源化、鼠源化(murinized)等抗体)。该抗体可以是同种型/(亚)类转换的抗体。根据本发明,异源抗体至少部分地能够与蛋白A结合。
在某些实施方案中,(脱脂)羊乳或乳清包含内源或天然抗体,即在羊乳中天然存在和分泌的羊抗体。应当理解,除了异源抗体之外,还存在这样的内源性羊抗体。
在某些实施方案中,异源抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中,一种或更多种不同的(单克隆)异源抗体可存在于(脱脂)羊乳或乳清中。因此,(脱脂)羊乳或乳清可包含不同的(单克隆)抗体的混合物。特别是在哺乳动物中用于转基因或重组表达(单克隆)抗体的方法是本领域已知的(参见例如Moura et al.(2001),Braz Arch Biol Technol,54(5):927-938;Maksimenko et al.(2013)Acta Naturae,5(1):33-46;Pollock et al.(1999),JImmunol Methods 231:147-157;WO 1995/017085)。本质上,为了表达异源蛋白,例如抗体,并在乳中分泌,通过在乳特异性启动子(例如WAP、α-酪蛋白或β-酪蛋白启动子)的控制下引入编码异源蛋白的多核苷酸序列来产生转基因动物。
异源抗体可源自来自任何物种的一种或更多种抗体的一个或更多个片段或者可包含源自任何物种的一种或更多种抗体的一个或更多个片段,只要该抗体(片段)能够与蛋白A结合或与能够与蛋白A结合的部分融合即可。应当理解,技术人员可从与蛋白A适当结合的特定物种中适当选择特定抗体(同种型/(亚)类)。各个抗体的相对结合能力/亲和力是本领域已知的或可常规地进行评估(例如如借助于表面等离激元共振)。应当理解,抗体与蛋白A结合得越强,最终产率将越大。尽管显示出与蛋白A的强结合的抗体是优选的,但是本发明的方法不限于这样的抗体。尽管最终产率可能损失,但是也可使用较弱的结合抗体。如本文中其他地方所述,嵌合抗体的类别转换或产生,或在其他情况下抗体的工程化可产生更强的结合抗体。
在某些实施方案中,异源抗体(片段)是哺乳动物抗体(片段)。在某些实施方案中,异源抗体(片段)选自鼠抗体、牛抗体、猪抗体、犬抗体、猫抗体或马抗体(或片段)。在某些实施方案中,异源抗体(片段)是人抗体(或片段)。如在其他地方所指出的,抗体可以是嵌合抗体(例如,包含来自不同物种或同种型/(亚)类的片段),或者可被工程化以在预期物种中出于预期的治疗目的而具有足够的功能性(包括例如犬源化、猫源化等抗体)。
异源抗体的同种型/(亚)类没有特别的相关性,并且可取决于所需的功能性(例如治疗适应证、靶组织或抗原等)。然而,应理解,抗体必须能够与蛋白A结合,或者作为替选地该抗体与能够与蛋白A结合的部分融合。在某些实施方案中,抗体是IgG。在某些实施方案中,抗体是不同IgG亚类的混合物或可以是IgG亚类的总和。在某些实施方案中,抗体是IgG1。在某些实施方案中,抗体是IgG2(a和/或b)。在某些实施方案中,抗体是IgG3。在某些实施方案中,抗体是IgG4。在某些实施方案中,该抗体是嵌合抗体、类别转换抗体或以其他方式改造的抗体,其包含能够与蛋白A结合的Fc结构域。
在一个优选的实施方案中,异源抗体对蛋白A的亲和力高于(内源)羊抗体,例如乳中存在的(内源)羊抗体,特别是(内源)羊IgG,例如优选IgG1和/或lgG2。如果异源抗体与蛋白A结合的分数比结合羊抗体的分数更高,则异源抗体对蛋白A的亲和力比对羊抗体的亲和力更高(特别是在相同条件下,例如相同的缓冲液和/或相同的pH,例如本文中其他地方所述的加载或平衡缓冲液的pH)。亲和力可例如通过以下方法来估计或确定:使蛋白A基质加载有一定量的抗体(在特定的加载或平衡缓冲液中,并且优选地在蛋白A基质不被抗体饱和的条件下)并检测未结合的抗体(例如在流通或洗涤缓冲液中)的量或分数。作为替选地,例如可通过以下方式来估计或确定亲和力:使蛋白A基质加载有给定量的抗体(在特定的加载或平衡缓冲液中,并且优选地在蛋白A基质不被抗体饱和的条件下)并检测洗脱后结合抗体的量或分数,例如用本文中其他地方所述的洗脱缓冲液(优选在用洗涤缓冲液洗涤基质之后)。在某些实施方案中,异源抗体的更高亲和力由结合的异源抗体的分数表示,该分数比结合的羊抗体(例如,羊IgG,例如优选羊IgG1和/或IgG2)的分数高至少5%(wt%或摩尔%)),优选高至少10%,更优选高至少15%,甚至更优选高至少20%。应当理解,用于确定抗体亲和力的其他技术同样适用,例如如表面等离激元共振。在某些实施方案中,如本领域已知的,亲和力可通过确定KD来确定。对蛋白A的亲和力较高的抗体的KD较低。在某些实施方案中,异源抗体与蛋白A的KD比羊抗体与蛋白A的KD低至少2倍(即,至多为羊抗体的KD的一半),优选低至少5倍(即,至多为羊抗体的KD的20%),更优选低至少10倍(即至多为羊抗体的KD的10%)。应当理解的是,如本文所述对蛋白A具有更高亲和力的异源抗体可如本文其他地方所述进行工程化(例如类别转换或产生嵌合抗体,或以其他方式对抗体进行工程化从而产生更强结合抗体)。
在某些实施方案中,异源抗体是鼠IgG2a、IgG2b或IgG3抗体(或包含鼠IgG2a、IgG2b或IgG3重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。在某些实施方案中,异源抗体是鼠IgM抗体(或包含鼠IgM重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。
在某些实施方案中,异源抗体是牛IgG抗体(或包含牛IgG重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。在某些实施方案中,异源抗体是牛IgG1或IgG2抗体(或包含牛IgG1或IgG2重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。
在某些实施方案中,异源抗体是犬IgG抗体(或包含犬IgG重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。在某些实施方案中,异源抗体是犬IgG1或IgG2抗体(或包含犬IgG1或IgG2重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。
在某些实施方案中,异源抗体是马(包括驴或马)IgG抗体(或包含马IgG重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。在某些实施方案中,异源抗体是马IgG1或IgG2抗体(或包含马IgG1或IgG2重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。
在某些实施方案中,异源抗体是猴(例如恒河猴(rhesus))IgG抗体(或包含猴IgG重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。在某些实施方案中,异源抗体是猴IgG1或IgG2抗体(或包含猴IgG1或IgG2重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。
在某些实施方案中,异源抗体是猪IgG抗体(或包含猪IgG重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。在某些实施方案中,异源抗体是猪IgG1或IgG2抗体(或包含猪IgG1或IgG2重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。
在某些实施方案中,异源抗体是兔IgG抗体(或包含兔IgG重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。在某些实施方案中,异源抗体是兔IgG1或IgG2抗体(或包含兔IgG1或IgG2重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。
在某些实施方案中,异源抗体是大鼠IgG2c抗体(或包含大鼠IgG2c重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。
在某些实施方案中,异源抗体是猫IgG抗体(或包含猫IgG重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。在某些实施方案中,异源抗体是猫IgGl或IgG2抗体(或包含猫IgG1或IgG2重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。
在某些实施方案中,异源抗体是人IgG1、IgG2或IgG4抗体(或包含人IgG1、IgG2或IgG4重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。在某些实施方案中,异源抗体是人IgA抗体(或包含人IgA重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。在某些实施方案中,异源抗体是人IgM抗体(或包含人IgM重链、Fc或CH2/CH3片段的工程化抗体)。
在某些实施方案中,异源抗体是治疗性抗体。在某些实施方案中,该抗体是用于兽医用途的治疗性抗体。应当理解,抗体本身不必是治疗性的,而是可与治疗剂(例如放射性配体、毒素、(前)药物等)或包含这样的药剂的载体(例如脂质体)偶联或缀合。异源抗体可用于免疫治疗,包括激活性免疫治疗(例如癌症的治疗、免疫恢复、疫苗接种等)或抑制性免疫治疗(例如***反应的治疗、诱导免疫耐受、免疫抑制药物的递送等)。
根据本文所述的本发明的方法,使(脱脂)乳清与含有蛋白A的基质或树脂(例如蛋白A偶联的sepharose珠)接触或孵育。在某些实施方案中,对(脱脂)乳清进行色谱法以纯化抗体。在某些实施方案中,本发明的方法包括亲和色谱法。在某些实施方案中,该方法包括柱色谱法,例如柱亲和色谱法。在某些实施方案中,所述方法包括填充床或膨胀床(柱)色谱法(优选填充床),例如填充/膨胀床(柱)亲和色谱法。在某些实施方案中,本发明的方法包括连续或批色谱法,例如连续/批(填充/膨胀床柱亲和)色谱法。在某些实施方案中,本发明的方法包括连续/批填充/膨胀床(柱)色谱法。连续色谱法是本领域已知的,并且包括例如PCC(周期逆流(Periodic Counter Current))、MCC(多柱连续色谱)或SMB(模拟移动床)。通常,这些连续色谱法方法包括使用多个柱(2、3、4、8个或更多个),这些柱可交替加载、洗涤、洗脱、再生。柱色谱法主要涉及提供填充有固定相的柱(即床),在当前情况下是含有蛋白A的基质或树脂。柱(特别是床)可具有任何合适的大小、高度或尺寸(例如,床高度为10cm的柱),这取决于纯化体系的规模。包含固定相的柱通常加载有流动相,在这种情况下为(脱脂)乳清。根据本发明,抗体被保留在固定相上,并且可被洗脱。在某些实施方案中,色谱法是或包括HPLC(高效液相色谱法)。在HPLC中,在压力下促使流动相通过固定相。作为替选地,流动相可通过重力或通过施加真空而渗透通过固定相。如前所指出的,抗体被保留在固定相上,而乳清作为耗竭抗体的乳清流过并离开固定相。因此,色谱法有效地将抗体与乳清分离。(抗体耗竭的)乳清从含有蛋白A的基质或树脂中作为通过流而分离出。
乳清与含有蛋白A的基质或树脂接触的时间可改变,并且可例如取决于柱或柱床的尺寸以及乳清流过柱或床的速度(其可例如根据色谱法是基于重力还是基于施加压力而变化)。或者,在不进行柱色谱法的情况下,可将含有蛋白A的基质或树脂与乳清孵育固定的时间段,然后将乳清与含有蛋白A的基质或柱分离(例如,通过离心或过滤)。
如本文中所用,“蛋白A”是指最初在细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的细胞壁中发现的42kDa的表面蛋白。它由spa基因编码。蛋白A具有结合免疫球蛋白的能力。它由折叠成三螺旋束的五个同源Ig结合结构域构成。每个结构域都能够结合来自许多哺乳动物种类的蛋白质,最著名的是IgG。它结合大多数免疫球蛋白的Fc区内的重链以及在人VH3家族的情况下结合Fab区内的重链。蛋白A可在工业发酵中生产和纯化,以用于免疫学、生物学研究和工业应用。天然(或天然)蛋白A可在金黄色葡萄球菌中培养,并含有上述五个同源抗体结合区和一个用于细胞壁附着的C端区。或者,蛋白A可重组产生,例如在大肠杆菌(Escherichia coli)或短芽胞杆菌属(Brevibacillus)中。蛋白A的重组形式同样包含五个同源抗体结合结构域,但在结构的其他部分中可能会有所不同,以利于与多孔基底偶联。也可提供蛋白A的工程化形式,包括rProtein A、B4、C-CYS。工程化形式可以是单个结构域的多聚体(通常是四聚体、五聚体或六聚体),已对其进行了修饰以提高其在工业应用中的可用性。所有这些形式的蛋白A均适用于本发明。
如本文中所用,含有蛋白A的基质或树脂包含与蛋白A固定在一起或偶联(共价或非共价,优选共价)的基底。蛋白质偶联或固定在其上的基底通常是固体或半固体支持物。合适的基底例如包括sepharose或者其他的类型或交联(任选地为珠状的)形式或者多糖聚合物,例如琼脂糖。其他类型的树脂或基质同样可以是合适的,例如如玻璃珠。载体可以是多孔的或无孔的。举例来说,但不限于,合适的含有蛋白A的基质或树脂包括Praeso AP或APc(均来自Purolite)、MabSelectSure(GE Healthcare)或AffiGel(Bio-Rad),所有这些均可有利地用于根据本发明的方法中。在一个优选的实施方案中,使用Praeso AP或APc。
在某些实施方案中,(脱脂)乳清在与含有蛋白A的基质或树脂接触之前稀释,例如稀释0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或更多倍。稀释剂与乳清的比可为0.1∶1、0.2∶1、0.3∶1、0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1、1∶1、1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、1.6∶1、1.7∶1、1.8∶1、1.9∶1、2∶1、2.1∶1、2.2∶1、2.3∶1、2.4∶1、2.5∶1、2.6∶1、2.7∶1、2.8∶1、2.9∶1、3∶1、3.1∶1、3.2∶1、3.3∶1、3.4∶1、3.5∶1、3.6∶1、3.7∶1、3.8∶1、3.9∶1、4∶1、4.1∶1、4.2∶1、4.3∶1、4.4∶1、4.5∶1、4.6∶1、4.7∶1、4.8∶1、4.9∶1、5∶1。在某些实施方案中,稀释剂与乳清的比可为0.5∶1至1.5∶1,例如1∶1。如本文其他地方所述,可使用任选地在合适的pH下的合适的缓冲液(例如,用于平衡乳/乳清和/或含有蛋白A的基质或树脂的缓冲液和/或pH)。在某些实施方案中,在纯化之前,任选地用1M NaOH将乳清的pH调节至pH 5至pH 8,例如pH 6.0。任选地,可将缓冲液添加至样品,例如5至50v/v%的缓冲液,例如约10v/v%的缓冲液。缓冲液可例如是平衡缓冲液或浓缩的平衡缓冲液,如本文其他地方所述,或者可例如是含NaCl的缓冲液。
在某些实施方案中,在使(脱脂)乳清与含有蛋白A的基质或树脂接触之前,使含有蛋白A的基质或树脂和/或(脱脂)乳清平衡至约5至约8的pH。如本文中所用,“平衡”是指将pH调节至(如果需要的话)预计范围或值。应当理解,调节含有蛋白A的基质或树脂的pH可包括使含有蛋白A的(固体)基质或树脂与具有所示pH范围或值的合适的缓冲液接触。应当理解,乳清的pH的调节可包括向乳清添加合适的碱(例如NaOH)或缓冲液,其具有一定的pH范围或值,以使得达到指示的最终pH范围或值。在某些实施方案中,在酪蛋白沉淀之后但在酪蛋白去除之前(即在粗滤、离心或过滤之前)调节(脱脂)乳的pH。应当理解,优选地,在这种pH调节和酪蛋白去除之间的时间优选是短的,以排除酪蛋白的再溶解。在某些实施方案中,将(脱脂)乳清/乳和/或含有蛋白A的基质或树脂的pH平衡/调节至以下pH:约4.5至8.0,例如约4.7至约8.0,例如约5.0至约8.0,优选约6.0至约7.0,例如约5.0至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2或5.1;约5.1至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3或5.2;约5.2至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4或5.3;约5.3至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5或5.4;约5.4至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6或5.5;约5.5至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7或5.6;约5.6至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8或5.7;约5.7至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9或5.8;约5.8至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0或5.9;约5.9至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1或6.0;约6.0至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2或6.1;约6.1至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3或6.2;约6.2至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4或6.3;约6.3至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5或6.4;约6.4至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6或6.5;约6.5至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7或6.6;约6.6至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8或6.7;约6.7至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9或6.8;约6.8至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0或6.9;约6.9至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2、7.1或7.0;约7.0至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3、7.2或7.1;约7.1至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4、7.3或7.2;约7.2至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.4或7.3;约7.3至约8.0、7.9、7.8、7.7、7.6或7.4;约7.4至约8.0、7.9、7.8、7.6或7.5;约7.5至约8.0、7.9、7.8、7.7或7.6;约7.6至约8.0、7.9、7.8或7.7;约7.7至约8.0、7.9或7.8;约7.8至约8.0或7.9;约7.9至约8.0。在某些实施方案中,将(脱脂)乳清/乳和/或含有蛋白A的基质或树脂的pH平衡/调节至约4.7至约7.5,例如约4.8至约7.5,例如约4.9至约7.5,例如约5.0至约7.5,例如约5.5至约7.5的pH。在某些实施方案中,将(脱脂)乳清/乳和/或含有蛋白A的基质或树脂的pH平衡/调节至约6.0至约7.0的pH。在某些实施方案中,将(脱脂)乳清/乳和/或含有蛋白A的基质或树脂的pH平衡/调节至约6.0至约6.5的pH。在某些实施方案中,将(脱脂)乳清/乳和/或含有蛋白A的基质或树脂的pH平衡/调节至约6.5至约7.0的pH。在某些实施方案中,将(脱脂)乳清/乳和/或含有蛋白A的基质或树脂的pH平衡/调节至约5.5至约7.0的pH。在某些实施方案中,将(脱脂)乳清/乳和/或含有蛋白A的基质或树脂的pH平衡/调节至约5.0至约7.0的pH。在某些实施方案中,将(脱脂)乳清/乳和/或含有蛋白A的基质或树脂的pH平衡/调节至约4.7至约7.0的pH。在某些实施方案中,将(脱脂)乳清/乳和/或含有蛋白A的基质或树脂的pH平衡/调节至约4.5至约7.0的pH。
在某些实施方案中,用于平衡含有蛋白A的基质或树脂和/或乳/乳清(或用于稀释乳/乳清)的缓冲液可以是但不限于乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、氨基酸补充缓冲液、磷酸盐缓冲液,例如PBS、TBS等。在某些优选的实施方案中,缓冲液是乙酸盐缓冲液。在某些实施方案中,缓冲液包含10至100mM的缓冲剂,例如约20mM。在某些实施方案中,缓冲液补充有盐,例如NaCl。在某些实施方案中,盐浓度为约0至100mM。在某些实施方案中,缓冲液包含约50mM NaCl和约50mM乙酸钠,并且具有约6.0的pH。
在某些实施方案中,平衡缓冲液选自:
-磷酸盐缓冲盐水(PBS):20至100mM磷酸盐,50至500mM NaCl,pH5.8至8。优选50mM磷酸盐,250mM NaCl,pH 6
-具有或不具有NaCl的乙酸盐。20至100mM乙酸盐,0至500mM NaCl,pH 4.7至6。优选50mM乙酸盐,50mM NaCl,pH 6
-具有或不具有NaCl的MES。20至100mM MES,0至500mM NaCl,pH 5.5至6.7。优选50mM MES,50mM NaCl,pH 6
-具有或不具有NaCl的BIS-tris。20至100mM BIS-tris,0至500mM NaCl,pH 5.8至7.2。优选50mM BIS-tris,50mM NaCl,pH 6
-具有或不具有NaCl的柠檬酸盐。20至100mM柠檬酸盐,0至500mM NaCl,pH 5.8至7.2。优选50mM BIS-tris,50mM NaCl,pH6
-具有或不具有NaCl的苹果酸盐。20至100mM BIS-tris,0至500mM NaCl,pH4.0到6.0。优选50mM苹果酸盐,50mM NaCl,pH6
-具有或不具有NaCl的碳酸盐。20至100mM碳酸盐,0至500mM NaCl,pH6.0至8.0。优选50mM碳酸盐,50mM NaCl,pH 6
-具有或不具有NaCl的二甲胂酸盐。20至100mM二甲胂酸盐,0至500mM NaCl,pH5.0至7.4。优选50mM二甲胂酸盐,50mM NaCl,pH 6
-具有或不具有NaCl的吡啶。20至100mM吡啶,0至500mM NaCl,pH 4.9至5.9。优选50mM吡啶,50mM NaCl,pH 5.5
-具有或不具有NaCl的琥珀酸盐。20至100mM琥珀酸盐,0至500mM NaCl,pH 5.5至6.5或4.7至5.2。优选50mM琥珀酸盐,50mM NaCl,pH 6
-具有或不具有NaCl的马来酸盐。20至100mM马来酸盐,0至500mM NaCl,pH 5.5至7.2。优选50mM琥珀酸盐,50mM NaCl,pH 6
在某些实施方案中,在(脱脂)乳清与含有蛋白A的基质或树脂分离(例如通过重力流)之后,洗涤含有蛋白A的基质(即,在洗脱异源抗体之前)。在某些实施方案中,将含有蛋白A的基质洗涤至少一次,例如1、2、3次或更多次,或用至少1倍,例如1、2、3或更多倍,例如至少5倍或至少10倍床(例如柱)体积(其中床体积是(填充的)含有蛋白A的基质或树脂的体积),例如2至5倍床体积,或者3至5或4至5倍床体积来洗涤。在某些实施方案中,用至少一倍,例如1、2或3倍床体积来洗涤含有蛋白A的基质,以进行分批纯化。在某些实施方案中,用至少5倍,例如5至15倍床体积来洗涤含有蛋白A的基质,以用于柱纯化。在某些实施方案中,用与平衡缓冲液相同的缓冲液洗涤含有蛋白A的基质或树脂,任选地,具有提高的盐(例如NaCl)浓度(例如如提高至少两倍的盐浓度,例如提高至少5倍的盐浓度,例如提高10倍的盐浓度,例如约50mM NaCl至约500mM NaCl)的平衡缓冲液。在某些实施方案中,用pH为约4.5至约8.0的缓冲液(例如乙酸盐缓冲液)将含有蛋白A的基质或树脂洗涤至少一次。在某些实施方案中,用pH为约4.5至约7.0的缓冲液将含有蛋白A的基质或树脂洗涤至少一次。在某些实施方案中,用pH为约4.5至约6.0的缓冲液将含有蛋白A的基质或树脂洗涤至少一次。在某些优选的实施方案中,用pH为约4.5至约5.0,例如约4.6至5.0或4.7至4.9的缓冲液将含有蛋白A的基质或树脂洗涤至少一次。在一个优选的实施方案中,用pH为约4.8或pH为4.8的缓冲液将含有蛋白A的基质或树脂洗涤至少一次。在某些实施方案中,用pH为约4.0至约8.0的缓冲液(例如乙酸盐缓冲液)将含有蛋白A的基质或树脂洗涤至少一次。在某些实施方案中,用pH为约4.0至约7.0的缓冲液将含有蛋白A的基质或树脂洗涤至少一次。在某些实施方案中,用pH为约4.0至约6.0的缓冲液将含有蛋白A的基质或树脂洗涤至少一次。在某些优选的实施方案中,用pH为约4.0至约5.0,例如约4.3至5.0或4.5至5.0的缓冲液将含有蛋白A的基质或树脂洗涤至少一次。在一个优选的实施方案中,用pH为约4.8或pH为4.8的缓冲液将含有蛋白A的基质或树脂洗涤至少一次。在一个优选的实施方案中,用pH为约4.7或pH为4.7的缓冲液将含有蛋白A的基质或树脂洗涤至少一次。应当理解,在这些实施方案中,如果进行多次洗涤,则可在所示的pH范围或值下进行至少一次洗涤(或床体积),优选至少两次洗涤(或床体积),以洗脱内源性羊抗体。出乎意料地,本发明人已经确定洗涤缓冲液的上述pH范围提高了异源抗体的产率和/或纯度。特别是在指定的pH范围内,残留结合的内源性羊抗体从含有蛋白A的基质或树脂上洗脱,而异源抗体保持与含有蛋白A的基质或树脂结合。在此背景下,在某些实施方案中,异源抗体具有与内源羊抗体不同的等电点,例如比内源羊抗体更高或更低的等电点。在此程度上,可将异源抗体工程化以达到这种效果(例如,类别转换、嵌合抗体,或以其他方式进行重组工程化以影响抗体的等电点)。在某些实施方案中,异源抗体的等电点与内源性羊抗体的等电点相差约0.5至3.0个单位,优选相差约1.0至约3.0个单位,例如约1至2个单位,优选至少0.5个单位,例如至少1个单位。在某些实施方案中,异源抗体的等电点为约6.0至约8.0,优选约6.0至约7.5,更优选约6.0至约7.0或约6.0至约6.5。在某些实施方案中,异源抗体的等电点低于7.5,优选低于7.0,例如低于6.9、6.8、6.7、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0。
在某些优选的实施方案中,洗涤缓冲液(优选洗脱内源性羊抗体的洗涤缓冲液)和/或平衡缓冲液的pH高于洗脱缓冲液(用于洗脱异源抗体)的pH。例如,如果洗涤缓冲液(例如用于洗脱内源性羊抗体的洗涤缓冲液)的pH为4.8,则异源抗体的洗脱缓冲液小于4.8。在某些实施方案中,至少一种洗涤缓冲液(优选洗脱内源性羊抗体的洗涤缓冲液)的pH比平衡缓冲液的pH低至少1个单位,优选低至多2个单位。在某些实施方案中,洗脱缓冲液(用于洗脱异源抗体)的pH比洗涤缓冲液(特别是具有最低pH的洗涤缓冲液,即用于洗脱内源性羊抗体的洗涤缓冲液)的pH低至少1个单位,优选低至多2个单位。在某些实施方案中,洗脱缓冲液(用于洗脱异源抗体)的pH比洗涤缓冲液(特别是具有最低pH的洗涤缓冲液,即用于洗脱内源性羊抗体的洗涤缓冲液)的pH低至少0.1个单位,优选低至多2个单位。在某些实施方案中,洗脱缓冲液(用于洗脱异源抗体)的pH比洗涤缓冲液(特别是具有最低pH的洗涤缓冲液,即用于洗脱内源性羊抗体的洗涤缓冲液)的pH低至少0.2个单位,优选地低至多2个单位。在某些实施方案中,洗脱缓冲液(用于洗脱异源抗体)的pH比洗涤缓冲液(特别是具有最低pH的洗涤缓冲液,即用于洗脱内源性羊抗体的洗涤缓冲液)的pH低至少0.3个单位,优选低至多2个单位。在某些实施方案中,洗脱缓冲液(用于洗脱异源抗体)的pH比洗涤缓冲液(特别是具有最低pH的洗涤缓冲液,即用于洗脱内源性羊抗体的洗涤缓冲液)的pH低至少0.4个单位,优选低至多2个单位。在某些实施方案中,洗脱缓冲液(用于洗脱异源抗体)的pH比洗涤缓冲液(特别是具有最低pH的洗涤缓冲液,即用于洗脱内源性羊抗体的洗涤缓冲液)的pH低至少0.5个单位,优选低至多2个单位。
在某些实施方案中,异源抗体从含有蛋白A的基质或树脂中洗脱(即解离)。在某些实施方案中,用多至5倍床体积,例如5倍床体积的洗脱缓冲液洗脱异源抗体。在某些实施方案中,用多至4倍床体积,例如4倍床体积的洗脱缓冲液洗脱异源抗体。在某些实施方案中,用多至3倍床体积,例如3倍床体积的洗脱缓冲液洗脱异源抗体。在某些实施方案中,用与平衡缓冲液相同的缓冲液但是具有允许洗脱异源抗体的pH从含有蛋白A的基质或树脂中洗脱异源抗体。在某些实施方案中,用与平衡缓冲液相同的缓冲液但是具有允许洗脱异源抗体的不同的盐浓度从含有蛋白A的基质或树脂中洗脱异源抗体。通常使用提高的盐浓度。应当理解,特别是对于柱色谱法,可以不同的级分收集洗脱液。可在每个级分中确定抗体浓度,以鉴定具有最高浓度和/或纯度的级分。可收集这些级分以确保最高的异源抗体产率和浓度。在某些实施方案中,每个级分为约一倍床体积。
在某些实施方案中,洗脱缓冲液包含:洗脱缓冲液可以是:甘氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、苹果酸盐、甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐等。
在某些实施方案中,将异源抗体在具有以下pH的缓冲液中洗脱:约2至约5,或约3至约5,或者约2.0或3.0至约5.0,优选约2.0或3.0至4.8或者2.0或3.0至4.7,更优选2.0或3.0至4.5,2.0或3.0至4.3,或2.0或3.0至4.0,优选约2.0或3.0至4.6或2.0或3.0至4.5。在某些实施方案中,异源抗体在具有以下pH的缓冲液中洗脱:约3.0至约5.0,例如约3.0至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2或3.1;约3.1至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3或3.2;约3.2至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4或3.3;约3.3至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5或3.4;约3.4至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6或3.5;约3.5至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7或3.6;约3.6至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8或3.7;约3.7至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9或3.8;约3.8至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0或3.9;约3.9至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1或4.0;约4.0至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2或4.1;约4.1至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3或4.2;约4.2至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4或4.3;约4.3至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5或4.4;约4.4至约5.0、4.9、4.8、4.7、4.6或4.5;约4.5至约5.0、4.9、4.8、4.7或4.6;约4.6至约5.0、4.9、4.8或4.7;约4.7至约5.0、4.9或4.8;约4.8至约5.0或4.9;约4.9至约5.0。在某些优选的实施方案中,异源抗体在pH为约3.0至约4.5或约3.0至约4.0,例如3.5或约3.5的缓冲液中洗脱。在某些优选的实施方案中,异源抗体在pH为约2.0至约4.5或约2.0至约4.0或约2.0至约4.3的缓冲液中洗脱。
应当理解,洗脱的异源抗体可在下游进一步处理,例如包括稀释或浓缩、中和、透析等。根据治疗适应证,可进一步适当地配制抗体。
在某些实施方案中,在pH 5.5至pH 7.0,例如优选pH 6下进行平衡,在pH 4.5至pH5.0,例如优选pH 4.8下进行至少一个洗涤步骤(用于内源性山羊抗体的洗脱/去除),并且在pH 2至pH 4,例如优选pH 3.5下进行洗脱(用于异源抗体洗脱)。在某些实施方案中,平衡和/或至少一个洗涤步骤(优选全部)在pH 4.5至pH 5.0,例如优选pH 4.8下进行(用于内源性山羊抗体的洗脱/去除),并且在pH 2.0至pH 4.0,例如优选pH 3.5下进行洗脱(用于异源抗体洗脱)。在某些实施方案中,平衡和/或至少一个(优选全部)洗涤步骤在pH 4.0至pH5.0,例如优选pH 4.8下进行(用于内源性山羊抗体的洗脱/去除),并且在pH 2.0至pH4.0,例如优选pH 3.5下进行洗脱(用于异源抗体洗脱)。在某些实施方案中,平衡和/或至少一个(优选全部)洗涤步骤在pH 4.5至pH 5.0,例如优选pH 4.8下进行(用于内源性山羊抗体的洗脱/去除),并且在pH 2.0至pH 4.5,例如优选pH 3.5下进行洗脱(用于异源抗体的洗脱)。在所有这些实施方案中,用于平衡和/或洗涤的pH优选高于用于异源抗体洗脱的pH,如本文其他地方所述,例如如高至少0.1个单位。在某些实施方案中,包括另外的洗脱步骤,优选在pH 3.0下。在某些实施方案中,这些步骤中的一个或更多个(优选全部)的缓冲液是乙酸盐缓冲液(具有或不具有盐,优选NaCl)。在某些实施方案中,样品被稀释,例如优选在平衡缓冲液中稀释。在某些实施方案中,将洗脱液例如在1M Tris缓冲液中中和至例如约pH9。
在某些实施方案中,平衡缓冲液和/或至少一种洗涤缓冲液包含50mM乙酸钠和50mM NaCl,pH 6,例如pH 6.0。在某些实施方案中,至少一种洗涤缓冲液包含50mM乙酸钠和50mM NaCl,pH 4.8。在某些实施方案中,洗脱缓冲液包含乙酸钠50mM NaCl,pH 4.8或3.5或3.0。
在某些实施方案中,平衡缓冲液包含50mM乙酸钠,500mM NaCl,pH 6,10倍柱体积。在某些实施方案中,用包含50mM乙酸钠,100mM NaCl,pH 4.7的缓冲液去除/洗脱山羊IgG。在某些实施方案中,用包含100mM甘氨酸,pH 3的缓冲液洗脱异源抗体。
以下非限制性实施例进一步支持本发明的一些方面和实施方案。
实施例
缩写
BCA | 二喹啉甲酸测定 |
BLI | 生物层干涉测量术 |
CE | 毛细管电泳 |
ELISA | 酶联免疫吸附测定 |
HCP | 宿主细胞蛋白质 |
MW | 分子量 |
rpm | 每分钟转数 |
SDS-PAGE | SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
WB | Western印迹 |
实施例1:样品制备
1.山羊乳
将新鲜的山羊全脂乳在50℃下加热,然后以3000g离心10分钟。使烧瓶冷却以使脂肪固化。去除烧瓶顶部的乳脂。通过添加1M HCl直至pH 4.3来在37℃下使脱脂乳酪蛋白沉淀。通过在20℃以3000g离心15分钟来去除沉淀的酪蛋白。
通过二喹啉甲酸测定(bicinchoninic acid assay,BCA)测量总蛋白质浓度。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使蛋白质可视化。通过称重确定每个步骤之后获得的乳体积。通过ELISA测量山羊抗体浓度。使用以下方程计算回收率(%):(其中Cf=可对应于脱脂乳、乳清或加载样品的最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=可对应于脱脂乳、乳清或加载样品的最终产品的体积(1),Ci=对应于经处理全脂乳的初始产品中目标分子的浓度(g/1),Vi=对应于经处理全脂乳的初始产品的体积(1))。
对于100ml全脂乳,收获了大于90ml的脱脂乳,并且收获了大于80ml的乳清。在脱脂和酪蛋白沉淀步骤之后,去除了超过75%的总蛋白质(表1)。我们的结果与乳蛋白质的可获得数据之间的比较证实了酪蛋白沉淀之后蛋白质的显著损失(Selvaggi et al.(2014)Mol.Biol.Rep.41:1035-1048)。表1中报告了乳样品的SDS-PAGE分析。
表1.乳样品的抗体和蛋白质回收率。通过ELISA测量抗体浓度。通过BCA测量总蛋白质浓度。如文中所解释的计算回收率。
2.含有异源抗体的山羊乳
将含有犬单克隆异源抗体(2mg/ml)的新鲜山羊全脂乳在50℃下加热,然后以3000g离心10分钟。使烧瓶冷却以使脂肪固化。去除烧瓶顶部的乳脂。通过添加1M HCl直至pH 4.3来在37℃下使脱脂乳酪蛋白沉淀。通过在20℃以3000g离心15分钟来去除沉淀的酪蛋白。抗体主要存在于被称为乳清的上清液中。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量单克隆异源抗体浓度。生物层干涉测量术(BLI)测定证实了通过ELISA获得的结果。通过二喹啉甲酸测定(BCA)测量总蛋白质浓度。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使蛋白质可视化。通过ELISA测量山羊抗体浓度。通过称重确定每个步骤之后获得的乳体积。回收率定义为处理后可以得到的目标分子的量。通常表示为起始原料的百分比或产率。使用以下方程计算回收率(%):(其中Cf=可对应于脱脂乳、乳清或加载样品的最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=可对应于脱脂乳、乳清或加载样品的最终产品的体积(l),Ci=对应于经处理全脂乳的初始产品中目标分子的浓度(g/l),Vi=对应于经处理全脂乳的初始产品的体积(l))。
含有异源抗体的山羊乳的行为类似于不含异源抗体的山羊乳。实际上,在与实施例1.1相同的条件下进行脱脂和酪蛋白沉淀,并且结果与实施例1.1的相同:i)回收了相同体积的脱脂乳和乳清,ii)去除了相同量的总蛋白质,并且iii)回收了相同量的山羊IgG。
对于含有2mg/ml异源抗体的1 l全脂乳,在乳清中收获了大于80%的异源抗体。山羊IgG的回收率类似。表1中报告了每个步骤之后的异源抗体和山羊IgG回收率。
a)酪蛋白沉淀洗涤
将含有犬单克隆异源抗体(2mg/ml)的新鲜山羊全脂乳在50℃下加热,然后以3000g离心10分钟。使烧瓶冷却以使脂肪固化。去除烧瓶顶部的乳脂。通过添加1M HCl直至pH4.3来在37℃下使脱脂乳酪蛋白沉淀。通过在20℃以3000g离心15分钟来去除沉淀的酪蛋白。使用5%初始乳体积的pH 4.3的50mM乙酸钠、50mM NaCl将沉淀洗涤3次,以收获存在于酪蛋白沉淀中的残留异源抗体。将洗涤液与乳清混合,用1M NaOH调节至pH6,并分别通过3μm和0.22μm过滤2次,然后加载到基质上。在以下实施例中,将乳清和洗涤液的混合物称为“加载样品”。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量单克隆异源抗体浓度。生物层干涉测量术(BLI)测定证实了通过ELISA获得的结果。通过二喹啉甲酸测定(BCA)测量总蛋白质浓度。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使蛋白质可视化(图2B)。通过western印迹使单克隆异源抗体可视化(图2A)。通过ELISA测量山羊抗体浓度。通过称重确定每个步骤之后获得的乳体积。使用以下方程计算回收率(%):(其中Cf=可对应于脱脂乳、乳清或加载样品的最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=可对应于脱脂乳、乳清或加载样品的最终产品的体积(l),Ci=对应于经处理全脂乳的初始产品中目标分子的浓度(g/l),Vi=对应于经处理全脂乳的初始产品的体积(l))。
表2.图2的样品说明
孔编号 | 样品 | 稀释度 |
1 | 全脂乳对照 | 1/4 |
2 | 全脂乳异源抗体1g/l | 1/4 |
3 | 脱脂乳异源抗体1g/l | 1/4 |
4 | 乳脂异源抗体1g/l | 1/4 |
5 | 乳清异源抗体1g/l | 1/4 |
6 | 沉淀洗涤液1 | 1/4 |
7 | 沉淀洗涤液2 | 1/4 |
8 | 沉淀洗涤液3 | 1/4 |
9 | 经过滤乳清异源抗体1g/l | 1/4 |
含有异源抗体的山羊乳的行为类似于不含异源抗体的山羊乳。实际上,在与实施例1.1相同的条件下进行脱脂和酪蛋白沉淀,并且结果与实施例1.1的相同:i)回收了相同体积的脱脂乳和乳清,ii)去除了相同量的总蛋白质,并且iii)回收了相同量的山羊IgG。
对于含有2mg/ml异源抗体的1 l全脂乳,在乳清中收获了大于80%的异源抗体。通过洗涤酪蛋白沉淀回收了大于5%的异源抗体。因此,在乳清和洗涤液的混合物中回收了总计大于85%的抗体。山羊IgG的回收率类似。表1中报告了每个步骤之后的异源抗体和山羊IgG回收率。
实施例2:脱脂
1.乳脂分离器(Creamer separator)
重复实施例1.1和1.2,但是用乳脂分离器以10.500±1000rpm进行全脂乳的脱脂(输出为100l/h)。乳脂分离器直接去除经加热全脂乳的乳脂,而无冷却步骤。
结果分别与实施例1.1和1.2中的相同。
2.加热温度
重复实施例1.2,但是在脱脂之前将全脂乳在75℃下加热10秒。异源抗体的回收率大幅低于实施例1.2。
脱脂乳表现出降低100倍的异源抗体浓度。对于山羊抗体获得的类似结果表明抗体在高温下不稳定。因此,脱脂应在75℃下进行。
3.加热时间
重复实施例1.2,但是在脱脂之前将全脂乳在50℃下加热60分钟。结果与实施例1.2中的相同。因此,与实施例1.2相同的回收率表明抗体在50℃下不变性。
实施例3:酪蛋白沉淀
1.酸的种类
重复实施例1.2,但是用1M柠檬酸进行酪蛋白沉淀。
结果与实施例1.2的相同。
2.酸浓度
重复实施例1.2,但是使用0.1、0.2、0.5或1N HCl进行酪蛋白沉淀。结果与实施例1.2的相同。
3.用于酪蛋白沉淀的pH
重复实施例1.2,但是用1M HCl直到pH从6.7调节至2.6来进行酪蛋白沉淀。没有HCl的起始pH为6.7。测试的pH为6.4、5.8、5.3、5.0、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.8、3.2和2.6。如实施例1.2进行分析测定。
从pH 4.3至2.6完全去除了酪蛋白。无论使用的pH如何,直至约pH 4,沉淀之后的异源抗体回收率都类似(图3)。在约pH 4下,观察到异源抗体的回收率下降(图5)。对于调节至pH 4.3至2.6的pH,结果与实施例1.2中的相同(图4)。表3-5对应于图3-5。
表3.
样品 | 靶标回收率(%) | SD |
原料乳 | 100 | 3 |
经加热乳 | 98 | 2 |
脱脂乳 | 99 | 4 |
pH 6.38 | 93 | 3 |
pH 5.77 | 99 | 5 |
pH 5.38 | 91 | 4 |
pH 4.99 | 89 | 3 |
pH 4.62 | 128 | 20 |
pH 4.53 | 109 | 8 |
pH 4.48 | 138 | 2 |
pH 4.36 | 84 | 4 |
pH 4.24 | 105 | 11 |
pH 4.13 | 104 | 3 |
pH 4.01 | 130 | 5 |
表4
pH | 总蛋白质含量(μg/ml) |
6.71 | 26548 |
6.26 | 26035 |
5.89 | 25842 |
5.51 | 25658 |
5.11 | 24095 |
4.66 | 15746 |
4.32 | 8002 |
3.97 | 8820 |
3.49 | 8971 |
2.82 | 9362 |
2.58 | 9349 |
表5
pH | 异源抗体(%) | 总蛋白质含量(%) |
6.56 | 104 | 77 |
5.29 | 100 | 75 |
4.61 | 101 | 37 |
4.17 | 99 | 37 |
3.76 | 95 | 30 |
3.21 | 80 | 45 |
2.68 | 35 | 43 |
4.使用硫酸铵的酪蛋白沉淀
a)用于酪蛋白沉淀的硫酸铵浓度的确定。
如实施例1.1中所述对新鲜山羊全脂乳进行脱脂。将10ml脱脂乳用1.3ml的1.5MTRIS-HCl在pH 7下缓冲。然后,向脱脂乳添加多种量的硫酸铵(0%、20%、30%、45%、60%、75%和95%)。将混合物在室温下混合10分钟。通过以10000g离心10分钟去除沉淀物。通过SDS-PAGE分析上清液(图6)。
通过添加45%和60%的硫酸铵使酪蛋白沉淀(图6)。
b)用于酪蛋白沉淀而不使抗体沉淀的硫酸铵浓度的确定
进行以上实施例,但是处理含有犬单克隆异源抗体(0.5g/l)的新鲜山羊全脂乳。通过将中间硫酸铵浓度加至以上使用的浓度(30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%和75%)进行测试。通过ELISA测量上清液中的异源抗体浓度。
对于45%至70%的的硫酸铵浓度观察到沉淀。然而,ELISA显示在这些硫酸铵浓度下异源抗体也发生沉淀。结果未发现用于使酪蛋白沉淀而不使目标抗体沉淀的条件。由于酪蛋白沉淀中异源抗体的损失,因此不使用硫酸铵进行酪蛋白沉淀。
实施例4:色谱法优化实验
1.树脂选择
a)混合模式树脂
CMM hyperCelTm混合模式吸附剂
重复实施例1.2的样品制备,只是将乳清和洗涤液的混合物调节至pH4、5或6。使用混合模式树脂和合适的缓冲液进行异源抗体的纯化。将CMM hyperCelTm混合模式吸附剂(PALL)包含在Acroprep Advance 96孔滤板(PALL)中,以通过批模式纯化异源抗体。将树脂用2树脂体积的平衡缓冲液(pH 4、5或6的50mM乙酸钠)洗涤两次。通过以500g离心2分钟去除缓冲液。将2床体积的样品与基质混合60分钟。通过以500g离心2分钟去除通过流。通过使用4床体积的平衡缓冲液与树脂孵育5分钟然后以500g离心2分钟来将树脂洗涤两次。依次用pH 7至9.5(7、7.5、8、8.5、9和最后9.5)的50mM Tris-HCl如下洗脱保留的蛋白质:将4床体积的缓冲液与树脂孵育10分钟,然后以500g离心2分钟。每种洗脱均作为单独的级分收集。对应于4床体积的每种洗脱作为单独的级分收集。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量单克隆异源抗体浓度,并通过生物层干涉测量术(BLI)确认结果。通过毛细管电泳(CE)估计纯度,并使用以下方程计算:(其中Ca=样品中的抗体浓度(g/l)并且Ct=样品中的总蛋白质浓度(g/1))。通过western印迹(WB)进行异源抗体可视化。通过ELISA测量最终产品中的残留山羊抗体。使用以下方程计算回收率(%):(其中Cf=最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=最终产品的体积(1),Ci=对应于加载样品的初始产品中目标分子的浓度(g/l),Vi=对应于加载样品的初始产品的体积(1))。
在我们的实验条件下,使用的基质在pH 5下以最大值结合异源抗体和山羊抗体。异源抗体主要在pH 8洗脱。该级分中异源抗体的纯度和产率估计分别为50%和75%。但是,在pH 8也洗脱了约40%的山羊IgG,并保留在最终产品中。在我们的实验条件下,山羊抗体和异源抗体无法分离。
加载pH
在第一个试验中,我们在pH 4、5和6测试了平衡和洗涤,但在pH 5时观察到了较好的回收率,因此在第二个试验中,我们使用边界pH值:5、5.5-6-6.5。重复实施例4.1.a,但是使用pH 5、5.5、6或6.5的50mM乙酸钠进行平衡和洗涤。
结果与以上实施例中的类似。但是,当在pH 5进行平衡时,异源抗体的纯度和产率更高。实际上,在pH>5的情况下,由于其pI为6.5,一部分异源抗体必然在通过流中收获。
b)阳离子树脂
HyperCelTm Star CEX阳离子交换吸附剂
重复实施例4.1.a,但是使用阳离子树脂和合适的缓冲液进行异源抗体的纯化。使用的树脂是hyperCelTm Star CEX阳离子交换吸附剂(PALL)。使用pH 3.5、4.5和5.5的50mM乙酸钠、50mM NaCl进行平衡和洗涤。使用与用于平衡具有相同pH但是包含200mM至700mM(200、300、400、500、600和最后700mM)的NaCl的50mM Tris-HCl依次洗脱保留的蛋白质。每个步骤的体积与以上实施例中的相同。如实施例4.1.a中进行分析测定。
在我们的实验条件下,使用的基质在pH 5.5以最大值结合全部异源抗体和一部分山羊抗体。山羊IgG主要使用200mM和300mM NaCl洗脱,而异源抗体则使用200至400mM的NaCl浓度洗脱。对于300mM的洗脱级分,异源抗体纯度更好并且估计为76%。然而,在该级分中回收不到45%的异源抗体。结果,对于该树脂,没有确定用于高产率和高纯度的异源抗体以及分离这两种抗体的参数。
加载pH
重复以上实施例,但是使用pH 5.5、6或6.5的50mM乙酸钠进行平衡和洗涤。异源抗体的纯度和产率比以上实施例中的差。实际上,当平衡pH提高时,由于其pI为约6.5,基质结合较少异源抗体。
c)阴离子树脂
HyperCelTm Star AX离子交换吸附剂
重复实施例4.1.b,但是使用阴离子树脂和合适的缓冲液进行异源抗体的纯化。使用的树脂是hyperCelTm Star AX离子交换吸附剂(PALL)。此外,将样品调节至pH 7.5,并在平衡缓冲液中稀释2倍。使用pH 7.5的50mM Tris-HCl进行平衡和洗涤。用pH 7.5的包含300mM至1000mM(300、500和1000mM)的NaCl的50mM Tris-HCl依次洗脱保留的蛋白质。每个步骤的体积与实施例4.1.b相同。如实施例4.1.b进行分析测定。
在我们的实验条件下,使用的基质结合了约75%的加载异源抗体。异源抗体主要使用300mM NaCl洗脱。对于该基质,产率不足以令人满意。
加载pH
重复实施例,但是使用pH 8或8.5进行平衡和洗涤。结果与以上实施例的类似。提高加载pH值并不改善异源抗体在基质上的结合。由于异源抗体的pI为约6.5,因此未进行使用pH值小于7.5的测试。
d)亲和树脂
MabSelectSure(GE)-蛋白-A
重复实施例4.1.a,但是使用蛋白-A MabselectSure(GE Healthcare)进行异源抗体的纯化。使用pH 6的20mM磷酸钠进行平衡和洗涤。依次用pH 6至2(6、5、4、3、2.5和2)的100mM柠檬酸钠洗脱保留的蛋白质。每个步骤的体积与以上实施例中的相同。如实施例4.1.b进行分析测定。
在通过流和洗涤液中收获了超过80%的加载山羊抗体。在第一和第二洗脱(pH为6和5的洗脱)中分别收获了约5%和10%的加载的山羊抗体。相比之下,在通过流和洗涤液中收获了不到1%的加载的异源抗体。在第二和第三洗脱(pH为5和4的洗脱)中分别收获了9%和90%的加载的异源抗体。第三级分中的异源抗体的纯度估计为55%。
以上四种树脂的比较表明,蛋白A基质是用于我们异源抗体纯化的更好候选物。实际上,亲和色谱法具有以下优点:蛋白A结合异源抗体并且弱地结合山羊IgG。然后可以在比异源抗体酸度更小的pH下洗脱山羊IgG。由于使用蛋白A进行山羊和异源抗体分离的色谱法。此外,乳蛋白不与蛋白A基质结合,因此收获的异源抗体的纯度高。通过亲和色谱法纯化的优化在以下部分中进行。
2.参数选择
a)洗脱
线性梯度
重复实施例1.2的样品制备。使用含有蛋白A的5ml柱(MabselectSure,GEHealthcare)通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。如下以6ml/min的流量进行运行:将1柱体积(CV)的样品在平衡缓冲液中稀释2倍,然后加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、50mM NaCl中平衡的柱上。将柱用10CV的平衡缓冲液洗涤。用平衡缓冲液和pH 3的0.1M柠檬酸盐之间的10CV的线性梯度进行洗脱。通过对应于1CV的级分收集异源抗体,并且在pH 9.0的1MTris-HCl中中和至使抗体稳定的pH。色谱图报告在图7中,并且通过EC对级分2至11的分析报告在图8中。收集具有异源抗体的级分。通过SDS-PAGE和WB分析加载样品、流通+洗涤和收集物级分的蛋白质和异源抗体(图9)。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量单克隆异源抗体浓度,并通过生物层干涉测量术(BLI)确认结果。通过毛细管电泳(CE)估计纯度,并使用以下方程计算:(其中Ca=样品中的抗体浓度(g/l)并且Ct=样品中的总蛋白质浓度(g/l))。通过ELISA测量最终产品中的残留山羊抗体。使用以下方程计算回收率(%):(其中Cf=最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=最终产品的体积(1),Ci=对应于加载样品的初始产品中目标分子的浓度(g/l),Vi=对应于加载样品的初始产品的体积(1))。
在通过流和洗涤液中收获了超过93%的加载的山羊抗体。在pH>4.8的第一部分洗脱中收获了约4%的加载的山羊抗体。相反,对蛋白A树脂具有高亲和力的异源抗体在通过、洗涤和第一部分洗脱中微弱地损失。在pH值<4.8的第二部分洗脱中收获了75%的单克隆抗体,纯度>90%(图8,级分6至10)。这些结果表明,可以使用不同的pH分离山羊IgG和异源抗体。这就是为什么在以下实施例中测试分步pH梯度的原因。
使用蛋白-A Praesto AP树脂(Purolite)重复以上实施例。结果与以上实施例的相同。
表6.图9的样品说明
样品编号 | 样品 | 稀释度 |
1 | 乙酸乳清+异源抗体2mg/ml | 1/4 |
2 | FT+洗涤:PA Purolite | 1/4 |
3 | FT+洗涤:PA GE MabSelect sure | 1/4 |
4 | 收集物洗脱液PA Purolite | 1/4 |
5 | 收集物洗脱液PA GE MabSelect sure | 1/4 |
6 | 级分7PA Purolite | 1/4 |
7 | 级分8PA Purolite | 1/4 |
8 | 级分6PA MabSelect sure | 1/4 |
9 | 级分7PA MabSelect sure | 1/4 |
分步梯度
4步梯度(pH 6.0、pH 4.8、pH 3.5和pH 3.0)
为了更好地分离山羊IgG和异源抗体,使用4步pH进行洗脱。重复以上实施例,但如下进行运行:
将20柱体积(CV)的样品(由17ml乳清和2mg/ml异源抗体构成,并用100ml pH 7.5的1M乙酸盐达到pH 6)加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、50mM NaCl中平衡的柱上。将柱用10CV的平衡缓冲液洗涤。使用5CV的pH 4.8的50mM乙酸钠、50mM NaCl进行第一洗脱。使用5CV的pH 3.5的50mM乙酸钠、50mM NaCl进行第二洗脱。最后,使用5CV的pH 3.0的50mM乙酸钠、50mM NaCl进行第三洗脱。通过对应于1CV的级分收集异源抗体,并且在pH 9.0的1MTris-HCl中中和至使抗体稳定的pH。收集具有异源抗体的级分。通过30kDa膜相对于pH 6的50mM乙酸盐、50mM NaCl对异源抗体进行透析。分析测定与以上实施例的类似。色谱图报告于图10中。
在我们的实验条件下,在通过流和洗涤液中收获了超过90%的加载的山羊抗体。在pH 4.8的第一洗脱中收获了约4%的山羊抗体。相反,对蛋白A树脂具有高亲和力的异源抗体在流通、洗涤和第一洗脱中损失很小(小于5%)。在pH 3.5的第二洗脱中收获了单克隆抗体。
图11提供了该过程对山羊IgG和异源抗体回收的影响。
从含有2mg犬单克隆抗体的17ml乳清中,回收了>87%的单克隆抗体,纯度大于>84%。最终产品中残留的山羊抗体估计少于30ug。最终产品中残留的山羊蛋白估计少于1μg/mg。表7显示了抗体回收的产率。
表7.纯化级分的抗体回收率。
3步梯度(pH 6.0、pH 4.8和pH 3.0)
重复以上实施例,但以6ml/min的流量如下进行运行:将1柱体积(CV)的样品(由使用NaOH调节为pH 6.0的乳清构成)加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、50mM NaCl中平衡的柱上。将柱用10CV的平衡缓冲液洗涤。使用5CV的pH 4.8的50mM乙酸钠、50mM NaCl进行第一洗脱。使用5CV的pH 3.0的50mM乙酸钠、50mM NaCl进行第二洗脱。通过对应于1CV的级分收集异源抗体,并且在pH 9.0的1M Tris-HCl中中和至使抗体稳定的pH。收集具有异源抗体的级分。通过30kDa膜相对于pH 6的50mM乙酸盐、50mM NaCl对异源抗体进行透析。分析测定与以上实施例的类似。
山羊抗体主要在pH 4.8洗脱。异源抗体在pH 3.0洗脱。获得的该结果与以上实施例的结果的比较表明,在pH 3.5下洗脱的抑制对异源抗体的产率和纯度没有显著影响。为了回收最大量的异源抗体,在pH 3洗脱优于在pH 3.5洗脱。
使用500mM NaCl洗涤和3步梯度(pH 6.0、pH4.7和pH 3.0)
重复实施例1.2的样品制备。使用含有蛋白A的5ml柱(praesto,purolite)通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。如下进行运行:将1柱体积(CV)的样品以1ml/min的流量加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、50mM NaCl中平衡的柱上。将柱用10CV的平衡缓冲液以4ml/min的流量洗涤。然后将柱用5CV的pH 6.0的50mM乙酸钠、500mM NaCl中以4ml/min的流量洗涤。
使用5CV的pH 4.7的50mM乙酸钠、100mM NaCl以4ml/min的流量进行第一洗脱。使用5CV的pH 3.0的100mM甘氨酸以4ml/min的流量进行第二洗脱。通过2ml级分收集异源抗体,并且使用200μl pH 8.5的1.5M Tris-HCl中和至使抗体稳定的pH。收集具有异源抗体的级分。
通过生物层干涉测量术(BLI)测量单克隆异源抗体浓度。通过SDS-PAGE使蛋白质可视化。通过ELISA测量最终产品中的残留山羊抗体。使用以下方程计算回收率(%):(其中Cf=最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=最终产品的体积(l),Ci=对应于加载样品的初始产品中目标分子的浓度(g/l),Vi=对应于加载样品的初始产品的体积(l))。纯化的色谱图如图12所示,并且相应的SDS-PAGE分析如图13所示。
在我们的实验条件下,在通过流和洗涤中收获了超过83%的加载的山羊抗体。使用500mM NaCl洗涤使得可以释放山羊抗体(级分n°19)。在pH 4.7的第一洗脱中收获了约15%的加载的山羊抗体。相反,对蛋白A树脂具有高亲和力的异源抗体在流通、洗涤和第一次洗脱中损失很小(小于1%)。在pH 3的第二次洗脱中收获单克隆抗体。
3和2步梯度(pH 4.7和pH 3.0)的比较
重复实施例1.2.以从含有0.1g/l异源抗体的1.3升乳进行样品制备。使用含有蛋白A的5ml柱(praesto,purolite)通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。进行两种不同的色谱法:(A)pH 6的加载样品和平衡缓冲液,和(B)pH 4.7的加载样品和平衡缓冲液。如下进行运行:将10柱体积(CV)的样品以5ml/min的流量加载到在(A)pH 6.0的50mM乙酸钠、500mMNaCl或(B)pH 4.7的50mM乙酸钠、500mM NaCl(B)中平衡的柱上。将柱用10CV的平衡缓冲液以5ml/min的流量洗涤。仅使用5CV的pH 4.7的50mM乙酸钠、500mM NaCl以5ml/min的流量对于条件(A)进行第一洗脱。使用5CV的pH 3.0的100mM甘氨酸以5ml/min的流量在这两种条件下进行第二洗脱。通过2.5ml级分收集异源抗体,并且使用250μl pH 8.5的1.5M Tris-HCl中和至使抗体稳定的pH。收集具有异源抗体的级分。
通过ELISA测量单克隆异源抗体浓度。通过SDS-PAGE使蛋白质可视化。通过ELISA测量最终产品中的残留山羊抗体。使用以下方程计算回收率(%):(其中Cf=最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=最终产品的体积(l),Ci=对应于加载样品的初始产品中目标分子的浓度(g/l),Vi=对应于加载样品的初始产品的体积(l))。纯化的色谱图如图14所示,ELISA结果如图15所示,并且相应的SDS-PAGE/WB分析如图16所示。
该过程对总蛋白质含量的影响如图17所示。
在我们的实验条件下,在pH 3.0的洗脱中收获了少于1%的加载的山羊抗体。相反,对蛋白A树脂具有高亲和力的异源抗体在流通、洗涤和第一次洗脱中损失很小。在pH 3的洗脱中收获单克隆抗体。我们观察到,与在pH 6.0加载样品相比,在pH 4.7加载样品导致洗脱后异源抗体回收率降低,这可能是因为在该pH下更好的亲和力。在pH 4.7或pH 6.0加载后收获的异源抗体的纯度相似。
b)平衡缓冲液
pH 8和9的1.5M甘氨酸
通过批模式进行异源抗体的纯化(参见实施例4.1.d)。用2树脂体积的平衡缓冲液(pH 8和9的1.5M甘氨酸)洗涤A蛋白树脂两次。通过以500g离心2分钟去除缓冲液。将在平衡缓冲液中稀释2倍的2床体积的样品与基质混合60分钟。通过以500g离心2分钟去除通过流。通过使用平衡缓冲液和树脂以4床体积孵育将树脂洗涤2次持续分钟,然后以500g离心2分钟。依次用pH 4.8、3.5和最后3.0的50mM乙酸钠洗脱保留的蛋白质。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量单克隆异源抗体浓度。通过毛细管电泳(CE)估计纯度,并使用以下方程计算:(其中Ca=样品中的抗体浓度(g/l)并且Ct=样品中的总蛋白质浓度(g/l))。通过ELISA测量最终产品中的残留山羊抗体。使用以下方程计算回收率(%):(其中Cf=最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=最终产品的体积(1),Ci=对应于加载样品的初始产品中目标分子的浓度(g/l),Vi=对应于加载样品的初始产品的体积(1))。
从含有400μg犬单克隆抗体的200μl乳清中,回收了多至74%的单克隆抗体(图18),纯度高至87%。最终产品中的残留山羊抗体估计为0.1至10μg。
pH 7、8和9的1M硼酸钠
重复以上实施例,但用pH7、8或9的1M硼酸钠代替平衡和洗脱缓冲液。如以上实施例进行分析测定。
从含有400μg犬单克隆抗体的200μl乳清中,回收了多至46%的单克隆抗体(图18),纯度高至88%。最终产品中残留的山羊抗体估计小于1μg。
pH 6和7的0.1M磷酸钠
重复以上实施例,但是用pH 6或7的0.1M磷酸钠代替平衡和洗脱缓冲液。如以上实施例进行分析测定。
从含有400μg犬单克隆抗体的200μl乳清中,回收了>85%的单克隆抗体(图18),纯度大于>80%。最终产品中残留的山羊抗体估计小于13μg。pH 7、8和9的1M Tris碱
重复以上实施例,但是用pH 7、8或9的1M Tris碱代替平衡和洗脱缓冲液。如以上实施例进行分析测定。
从含有400μg犬单克隆抗体的200μl乳清中,回收了多至86%的单克隆抗体(图18),纯度大于>90%。最终产品中残留的山羊抗体估计小于20μg。
pH 6和7的1M乙酸钠
重复以上实施例,但是用pH 6或7的1M乙酸钠代替平衡和洗脱缓冲液。如以上实施例进行分析测定。通过ELISA定量最终产品中残留的山羊蛋白浓度(宿主细胞蛋白质的HCP)。
从含有400μg犬单克隆抗体的200μl乳清中,回收了>90%的单克隆抗体(图18),纯度大于>89%。最终产品中残留的山羊抗体估计小于1.5μg。最终产品中残留的山羊蛋白估计低于1ng/μg。
pH 6的10至100mM乙酸钠
重复以上实施例,但是用pH 6的10、20、50和100mM乙酸钠代替平衡和洗脱缓冲液。在加载之前,将样品在平衡缓冲液中以9∶1(v∶v)稀释。如以上实施例中进行分析测定。
从含有400μg犬单克隆抗体的200μl乳清中,回收了>90%的单克隆抗体(图18),纯度大于>92%。最终产品中残留的山羊抗体估计小于1.5μg。最终产品中残留的山羊蛋白估计小于1ng/μg。
选择用于下一个测定的最佳平衡缓冲液条件是pH 6的50mM乙酸钠,因为其显示出更好的纯度和产率二者。
c)洗脱缓冲液
通过批模式进行异源抗体的纯化(参见实施例4.1.d)。用2树脂体积的平衡缓冲液(pH 6的0.1M的乙酸盐)洗涤蛋白A树脂两次。通过以500g离心2分钟去除缓冲液。将在平衡缓冲液中稀释2倍的2床体积的样品与基质混合60分钟。通过以500g离心2分钟去除通过流。通过使用平衡缓冲液(pH 4.7-4.8-4.9和5.0的0.1M乙酸盐、1M甘氨酸或0.1M柠檬酸盐)和树脂以4床体积孵育将树脂洗涤2次,然后以500g离心2分钟。依次用pH 3.5和3.0的相同的缓冲液洗脱保留的蛋白质。如以上实施例中进行分析测定。
在最佳条件下,从含有400μg犬单克隆抗体的200μl乳清中,回收了多至90%的单克隆抗体:甘氨酸缓冲液100mM NaCl用于pH 4.7的洗脱1(提供更好的山羊IgG消除且同时具有好的异源抗体保留的条件)和pH 3.0的甘氨酸缓冲液用于洗脱2(出于相同的原因);参见图19。最终产品中残留的山羊抗体估计<1000ppm。在pH 4.7进行第一洗脱可以在pH>4.7下消除更多的山羊IgG。
实施例5:乳
1.冷冻乳
重复实施例1.1和1.2,但是将山羊全脂乳在-20℃冷冻1个月,然后进行处理。结果与实施例1相同。
2.冷藏乳
重复实施例1.1和1.2,但是将山羊全脂乳在4℃下保存2天,然后进行处理。结果与实施例1相同。
3.含有异源抗体的绵羊乳
重复实施例1.2的样品制备,但是处理含有异源抗体的新鲜绵羊全脂乳。脱脂和酪蛋白沉淀的结果与实施例1.2的类似。
使用含有蛋白A的5ml柱(praesto,purolite)通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。如下进行运行:将1柱体积(CV)的样品加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、50mM NaCl中平衡的柱上。将柱用10CV的平衡缓冲液洗涤。然后将柱用5CV的pH6.0的50mM乙酸钠、500mM NaCl洗涤。
使用5CV的pH 4.7的50mM乙酸钠、100mM NaCl进行第一洗脱。使用5CV的pH 3.0的100mM甘氨酸进行第二洗脱。通过2ml级分收集异源抗体,并且使用200μl pH 8.5的1.5MTris-HCl中和至使抗体稳定的pH。收集具有异源抗体的级分。纯化的色谱图如图20所示。
通过生物层干涉测量术(BLI)测量单克隆异源抗体浓度。通过SDS-PAGE使蛋白质可视化(图21)。通过ELISA测量最终产品中的残留绵羊抗体。使用以下方程计算回收率(%):(其中Cf=最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=最终产品的体积(1),Ci=对应于加载样品的初始产品中目标分子的浓度(g/l),Vi=对应于加载样品的初始产品的体积(1))。
色谱法的结果与实施例4.2.ii中在相同条件下进行但是使用山羊乳的名为“使用500mM NaCl洗涤和3步梯度”的结果类似。
4.异源抗体浓度
重复实施例1.2,但是处理含有0、1、2或3mg/ml犬单克隆抗体的山羊全脂乳。结果与实施例1的相同。此外,我们观察到从具有更高异源抗体浓度的样品中得到了更高的浓度(图22)。
5.鼠异源抗体
重复实施例1.2.a,但是处理含有单克隆鼠抗体的山羊全脂乳。结果与实施例1.2.a的类似(图23-26)。
6.含有异源抗体的山羊初乳(colostrum)
重复实施例1.2.的样品制备,但是处理山羊初乳。脱脂与实施例1.2中的相同。在pH 4.3下酪蛋白沉淀不完全。通过在20℃下以3000g离心15分钟去除沉淀的酪蛋白。抗体主要存在于被称为乳清的上清液中。使用5%初始乳体积的pH 4.3的50mM乙酸钠、50mM NaCl洗涤沉淀,以收获存在于酪蛋白沉淀中的残留抗体。混合洗涤液和乳清,用1M NaOH调节至pH 6,并且分别通过3μm和0.22μm过滤2次,然后加载到基质上。乳清和洗涤液的混合物称为“加样样品”。
使用含有蛋白A的5ml柱(praesto,purolite)通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。如下进行运行:将1柱体积(CV)的加载样品以1ml/min的流量加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、500mM NaCl中平衡的柱上。将柱用10CV的平衡缓冲液以4ml/min的流量洗涤。使用5CV的pH 4.7的50mM乙酸钠、100mM NaCl进行第一洗脱。使用5CV的pH 3.0的100mM甘氨酸进行第二洗脱。通过2ml级分收集异源抗体,并且使用200μl pH8.5的1.5M Tris-HCl中和至使抗体稳定的pH。收集具有异源抗体的级分。
通过生物层干涉测量术(BLI)测量单克隆异源抗体浓度。通过SDS-PAGE使蛋白质可视化。通过ELISA测量最终产品中的残留山羊抗体。使用以下方程计算回收率(%):(其中Cf=最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=最终产品的体积(l),Ci=对应于加载样品的初始产品中目标分子的浓度(g/l),Vi=对应于加载样品的初始产品的体积(l))。纯化的色谱图如图27所示。
初乳是临生产时产生的形成乳。初乳比常规乳含有更多的抗体。初乳的纯化证实了本方法是稳健的。的确,初乳是最坏的情况,因为其含有很多山羊抗体(>31mg/ml,而常规乳为0.25mg/ml)。初乳脱脂的结果与常规乳类似:i)回收了相同体积的脱脂初乳,并且ii)在脱脂初乳中收获了相同百分比的山羊抗体和异源抗体。但是,尽管常规乳中酪蛋白的沉淀在pH 4.3时是完全的,但初乳并非如此:在pH 4.3仅一部分酪蛋白沉淀。另一方面,酪蛋白沉淀中抗体的损失与常规乳的相当。
在本实施例中,使用3步梯度(pH 6.0、pH 4.7和pH 3.0)进行亲和色谱法。将部分澄清的初乳注入到含有蛋白A的基质上。色谱图表明许多蛋白质不与基质结合(图27)。SDS-PAGE显示不结合的蛋白质主要是酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白(数据未显示)。在pH4.7洗脱固定在柱上的山羊抗体。在pH 3洗脱的蛋白质是异源抗体。
从含有2mg犬单克隆抗体的10ml乳清中,回收了>80%的单克隆抗体,纯度大于>90%。
7.山羊初乳
重复实施例1.1的样品制备,但是处理山羊初乳。脱脂与实施例1.1中的相同。在pH4.3下酪蛋白沉淀不完全。通过在20℃下以3000g离心15分钟去除沉淀的酪蛋白。抗体主要存在于被称为乳清的上清液中。使用5%初始乳体积的pH 4.3的50mM乙酸钠、50mM NaCl洗涤沉淀,以收获存在于酪蛋白沉淀中的残留抗体。混合洗涤液和乳清,用1M NaOH调节至pH6,并且分别通过3μm和0.22μm过滤2次,然后加载到基质上。乳清和洗涤液的混合物称为“加样样品”。
使用含有蛋白A的5ml柱(praesto,purolite)通过亲和色谱法进行纯化。如下进行运行:将1柱体积(CV)的加载样品以1ml/min的流量加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、500mMNaCl中平衡的柱上。将柱用10CV的平衡缓冲液以4ml/min的流量洗涤。使用5CV的pH 4.7的50mM乙酸钠、100mM NaCl进行第一洗脱。使用5CV的pH 3.0的100mM甘氨酸进行第二洗脱。
通过ELISA测量最终产品中的山羊抗体。使用以下方程计算回收率(%):(其中Cf=最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=最终产品的体积(l),Ci=对应于加载样品的初始产品中目标分子的浓度(g/l),Vi=对应于加载样品的初始产品的体积(l))。纯化的色谱图如图28所示。
通过监测色谱图上280nm处的吸光度,可以发现几乎所有山羊蛋白和抗体都在约pH≥4.7洗脱。该实施例清楚地表明在约pH 4.7的阶段是必要的。在pH 3洗脱时,洗脱了低水平的山羊抗体,其通过280nm处的小吸光度峰表示。
与在相同条件下进行的以上实施例(参见图27)相比,该实施例表明在pH>3时所有乳清初乳蛋白均被洗脱,并且在pH=3时,异源抗体被洗脱。
8.初乳和2步梯度(pH 6和pH 3.0)纯化
重复实施例1.1的样品制备,但处理山羊初乳。脱脂与实施例1.1中的相同。在pH4.3下酪蛋白沉淀不完全。通过在20℃下以3000g离心15分钟去除沉淀的酪蛋白。抗体主要存在于被称为乳清的上清液中。使用5%初始乳体积的pH 4.3的50mM乙酸钠、50mM NaCl洗涤沉淀,以收获存在于酪蛋白沉淀中的残留异源抗体。混合洗涤液和乳清,用1M NaOH调节至pH 6,并且分别通过3μm和0.22μm过滤2次,然后加载到基质上。乳清和洗涤液的混合物称为“加样样品”。
使用含有蛋白A的5ml柱(praesto,purolite)通过亲和色谱法进行纯化。如下进行运行:将1柱体积(CV)的加载样品以1ml/min的流量加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、500mMNaCl中平衡的柱上。将柱用10CV的平衡缓冲液以4ml/min的流量洗涤。然后将柱用5CV的pH6.0的50mM乙酸钠、100mM NaCl以4mL/min的流量洗涤。使用5CV的pH3.0的100mM甘氨酸以4ml/min的流量进行洗脱。纯化的色谱图如图29所示。
该实施例表明,如果不进行约pH 4.7的平台,则山羊抗体在pH=3时被洗脱。如先前实施例中所示,在pH 3时的洗脱洗脱了异源抗体。
为了以高纯度水平回收异源抗体,在约pH 4.7的平台是有利的。
9.加载之前稀释乳清
重复实施例4第2.a.ii节,但是用pH 7.5的1M乙酸盐不仅乳清的pH达到pH 6,而且达到pH 6.5和7.0。这种pH调节导致乳清样品体积从未稀释的17ml分别提高到pH 6、6.5和7.0下的117ml、436.7ml和1354ml。然后将样品加载到蛋白A树脂上。结果与实施例4第2.a.ii节相同。
实施例6:实施例1-5中使用的测定
1.ELISA
a)异源抗体
使用的ELISA方案如下。将亲和纯化的绵羊抗狗IgG(LabNed LN0801904)以0.5μg的量加载到碳酸盐缓冲液0.05M pH 9.6中的聚苯乙烯微量滴定板上,并且在4℃孵育过夜。通过在pH 8的50mM Tris、0.14M NaCl、1%BSA(TBS-BSA)中孵育(室温下至少30分钟)进行孔的饱和。在用TBS-T缓冲液(0.1%Tween 20)的5个洗涤步骤之后,将标准品(亲和纯化的异源抗体)或样品添加入孔中,并在室温下孵育1小时。接下来,洗涤孔并且按照相同的程序孵育1μg中性亲和素缀合的绵羊抗狗IgG(Bethyl Lab,内部(in house)偶联)。在这些步骤中的每个步骤之前和之后均进行在TBS-T中的五次洗涤,以去除未结合的mAb。将TMB用作底物以测量固定的过氧化物酶活性,并使用1M H3PO4终止反应。在450nm下读取板。绘制标准曲线(OD相对于浓度)并建模4参数逻辑斯谛曲线。使用标准曲线的方程确定样品浓度。
b)羊抗体
所用的ELISA方案基于试剂盒“Goat IgG ELISA Quantification Set”((BethylLaboratories,Inc.)所提供的。将亲和纯化的兔抗山羊IgG-Fc(Bethyl Laboratories,Inc.)以0.5μg的量加载到聚苯乙烯微量滴定板上,并且在4℃孵育过夜。通过在pH 8的50mMTris、0.14M NaCl、0.1%tween20(TBS-T)中孵育(室温下1小时)进行孔的饱和。将标准品(山羊参照血清,Bethyl Laboratories,Inc.)或样品添加入孔中,并在室温下孵育1小时。然后按照相同的程序孵育1μg HRP缀合的兔抗山羊IgG-Fc检测抗体(BethylLaboratories,Inc.)。在这些步骤中的每个步骤之前和之后均进行在TBS-T中的五次洗涤,以去除未结合的mAb。将TMB用作底物以测量固定的过氧化物酶活性,并使用0.18M H2SO4终止反应。在450nm下读取板。绘制标准曲线(OD相对于浓度)并建模4参数逻辑斯谛曲线。使用标准曲线的方程确定样品浓度。
2.BLI
a)异源抗体
使用Octet HTX***(ForteBio,Pall Life Sciences,Menlo Park,CA)确定异源抗体的定量。将样品、标准品或缓冲液以每孔200μL的体积分配到96孔微量滴定板(GreinerBio-one)中。工作温度保持在25℃。将蛋白A涂覆的生物传感器尖端(ForteBio,Inc.,MenloPark,CA)用pH 8.0的TRIS 50mM、NaCl 140mM、0.1%BSA、0.05%tween 20、0.05%叠氮化物预润湿10分钟。通过在pH 8的50mM Tris、140mM NaGl、0.1%BSA、0.05%tween 20(中和缓冲液)中以0至150μg/mL(150μg/ml、100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml和0μg/ml(空白))的浓度稀释纯化的抗体来构建标准曲线。对于每次测定,通过在以1000RPM摇动微孔板的情况下将尖端浸入每种标准品60秒来产生8点标准曲线的2个重复。通过在1000rpm下将尖端浸入在中和缓冲液中稀释至落入标准品的浓度范围内的样品60秒来进行样品结合速率的测量。每次测量后,通过连续3次将尖端浸入pH 1.7的10mM甘氨酸然后中和缓冲液来使传感器再生,分别将微孔板以400rpm和1000rpm摇动5秒。将数据载入Octet Data Analysis 4.0中,并使用初始斜率速率方程(initial slope rate equation)进行分析。
3.BCA
通过来自ThermoFisher的BCA Pierce assay,微孔板方案(Cat#23225)测量总蛋白含量。使用PBS中浓度为1500-1000-750-500-250-125-25和0μg/ml的牛血清白蛋白参照准备标准曲线。将样品在PBS中稀释至落入标准品的浓度范围内。接下来,将标准品和样品均置于平底96孔透明微孔板中,每个样品25μl,一式三份。然后通过将50份试剂A与1份试剂B混合来制备试剂溶液,然后将200μl此溶液置于每个孔中,并将微孔板在37℃孵育30分钟。在使板冷却至室温之后,读取570nm的OD。绘制标准曲线(OD相对于浓度)并建模线性回归曲线。使用标准曲线的方程确定样品浓度。
4.SDS-PAGE/Western印迹
如下使用凝胶电泳SDS-PAGE测定纯度和杂质。根据制造商的说明制备预制凝胶(Precast gel)(4-20%,Biorad Criterion)并将其装在设备上以运行凝胶。通过将TGX10x缓冲液(Biorad)用水稀释来制备TGX缓冲液,然后将该缓冲液添加到电泳槽中。通过与加载缓冲液(还原或未还原的)以1∶1的比例混合来稀释和制备样品。对于天然条件凝胶,不加热样品,但在其他情况下,将样品在90℃加热5分钟,然后离心并置于凝胶上。在凝胶的第一个孔中设置5微升蛋白梯(ThermoFisher),然后在随后的孔中添加15μl的每个样品。然后将凝胶在200V下运行35-40分钟,然后用水清洗3次5分钟,然后与着色溶液(Bio-safeCoomassie,Bio-rad)孵育1小时。接下来,将凝胶用水脱色,第一次清洗1小时,然后在室温下过夜。然后用相机拍摄凝胶的图片,并对凝胶进行分析。
对于Western印迹分析,使用吸墨纸将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上。封闭膜后,孵育与碱性磷酸酶缀合的抗异源抗体,洗涤膜,然后用AEC显示。然后将膜拍照以进行持续分析。
5.EC
使用毛细管电泳装置(Experion,Biorad)确定纯化产物的纯度。根据生产商的说明,用运行凝胶制备蛋白质芯片(Experion,Bio-rad)。通过将样品与加载试剂(还原或未还原的)混合,然后在95℃加热5分钟来制备样品。然后将样品加载到芯片上,然后将其放置在毛细管电泳装置中。在运行过程中,检测荧光以鉴定蛋白质峰和强度。运行实验后,用汇总了所有出现的带、分子量和相对纯度的表格生成重构的凝胶电泳谱。
6.HCP(山羊乳蛋白ELISA)
山羊乳蛋白测定是夹心免疫酶促测定(Cygnus Technologies,Cat#F240)。由制造商在96孔ELISA微孔板中预涂覆亲和纯化的捕获多克隆抗体(针对30种乳蛋白),然后对其进行洗涤、饱和和稳定化。进行样品的制备,以使其在ELISA范围内,为0到25ng/ml的山羊乳蛋白。然后将标准品和样品以每孔25μl一式两份设置。然后将与HRP缀合的抗山羊乳抗体以100μl/孔添加到孔。在室温下在旋转仪上以500rpm孵育2小时后,将孔用350ml的洗涤缓冲液洗涤4次。最后,将100ml的TMB底物添加到所有孔,使其反应30分钟,并用100μl的终止溶液终止。然后在450和650nm读取板,并按照与异源抗体ELISA相同的原理进行山羊乳蛋白的浓缩。
实施例7:不同异源抗体的纯化
将含有犬单克隆异源抗体n°1的山羊乳的纯化与含有犬单克隆异源抗体n°2的山羊乳的纯化进行比较。异源抗体n°1与异源抗体n°2表现出~85%的序列同一性。
重复实施例1.2的样品制备:将含有~1g/l犬单克隆异源抗体的山羊全脂乳在50℃加热,然后以3000g离心10分钟。使烧瓶冷却以使脂肪固化。去除烧瓶顶部的乳脂。通过添加1M HCl直至pH 4.3来在20℃下使脱脂乳酪蛋白沉淀。通过在20℃以3000g离心20分钟来去除沉淀的酪蛋白。
用5%初始乳体积的pH 5的50mM乙酸钠、50mM NaCl洗涤沉淀,以收获存在于酪蛋白沉淀中的残留异源抗体。将洗涤液与乳清混合,用1M NaOH凋节至pH 6,并通过0.22μm过滤,然后加载到色谱基质上。乳清和洗涤液的混合物称为“加样样品”。通过称重确定每个步骤之后获得的乳体积。
在制备“加载样品”时,含有异源抗体n°1的山羊乳的行为类似于含有异源抗体n°2的山羊乳。实际上,对于两个样品在相同条件下进行脱脂和酪蛋白沉淀并且观察到了相同的结果:i)回收了相同体积的脱脂乳和乳清:从42ml全脂乳中,收获了大于90%的脱脂乳并且收获了大于85%的乳清。过滤过程中损失了死体积,因此回收了85%的加载样品,ii)回收了相同量的山羊抗体。图30中报告了通过ELISA测量的山羊抗体浓度,iii)乳样品的SDS-PAGE分析显示相同的谱(图31和表8)。
使用含有蛋白A的5ml柱(Praesto AP Minichrom(purolite))通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。如下进行运行:将7柱体积(CV)的加载样品以1ml/min的流量加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、500mM NaCl中平衡的柱上。用10CV的平衡缓冲液以4ml/min的流量洗涤柱。使用5CV的pH 4.7的50mM乙酸钠、100mM NaCl以4ml/min的流量进行第二洗涤。使用5CV的pH 3.0的100mM甘氨酸以4ml/min的流量进行洗脱。图32和图33分别报告了异源抗体n°1和n°2的纯化色谱图。借助Unicorn软件对峰进行整合。
按照与上述相同的参数处理和纯化阴性对照(不含异源抗体的山羊乳)。图34报告了阴性对照的纯化色谱图。
表8.图31凝胶上的加载的样品的说明。标记是Thermo ScientificTM PierceTM未染色蛋白质分子量标记(#11882114)
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量单克隆异源抗体浓度。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使蛋白质可视化(图31和图35)。通过western印迹使单克隆异源抗体可视化(图35)。通过ELISA测量山羊抗体浓度(图30)。使用以下方程计算回收率(%):(Cf×Vf)/(Ci×Vi)×100(其中Cf=最终产品中目标分子的浓度(g/l),Vf=最终产品的体积(l),Ci=初始产品中目标分子的浓度(g/l),Vi=初始产品的体积(1))。
色谱图和SDS-PAGE分析表明,加载的山羊蛋白(包括山羊抗体)主要在通过流和洗涤液中收获(图30-35)。在pH 4.7的分步梯度(峰保留体积=99ml)下收获约3.5%的加载的山羊抗体。相反,如犬western印迹所示,对蛋白A树脂具有高亲和力的异源抗体在流通、洗涤和pH 4.7的分步梯度中损失很小(图35)。犬ELISA揭示在pH3的洗脱(峰保留体积=121ml)中收获了超过80%的加载的单克隆抗体n°1和n°2。阴性对照的纯化表明,在pH 3的分步梯度中洗脱残留的山羊蛋白质(峰保留体积=122ml,图34)。小峰面积(比用于纯化抗体n°1和n°2的pH3的洗脱峰弱超过280倍),并且通过SDS-PAGE分析没有可检测的带,证明与纯化的异源抗体n°1和n°2相比,残留蛋白质的量小且可忽略。
纯化异源抗体n°1和n°2的结果相同。这些结果证明了乳处理和山羊乳中异源抗体纯化步骤的稳健性。
表9.图35凝胶上加载的样品的说明。标记是10至250kDa PageRulerTM PlusPrestained Protein Ladder(ThermoFisher#26619)。
实施例8:用不同的蛋白A基质纯化
1.线性梯度
重复实施例1.2的样品制备:将含有犬单克隆异源抗体(1mg/ml)的新鲜山羊全脂乳在50℃下加热,然后以3000g离心10分钟。使烧瓶冷却以使脂肪固化。去除烧瓶顶部的乳脂。通过添加1M HCl直至pH 4.3来在20℃下使脱脂乳酪蛋白沉淀。通过在20℃以3000g离心15分钟来去除沉淀的酪蛋白。用1M的NaOH将上清液(称为乳清)调节至pH 6并通过0.22μm过滤,然后加载至色谱基质。
使用含有蛋白A的5ml柱(HiTrap MabSelect PrismA,GE Healthcare)通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。如下进行运行:将2柱体积(CV)的样品以1ml/min的流量加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、50mM NaCl中平衡的柱上。用10CV的平衡缓冲液以2.5ml/min的流量洗涤柱。用平衡缓冲液和pH 3的0.1M柠檬酸钠之间10CV的线性梯度以2.5ml/min的流量进行洗脱。使用pH 8.5的1M Tris-HCl中和在pH<4.8洗脱的级分。色谱图报告在图36中。通过SDS-PAGE和western印迹分析加载样品、通过流、在pH>4.8收集的级分(峰保留体积=~70ml)和在pH<4.8收集的级分(峰保留体积=~92ml)的蛋白质和异源抗体(图40)。通过生物层干涉测量术(BLI)测量单克隆异源抗体浓度。使用以下方程计算mAb的回收率(%):(Cf×Vf)/(Ci×Vi)×100(其中Cf=最终产品中mAb的浓度(g/l),Vf=最终产品的体积(1),Ci=加载样品中mAb的浓度(g/l),Vi=加载样品的体积(l))。BLI显示,在pH<4.8收集的级分(峰保留体积=~92ml)中收获了大于80%的加载的单克隆抗体。
使用上述相同的纯化参数,通过以下进行两种其他纯化:i)加载澄清的山羊乳(不含异源抗体)和ii)pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中1g/l异源抗体。色谱图分别报告在图37和图38中。
图37显示,大部分山羊乳蛋白不与蛋白A树脂结合,并且在通过流中收获。在pH 6加载和结合的山羊乳蛋白(包括山羊IgG)在pH>4.8的第一部分洗脱中收获。图38显示,所有单克隆异源抗体在pH<4.8,更确切在pH~4.0的第二部分洗脱中收获。
将获得的这些结果与实施例4.2.a(线性梯度)的结果进行比较证实可以使用不同的蛋白A树脂纯化山羊乳蛋白(包括山羊IgG)和异源抗体。
2.分步梯度
为了更好地分离山羊IgG和异源抗体,使用3步pH进行洗脱。加载样品与上述相同(通过线性梯度在MabSelect PrismA树脂上纯化):含有~1g/l异源抗体的乳清山羊乳。
使用含有蛋白A的5ml柱(HiTrap MabSelect PrismA,GE Healthcare)通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。如下进行运行:将2柱体积(CV)的样品以1ml/min的流量加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、50mM NaCl中平衡的柱上。用10CV的平衡缓冲液以2.5ml/min的流量洗涤柱。使用5CV的pH 4.7的50mM乙酸钠、100mM NaCl以2.5ml/min的流量进行第一洗脱。使用5CV的pH 3.0的100mM甘氨酸以2.5ml/min的流量进行第二洗脱。使用pH 8.5的1MTris-HCl中和在pH 3洗脱的异源抗体。色谱图报告在图39中。
通过生物层干涉测量术(BLI)测量单克隆异源抗体浓度。使用以下方程计算mAb的回收率(%):(Cf×Vf)/(Ci×Vi)×100(其中Cf=最终产品中mAb的浓度(g/1),Vf=最终产品的体积(1),Ci=加载样品中mAb的浓度(g/l),Vi=加载样品的体积(l))。通过western印迹将山羊IgG可视化(图40)。
表10.图40凝胶上加载的样品的说明。标记是10至250kDa的PageRulerTM PlusPrestained Protein Ladder(ThermoFisher#26619)
在实验条件下,色谱图显示,加载的山羊蛋白质主要在通过流中收获(图39)。无论是对于分步梯度纯化还是线性梯度纯化,山羊IgG western印记分析均显示加载的山羊抗体主要在pH≥4.7收获(图40)。相反,对蛋白A树脂具有高亲和力的异源抗体在流通、洗涤和pH≥4.7损失很小。BLI显示在pH 3的洗脱(峰保留体积=121ml)中收获了大于80%的加载的单克隆抗体。纯化的异源抗体包含残留的山羊IgG,其可通过分步梯度或线性梯度进行纯化(图40)。
这些结果证实,可以使用不同的蛋白A树脂纯化山羊乳蛋白(包括山羊IgG)和异源抗体。
3.动态结合能力
使用含有蛋白A的5ml柱(HiTrap MabSelect PrismA,GE Healthcare)通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。如下进行运行:将2柱体积(CV)的pH 5的50mM乙酸盐中的14g/l异源抗体以0.8ml/min的流量加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、500mM NaCl中平衡的柱上。用10CV的平衡缓冲液以2.5ml/min的流量洗涤柱。使用5CV的pH 4.7的50mM乙酸钠、100mMNaCl以2.5ml/min的流量进行第一pH步骤。使用5CV的pH 3.0的100mM甘氨酸以2.5ml/min的流量行第二洗脱。使用pH 8.5的1M Tris-HCl中和在pH 3洗脱过程中收集的级分(保留体积为92至103ml)。色谱图报告在图41中。借助Unicorn软件对峰进行了整合。
加载28mg异源抗体/ml树脂。在通过流和pH 4.7的分步梯度中较弱地回收了抗体(5ml至16ml和71ml至92ml的峰面积分别为149mAU*ml和295mAU*ml)。异源抗体主要在pH 3的分步梯度中洗脱(92ml至103ml的峰面积为17225mAU*ml)。在纯化条件下,DBC估计为26mg异源抗体/ml PrismA树脂。
4.加载pH
使用含有蛋白A的5ml柱(HiTrap MabSelect PrismA,GE Healthcare)通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。如下进行运行:将2柱体积(CV)的样品(平衡缓冲液中的1g/l异源抗体)以1ml/min的流量加载到在pH4.7的50mM乙酸钠、100mM NaCl中平衡的柱上。用10CV的平衡缓冲液以2.5ml/min的流量洗涤柱。分别使用5CV的pH 4.5的50mM乙酸钠、100mMNaCl,5CV的pH 4.3的50mM乙酸钠、100mM NaCl,5CV的pH 3.5的50mM乙酸钠、100mM NaCl,以及5CV的pH 3.0的100mM乙酸钠,以2.5ml/min的流量进行四个pH步骤。使用pH 8.5的1MTris-HCl中和在pH 3.5洗脱的异源抗体。色谱图报告在图42中。
图42在280nm处的吸光度表明,异源抗体在pH≥4.5下结合至蛋白A树脂。根据此结果,可以在pH≥4.5加载样品。在pH 4.3,异源抗体逐渐从基质释放。在pH 3.5时,异源抗体的洗脱完成。在pH 3.0,未观察到峰。异源抗体也可以在pH 3.5洗脱。
为了确认先前的结果,如下制备两个加载样品:将新鲜的山羊全脂乳在50℃加热,然后以3000g离心10分钟。使烧瓶冷却以使脂肪固化。去除烧瓶顶部的乳脂。对于第一个样品,通过添加1M HCl直至pH 4.3来在20℃下使脱脂乳酪蛋白沉淀,并且对于第二样品,通过添加1M HCl直至pH 4.5来在20℃下使脱脂乳酪蛋白沉淀。通过在20℃以10000g离心20分钟去除沉淀的酪蛋白。将NaCl添加到上清液至电导率为50mS/cm。将混合物(上清液+NaCl)通过0.22μm过滤,然后加载到色谱基质上。通过SDS-PAGE和山羊IgG western印迹分析乳样品(图46)。
使用含有蛋白A的5ml柱(HiTrap MabSelect PrismA,GE Healthcare)通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。如下进行运行:对于第一个加载样品,将2柱体积(CV)的含有犬单克隆异源抗体(~1mg/ml)的pH 4.3加载样品的以1ml/min的流量加载到在pH 4.3的50mM乙酸钠,100mM NaCl中平衡的柱上。用10CV的平衡缓冲液以2.5ml/min的流量洗涤柱。使用5CV的pH 3.5的50mM乙酸钠、100mM NaCl以2.5ml/min的流量进行洗脱步骤。使用pH 8.5的1M Tris-HCl中和在pH 3.5下洗脱的异源抗体。色谱图报告在图43中。对于第二个加载样品,将2柱体积(CV)的含有犬单克隆异源抗体(~1mg/ml)的pH 4.5加载样品以1ml/min的流量加载到在pH 4.5的50mM乙酸钠,100mM NaCl中平衡的柱上。用10CV的平衡缓冲液以2.5ml/min的流量洗涤柱。使用5CV的pH 3.5的50mM乙酸钠、100mM NaCl以2.5ml/min的流量进行洗脱步骤。使用pH 8.5的1M Tris-HCl中和在pH 3.5下洗脱的异源抗体。色谱图报告在图44中。
根据与第二个样品(pH 4.5)相同的参数处理和纯化阴性对照(不含异源抗体的山羊乳)。阴性对照的纯化色谱图报告在图45中。通过SDS-PAGE和山羊IgG western印迹分析样品(图46)。
表11.图46的凝胶上加载的样品的描述说明。标记是10至250kDa的PageRulerTMPlus Prestained Protein Ladder(ThermoFisher#26619)
SDS-PAGE分析显示在pH 4.3酪蛋白完全沉淀,而在pH 4.5凝胶上可见酪蛋白(MW酪蛋白=19-25kDa)(图46)。图43中的低洗脱峰面积(峰保留体积≈68ml)表明,当以pH 4.3加载样品时,异源抗体非常弱地与蛋白A树脂结合。这些结果与以前的结果一致(图42)。在我们的纯化条件下,优选以pH>4.3加载样品。相比之下,当在pH4.5加载样品时,异源抗体很好地与蛋白A树脂结合(图44)。SDS-PAGE和山羊IgG western印迹分析表明,在通过流中收获了加载的山羊乳蛋白(包括山羊IgG),而主要在在pH 3.5的洗脱中以显著的纯度收获异源抗体(MW≈150kDa)。通过生物层干涉测量术(BLI)测量单克隆异源抗体浓度。使用以下方程计算mAb回收率(%):(Cf×Vf)/(Ci×Vi)×100(其中Cf=最终产品中mAb的浓度(g/l),Vf=最终产品的体积(l),Ci=pH 4.5的加载样品中mAb的浓度(g/l),Vi=pH 4.5的加载样品的体积(l))。BLI显示在pH 3.5的洗脱中收获了大于80%的加载的单克隆抗体。
阴性对照的纯化色谱图显示了对于在pH 3.5洗脱的小峰面积,表明在pH 3.5的分步梯度中洗脱了残留的山羊蛋白(峰保留体积=~70ml,图45)。SDS-PAGE分析证明,与纯化的异源抗体相比,这种残留蛋白质的量很小且可忽略(图46)。山羊IgG western印迹表明纯化的异源抗体中存在残留的山羊IgG。
这些先前的实施例表明可以在pH 4.5将样品加载到蛋白A树脂上。主要优点是:i)仅具有两个pH步骤(pH 4.5和pH 3.5),并且ii)不与树脂上的山羊IgG结合(因此提高了其与异源抗体的动态结合能力)。
实施例9:加载样品中的盐浓度
如下制备加载样品:将新鲜的山羊全脂乳在50℃加热,然后以3000g离心10分钟。使烧瓶冷却以使脂肪固化。去除烧瓶顶部的乳脂。通过添加1M HCl直至pH 4.3来在20℃下使脱脂乳酪蛋白沉淀。通过在20℃下以10000g离心20分钟去除沉淀的酪蛋白。对于第一个样品,将NaCl添加到上清液至电导率为50mS/cm,并且对于第二个样品,不添加任何物质到上清液。将混合物(上清液+NaCl)或上清液通过0.22μm过滤,然后加载到色谱基质上。
对于第一个样品和第二个样品使用相同的条件,使用含有蛋白A的5ml柱(PraestoAP Minichrom(purolite))通过亲和色谱法进行异源抗体的纯化。如下进行运行:将含有犬单克隆异源抗体(~1mg/ml)的6柱体积(CV)的加载样品以1ml/min的流量加载到在pH 6.0的50mM乙酸钠、500mM NaCl中平衡的柱上。使用10CV的平衡缓冲液以4ml/min的流量洗涤柱。使用5CV的pH 4.7的50mM乙酸钠、100mM NaCl以4ml/min的流量进行第二洗涤。使用5CV的pH 3.0的100mM乙酸盐以4ml/min的流量进行洗脱。使用pH 8.5的1M Tris-HCl中和在pH3.0下洗脱的异源抗体。色谱图报告在图47和图48中。借助Unicom软件对峰进行整合。
图47和图48的色谱图在280nm处的吸光度的比较显示,如果将NaCl添加到加载样品,则在通过流中更快速回收了与树脂无亲和力的蛋白质。实际上,当样品中加载NaCl时,可以更快地达到280nm吸收的基线。
图47和图48的色谱图在pH 3.0处的洗脱峰面积(保留体积≈115ml)非常类似,这表明如果样品中加载NaCl,则异源抗体的回收率没有差异。。SDS-PAGE分析表明,无论使用何种加载条件(有或没有NaCl),在pH 3下洗脱的异源抗体均具有显著的纯度(数据未显示)。
在加载样品中添加NaCl是有利的,以减少洗涤体积(例如10CV至5CV),同时在色谱法后保持异源抗体的相同产率和纯度。
Claims (15)
1.纯化抗体的方法,其包括:
(a)提供包含异源抗体的羊乳清,任选地脱脂羊乳清;
(b)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触;
(c)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离;以及
(d)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体;
其中在洗脱所述异源抗体之前,内源性羊抗体被洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法,其包括:
(a)提供包含异源抗体的羊乳,任选地脱脂羊乳;
(b)从所述乳中去除酪蛋白以获得乳清;
(c)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触;
(d)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离;以及
(e)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体;
其中在洗脱所述异源抗体之前,内源性羊抗体被洗脱。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其包括:
(a)提供包含异源抗体的羊乳;
(b)对所述乳进行脱脂;
(c)从所述脱脂乳中去除酪蛋白以获得乳清;
(d)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触;
(e)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离;以及
(f)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体;
其中在洗脱所述异源抗体之前,内源性羊抗体被洗脱。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述内源性羊抗体在低于用于洗脱所述异源抗体的pH的pH下洗脱;优选地,其中所述用于洗脱内源性羊抗体的pH为4.0至5.0,优选4.3至5.0,更优选4.5至5.0,例如pH为4.7或4.8。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述方法包括色谱法,优选填充床(柱)色谱法。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中在与所述乳清孵育之前,所述蛋白A固体基质和/或所述乳清被平衡至pH为5至8,优选6至7。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述异源抗体在高于用于洗脱所述内源性羊抗体的pH的pH下洗脱,优选地,其中洗脱所述异源抗体包括将pH调节至2至5,优选2.0至4.5,例如2.0至4.3或2.0至4.0的pH。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述异源抗体不是羊抗体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述异源抗体是用于兽医用途的抗体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述异源抗体是鼠抗体、牛抗体、猪抗体、犬抗体、猫抗体或马抗体。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述异源抗体是IgG抗体。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述异源抗体是单克隆抗体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中所述乳清包含天然内源性羊抗体。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的方法,其中去除酪蛋白包括将pH调节至3.5至5.0,优选4.0至4.5,更优选4.3的pH,随后优选通过过滤和/或离心去除沉淀的酪蛋白。
15.根据权利要求3至14中任一项所述的方法,其中对所述乳进行脱脂包括将所述乳加热至30至60℃,优选地45至55℃的温度,随后优选通过离心去除脂肪。
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