CN111337665A - 一种用于检测肺结核感染的免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测肺结核感染的免疫层析试纸条及其制备方法，涉及免疫检测技术领域，所述免疫层析试纸条包括一对脂肪***甘露糖特异性抗体；其中，一个脂肪***甘露糖特异性抗体用于制作固相标记抗体；另一个配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体用于检测区作包被抗体。本发明提供的试纸条成本低，操作简便、快速，能够在常温储存运输，稳定性好，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种用于检测肺结核感染的免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
肺结核TB感染仍是困惑全球的传染性疾病，每年死亡人数约三百万。若干年以来，检测TB已经用好多种检验方法，皮试法不准确，痰培养法费时间，DNA探针假阳性极高；x光透视需昂贵设备。
脂肪***甘露糖Lipoazafinomannan简称LAM是一种脂肪甘露糖。此分子是组成Mycobacterium Tuberculosis肺结核细菌外封细胞壁的毒性成分。其主要功能为脱活巨噬细胞和清除氧化自由基。脱活巨噬细胞致使结核菌散播到身体其他部分。氧化自由基的破坏致使结核菌活下来而不被人体清除。
现有技术中，已证实人体液或***物中的脂肪***甘露糖(LAM)可作为验证TB感染的重要指标。但现有技术中的检测LAM的试剂盒多采用血液或痰液进行检测，对于艾滋病感染肺结核的患者血液和痰液不易提取，从而会出现检测的延误。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测肺结核感染的免疫层析试纸条。本发明提供的试纸条能够快速即时，利用少量尿液即可检测尿液中的肺结核病菌，且检测结果依靠患者肉眼即可辨别。本发明提供的免疫层析试纸条稳定性好，灵敏度高，检测时间短。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测肺结核感染的免疫层析试纸条，包括一对脂肪***甘露糖特异性抗体；其中，一个脂肪***甘露糖特异性抗体用于制作固相标记抗体；另一个配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体用于检测区作包被抗体。
优选地，所述试纸条用于检测尿液中的肺结核病菌。
优选地，所述试纸条包括加样区、固相标记抗体区、层析区和吸水区；所述层析区包括检测区和对照区；所述固相标记抗体区包被有胶体金标记的脂肪***甘露糖特异性抗体；所述检测区包被有配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体。
优选地，所述对照区包被有羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体的对照线。
优选地，所述固相标记的颗粒包括胶体金。
本发明还提供了上述技术方案所述的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)将标记抗体溶解于缓冲液中，得到稀释的标记抗体，将所述的标记的稀释抗体喷涂在玻璃纤维膜，干燥得到固相标记抗体膜；
(2)将包被配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体溶液划线于检测区上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG溶液划线于对照区形成对照线，将划线后的硝基纤维膜烘干；
(3)从底板由下而上依次粘贴加样区、固相标记抗体区、层析区和吸水区，得到组装的底板后进行切条，得到免疫层析试纸条。
本发明提供了一种用于检测肺结核感染的免疫层析试纸条，本发明提供的试纸条能够快速即时，利用少量尿液即可检测尿液中的肺结核病菌，且检测结果依靠患者肉眼即可辨别。其稳定性好，检测灵敏度为100pg/ml，检测时间短仅需1～5min。
附图说明
图1为本发明提供的试纸条的结构示意图；其中，第一区为加样区，第二区为固相标记抗体区，第三区为检测区，第四区为对照区，第五区为吸水区；
图2为肺结核病菌检测试纸条检测结果示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测肺结核感染的免疫层析试纸条，包括一对脂肪***甘露糖特异性抗体；其中，一个脂肪***甘露糖特异性抗体用于制作固相标记抗体；另一个配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体用于检测区作包被抗体。本发明提供的试纸条能够用来快速即时检测尿液中的肺结核病菌，在少量尿液中肺结核病菌即可被检测出来。利用本发明提供的试纸条肺结核病菌在1～5min内仅靠患者肉眼即可辨别并读取结果。
在本发明中，所述试纸条包括加样区、固相标记抗体区、层析区和吸水区；所述层析区包括检测区和对照区；所述固相标记抗体区包被有胶体金标记的脂肪***甘露糖特异性抗体；所述检测区包被有配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体。
在本发明中，所述试纸条包括加样区，所述加样区设置样品垫，本发明对所述样品垫的材质和制备方法没有特殊要求，采用本领域常规样品垫的材质和制备方法即可。
在本发明中，所述试纸条包括固相标记抗体区，所述固相标记抗体区包被包被有胶体金标记的脂肪***甘露糖特异性抗体。
在本发明中，所述试纸条层析区包括检测区，所述检测区包被有配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体；所述配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体的浓度优选为1～3mg/mL，更优选为2mg/mL；所述配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体的喷涂速度优选为60～100μL/s，更优选为80μL/s。
在本发明中，所述试纸条层析区包括对照区，所述对照区包被有羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体的对照线；所述羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体的浓度优选为1～3mg/mL，更优选为2mg/mL；所述羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体的喷涂速度优选为60～100μL/s，更优选为80μL/s。
在本发明中，所述吸水区优选的设置吸水垫。本发明对所述吸水垫的材质和来源没有特殊要求，采用本领域常规的吸水垫即可。
本发明对所述固相标记的颗粒没有特殊限定，胶体金或其它颗粒均可。
本发明还提供了上述技术方案所述的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)将标记抗体溶解于缓冲液中，得到稀释的标记抗体，将所述的标记的稀释抗体喷涂在玻璃纤维膜，干燥得到固相标记抗体膜；
(2)将包被配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体溶液划线于检测区上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG溶液划线于对照区形成对照线，将划线后的硝基纤维膜烘干；
(3)从底板由下而上依次粘贴加样区、固相标记抗体区、层析区和吸水区，得到组装的底板后进行切条，得到免疫层析试纸条。
在本发明中，所述标记抗体的制备方法优选为将标记抗体加入胶体金标记溶液，搅拌10～15min后，加入浓度为1％的小牛血清蛋白液，所述小牛血清蛋白液与胶体金标记溶液体积比为1:7～15，经离心10min后，得到有色沉淀物，所述有色沉淀物为标记抗体。
本发明对所述胶体金标记溶液的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的胶体金标记溶液即可。
在本发明中，所述离心转速优选为12000rpm，所述离心的温度优选为4℃。
在本发明中，所述标记抗体的方法没有特殊限制，本领域技术人员熟知的稀释方法即可。
本发明得到标记抗体后，将标记抗体喷涂在玻璃纤维膜上，所述喷涂优选为浸泡、手动涂布或仪器喷涂，本发明实施例中采用浸泡的方法。本发明将浸泡后的玻璃纤维膜在真空环境下，进行干燥，得到固相标记抗体区。在本发明中，所述干燥的温度优选为35～38℃，更优选为37℃，7～9h制备得到固相标记抗体膜。
本发明将配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体溶液划线于硝基纤维膜上制作检测线T线(第3区)，将兔抗鼠IgG溶液划线于对照区上制作质控线C线(第4区)，形成对照线。本发明对所述划线的方式并没有限制，采用本领域技术人员熟知的标记抗体喷涂方式即可。在本发明中，所述划线采用划线仪进行划线，所述划线仪的型号为Biodot,CA，USA。在本发明中，所述包被液的浓度优选为2mg/ml；所述包被液喷涂量优选为每30cm硝基纤维膜喷涂80μL/s。
本发明将划线后的硝基纤维膜放在25～37℃环境下烘干15～25min得到烘干的检测区和对照区。本发明对所述烘干的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的烘干方法即可。
本发明将样品垫、固相标记抗体膜、检测垫、对照垫和吸水垫粘贴在粘胶底板上，得到组装的底板。在本发明中，所述组装优选为从底板由下而上依次粘贴加样区(第1区)、固相化标记抗体区(第2区)、包被检测区(第3区)、对照区(第4区)的层析膜以及吸水区(第5区)，粘贴在粘胶板上，粘贴时使所述各区交叠1～1.5mm。
本发明得到组装的底板后，将组装的底板进行切条，得到检测肺结核感染的免疫层析试纸条。本发明对所述切条的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的切条方法即可。在本发明中，所述切条采用切条机切条，所述切条机型号为Kinematic2360 CA，USA。在本发明中，所述切条的宽度优选为3.0～5.0mm，更优选为4mm。
本发明在获得所述裁切的试纸条后，优选的将所述裁切后的试纸条装入试剂卡中，加入干燥剂及铝箔袋封口，得到检测试纸条成品。
本发明提供了上述技术方案所述的免疫层析试纸条在制备检测肺结核感染的试剂盒中的应用。在本发明中，所述检测肺结核感染的步骤优选包括：将待测尿液样品滴加到样品垫上进行层析；待质控线显色后，观察检测线是否由无色变为红色；检测线变为红色或玫瑰色，则待测样品含有脂肪***甘露糖，诊断为感染肺结核。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
胶体金标记抗体的制备：将抗体30微克加入胶体金溶液10毫升，搅拌10分钟后，加入浓度为1％的小牛血清蛋白液，小牛血清蛋白液与胶体金溶液体积比为1:7，经12000rpm离心10分钟后，得到有色沉淀物，所述有色沉淀物为标记抗体。
实施例2
免疫层析试剂条的制备：
(1)将标记抗体#TB0204(JAJ International,CA,USA)溶解于缓冲液中使用常规标记抗体的方法，将的稀释的标记抗体喷涂在玻璃纤维垫上，然后在真空干燥器进行干燥，其中干燥的温度为37℃；
(2)将配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体溶液划线于硝基纤维膜上制作检测线T线，包被的配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体为抗体TB0526(JAJInternational,CA,USA)，包被浓度为2mg/ml，同时将羊或兔抗鼠IgG溶液划线在硝基纤维膜上制作C线，将划线的硝基纤维素膜放在25℃烘干25分钟；
(3)将样品垫，烘干的玻璃纤维垫，烘干的硝酸纤维素膜、吸水纸依次黏贴在底板上；将试剂大板进行裁切，然后装入试剂卡中，加入干燥剂及铝箔袋封口，得到检测试纸条。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于检测肺结核感染的免疫层析试纸条，其特征在于，包括一对脂肪***甘露糖特异性抗体；其中，一个脂肪***甘露糖特异性抗体用于制作固相标记抗体；另一个配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体用于检测区作包被抗体。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条用于检测尿液中的肺结核病菌。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括加样区、固相标记抗体区、层析区和吸水区；所述层析区包括检测区和对照区；
所述固相标记抗体区包被有胶体金标记的脂肪***甘露糖特异性抗体；
所述检测区包被有配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体。
4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述对照区包被有羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体的对照线。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述固相标记的颗粒包括胶体金。
6.权利要求1～5任一项所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将标记抗体溶解于缓冲液中，得到稀释的标记抗体，将所述的标记的稀释抗体喷涂在玻璃纤维膜，干燥得到固相标记抗体膜；
(2)将包被配对固相标记抗体抗脂肪***甘露糖的抗体溶液划线于检测区上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体溶液划线于对照区形成对照线，将划线后的硝基纤维膜烘干；
(3)从底板由下而上依次粘贴加样区、固相标记抗体区、层析区和吸水区，得到组装的底板后进行切条，得到免疫层析试纸条。
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